PL213309B1

PL213309B1 - Sposób hydrolizy wiazania peptydowego

Info

Publication number: PL213309B1
Application number: PL378946A
Authority: PL
Inventors: Wojciech Bal; Edyta Kopera; Artur Krężel; Aleksandra Wysłouch-Cieszyńska
Original assignee: Polska Akademia Nauk Inst Biochemii I Biofizyki
Priority date: 2006-02-09
Filing date: 2006-02-09
Publication date: 2013-02-28
Also published as: AU2006337723A1; DK2102227T3; US8969516B2; PL378946A1; EP2102227B1; WO2007091907A1; US20100256335A1; EP2102227A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób hydrolizy wiązania peptydowego pomiędzy R1 i B w swoistej, zaprojektowanej sekwencji aminokwasowej R1BXJZR3R2, w której R1 przedstawia pożądany peptyd lub białko, R2 przedstawia sekwencję posiadającą zdolność do swoistego wiązania się z innym komponentem/cząsteczką lub inną domeną, którą należy odciąć, a R3 przedstawia ewentualną krótką sekwencję peptydową, przy czym rzeczony sposób jest oparty na nowym mechanizmie molekularnym, zachodzącym w określonym kompleksie tego jonu metalu z sekwencją BXJZ. Ten mechanizm obejmuje wspomagane przez jon metalu przeniesienie grupy R1 do łańcucha bocznego reszty B, z utworzeniem produktu przejściowego, który następnie ulega hydrolizie. Ten sposób może zostać zastosowany do usuwania C-końcowych domen R3R2 w białkach fuzyjnych, dla uzyskania czystych, niemodyfikowanych pożądanych białek/peptydów R1. Produkt przejściowy można również poddawać reakcji z innymi związkami, by otrzymywać pochodne pożądanych białek ze zmodyfikowaną grupą karboksylową przy końcu C.

Stan techniki

Przecinanie wiązania peptydowego jest przedmiotem stałego zainteresowania, będąc jedną z najczęstszych i najważniejszych procedur w biochemii. Jednakże ogromna trwałość tego wiązania, którego okres półżycia dla hydrolizy spontanicznej jest szacowany na 350 - 600 lat w pH obojętnym i temperaturze pokojowej (Radzicka, A., Wolfenden, R., J. Am. Chem. Soc. 1996, 110, 6105-6109) ogranicza zakres reagentów dla wydajnego cięcia białek lub peptydów. Enzymy proteolityczne są naturalnymi reagentami, przecinającymi wiązania peptydowe z różnym stopniem wybiórczości. Jednak tylko kilka spośród nich jest stosowanych rutynowo w praktyce przemysłowej lub laboratoryjnej, ze względu na takie ograniczenia, jak ich wąskie wymagania co do temperatury i pH. Nowe czynniki, które dostarczają wybiórczego cięcia peptydów i białek zyskują, zatem na znaczeniu. Potencjalne zastosowania przewiduje się w inżynierii białek, obejmują one usuwanie etykiet powinowactwa w procedurach oczyszczania peptydów/białek, obróbkę prekursorów białek aktywnych itp.

Postępy w technologii rekombinowanego DNA umożliwiły ekspresję szerokiej gamy sklonowanych obcych genów w organizmach gospodarzy, takich jak bakterie lub drożdże.

Zastosowanie odpowiednich białek fuzyjnych dla ekspresji docelowych peptydów lub białek stało się zwykłą praktyką. Takie nośniki fuzyjne mają wiele zalet. Można je dobierać dla zwiększenia rozpuszczalności białek fuzyjnych, dla zapobiegania degradacji białek docelowych w komórkach gospodarza lub dla uproszczenia procedur oczyszczania i wykrywania. Często jednakże konieczne jest usunięcie partnera fuzyjnego z peptydu/białka docelowego. Dotyczy to na przykład zastosowań farmaceutycznych, gdzie obce sekwencje peptydowe mogą wywołać odpowiedź immunologiczną u pacjentów lub badań strukturalnych. Przydatny sposób cięcia wiązania peptydowego musi być zarówno wybiórczy, jak i wydajny i nie może dawać niepożądanych produktów ubocznych. W szczególności taki sposób nie powinien wprowadzać do pożądanego białka/peptydu takich modyfikacji, które trudno byłoby usunąć. Ponadto, dla zastosowań farmaceutycznych lub innych, związanych z naukami biologicznymi, taki sposób nie powinien stwarzać zagrożenia zanieczyszczenia produktu przez patogeny.

Jednym z typowych podejść do zagadnienia specyficznego cięcia wiązania peptydowego jest zastosowanie enzymów proteolitycznych. Do najczęściej stosowanych należą Factor Xa (na przykład Nagai i wsp., EP0161937 oraz Grandi i wsp., EP0505921), enterokinaza (na przykład LaVallie, EP0679189 oraz Ley i wsp., US2005158838), oraz trombina (na przykład Gilbert i wsp., EP0666920). Proteolizie enzymatycznej towarzyszy jednak kilka poważnych niedogodności. Należą do nich: niespecyficzny atak proteolityczny na pożądane białko; potrzeba długotrwałej inkubacji, która może spowodować denaturację lub agregację białka fuzyjnego; niepełne cięcie, które ogranicza wydajność i/lub wprowadza heterogenność w oczyszczonym białku; potrzeba dodatkowych etapów oczyszczania dla oddzielenia białka docelowego od partnera fuzyjnego, dezaktywacji i usunięcia proteazy oraz wymiany buforu lub soli. Wreszcie, enzymy proteolityczne są często kosztowne, a zatem nieodpowiednie do używania na dużą skalę w zastosowaniach farmaceutycznych, klinicznych i biotechnologicznych.

Inna rodzina sposobów specyficznego cięcia wiązania peptydowego jest oparta na splataniu (ang. splicing) białek za pomocą intein, występujących naturalnie sekwencji wewnętrznych, które podlegają przegrupowaniu wewnątrzcząsteczkowemu przez tworzenie i następczą hydrolizę aktywnego (tio)estru. Ten ostatni etap prowadzi do eliminacji inteiny i rekombinacji sekwencji sąsiadujących (Hiera i wsp., J. Biol. Chem. 1990, 265, 6726-6733). Ostatnio zaprojektowano szereg mutantów intein, które są zdolne do ułatwiania tylko pierwszego etapu splatania białka (Muir, Annu. Rev. Biochem.

PL 213 309 B1

2003, 72, 249-289). W tym podejściu białko docelowe jest połączone z samowycinającą się domeną inteinową, którą można alternatywnie wyciąć przez trans(tio)estryfikację międzycząsteczkową z dodanymi tiolami, takimi jak ditiotreitol, β-merkaptoetanol lub cysteina. Ta metodologia, której popularność rośnie, ma kilka wad. Reakcja cięcia wymaga dodawania tioli, które modyfikują C-koniec białka docelowego. Jest ona ściśle zależna od zachowania natywnej konformacji inteiny, czego wynikiem są swoiste, zawężone wymagania dla warunków reakcji. Również duży rozmiar ugrupowań inteinowych stanowi wadę, gdyż może obniżać rozpuszczalność i wydajność oczyszczania (Belfort i wsp. US6933362).

Kolejna rodzina wybiórczych sposobów cięcia wiązania peptydowego jest oparta na chemicznych środkach tnących. Te często wymagają ostrych warunków reakcji. Nawet, gdy dodawane są z dużym nadmiarem w stosunku do substratu, zazwyczaj tną z tylko częściową selektywnością i niską wydajnością. Bromocyjan jest jednym z głównych odczynników chemicznych dla hydrolizy wiązania peptydowego. Choć stosowany powszechnie, ma on kilka poważnych wad. Jest lotny i bardzo toksyczny, stosuje się go w 100-krotnym nadmiarze w stosunku do reszt metioniny, wobec których jest wybiórczy, wymaga 70% kwasu mrówkowego jako rozpuszczalnika i daje kilka niepożądanych reakcji ubocznych. W konsekwencji wybiórczości dla pojedynczych reszt metioninowych, w białkach zawierających dodatkowe metioniny bromocyjan wytwarza fragmenty białkowe, które nie są już natywne, gdyż reszty metioninowe w nich ulegają nieodwracalnej modyfikacji (Dimarchi, EP0134070). Innym sposobem cięcia chemicznego jest reakcja białka lub peptydu z hydroksyloaminą, która przecina wiązanie pomiędzy resztami Asn i Gly. Do wad tego podejścia należą reakcje uboczne hydroksyloaminy z innymi resztami Asn i Gly w białku lub peptydzie, dające hydroksaminiany (Wang, CN1371918). Ujawniono (Palm, WO952815) cięcie wiązania Asn-Gly w białku lub peptydzie przez traktowanie go związkiem o wzorze ogólnym R1-(CH2)n-NH-(CH2)m-R2, w którym R1 oznacza NH2 lub OH, R2 oznacza atom wodoru, niższy alkil, NH2, OH lub fluorowiec, n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 3, a m oznacza 0 lub liczbę całkowitą od 1 do 3. Jest to uogólnienie cięcia za pomocą hydroksyloaminy, posiadające podobne ograniczenia. Ujawniono też (Richiyaado, EP0288272) chemiczny sposób cięcia wiązania peptydowego przy resztach tryptofanu przez traktowanie peptydu lub białka kwasem trifluorooctowym w obecności sulfotlenku i jonów chlorkowych. Hinman i wsp. (EP0339217) ujawnili cięcie wiązań peptydowych przez nukleofilowe organofosfiny trzeciorzędowe. Inny sposób obejmuje cięcie wiązania peptydowego pomiędzy resztami Lys i Cys. W tej reakcji reszta cysteiny jest najpierw cyjanowana, następnie peptyd traktuje się słabą zasadą, a grupa aminowa lizyny działa jako grupa nukleofilowa, atakująca karbonylowy atom węgla wiązania peptydowego pomiędzy lizyną i cyjanocysteiną i tnąca to wiązanie (Iwakura i wsp., JP10045796). Zastosowanie chemicznych sposobów cięcia przedstawionych powyżej w zdecydowanej większości przypadków spowoduje nieswoistą fragmentację białek, gdyż reszty tryptofanu oraz pary Asn-Gly i Lys-Cys często występują w białkach. Inną poważną wadą tych sposobów jest stosowanie toksycznych lub szkodliwych chemikaliów.

