JPH02117387A - 変異型ヒトリゾチーム - Google Patents
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、組換えDNA技術による変〃′、型ヒトリゾ
チームの製造に関するものて」うる。さらに詳しくは、
本発明は、天然型ヒトリゾチーム(以下、単にヒトリゾ
チームともいう)のアミノ酸配列の第110位のバリン
がアラニンて置き換えられた変異型ヒトリゾチームをコ
ートしているHヒトリゾチーム遺伝子、該遺伝子を真核
性宿主内で発現させるための発現ベクター、践発現ベク
ターで形質転換された真核性宿主細胞、該形質転換体を
用いてヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を製造す
る方法、並びにこのようにして製造された変異型ヒトリ
ゾチームに関するものである。
チームの製造に関するものて」うる。さらに詳しくは、
本発明は、天然型ヒトリゾチーム(以下、単にヒトリゾ
チームともいう)のアミノ酸配列の第110位のバリン
がアラニンて置き換えられた変異型ヒトリゾチームをコ
ートしているHヒトリゾチーム遺伝子、該遺伝子を真核
性宿主内で発現させるための発現ベクター、践発現ベク
ターで形質転換された真核性宿主細胞、該形質転換体を
用いてヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を製造す
る方法、並びにこのようにして製造された変異型ヒトリ
ゾチームに関するものである。
従来技術および発明が解決すべき課題
リゾチームはヒトをも含めた動物の各種組織、分泌液、
卵白等に広く分布しており、一部の植物にも見出されて
いる酵素であって、細菌細胞壁のペプチドグリカンに作
用してN−アセチルムラミン酸とN−アセチルグルコサ
ミンのβ−1,4結合を加水分解することにより溶菌作
用を現す。
卵白等に広く分布しており、一部の植物にも見出されて
いる酵素であって、細菌細胞壁のペプチドグリカンに作
用してN−アセチルムラミン酸とN−アセチルグルコサ
ミンのβ−1,4結合を加水分解することにより溶菌作
用を現す。
この溶菌作用により生成される少糖を同定することによ
って、細胞壁の化学構造に関する手懸かりが得られるの
で、リゾチームは、細菌学、蛋白質化学、生化学等、様
々な研究分野において有用な酵素である。リゾチームは
ニワトリの卵白から比較的容易に高純度で単離されるた
め、ニワトリリ/チームが様々な分野でfII用されて
いる。例えば、食品保存の目的で、チーズ、ソーセージ
、水産食品などに添加されたり、牛乳のヒト母乳化の目
的で使用されている池、止血、抗炎症、組織再生、抗腫
瘍活性などの薬理活性を有することも知られており、消
炎酵素剤として市販されている。
って、細胞壁の化学構造に関する手懸かりが得られるの
で、リゾチームは、細菌学、蛋白質化学、生化学等、様
々な研究分野において有用な酵素である。リゾチームは
ニワトリの卵白から比較的容易に高純度で単離されるた
め、ニワトリリ/チームが様々な分野でfII用されて
いる。例えば、食品保存の目的で、チーズ、ソーセージ
、水産食品などに添加されたり、牛乳のヒト母乳化の目
的で使用されている池、止血、抗炎症、組織再生、抗腫
瘍活性などの薬理活性を有することも知られており、消
炎酵素剤として市販されている。
しかしながら、上記のニワトリ卵白由来のりゾチームを
含有する物質には不都合な点もあることが指摘されてい
る。特に医薬として用いると、異種タンパクに対する免
疫応答によると思われる発疹、発赤などの過敏症状がし
ばしば、副作用として発現する。従って、ヒトを対象と
する医薬の場合には、ヒト起源のリゾチームを使用する
ことが好ましく、ヒトリゾチームの安定した供給が待た
れている。また、リゾチームの生理学的作用に関する研
究を押し進めるためにも、ヒトリゾチームの大量供給が
必要である。
含有する物質には不都合な点もあることが指摘されてい
る。特に医薬として用いると、異種タンパクに対する免
疫応答によると思われる発疹、発赤などの過敏症状がし
ばしば、副作用として発現する。従って、ヒトを対象と
する医薬の場合には、ヒト起源のリゾチームを使用する
ことが好ましく、ヒトリゾチームの安定した供給が待た
れている。また、リゾチームの生理学的作用に関する研
究を押し進めるためにも、ヒトリゾチームの大量供給が
必要である。
しかしながら、ヒトの人乳や涙液から単離、精製し得る
ヒトリゾチームの量は僅かである。従って、上記の治療
、あるいは生体内機能に関する研究推進のためにも、遺
伝子組換え技術を利用したヒトリゾチーム製造手段の確
立が強く望まれている。
ヒトリゾチームの量は僅かである。従って、上記の治療
、あるいは生体内機能に関する研究推進のためにも、遺
伝子組換え技術を利用したヒトリゾチーム製造手段の確
立が強く望まれている。