Różne jony metali, w tym Cu²⁺, Zn²⁺, Pt²⁺, Pd²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Ce jako środki do nieenzymatycznego cięcia wiązania peptydowego - nieskompleksowane lub skompleksowane ze swoistymi ligandami, takie kompleksy nazywa się często sztucznymi metalopeptydazami. Można wykorzystywać dwa ogólne mechanizmy cięcia. Badano reakcje redoks chelatów jonów metali, często w obecności H2O2/askorbinianu (na przykład patrz Rana i wsp., J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 2457-2458). Według Linder i wsp. (WO2005005458) w z góry ustalonym miejscu cięcia konstruuje się sekwencję aminokwasową, zawierającą przynajmniej dwa aminokwasy z grupy, obejmującej histydynę, lizynę, tryptofan, argininę, tyrozynę, fenyloalaninę i cysteinę, a białka lub peptydy poddaje się reakcji z wolnymi jonami metalu w buforze. Bufor zawiera czynnik redukujący lub utleniający, który ułatwia cięcie. W rzeczywistości redoksowe cięcie sekwencji oligo-His i oligo-His-X przez jony Cu²⁺ i Co²⁺wykazano tylko za pomocą elektroforezy żelowej, bez dalszej analizy produktów cięcia, a zatem dokładność cięcia w tej reakcji należy dopiero wykazać. Tak jak dla innych reakcji redoksowych jonów metali, należy się spodziewać licznych reakcji ubocznych o charakterze wolnorodnikowym, na przykład utleniania łańcuchów bocznych aminokwasów.

W większości innych podejść wykorzystuje się alternatywną chemię, opartą na reakcjach hydrolizy. Suh i Son (EP 1381392) ujawnili rodzinę katalizatorów syntetycznych o wzorze ogólnym (R)(Z)n, w którym n oznacza liczbę całkowitą 1 lub większą, R oznacza materiał zdolny do wybiórczego rozpoznania i wiązania białka docelowego, a Z oznacza aktywny kompleks jon metalu-ligand. Cięcie wykazano dla kompleksów Cu²⁺ i Co³⁺, z użyciem mioglobiny i awidyny jako substratów białkowych,

3+

Eu³⁺ i Pr³⁺ badano

PL 213 309 B1 ale wybiórczość sekwencyjna była niska. Ta metodologia wymaga projektowania R indywidualnie dla każdego substratu i miejsca cięcia, a synteza odpowiednich katalizatorów jest żmudna.

Na układach modelowych, takich jak zaktywowane amidy (Sayre i wsp., Inorg. Chem. 1992, 31, 935-937 i odnośniki tamże) i dipeptydy lub małe peptydy (Fujii i wsp., J. Biol. Inorg. Chem. 2002, 7, 843-851 i odnośniki tamże, Kassai i wsp., Inorg. Chem. 2004, 43, 6130-6132 i odnośniki tamże) wykonano wiele badań, ale hydrolityczne cięcie białek uzyskano tylko w kilku przypadkach. Smith i wsp. wykazali, że jony Cu²⁺, a także jony Ni²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Fe²⁺, są zdolne do cięcia (z różnymi wydajnościami) wiązania peptydowego Lys226-Thr227 w rejonie zawiasu ludzkiego IgG1, ale nie zaproponowali mechanizmu molekularnego (Smith i wsp., Int. J. Peptide Protein Res. 1996, 48, 48-55). Cięcie mioglobiny uzyskano dla akwakompleksu Pd²⁺ z niską wybiórczością sekwencyjną (Zhu i wsp., J. Biol. Inorg. Chem., 1998, 3, 383-391) i dla serii związków Cu²⁺ (Zhang i wsp., Inorg. Chem., 2003, 42, 492), które wykazały dwa sąsiadujące miejsca wiązania. Inna praca nad BSA, z użyciem makrocyklicznego kompleksu Cu²⁺, wykazała kilka preferowanych miejsc cięcia, ale nie stwierdzono jasnej wybiórczości sekwencyjnej (Hegg i Burstyn, J. Am Chem. Soc. 1995, 117, 70115-7016). Choć w pewnych przypadkach cięcie białka może być szybkie, to wybiórczość sekwencyjna takich reakcji jest wciąż słaba i trudna do przewidzenia (de Oliveira i wsp., Inorg. Chem., 2005, 44, 921-929).

Yashiro i wsp. badali mechanizm hydrolizy peptydów, zawierających reszty Ser, o niewielkiej wybiórczości sekwencyjnej, zdefiniowanej jako -Xaa-Ser-, gdzie Xaa oznacza dowolny aminokwas. Mechanizm tej reakcji polega na przeniesieniu grupy acylowej N >O, z możliwą rolą dla Zn²+, Cu²+, Ni²⁺, Pr³⁺ lub Eu³⁺, dodawanych jako wolne jony lub kompleksy w celu polaryzacji peptydowej grupy karbonylowej przez koordynację i ułatwienia ataku nukleofilowego wewnątrzcząsteczkowej grupy OH (Yashiro i wsp., Org. Biomol. Chem., 2003, 1, 629-632 i odnośniki tamże).

Odmienny mechanizm zaproponowano dla reakcji hydrolitycznych, w których pośredniczą kompleksy Pt²⁺ i Pd²⁺. Kostic i Zhu (US5352771) ujawnili kompleksy Pt²⁺ i Pd²⁺, które wybiórczo wiążą się do atomów siarki w łańcuchach bocznych takich reszt, jak metionina, cysteina i S-alkilocysteina i promują cięcie wiązań peptydowych, przyległych do tych reszt zawierających siarkę. Ujawniony mechanizm tego procesu zakłada, że kluczowym etapem tej reakcji jest albo wewnętrzny transfer cząsteczki wody z kompleksu metalu do grupy amidowej, albo atak zewnętrznej cząsteczki wody, pochodzącej z wodnego środowiska reakcji, na grupę amidową. Choć ci wynalazcy zaproponowali szeroką gamę peptydów i białek, które można hydrolizować za pomocą tego sposobu, to niskie pH reakcji, około 2, wraz z niską wybiórczością sekwencyjną, ograniczają zakres zastosowań. Wykazano również podobny mechanizm cięcia wiązania peptydowego pomiędzy resztami X i Z dla kompleksu Pd²⁺ i peptydów o sekwencji X-Z-His (Milovic i wsp., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 781-788 i odnośniki tamże). Ta metodologia jest dobrze dostosowana do fragmentacji białek dla spektrometrii mas. Jeszcze inny mechanizm zaproponowali spekulatywnie Zhu i Kostic (Inorg. Chim. Acta 2002, 339, 104-110) dla cięcia sekwencji Ser/Thr-His/Met w albuminie osocza człowieka (HSA) przez kompleksy Pd²⁺. Obejmuje on przeniesienie grupy acylowej z utworzeniem przejściowego estru z grupą alkoholową obecną w łańcuchu bocznym Ser/Thr. Ten mechanizm zacytowano dla wybiórczego odcinania kwasu octowego od dipeptydu Ac-Ser-Met, w którym pośredniczy cisplatyna, ale nie dla reakcji z dipeptydem Ac-Ser-His (Manka i wsp., J. Inorg. Biochem. 2004, 98, 1947-1956).

Ostatnio Dutca i wsp. (Inorg. Chem., 2005, 44, 5141-5146) przedstawili podwyższone cięcie wiązań peptydowych Met-X przez kompleks Pt²⁺ przy napromieniowaniu ultrafioletem lub mikrofalami.

Humphreys (WO0032795) zaproponował miejsca cięcia, obejmujące sekwencje -DKTH-, -DRSH-, -EKSH- lub -DKSH-, które są wybiórczo cięte przez jony Cu²⁺ w temperaturze powyżej 50°C. Jednak uprzednio wykazano, że hydroliza związana z Cu²⁺ zachodzi w tych warunkach po prostu dla sekwencji Ser-His i Thr-His (Allen i Campbell, Int. J. Pept. Protein Res. 1996, 48, 265-273), a zatem dla tego sposobu należy oczekiwać licznych cięć nieswoistych.

W sumie więc reakcje jonów metali zaproponowane uprzednio i przedstawione powyżej łączy wada niskiej wybiórczości sekwencyjnej, opartej na jednej lub dwóch sąsiednich resztach aminokwasowych. Są one zatem odpowiedniejsze dla fragmentacji białek, niż dla wybiórczego cięcia dedykowanych miejsc, które zachodziłoby bez reakcji ubocznych.

Niedawno odkryto, że heksapeptyd AC-TESHHK-NH2 ulega powolnej, spontanicznej, wybiórczej sekwencyjnie hydrolizie w obecności jonów Ni²⁺ w buforze fosforanowym, przy pH 7,4 w 37^oC (Bal i wsp., Chem. Res. Toxicol., 1998, 11, 1014-1023). Stwierdzono, że produktem tej reakcji był kompleks Ni²⁺ z C-końcowym tetrapeptydem SHHK-NH2, z wydajnością pomiędzy 3% i 9% po 140 godzinach inkubacji, w zależności od stężenia jonów Ni²⁺. Cięcie nastąpiło zatem pomiędzy resztami

PL 213 309 B1

Glu i Ser. Dalsze prace wykazały, że peptyd o 34 resztach, obejmujący powyższą sekwencję, ulegał w analogicznych warunkach cięciu w obecności jonów Ni²⁺ z identyczną wybiórczością sekwencyjną, ale ok. pięć razy szybciej (Bal i wsp., Chem. Res. Toxicol., 2000, 13, 616-624). W tej samej pracy wykazano, że jony Cu²⁺ hydrolizują ten 34-peptyd równie wybiórczo, ale wolniej. Inne dwa badane jony metali, Co²⁺ i Zn²⁺ były nieaktywne. Analogiczną reakcję hydrolizy zaobserwowano dla jonów Ni²⁺i histonu H2A, który był źródłem sekwencji heksapeptydu i 34-peptydu. Dalsze badania podstawionych alaniną analogów heksapeptydowych Ac-TESHHK-NH2 wskazały, że reakcja zachodzi w środowisku alkalicznym i pozwoliły na zidentyfikowanie reszt Ser i C-końcowej His jako koniecznych dla jej zajścia. Podstawienie reszty Glu przez Ala nie wpłynęło na reakcję (Mylonas i wsp., J. Chem. Soc., Dalton Trans., 2002, 4296-4306). Opublikowane wyniki wskazywały, że sekwencje, które mogłyby potencjalnie być hydrolizowane w warunkach zasadowych obecności jonów metali, takich jak Ni²⁺, są reprezentowane przez ogólną sekwencję R1SXHZR2, gdzie R1 i R2 oznaczają dowolne sekwencje peptydowe, a X i Z oznaczają dowolne reszty aminokwasowe.

Powyższy opis jasno wykazuje, że istnieje potrzeba dla sposobu wybiórczego cięcia wiązania peptydowego w peptydzie lub białku, która łączyłaby zalety środków chemicznych, takie jak niska cena i łatwe usuwanie czynnika tnącego z zaletami, związanymi zazwyczaj z reakcjami enzymatycznymi, takimi jak duża wybiórczość sekwencyjna i powtarzalność cięcia oraz brak reakcji ubocznych.

Niniejszy wynalazek dostarcza takiego sposobu, opartego na nowym mechanizmie molekularnym z udziałem jonów metali.

Istota wynalazku

Sposób hydrolizy wiązania peptydowego pomiędzy sekwencją peptydową R1 i resztą aminokwasową B, polega na tym, że projektuje się i otrzymuje metodami biologii molekularnej, korzystnie metodą nadekspresji, białko fuzyjne przedstawione wzorem ogólnym R1BXJZR3R2, zawierające kolejno od końca N: sekwencję aminokwasową pożądanego białka fuzyjnego R1, sekwencję wiążącą kation metalu BXJZ, i domenę funkcjonalną (R3)R2, gdzie:

R1 oznacza sekwencję peptydu lub białka, która ma być odcięta, korzystnie białko docelowe, przeznaczone do oczyszczenia, zawierające C-końcową resztę aminokwasową zdolną do tworzenia wiązania peptydowego z resztą aminokwasową B.

R2 oznacza sekwencję peptydu lub białka, która jest usuwana, korzystnie sekwencję posiadającą zdolność do swoistego wiązania się z innym komponentem/cząsteczką.

R3 oznacza sekwencję peptydu lub białka, korzystnie oligopeptydową sekwencję rozdzielającą (ang. spacer), która oddziela R2 od innych części białka fuzyjnego, korzystnie ST sekwencję AP.

B oznacza resztę aminokwasową Ser lub Thr

X oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy obejmującej Arg, Lys lub His

J oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy obejmującej Asp, Glu, Tyr, Met, Cys, His,

Z oznacza resztę aminokwasową Trp, która z resztą aminokwasową J tworzy wiązanie peptydowe o postaci -C(O)-NHa po wykorzystaniu do zaplanowanego celu tak skonstruowanego białka, odcina się docelowe ₂ białko R1, wprowadzając do środowiska, w którym znajduje się to białko, jon metalu Ni² w obecności buforu, korzystnie Tris lub Hepes, a następnie inkubuje się tak otrzymaną mieszaninę reakcyjną do całkowitego zajścia procesu hydrolizy wiązania peptydowego pomiędzy R1 i B.

W sposobie według wynalazku, korzystnie jako operację dla której tworzy się domenę funkcjonalną (R3)R2, stosuje się nałożenie białka fuzyjnego, obecnego w mieszaninie pochodzenia biologicznego, korzystnie Iizatu komórkowego, na kolumnę powinowactwa, dla której swoista jest ta domena i odmycie pozostałych zanieczyszczeń.

W sposobie według wynalazku, korzystnie właściwą reakcję hydrolizy wiązania peptydowego przeprowadza się po odłączeniu białka fuzyjnego z kolumny, albo bezpośrednio na kolumnie.

W sposobie według wynalazku, korzystnie gdy procedurę wykonuje się w roztworze, to rozdziela się produkty reakcji hydrolizy za pomocą odpowiednich standardowych technik, natomiast po hydrolizie wiązania peptydowego na kolumnie otrzymuje się czyste białko R1 w roztworze.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się sekwencję peptydową R1 oznaczającą peptyd lub białko, sekwencję peptydową R2 oznaczającą peptyd lub białko zdolne do wykonywania swoistej funkcji oraz sekwencję peptydową R3, która jest obecna opcjonalnie.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się sekwencję peptydową R3 zawierającą jedną, dwie lub większą liczbę reszt aminokwasowych, które oddzielają sekwencję peptydową R2 od sekwencji BXJZ, zapobiegając zakłócaniu działania swoistego dla sekwencji peptydowej R2.

PL 213 309 B1

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się sekwencję peptydową R2 zawierającą peptyd lub białko zdolne do swoistego wiązania się lub innego oddziaływania z innym komponentem lub cząsteczką.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się resztę aminokwasową J wybraną z grupy obejmującej reszty aminokwasowe Cys i His.

W sposobie według wynalazku, korzystnie jako resztę aminokwasową B stosuje się resztę aminokwasową Ser.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się środowisko hydrolizy zawierające jeden lub więcej komponentów, przyspieszających hydrolizę wybraną z grupy obejmującej esterazy naturalne i syntetyczne.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się środowisko hydrolizy zawierające jeden lub więcej komponentów, modyfikujących kowalencyjnie C-końcowy atom węgla sekwencji peptydu/białka R1 wybrany z grupy obejmującej hydroksyloaminę i jej pochodne, alkohole, fenole, tiole, aminy, fosfiny oraz inne substancje o podobnych właściwościach.

Wszystkie pozostałe symbole jednoliterowe opisują indywidualne reszty aminokwasowe, zgodnie z oficjalną nomenklaturą IUPAC. Trzyliterowe symbole reszt aminokwasowych są również używane zgodnie z tą nomenklaturą.

W sposobie według wynalazku, nieoczekiwanie, okazało się, że pewne swoiste podstawienia w pozycjach B, X, J oraz Z sekwencji ogólnej BXJZR3R2 powodują raptowny wzrost szybkości hydrolizy wiązania peptydowego, poprzedzającego resztę B, zależnej od jonu metalu Mⁿ⁺, jednocześnie zachowując wybiórczość sekwencyjną reakcji. Wybór tych korzystnych podstawień jest oparty na danych eksperymentalnych przedstawionych w dołączonych poniżej przykładach, a także na rozważaniach teoretycznych, umożliwiających wyjaśnienie ogólnego mechanizmu molekularnego, odpowiedzialnego za tę reakcję hydrolizy. Korzystne cechy zoptymalizowanych sekwencji R1BXJZR3R2 sprawiają, że rzeczona reakcja jest przydatna jako sposób hydrolizy wiązania peptydowego w różnorakich zastosowaniach, korzystnie obejmujących odcinanie etykiet powinowactwa od białek docelowych, ale nie ograniczających się do nich.

Mechanizm molekularny hydrolizy wiązania peptydowego, który zapewnia nowość niniejszemu wynalazkowi, składa się z pięciu zasadniczych etapów, pokazanych na Schemacie I.