このような状況の下、遺伝子組換え技術を利用してヒト
リゾチームを生産し、安定供給する試みがなされてきた
。ヒトリゾチームタンパク質は130個のアミノ酸から
なり、その配列は公知である[日本生化学全編、生化学
データブ・7り巻1. 189頁(1979)j。この
アミノ酸配列に基いて、ヒトリゾチームをコードするD
NAが化学合成されている[1 kehara、 M、
ら、ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・プリ
テン(Chem、 P harm、 Bull、)34
.2202(+986)]。従って、この公知のDNA
塩基配列を利用してヒトリゾチーム発現ベクターを構築
し、適当な宿主に導入して?IJられた形質転換体を培
養することにより、大型にヒトリゾチームを得ることか
できると考えられる。例えば、ムラキ(Muraki)
らは大腸菌を宿主としてヒトリゾチームの直接発現を試
みた[Muraki、 M、ら、アグリカルチュラル・
アンド・バイオロジカル・ケミストリー(A gric
、 B iol、 Chet )赳、713(1986
)]。しかしながら、直直接税ではヒトリゾチーム活性
を有するタンパク質を得ることができなかった。ジガミ
らは、酵母を宿主とする分泌系発現で、活性のあるヒト
リゾチームを得た[ J igami、 Y 、 ら
、ジーン(Gene)土J1273(1986)コが、
生産量(菌体内外の総和)が少ない上、生産量中に占め
る分泌量の比率は55〜65%程度であって、十分なも
のではなかった。
リゾチームを生産し、安定供給する試みがなされてきた
。ヒトリゾチームタンパク質は130個のアミノ酸から
なり、その配列は公知である[日本生化学全編、生化学
データブ・7り巻1. 189頁(1979)j。この
アミノ酸配列に基いて、ヒトリゾチームをコードするD
NAが化学合成されている[1 kehara、 M、
ら、ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・プリ
テン(Chem、 P harm、 Bull、)34
.2202(+986)]。従って、この公知のDNA
塩基配列を利用してヒトリゾチーム発現ベクターを構築
し、適当な宿主に導入して?IJられた形質転換体を培
養することにより、大型にヒトリゾチームを得ることか
できると考えられる。例えば、ムラキ(Muraki)
らは大腸菌を宿主としてヒトリゾチームの直接発現を試
みた[Muraki、 M、ら、アグリカルチュラル・
アンド・バイオロジカル・ケミストリー(A gric
、 B iol、 Chet )赳、713(1986
)]。しかしながら、直直接税ではヒトリゾチーム活性
を有するタンパク質を得ることができなかった。ジガミ
らは、酵母を宿主とする分泌系発現で、活性のあるヒト
リゾチームを得た[ J igami、 Y 、 ら
、ジーン(Gene)土J1273(1986)コが、
生産量(菌体内外の総和)が少ない上、生産量中に占め
る分泌量の比率は55〜65%程度であって、十分なも
のではなかった。
本発明者らは、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質
を効率良く生産することを目的として、卵白リゾチーム
のシグナルペプチド(こ修飾を施し、形質転換された酵
母宿主内で発現された該タンパク質を効率よく分泌させ
るリーダー配列を得た(特願昭62−069764号お
よび特願昭62−69765号)。
を効率良く生産することを目的として、卵白リゾチーム
のシグナルペプチド(こ修飾を施し、形質転換された酵
母宿主内で発現された該タンパク質を効率よく分泌させ
るリーダー配列を得た(特願昭62−069764号お
よび特願昭62−69765号)。
一方では、本発明者らは、天然型ヒトリゾチームのアミ
ノ酸配列に修飾を施し、活性の高い変異型ヒトリゾチー
ムを得ることを目的として研究を重ね、第77位と第9
5位のシスティンをアラニンで置き換えることにより、
分泌効率が高く、生産性の増大された変異型ヒトリゾチ
ームを得ることに成功した(特願昭62−245284
号)。
ノ酸配列に修飾を施し、活性の高い変異型ヒトリゾチー
ムを得ることを目的として研究を重ね、第77位と第9
5位のシスティンをアラニンで置き換えることにより、
分泌効率が高く、生産性の増大された変異型ヒトリゾチ
ームを得ることに成功した(特願昭62−245284
号)。
さらに、本発明者らは、より高活性の変異型ヒトリゾチ
ームを安定して得るために継続して検討をmねできたが
、その過程において、110位のバリンが酵素活性に及
ぼす影響に着目するに至った。即ち、110位バリンを
他のアミノ酸に変えると、基質との結合の強さを変化さ
せずに、比活性のみを変化させ得るということを予測さ
せる実験データーを得た。この結果に基き、110位バ
リンを様々なアミノ酸置換し、酵素活性に及ぼす影響を