W etapie 1 jon metalu Mⁿ⁺ spontanicznie tworzy wiązanie z atomem/grupą YJ reszty J sekwencji R1BXJZR3R2. W etapie 2 jon metalu Mⁿ⁺ tworzy dodatkowe wiązania koordynacyjne z azotami amidowymi reszt J, X, oraz B (kompleks III). Zachodzi to w sposób stopniowy i zależny od pH, gdyż jony wodorowe muszą zostać wyparte z tych atomów azotu przez Mⁿ⁺. W wyniku tego względne stężenia kompleksów zawierających jedno (J), następnie dwa (J i X) i wreszcie trzy (J, X i B) wiązania Mⁿ⁺-azot peptydowy są wyższe przy wyższych wartościach pH. Równowaga ustala się w ciągu minut lub godzin, w zależności od sekwencji peptydu, temperatury i pH. Etapy 1 i 2 są wspólne dla wszystkich sekwencji, zawierających pojedyncze reszty J. Dla peptydów, w których reszty X i/lub Z lub inne reszty są typu J, czyli mogą koordynować jon metalu przez łańcuchy boczne, mogą istnieć dodatkowe formy kompleksowe, ale kompleks (III) zawsze będzie obecny jako główna forma przy dostatecznie wysokim pH. Reakcje etapów 1 i 2 są dobrze znane biegłym w dziedzinie i zostały opisane dla wielu przykładów (zobacz na przykład Kozłowski i wsp., Coord. Chem. Rev. 1999, 184, 319-346, Sigel i Martin, Chem. Rev., 1982, 82, 385-420). W etapie 3 następuje atak grupy YB na wiązanie peptydowe R1-B. Udział YB W reakcji hydrolizy został zasugerowany w literaturze zacytowanej powyżej dla B oznaczającego resztę Ser lub Thr. Nowym i nieoczekiwanym aspektem etapu 3 jest to, że dla sekwencji aminokwasowej R1BXJZR3R2 atak grupy YB na wiązanie peptydowe R1-B zachodzi wybiórczo w kompleksie (III), w którym Mⁿ⁺ jest skoordynowany do grupy YJ i trzech peptydowych atomów azotu reszt J, X i B. Ten fakt jest wykazany przez profil pH hydrolizy, przedstawiony w Przykładzie 3 poniżej dla J oznaczającego His. W konsekwencji, etap 4 polega na wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniu grupy acylowej R1 z grupy aminowej reszty B na grupę YB, Z utworzeniem aktywnego estru lub analogu estru. Ten ester/analog ulega następnie spontanicznej hydrolizie w roztworze wodnym w etapie 5. Jednoznaczny dowód chemiczny na tworzenie przejściowego estru jest przedstawiony w Przykładzie V poniżej.

Schemat I przedstawia ogólny mechanizm molekularny hydrolizy wiązania peptydowego, zależnej od jonu metalu dla sekwencji R1BXJZR3R2 według wynalazku. Linie faliste łączące łańcuch główny z grupami YB i YJ oznaczają pozostałe atomy łańcuchów bocznych odpowiednio reszt B i J.

PL 213 309 B1

W jednym z aspektów wynalazku rzeczony mechanizm molekularny jest realizowany dla Mⁿ⁺ oznaczającego Ni²⁺ i dla takich sekwencji R1BXJZR3R2, w których B oznacza Ser lub Thr, a J oznacza

His. Tę wersję mechanizmu molekularnego według wynalazku ilustruje Schemat II. Biegli w dziedzinie stwierdzą, że mechanizm przedstawiony na Schemacie II odpowiada w pełni mechanizmowi ogólnemu ze Schematu I.

Schemat II przedstawia mechanizm molekularny hydrolizy wiązania peptydowego zależnej od jonu metalu dla sekwencji R1BXJZR3R2, według wynalazku w której B oznacza Ser lub Thr, a J oznacza His.

Mechanizm molekularny według wynalazku wymaga, by reszta B w sekwencji R1BXJZR3R2 zawierała taką grupę YB W swoim łańcuchu bocznym, która jest zdolna do przyjęcia grupy acylowej. Zatem, w jednym z wykonań wynalazku YB wybiera się z grupy zawierającej grupy hydroksylowe, tiolowe, selenolowe, a B oznacza resztę aminokwasową, przedstawioną wzorem 1, zawierającą taką grupę YB. W jednym z korzystnych wykonań B oznacza Ser (R11, R12 oraz R13 oznaczają atom wodoru). W innym z korzystnych wykonań B oznacza Thr (R11 i R12 oznaczają atom wodoru, R13 oznacza grupę metylową).

Mechanizm molekularny według wynalazku wymaga również, by reszta J w sekwencji R1BXJZR3R2 zawierała dowolny atom/grupę YJ w swoim łańcuchu bocznym, która jest zdolna do wiązania jonu metalu Mⁿ⁺ w taki sposób, by Mⁿ⁺ mógł jednocześnie koordynować atom/grupę YJ i trzy peptydowe atomy azotu reszt J, X i B. Zatem, w jednym z wykonań wynalazku YJ wybiera się z grupy zawierającej, ale nie ograniczonej do reszt kwasów nieorganicznych, takich jak siarczan, azotan lub fosforan, reszt kwasów organicznych, takich jak karboksylany, fenoli, amin, takich jak pierwszorzędowe, drugorzędowe lub trzeciorzędowe aminy alifatyczne lub alicykliczne, fosfin, tioli, tioeterów, heterocykli, takich jak pochodne pirydyny, imidazolu, triazyn itp. W szczególnym wykonaniu J oznacza Asp, Glu, Tyr, Met, Cys lub His. W korzystnym wykonaniu J oznacza Cys lub His. W bardziej korzystnym wykonaniu J oznacza His.

Należy zauważyć, że mechanizm molekularny, zaproponowany w literaturze dla reakcji hydrolizy wiązania peptydowego Ala-Ser lub Glu-Ser w kompleksach Ni²⁺ peptydów CH3CO-Thr-Glu/Ala-Ser-His/Ala-His-Lys-NH2 (Mylonas i wsp., J. Chem. Soc., Dalton Trans. 2002, 4296-4306) jest istotnie odmienny od mechanizmu według niniejszego wynalazku, ponieważ zakłada (i) atak jonu wodorotlenowego (lub cząsteczki wody) z wnętrza roztworu na wiązanie peptydowe podlegające hydrolizie oraz (ii) uczestnictwo łańcucha bocznego Ser w reakcji poprzez tworzenie wiązania wodorowego z tlenem karbonylowym wiązania peptydowego Glu/Ala-Ser. Jest on również błędny, ponieważ nie wyjaśnia ani obserwowanej zależności szybkości reakcji hydrolizy od pH, ani tworzenia estru z grupą hydroksylową Ser/Thr.

Należy również zauważyć, że mechanizm molekularny, zaproponowany w literaturze dla reakcji hydrolizy wiązania peptydowego poprzedzającego Ser/Thr w sekwencjach Ser/Thr-Met/His w HSA przez kompleksy Pd²⁺ (Zhu i Kostic, Inorg. Chim. Acta 2002, 339, 104-110) i rozszerzony na reakcję hydrolizy wiązania Ac-Ser w kompleksie Ac-Ser-Met z Pt²⁺ przez Manka i wsp. (J. Inorg. Biochem. 2004, 98, 1947-1956), jest istotnie różny od ujawnionego tutaj, gdyż zachodzi on w kompleksach, w których jon metalu tworzy tylko trzy, a nie cztery wiązania z hydrolizowaną sekwencją. Również tworzenie przejściowego estru z resztą Ser/Thr zaproponowano tam spekulatywnie, nie wykazując go eksperymentalnie.

W dalszym aspekcie tego wynalazku niespodziewanie stwierdzono, że pewne swoiste podstawienia aminokwasowe w pozycjach X i Z silnie modulują maksymalną szybkość, a także profil pH reakcji hydrolizy. Ten aspekt został wykazany przez półilościowe oszacowanie hydrolizy w bibliotece kombinatorycznej peptydów podstawionych w pozycjach X i Z sekwencji testowej R1BXHZR2, gdzie B oznacza Ser lub Thr, R1 oznacza CH3CO-GA, a R2 oznacza KFL-NH2 (Przykład I poniżej). Stwierdzono, że wpływ podstawników w pozycjach X i Z na szybkość hydrolizy w pH 8,2 jest w przybliżeniu addytywny. Dla pozycji X najwyższą podatność na hydrolizę stwierdzono dla reszt aminokwasowych o największych objętościach van der Waalsa, które są miarą rozmiaru ich łańcuchów bocznych. Dla pozycji Z najwyższą podatność na hydrolizę stwierdzono dla reszt aminokwasowych o wysokich współczynnikach podziału oktanol/woda, które są miarą hydrofobowości ich łańcuchów bocznych. Zatem w korzystnym wykonaniu wynalazek dotyczy zależnej od jonu metalu hydrolizy sekwencji R1BXJZR3R2, w których w pozycji X obecna jest duża reszta aminokwasowa, a w pozycji Z obecna jest hydrofobowa reszta aminokwasowa. X i Z mogą oznaczać reszty aminokwasowe występujące naturalnie lub syntetyczne. W dalszym korzystnym wykonaniu tego wynalazku B oznacza resztę Ser

PL 213 309 B1 lub resztę Thr, X oznacza resztę His, Lys, lub Arg, a J oznacza resztę His. W innym korzystnym wykonaniu B oznacza resztę Ser, X oznacza resztę Lys lub Arg, a J oznacza resztę His. W korzystnym wykonaniu Z oznacza resztę Lys, Val, Arg, He, Leu lub Trp. W bardziej korzystnym wykonaniu Z oznacza resztę Trp. W najbardziej korzystnym wykonaniu wynalazek dotyczy zależnej od jonu metalu hydrolizy sekwencji R1BXJZR3R2, w których B oznacza resztę Ser, X oznacza resztę Arg, J oznacza resztę His, a Z oznacza resztę Trp.

W innym wykonaniu wynalazku sekwencje zoptymalizowane dla hydrolizy można zastosować do zapewnienia funkcjonalnych i wybiórczych miejsc cięcia w białkach fuzyjnych, które można zastosować do oddzielania domen C-końcowych R2R3, takich jak peptydy lub białka zdolne do swoistego wiązania się lub innego oddziaływania z innym komponentem lub cząsteczką, od N-końcowych domen w białkach fuzyjnych, z tym że te domeny N-końcowe, reprezentowane przez R1 w sekwencji ogólnej R1BXJZR3R2, nie są w żaden sposób ograniczone przez inne składniki fuzji, mianowicie B, X, J, Z, R2 lub R3, gdzie B reprezentuje resztę zdolną do przyjęcia grupy acylowej R1, X reprezentuje dużą resztę, J reprezentuje resztę wiążącą jon metalu, Z reprezentuje resztę wysoce hydrofobową, a R2 i R3 reprezentują dowolne sekwencje aminokwasowe. Do przykładów domen funkcjonalnych R2 stosowanych szeroko w praktyce oczyszczania białek należą peptyd heksahistydynowy, białko wiążące maltozę (MBP), tioredoksyna (TRX), S-transferaza glutationowa (GST) i szereg innych (Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 60, 523-533).

W jednym z wykonań wynalazku Mⁿ⁺ reprezentuje dowolny jon metalu zdolny do tworzenia swoistej struktury molekularnej z sekwencją aminokwasową BXJZ, obecną w kompleksach III i IV na Schemacie I, która zawiera Mⁿ⁺ związany do atomu/grupy YJ i azotów peptydowych reszt J, X, i B w geometrii ściśle lub w przybliżeniu płaskiej, kwadratowej. W jednym z wykonań wynalazku Mⁿ⁺ wybiera się z grupy obejmującej Cu²⁺, Cu³⁺, Pt²⁺, Pt⁴⁺, Pd²⁺, Au³⁺, Ag²⁺, Ni²⁺ i Ni³⁺. W szczególnym wykonaniu Mⁿ⁺ wybiera się z grupy obejmującej Cu²⁺, Pt²⁺, Pd²⁺ i Ni²⁺. W korzystnym wykonaniu Mⁿ⁺ wybiera się z grupy obejmującej Cu²⁺ i Ni²⁺. W najbardziej korzystnym wykonaniu Mⁿ⁺ oznacza Ni²⁺.

W konsekwencji mechanizmu reakcji, szybkość hydrolizy jest proporcjonalna do stężenia kompleksu aktywnego (III). W wyniku tego profile pH tych dwóch wielkości ściśle pasują do siebie (fig. 1). Choć optymalne pH dla tej reakcji wynosi 10 i wyżej, to dla sekwencji zoptymalizowanych, ujawnionych powyżej, reakcja może przebiegać efektywnie przy niższym pH, takim jak 8,2, gdzie kompleks aktywny jest formą mniejszościową pośród kilku typów kompleksów tworzonych jednocześnie przez R1BXJZR3R2 i Mⁿ⁺. Tworzenie kompleksu aktywnego przy takim niższym pH zależy od dostępności Mⁿ⁺, która jest kontrolowana przez stężenie całkowite Mⁿ⁺, a także przez konkurencję o Mⁿ⁺ ze strony innych składników mieszanin reakcyjnych, takich jak bufory. Zatem w innym wykonaniu wynalazku hydrolizę R1BXJZR3R2 wykonuje się w takim buforze, który nie współzawodniczy skutecznie o wiązanie Mⁿ⁺. W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku reakcję hydrolizy wykonuje się, więc w buforze słabo koordynującym Mⁿ⁺ według wynalazku, a w najbardziej korzystnym wykonaniu reakcję hydrolizy wykonuje się w buforze, który nie koordynuje Mⁿ⁺. W innym korzystnym wykonaniu buforem jest Tris, a jonem metalu jest Ni²⁺. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu buforem jest Hepes, a jonem metalu jest Ni²⁺.

W jednym z wykonań niniejszego wynalazku R1BXJZR3R2 opisuje białko fuzyjne takie, że R1 oznacza peptyd/białko docelowe, R2 oznacza domenę funkcjonalną, a R3 oznacza pustą sekwencję (jest nieobecny w rzeczonej sekwencji). W innym wykonaniu wynalazku domena R2 jest oddzielona od reszty Z przez jedną, dwie lub większą liczbę reszt aminokwasowych, reprezentowanych przez R3, które nie uczestniczą w reakcji hydrolizy, ale oddzielają R2 od reszty konstruktu, zapobiegając zakłócaniu działania swoistego dla funkcję sekwencji peptydowej R2. W jeszcze innym wykonaniu, funkcją R3 jest zapobieganie hamowaniu wiązania jonów metali według wynalazku do sekwencji peptydowej BXJZ.

Niniejszy wynalazek nie nakłada ograniczeń na charakter domen R2. Mogą to być peptydy lub białka zdolne do swoistego wiązania się do złoża, domeny reporterowe, sekwencje kierujące, domeny wspomagające rozpuszczalność lub pełniące jakąkolwiek inną funkcję.

PL 213 309 B1

W szczególnym wykonaniu wynalazku BXJZ oznacza SRHW, R3 oznacza sekwencję dipeptydową AP, a R2 oznacza peptyd heksahistydynowy (HHHHHH).

W dalszym wykonaniu tego wynalazku, reakcję hydrolizy można wykonać w roztworze, po oczyszczaniu na kolumnie powinowactwa. To podejście wymaga kolejnego etapu oczyszczania, by oddzielić białko docelowe R1 od odciętej domeny BXJZR3R2, lub gdy białko fuzyjne pozostaje związane do kolumny powinowactwa. W tym podejściu, białko docelowe R1 zostaje wymyte z kolumny powinowactwa wraz z buforem, w którym zachodzi hydroliza, podczas gdy odcięta domena BXJZR3R2 pozostaje przyłączona do kolumny powinowactwa.

W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku do reakcji można dodać naturalną lub sztuczną esterazę lub podobnego katalizatora dla przyspieszenia hydrolizy estru lub analogu estru, co stanowi etap 5 mechanizmu przedstawionego na Schemacie I.

W jeszcze innym korzystnym wykonaniu wynalazku do reakcji można dodać dalsze reagenty dla derywatyzacji C-końca białka/peptydu R1, tym samym dokonując syntezy nowych pochodnych R1. Taka reakcja z hydroksyloaminą, dająca C-końcowy hydroksaminian białka docelowego, jest opisana w Przykładzie V. Inna reakcja, z trifluoroetanolem, dająca C-końcowy ester trifluoroetylowy peptydu, jest opisana w Przykładzie VII.

Krótki opis Rysunków

Na fig. 1 przedstawiono porównanie zależności od pH dla stałej szybkości reakcji pierwszego rzędu hydrolizy peptydu CH3CO-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Leu-NH2 (kółka) i stężenia aktywnego kompleksu (III, Schemat II) tego peptydu (linia ciągła).

Na fig. 2 przedstawiono chromatogram HPLC produktów reakcji białka fuzyjnego (SPI2)-SRHW-AP-HHHHHH z jonami Ni²⁺ w warunkach opisanych w Przykładzie VI. Oznaczenia: 1, SRHW-AP-HHHHHH, masa cząsteczkowa 1575,73; 2, produkt przejściowy, masa cząsteczkowa 5866; 3, białko SPI2, EAAVCTTEWDPVCGKDGKTYSNLCWLNEAGVGLDHEGEC, teoretyczna masa cząsteczkowa 4195,8, (z uwzględnieniem tworzenia dwóch mostków disiarczkowych) zmierzona masa cząsteczkowa 4309, ze względu na tworzenie adduktu z jedną cząsteczką kwasu trifluorooctowego (TFA), składnika buforu HPLC o masie 114; 4 wyjściowe białko fuzyjne o sekwencji AAVCTTEWDPVCGKDGKTYSNLCWLNEAGVGLDHEGECSRHWAPHHHHHH, teoretyczna masa cząsteczkowa 5752,5 zmierzona masa cząsteczkowa 5866, ze względu na tworzenie adduktu z jedną cząsteczką TFA.