調べた。そのような置換による突然変異誘発は、遺伝子
組換え技術に係る分野においては通常の技術であり、当
業者は、既知の方法で、容易に行うことができる。従っ
て、どのようなアミノ酸を用いるかが最も重要な課題で
ある。本発明は、目的に適ったアミノ酸を見出し、それ
を用いて高活性な変異型ヒトリゾチームを得ることに成
功した結果、完成されたものである。
ームを安定して得るために継続して検討をmねできたが
、その過程において、110位のバリンが酵素活性に及
ぼす影響に着目するに至った。即ち、110位バリンを
他のアミノ酸に変えると、基質との結合の強さを変化さ
せずに、比活性のみを変化させ得るということを予測さ
せる実験データーを得た。この結果に基き、110位バ
リンを様々なアミノ酸置換し、酵素活性に及ぼす影響を
調べた。そのような置換による突然変異誘発は、遺伝子
組換え技術に係る分野においては通常の技術であり、当
業者は、既知の方法で、容易に行うことができる。従っ
て、どのようなアミノ酸を用いるかが最も重要な課題で
ある。本発明は、目的に適ったアミノ酸を見出し、それ
を用いて高活性な変異型ヒトリゾチームを得ることに成
功した結果、完成されたものである。
課題を解決するための手段
即ち、本発明は、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列
の第110位のバリンがアラニンで置き換えられている
ポリペプチドをコードしている変異ヒトリゾチーム遺伝
子を提供するものである。
の第110位のバリンがアラニンで置き換えられている
ポリペプチドをコードしている変異ヒトリゾチーム遺伝
子を提供するものである。
また本発明は、変異りゾチーム遺伝子とシグナルペプチ
ドをコードしているヌクレオチド配列とを含有し、真核
生物内で自律的に複製可能な発現ベクターを提供するも
のである。
ドをコードしているヌクレオチド配列とを含有し、真核
生物内で自律的に複製可能な発現ベクターを提供するも
のである。
さらに本発明は、上記発現ベクターで形質転換され、変
異型ヒトリゾチームを産生し、分泌し得る形質転換体、
並びに、該形質転換体を培養し、培養液中に分泌された
ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を分離し、所望
により精製することからなる変異型ヒトリゾチームの製
造方法、およびこのようにして製造された変異型ヒトリ
ゾチームを提供するものである。
異型ヒトリゾチームを産生し、分泌し得る形質転換体、
並びに、該形質転換体を培養し、培養液中に分泌された
ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質を分離し、所望
により精製することからなる変異型ヒトリゾチームの製
造方法、およびこのようにして製造された変異型ヒトリ
ゾチームを提供するものである。
本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子の調製、該遺伝子を
含有する発現ベクターの構築、該発現ベクターによる宿
主細胞の形質転換、および得られた形質転換体を用いる
変異型ヒトリゾチームの製造は、全て本出願人の出願に
係る特願昭62−245284号および特願昭63−2
26873号に開示した方法に準じて行われた。
含有する発現ベクターの構築、該発現ベクターによる宿
主細胞の形質転換、および得られた形質転換体を用いる
変異型ヒトリゾチームの製造は、全て本出願人の出願に
係る特願昭62−245284号および特願昭63−2
26873号に開示した方法に準じて行われた。
即ち、第1図に示すように、天然のヒトリゾチームのア
ミノ酸配列をコードしている合成遺伝子を含有する公知
のプラスミドpGEL125[ヨシムラ(K、 Yos
himura)バイオケミカル・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション(Biochem、 B
1ophys、 Res、 Coffimun、 )
l 45.712(1987)]から、シグナルペプチ
ドの上流にのみXh。
ミノ酸配列をコードしている合成遺伝子を含有する公知
のプラスミドpGEL125[ヨシムラ(K、 Yos
himura)バイオケミカル・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション(Biochem、 B
1ophys、 Res、 Coffimun、 )
l 45.712(1987)]から、シグナルペプチ
ドの上流にのみXh。
I認識部位を有するプラスミドpERI 8602を
得る。
得る。
次いで、プラスミドpERI 8602から、シグナ
ルペプチドとヒトリゾチームとをコードしているヌクレ
オチド配列を含んだXhol −3IIlal断片を切
り出し、これを、M13mp18RF[M13mpファ