Na fig. 3 przedstawiono chromatogram HPLC produktów reakcji białka fuzyjnego (SPI2)-SRHW-AP-HHHHHH z jonami Ni²⁺, które inkubowano z 0,25 M hydroksyloaminą, jak opisano w Przykładzie VII. Oznaczenia: * - zanieczyszczenie, 1, SRHW-AP-HHHHHH; 2, produkt przejściowy; 3, hydroksaminian białka SPI2, masa cząsteczkowa 4325; 4, wyjściowe białko fuzyjne; 5, białko SPI2.

Na fig. 4 przedstawiono chromatogramy HPLC próbek uzyskanych podczas cięcia białka fuzyjnego (SPI2)-SRHW-AP-HHHHHH przyłączonego do Ni-NTA agarozy w 100 mM buforze Hepes, pH 8,2. Oznaczenia 1-4 są identyczne z użytymi na fig. 2.

Na fig. 5 przedstawiono widma ESI MS, wykazujące tworzenie estru trifluoroetylowego peptydu CH3CO-Gly-Ala w wyniku zależnej od Ni²⁺ hydrolizy peptydu CH3CO-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Leu-NH2. A. Widmo produktu reakcji hydrolizy prowadzonej w obecności 50% TFE. B. Widmo produktu reakcji hydrolizy prowadzonej pod nieobecność TFE, który następnie inkubowano z 50% TFE. Przypisania sygnałów: 189,0889, CH3CO-Gly-Ala+H⁺; 271,0712, CH3CO-Gly-Ala-OCH2CF3+H⁺; 293,0355, CH3CO-Gly-Ala-OCH2CF3+Na⁺; 309,0024, CH3CO-Gly-Ala-OCH2CF3+K⁺.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d I.

Optymalizacja pozycji X i Z w sekwencji R1BXHZR2, gdzie B oznacza S lub T, dla przyspieszenia szybkości hydrolizy zależnej od Ni²⁺, za pomocą syntezy kombinatorycznej i spektrometrii mas.

Sekwencję ogólną CH3CO-Gly-Ala-Ser/Thr-X-His-Z-Lys-Phe-Leu-NH2 zaprojektowano tak, by stałe sekwencje R1 i R2, odpowiednio CH3CO-Gly-Ala i Lys-Phe-Leu-NH2, umożliwiły optymalną detekcję za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF dla substratów, jak i oczekiwanych produktów, Ser/Thr-X-His-Z-Lys-Phe-Leu-NH2 i zapewniły rozdział pomiędzy zgrupowaniami sygnałów dla substratów i produktów w bibliotekach cząstkowych (zobacz poniżej).

PL 213 309 B1

Reszty w pozycji X obejmowały wszystkie aminokwasy występujące powszechnie w białkach, z wyjątkiem Asp, Glu i Cys. Dwa pierwsze zawierają w łańcuchach bocznych grupy karboksylowe, które mogą wiązać Ni²⁺ w sposób, który zahamowałby/zwolniłby reakcję hydrolizy. Reszta Cys może uczynić to samo, a także wejść w reakcje uboczne z jonami Ni²⁺, włączając procesy redoksowe (na przykład zobacz Bal i Kasprzak, Toxicol. Lett. 2002, 127, 55-62). Tylko reszta Cys została wyeliminowana z pozycji Z, z tych samych powodów.

Syntezę biblioteki wykonano na żywicy amidowej Rink (Novabiochem) w skali 800 mg, według typowego protokołu Fmoc (Fields, Meth. Enzymol., Tom 289). Najpierw zsyntezowano przyłączony do żywicy peptyd Leu-Phe-Lys który sprzęgano z izokinetyczną mieszaniną 19 aminokwasów wybranych dla pozycji Z, a następnie z resztą His. Na tym etapie żywica niosąca bibliotekę pentapeptydów została podzielona na połówki Ser i Thr, a każda połówka na 17 porcji, które sprzęgano z indywidualnymi aminokwasami wybranymi dla pozycji X. Następnie wykonano sprzęganie odpowiednio z Ser/Thr, dodanie reszt Ala i Gly, acetylację Gly, deprotekcję i odcięcie od żywicy. Każdą z otrzymanych 34 próbek bibliotek cząstkowych zrandomizowanych w pozycji X podzielono na dwie porcje, jedną dla reakcji w 37°C i drugą dla reakcji w 45°C. Reakcje hydrolizy przeprowadzono w 10 mM buforze Tris w pH 8,2. Całkowite stężenia mieszaniny peptydów i jonów Ni²⁺ wynosiły odpowiednio 1 mM i 2 mM. pH dla reakcji wybrano jako wybiórcze dla wysoce reaktywnych sekwencji.

Detekcję produktów reakcji wykonano za pomocą spektrometru mas MALDI-TOF (Micromass). Próbki z mieszanin reakcyjnych pobierano i mierzono na MS po 2, 4, 6 i 8 godzinach inkubacji. Postęp reakcji oceniano przez wizualną detekcję w widmach mas pojawiania się sygnałów odpowiadających oczekiwanym produktom hydrolizy, Ser/Thr-X-His-Z-Lys-Phe-Leu-NH2, przy danych czasach pomiaru, tm. Wzór użyty do półilościowego oszacowania postępu reakcji miał postać: wynik = 24/tm, zatem danemu peptydowi przypisano wynik 12, jeśli zaobserwowano częściową hydrolizę po 2 godzinach, wynik 6 dla detekcji po 4 godzinach, wynik 4 dla detekcji po 6 godzinach, wynik 3 dla detekcji po 8 godzinach, a wynik 0 jeśli nie zaobserwowano śladu produktu hydrolizy po 8 godzinach inkubacji. Dla najaktywniejszych peptydów, dla których zaobserwowano powstawanie produktów Ser/Thr-X-His-Z-Lys-Phe-Leu-NH2 po 2 godzinach, postęp reakcji kontrolowano dodatkowo przy dłuższych czasach inkubacji. W tych przypadkach kontrolowano również zanik sygnałów substratów.

Reszty X i Z porządkowano następnie według różnych parametrów molekularnych, opisujących właściwości fizyczne ich łańcuchów bocznych (Carugo, In Silico Biol. 2003, 3, 0035). Stwierdzono, że objętości van der Waalsa, odpowiadające wielkości łańcuchów bocznych oraz współczynniki podziału oktanol/woda, odpowiadające hydrofobowości łańcuchów bocznych, dają najlepsze dodatnie korelacje do uzyskanych wyników, odpowiednio dla pozycji X i Z. Wyniki dla indywidualnych peptydów, uporządkowane według tych parametrów, zaprezentowano w Tabeli 1 A-D. Stwierdzono, że wkłady podstawników X i Z do wyniku hydrolizy są w przybliżeniu addytywne, z pewnymi dodatnimi lub (częściej) ujemnymi odchyleniami, wskazującymi na obecność drugorzędnych swoistych oddziaływań między resztami. Biblioteka Ser dała większą liczbę reaktywnych peptydów niż biblioteka Thr. Podążając za addytywnością efektów wyniki zsumowano również w liniach i kolumnach Tabeli 1 A-D, tworząc w ten sposób ostateczne rankingi dla korzystnych podstawień pozycji X i Z.

PL 213 309 B1

T a b e l a 1

A. Wyniki hydrolizy z przesiewu za pomocą MALDI-TOF biblioteki peptydów CH3CO-Gly-Ala -X-His-Z-Lys-Phe-Leu-NH2, inkubowanej z Ni²⁺ w 45°C.

Ser-

κ	E	D	N	Q	s	A	P	H	T	G	V	Y	M	I	L	K	F	W	R	Sc.
G	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	3	0	0	3	3	3	0	4	3	19
A	0	0	0	0	0	3	0	4	0	0	3	3	0	4	4	6	3	6	6	42
s	3	3	0	0	3	3	0	3	0	3	4	3	3	6	6	6	3	12	6	67
P	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
T	0	0	0	0	0	0	0	3	0	0	6	3	0	6	6	6	3	6	6	45
N	0	0	0	0	0	0	0	3	0	0	3	3	0	4	4	4	3	6	6	36
V	0	0	0	0	0	0	0	3	0	0	3	3	0	3	3	4	3	4	3	29
Q	0	0	0	0	0	3	0	0	0	0	4	>4	3	6	6	6	4	6	6	48
L	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	3	3	0	0	0	4	3	4	4	21
I	0	0	0	0	0	0	0	3	0	0	3	0	0	3	3	4	0	3	3	22
H	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	6	4	0	6	6	12	3	12	6	55
M	0	0	0	0	3	3	0	3	0	0	6	4	3	12	12	6	4	6	6	68
K	3	0	0	0	0	0	0	3	0	0	6	4	4	12	12	12	4	12	6	78
^F	3	0	0	0	0	3	0	6	0	0	6	6	3	6	6	6	6	6	6	63
Y	0	0	0	0	0	0	0	4	0	0	4	4	0	6	6	6	4	6	6	46
R	3	0	0	0	4	6	0	4	3	6	12	6	3	12	12	12	4	12	12	111
W	0	0	0	0	0	3	0	3	0	3	12	6	3	12	12	12	4	6	6	32
Sc.	12	3	0	0	10	24	0	42	3	12	84	56	22	101	101	109	51	111	91	832

B. Wyniki hydrolizy z przesiewu za pomocą MALDI-TOF biblioteki peptydów CH3CO-Gly-Ala-Ser-X-His-Z-Lys-Phe-Leu-NH2, inkubowanej z Ni²⁺ w 37°C.

PL 213 309 B1

C. Wyniki hydrolizy z przesiewu za pomocą MALDI-TOF biblioteki peptydów CH3CO-Gly-Ala-Thr-X-His-Z-Lys-Phe-Leu-NH2, inkubowanej z Ni²⁺ w 45°C.

\ χ\	Ε	D	Ν	Q	S	Α	Ρ	Η	Τ	G	ν	γ	Μ	I	L	Κ	ρ	W	R	Sc,
ο	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Α	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
S	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Ρ	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
τ	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	3	3
κ	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	3	3	6
V	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	3	3	6
Q	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	3	3	3	0	4	4	17
L	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	3	0	3	3	9
I	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	3	0	3	3	9
Η	0	0	0	0	4	4	0	4	4	4	6	6	4	12	12	12	6	12	6	96
Μ	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	3	0	3	4	10
Κ	0	0	0	0	0	3	0	4	0	0	6	6	4	12	12	12	6	12	12	89
Ρ	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	3	0	3	4	10
Υ	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	4	0	4	4	12
R	0	0	0	0	0	3	0		0	0	4	6	4	12	12	12	4	12	6	79
W	0	0	0	0	0	0	0	0 \| 0	0	0	0	3	3	3	4	0	4	4	21
Sc,	0	0	0	0	4	10	0	12 4	4	16	18	15	42	42	59	16	66	S9	367

D. Wyniki hydrolizy z przesiewu za pomocą MALDI-TOF biblioteki peptydów CH3CO-Gly-Ala-Thr-X-His-Z-Lys-Phe-Leu-NH2, inkubowanej z Ni²⁺ w 37°C.

PL 213 309 B1

P r z y k ł a d II.

Ilościowe badania kinetyczne peptydów CH3CO-Gly-Ala-B-X-His-Z-Lys-Phe-Leu-NH2 wybranych w przesiewie bibliotek kombinatorycznych.

Tytułowe oktapeptydy zsyntezowano według typowego protokołu Fmoc (Fields, Meth. Enzymol., Tom 289). Listę użytych sekwencji BXHZ podano w Tabeli 2, wraz ze stałymi szybkości reakcji pierwszego rzędu, wyznaczonymi w 45°C, pH 8,2 (20 mM bufor Tris) dla 1 mM stężeń peptydu i Ni²⁺. Stałe szybkości uzyskano przez rozdział i pomiar ilościowy substratu i produktu w różnych czasach inkubacji z użyciem HPLC, a następnie dopasowanie do tych danych funkcji kinetycznej pierwszego rzędu. Piki substratu i produktu zidentyfikowano za pomocą MALDI-TOF MS.

T a b e l a 2

Stałe szybkości reakcji pierwszego rzędu dla hydrolizy 1 mM peptydów CH3CO-Gly-Ala-B-X-His-Z-Phe-Leu-NH2 wybranych na podstawie wyników Przykładu I, z 1 mM Ni²+ w 45°C i pH 8,2 (20 mM Tris).

sekwencja -BXHZ-	k ± S.D. (s'¹ x 10'⁵)
-SRHW-	28,8 ± 0,8
-THHW-	13,7 ± 0,5
-SKHW-	11 ± 1
-TRHW-	10,2 ± 0,7
-TKHW-	9,1 ± 0,6
-SRHK-	4,0 ± 0,2
-SWHL-	3,7 ± 0,4
-SWHI-	3 ± 1
-THHK-	1,01 ± 0,09

Powyższe wyniki wskazują, że wszystkie peptydy wybrane w przesiewie kombinatorycznym są podatne na hydrolizę w pH 8,2, ale stałe szybkości hydrolizy w 45°C różnią się w badanej grupie o czynnik 30. Stwierdzono, że sekwencja -Ser-Arg-His-Trp- (-SRHW-) jest najaktywniejsza spośród wybranych, została więc użyta w dalszych badaniach.

P r z y k ł a d III.

Zależność szybkości hydrolizy wiązania peptydowego Ala-Ser w peptydzie CH3CO-Gly-Ala-Ser-Arg-His-Trp-Lys-Phe-Leu-NH2 od pH, buforu i nadmiaru Ni²⁺.

Tytułowy peptyd zsyntezowano według typowego protokołu Fmoc (Fields, Meth. Enzymol., Tom 289). Zależność od pH tworzenia kompleksu aktywnego peptydu tytułowego, reprezentowanego przez strukturę (III) na Schemacie 2, wyznaczono za pomocą potencjometrii w 25°C, jak opisano w Krężel i wsp., Chem. Res. Toxicol. 2003, 16, 855-864. Szybkość hydrolizy peptydu badano za pomocą HPLC (tak jak w Przykładzie II) w serii buforów mieszanych fosforan/Tris/Boraks (40/20/20 mM) w 25°C i pH pomiędzy 6 i 12,5, przy stężeniach peptydu i Ni²⁺ równych 1 mM. Jak przedstawiono na fig. 1, stała szybkości hydrolizy ilościowo odpowiada tworzeniu kompleksu aktywnego.

Zależność szybkości hydrolizy od zastosowanego buforu badano w 25°C osobno w 20 mM buforach Tris, Hepes i fosforanowym, wszystkie o pH 8,2, dla 1 mM peptydu i 1,2 mM Ni²⁺. Wyniki przedstawiono w Tabeli 3.

T a b e l a 3

Zależność stałej szybkości reakcji pierwszego rzędu dla hydrolizy peptydu tytułowego od użytego buforu (20 mM) w 25°C i pH 8,2, dla 1 mM peptydu i 1,2 mM Ni²⁺.

bufor	k ± S.D. (s-¹ x 10^-5)
Tris	4,8 ± 0,5
Hepes	5,9 ± 0,8
fosforan	0,74 ± 0,09

W sposób jasny wykazano, że Hepes jest buforem optymalnym dla hydrolizy zależnej od Ni²⁺w pH 8,2, Tris jest nieco gorszy, a fosforan nieodpowiedni. Stopień hamowania hydrolizy peptydu jest skorelowany ze względnymi zdolnościami tych buforów do konkurencji o Ni²⁺ z peptydem tytułowym

PL 213 309 B1 w pH 8.2: Hepes nie wiąże Ni²⁺, Tris wiąże słabo, a fosforan jest względnie silnym konkurentem (zobacz Krężel i wsp., Chem. Res. Toxicol. 2003, 16, 855-864). Utrzymanie tej kolejności dla innych Mⁿ⁺ według wynalazku jest wysoce prawdopodobne (zobacz Sokołowska i Bal, J. Inorg. Biochem. 2005,

99, 1653-1660).

Zależność szybkości hydrolizy peptydu tytułowego od stosunku molowego Ni²⁺ do peptydu ba-1 -5 dano w 25°C i pH 8,2, dla stężenia peptydu 1 mM. Stała szybkości reakcji k wyniosła 4,3 ± 0,2 s^-1 x 10^-52+ -1 -5 dla stosunku molowego Ni²⁺ do peptydu równego 1,2 i 4,72 ± 0,01 s^-1 x 10^-5 dla stosunku molowego Ni²⁺ do peptydu równego 5. Ten eksperyment wykazał, że hydroliza peptydu tytułowego jest nieco przyspieszona przy kilkukrotnym nadmiarze molowym Ni²⁺, w porównaniu z układem równomolowym.

Wyniki przedstawione w tym przykładzie wykazują, że szybkość hydrolizy według wynalazku zależy przede wszystkim od stężenia kompleksu aktywnego, które można zmaksymalizować przez zapewnienie nadmiaru Mⁿ⁺ nad hydrolizowanym peptydem, unikanie konkurentów dla Mⁿ⁺ w mieszaninach reakcyjnych i dobranie pH reakcji.

Osoba biegła w dziedzinie stwierdzi, że wszystkie właściwości reakcji hydrolizy według wynalazku, ustalone w badaniach peptydów i ujawnione powyżej stosują się do procesu hydrolizy białka fuzyjnego według wynalazku.

P r z y k ł a d IV.

Zależne od Ni²⁺ uwalnianie białka SPI2 z jego fuzji w roztworze

Przydatność reakcji według wynalazku do odcinania zaprojektowanej etykiety powinowactwa od białka docelowego z wyboru zbadano na białku fuzyjnym (SPI2)-SRHW-AP-HHHHHH. SPI2 jest jednodomenowym inhibitorem proteaz typu Kazał. Uprzednio uzyskano ekspresję aktywnego biologicznie rekombinowanego SPI2, przedłużonego przy C-końcu o epitop myc, a za nim sekwencję HHHHHH (peptyd heksahistydynowy) w systemie Pichia pastoris (Grzelak i wsp., WO2005007693). Białko fuzyjne (SPI2)-SRHW-AP-HHHHHH sklonowano pod kontrolą promotera AOX w wektorze pPICZaB (Invitrogen), uzyskano ekspresję tego białka, które następnie oczyszczono przez chromatografię powinowactwa na Ni-NTA-agarozie i HPLC, tak jak opisano dla analogicznego białka fuzyjnego SPI2, zawierającego epitop myc (Grzelak i wsp., WO2005007693).