ージDNAの複製型(RF)]にXhol認識部位を挿
入したファージDNAの大きい方のXhol−3mal
断片と連結(ライゲーション)することにより、シグナ
ルペプチドとヒトリゾチームとをコードしている一本鎖
ファージDNAである、M 13mpl 8 XhL
ZMを得る(第2図参照)。
ルペプチドとヒトリゾチームとをコードしているヌクレ
オチド配列を含んだXhol −3IIlal断片を切
り出し、これを、M13mp18RF[M13mpファ
ージDNAの複製型(RF)]にXhol認識部位を挿
入したファージDNAの大きい方のXhol−3mal
断片と連結(ライゲーション)することにより、シグナ
ルペプチドとヒトリゾチームとをコードしている一本鎖
ファージDNAである、M 13mpl 8 XhL
ZMを得る(第2図参照)。
このM13mp18XhLZMのEcoRI −Xho
[断片を、pBR322XのEcoRI −Xhol断
片とライゲーションしてpBR322XhLZM(BC
)を構築する。PBR322XhLZM(BC)の構築
模式図を第3図に示す。
[断片を、pBR322XのEcoRI −Xhol断
片とライゲーションしてpBR322XhLZM(BC
)を構築する。PBR322XhLZM(BC)の構築
模式図を第3図に示す。
一方、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第110
位のバリンがアラニンで置換されたアミノ酸配列部分を
コードしている2本鎖合成オリゴマーを合成し、該合成
オリゴマーを、pBR322XhLZM(BC)のBa
mHl−C1al断片とライゲーションしてpBR32
2XhLLZM(Ala目0)を得る。pBR322X
hLZM(Ala”’°)の構築模式図を第4図に示す
。
位のバリンがアラニンで置換されたアミノ酸配列部分を
コードしている2本鎖合成オリゴマーを合成し、該合成
オリゴマーを、pBR322XhLZM(BC)のBa
mHl−C1al断片とライゲーションしてpBR32
2XhLLZM(Ala目0)を得る。pBR322X
hLZM(Ala”’°)の構築模式図を第4図に示す
。
このDNAからシグナルペプチドと変異型ヒトリゾチー
ムをコードしているXhol −3mal断片を切り出
し、上記プラスミドpERI 8602の9.5kb
Xhol−5mal断片とライゲーションし、変異型
ヒトリゾチーム発現ベクター、プラスミドpERI
8852を構築する。プラスミドpER+ 8852
の構築模式図、並びに制限酵素切断地図を第5図に示す
。
ムをコードしているXhol −3mal断片を切り出
し、上記プラスミドpERI 8602の9.5kb
Xhol−5mal断片とライゲーションし、変異型
ヒトリゾチーム発現ベクター、プラスミドpERI
8852を構築する。プラスミドpER+ 8852
の構築模式図、並びに制限酵素切断地図を第5図に示す
。
以上に概説した一連の操作における個々の操作は当業者
によ(知られている。例えば、DNAのクローニング等
における大腸菌の形質転換は、シーエン(Cohen)
らの方法[Cohen、 S 、 N ら、プロシー
ジング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス(Proc、Natl、Acad、Sci、U
SA)69.2110(1972)]によって行うこと
ができる。大腸菌宿主としてはE、coli294、E
、coliDHl、 E、coliW3110、E、c
oliC600などを用いることができる。
によ(知られている。例えば、DNAのクローニング等
における大腸菌の形質転換は、シーエン(Cohen)
らの方法[Cohen、 S 、 N ら、プロシー
ジング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス(Proc、Natl、Acad、Sci、U
SA)69.2110(1972)]によって行うこと
ができる。大腸菌宿主としてはE、coli294、E
、coliDHl、 E、coliW3110、E、c
oliC600などを用いることができる。
また、形質転換体から、所望の遺伝子が挿入されたプラ
スミドDNAを単離するには、アルカリ抽出法[B i
rnboim、 H、C、およびDoly、 J−、
ヌクレイツク・アシ、ズ・リサーチ(Nucleic
Ac1dsRes、 )7.1513(1979)]等
を利用することができる。次いで、プラスミドDNAを
適当な制限酵素で処理することによって、挿入された該
遺伝子を切り出し、たとえばアガロースゲル電気泳動あ
るいはポリアクリルアミド電気泳動によってこれを単離
する。これらの一連の操作は公知であり、文献、例えば
[モレキュラー・クローニング(Molecular
Ctoning)(1982)、 Co1d S pr
ing Harbor Laboratoryjに詳し