Wstępny eksperyment przeprowadzono w 1 M buforze Hepes w pH 8,2 i 45°C, dla białka fuzyjnego o stężeniu 16 μΜ i stężeń Ni²⁺ 0,2, 0,5 i 1 mM. Po 16 godzinach inkubacji próbki analizowano za pomocą HPLC (kolumna C18 z ACE, 250 x 4,6 mm, gradient 20-25% acetonitrylu/0,1% TFA w ciągu 25 min. przy 1 ml/min). Wyniki przedstawiono na fig. 2. Masy cząsteczkowe zebranych pików HPLC, zmierzone za pomocą ESI MS (Q-Tof1, Micromass), potwierdziły odcinanie domeny SRHW-AP-HHHHHH bez produktów ubocznych.

Jak widać na fig. 2, w odróżnieniu od badań peptydów, zaobserwowano znaczne ilości produktu pośredniego hydrolizy, o masie identycznej z masą wyjściowego białka fuzyjnego.

P r z y k ł a d V.

Tworzenie C-końcowego hydroksaminianu SPI2 w wyniku dodania hydroksyloaminy do produktu pośredniego w zależnym od Ni²⁺ uwalnianiu białka SPI2 z jego fuzji w roztworze.

Eksperyment z hydroksyloaminą dostarczył bezpośredniego dowodu na obecność grupy estrowej w produkcie przejściowym. Wiadomo, że hydroksyloamina reaguje swoiście z estrami, tworząc kwasy hydroksamowe (Jencks i wsp., J. Biol. Chem., 1960, 235, 3608-3614). Białko fuzyjne z Przykładu IV inkubowano w 1 M buforze Hepes, pH 8,2 z 5 mM Ni²⁺ w 37°C przez 6 godzin. Następnie dodano hydroksyloaminę do stężenia końcowego 0,25 M, ustalając pH na 6,0. Następnie mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 48 godzin w 37°C, po czym zanalizowano ją za pomocą HPLC w warunkach podanych w przykładzie IV. Na fig. 3 przedstawiono otrzymany chromatogram. Masy cząsteczkowe zebranych pików zmierzono za pomocą ESI MS. Tworzenie hydroksaminianu SPI2 zostało potwierdzone przez wykrycie SPI2 o masie zwiększonej o 16 Da (4325 wobec 4309) w wyniku działania hydroksyloaminą.

P r z y k ł a d VI.

Zależne od Ni²⁺ uwalnianie białka SPI2 z jego fuzji przyłączonej do kolumny powinowactwa.

Białko fuzyjne z Przykładu 4 (100 μl roztworu 140 μΜ) nałożono na 200 μl Ni-NTA-agarozy (Invitrogen), zgodnie z instrukcją producenta i inkubowano w 100 mM buforze Hepes, pH 8,2 z 5 mM Ni²+ w 50°C bez wytrząsania. Po 19 godzinach usunięto bufor inkubacyjny (500 μθ Następnie pozostały substrat i odciętą domenę SRHW-AP-HHHHHH odmyto z kolumny dwiema 400 μl porcjami 200 mM imidazolu, pH 7,4. Próbki zanalizowano za pomocą HPLC w warunkach podanych w Przykładzie IV. Na fig. 4 przedstawiono chromatogramy kontrolnego białka fuzyjnego, buforu inkubacyjnego i obydwu

PL 213 309 B1 frakcji odmywania. Masy białek zmierzono za pomocą ESI-MS. Wydajność oczyszczania SPI2 wyniosła 88%. SPI2 uzyskane w tej procedurze było w pełni aktywne, co wyznaczono według Chavira i wsp., Anal. Biochem. 1984, 136, 446-450.

P r z y k ł a d VII.

Tworzenie modyfikacji C-końca dipeptydu CH3CO-GA podczas reakcji hydrolizy peptydu CH3CO-GASRHWKFL-NH2 w obecności jonów Ni²⁺ i 50% trifluoroetanolu w roztworze.

Eksperyment z trifluoroetanolem (TFE) potwierdził możliwość modyfikowania C-końca białka docelowego w wyniku reakcji produktu pośredniego z innymi związkami. Peptyd tytułowy inkubowano w 10 mM buforze Hepes, pH 8,2 z 5 mM Ni²⁺ w obecności 50% trifluoroetanolu w 50°C przez 4 godziny. Następnie mieszaninę reakcyjną poddano analizie ESI MS. Tworzenie estru dipeptydu CH3CO-GA z trifluoroetanolem zostało potwierdzone przez wykrycie produktu reakcji o masie zwiększonej o 82 Da w stosunku do masy CH3CO-GA (189 wobec 271) (fig. 5B). Jako kontrolę przeprowadzono reakcję całkowitej hydrolizy peptydu CH3CO-GASRHWKFL-NH2 (50°C przez 20 godzin), następnie dodano 50% TFE, inkubowano w tych samych warunkach przez 4 godziny, po czym mieszaninę reakcyjną analizowano z użyciem ESI MS. Nie wykryto masy 271, stwierdzono natomiast obecność sygnału dla masy 189 (fig. 5A), co oznacza, że w tych warunkach ester dipeptydu CH3CO-GA z trifluoroetanolem powstaje wybiórczo w trakcie procesu według wynalazku, przez solwolizę produktu pośredniego.

O ile ten wynalazek został ukazany i opisany w sposób szczególny, z odniesieniami do swoich korzystnych wykonań, to biegli w dziedzinie uznają, że można w nim dokonać rozmaitych zmian w formie i szczegółach, nie odbiegając od zakresu wynalazku, wyznaczonego przez dołączone zastrzeżenia.

Claims

1. Sposób hydrolizy wiązania peptydowego pomiędzy sekwencją peptydową R1 i resztą aminokwasową B, znamienny tym, że projektuje się i otrzymuje metodami biologii molekularnej, korzystnie metodą nadekspresji, białko fuzyjne przedstawione wzorem ogólnym R1BXJZR3R2, zawierające kolejno od końca N: sekwencję aminokwasową pożądanego białka fuzyjnego R1, sekwencję wiążącą kation metalu BXJZ, i domenę funkcjonalną (R3)R2, gdzie:

R3 oznacza sekwencję peptydu lub białka, korzystnie oligopeptydową sekwencję rozdzielającą, która oddziela R2 od innych części białka fuzyjnego, korzystnie ST sekwencję AP.

B oznacza resztę aminokwasową Ser lub Thr

X oznacza resztę aminokwasową wybraną z grupy obejmującej Arg, Lys lub His

Z oznacza resztę aminokwasową Trp, która z resztą aminokwasową J tworzy wiązanie peptydowe o postaci -C(O)-NHa po wykorzystaniu do zaplanowanego celu tak skonstruowanego białka, odcina się docelowe białko R1, wprowadzając do środowiska, w którym znajduje się to białko, jon metalu Ni²⁺ w obecności buforu, korzystnie Tris lub Hepes, a następnie inkubuje się tak otrzymaną mieszaninę reakcyjną do całkowitego zajścia procesu hydrolizy wiązania peptydowego pomiędzy R1 i B.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako operację dla której tworzy się domenę funkcjonalną (R3)R2, stosuje się nałożenie białka fuzyjnego, obecnego w mieszaninie pochodzenia biologicznego, korzystnie lizatu komórkowego, na kolumnę powinowactwa, dla której swoista jest ta domena i odmycie pozostałych zanieczyszczeń.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że właściwą reakcję hydrolizy wiązania peptydowego przeprowadza się po odłączeniu białka fuzyjnego z kolumny, albo bezpośrednio na kolumnie.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że gdy procedurę wykonuje się w roztworze, to rozdziela się produkty reakcji hydrolizy za pomocą odpowiednich standardowych technik, natomiast po hydrolizie wiązania peptydowego na kolumnie otrzymuje się czyste białko R1 w roztworze.

PL 213 309 B1

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję peptydową R1 oznaczającą peptyd lub białko, sekwencję peptydową R2 oznaczającą peptyd lub białko zdolne do wykonywania swoistej funkcji oraz sekwencję peptydową R3, która jest obecna opcjonalnie.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję peptydową R3 zawierającą jedną, dwie lub większą liczbę reszt aminokwasowych, które oddzielają sekwencję peptydową R2 od sekwencji BXJZ, zapobiegając zakłócaniu działania swoistego dla sekwencji peptydowej R2.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję peptydową R2 zawierającą peptyd lub białko zdolne do swoistego wiązania się lub innego oddziaływania z innym komponentem lub cząsteczką.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się resztę aminokwasową J wybraną z grupy obejmującej reszty aminokwasowe Cys i His.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako resztę aminokwasową B stosuje się resztę aminokwasową Ser.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się środowisko hydrolizy zawierające jeden lub więcej komponentów, przyspieszających hydrolizę wybraną z grupy obejmującej esterazy naturalne i syntetyczne.

11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się środowisko hydrolizy zawierające jeden lub więcej komponentów, modyfikujących kowalencyjnie C-końcowy atom węgla sekwencji peptydu/białka R1, wybrany z grupy obejmującej hydroksyloaminę i jej pochodne, alkohole, fenole, tiole, aminy, fosfiny oraz inne substancje o podobnych właściwościach.