く記載されている。
スミドDNAを単離するには、アルカリ抽出法[B i
rnboim、 H、C、およびDoly、 J−、
ヌクレイツク・アシ、ズ・リサーチ(Nucleic
Ac1dsRes、 )7.1513(1979)]等
を利用することができる。次いで、プラスミドDNAを
適当な制限酵素で処理することによって、挿入された該
遺伝子を切り出し、たとえばアガロースゲル電気泳動あ
るいはポリアクリルアミド電気泳動によってこれを単離
する。これらの一連の操作は公知であり、文献、例えば
[モレキュラー・クローニング(Molecular
Ctoning)(1982)、 Co1d S pr
ing Harbor Laboratoryjに詳し
く記載されている。
DNAの化学合成は、たとえばc rcaらの方法[C
rea、R,ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス(Proc、Nat
l、Acad、sci、USA)75.765(197
8)]などに従って行うことができる。
rea、R,ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス(Proc、Nat
l、Acad、sci、USA)75.765(197
8)]などに従って行うことができる。
さらに、DNAの所望の部位に、特異的に変異を起こさ
せるためには、市販のキット(例えばアマ−ジャム社製
キットなど)が用いられ、その配列の確認には、ジデオ
キシヌクレオチド合成鎖停止法[S anger、 F
、 ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス(Proc、Natl、
Acad、Sci、)USA、74.5463(197
7)]が用いられる。
せるためには、市販のキット(例えばアマ−ジャム社製
キットなど)が用いられ、その配列の確認には、ジデオ
キシヌクレオチド合成鎖停止法[S anger、 F
、 ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス(Proc、Natl、
Acad、Sci、)USA、74.5463(197
7)]が用いられる。
本発明の発現プラスミドは、真核細胞内で自律的に複製
可能な発現ベクター群の内から選択されたベクターのプ
ロモーターの下流に、シグナルペプチドをコードしてい
る遺伝子と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連結させて挿入
することにより組立てられる。本明細書では、GLDプ
ロモーターヲ用い、天然型ヒトリゾチームをコードして
いる発現プラスミドpERI 8602を使用して本
発明の発現プラスミドの構築例を示したが、その他、プ
ラスミドpPHO17、pc D X [Okayam
a、 HおよびBerg、P、モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー(Mo1. Cel 1. B
iol、 ) 3.280(1983)]、pKSV
−1o(ファルマシア社製)なども利用し得る。
可能な発現ベクター群の内から選択されたベクターのプ
ロモーターの下流に、シグナルペプチドをコードしてい
る遺伝子と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連結させて挿入
することにより組立てられる。本明細書では、GLDプ
ロモーターヲ用い、天然型ヒトリゾチームをコードして
いる発現プラスミドpERI 8602を使用して本
発明の発現プラスミドの構築例を示したが、その他、プ
ラスミドpPHO17、pc D X [Okayam
a、 HおよびBerg、P、モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー(Mo1. Cel 1. B
iol、 ) 3.280(1983)]、pKSV
−1o(ファルマシア社製)なども利用し得る。
酵母宿主の場合には、プロモーターとして、たとえばP
H05プロモーター、GLDプロモータ、PGKプロ
モーター、A D HプロモーターPH081プロモー
ター、GALIプロモーターGALIOプロモーターな
どが、動物細胞宿主を用いた場合には、プロモーターと
して、たとえば5V4Q初期遺伝子プロモーター、メタ
ロチオネインプロモーター、ヒートショソタブロモータ
ーなどがそれぞれ利用できる。なお発現にエンハンサ−
の利用も効果的である。
H05プロモーター、GLDプロモータ、PGKプロ
モーター、A D HプロモーターPH081プロモー
ター、GALIプロモーターGALIOプロモーターな
どが、動物細胞宿主を用いた場合には、プロモーターと
して、たとえば5V4Q初期遺伝子プロモーター、メタ
ロチオネインプロモーター、ヒートショソタブロモータ
ーなどがそれぞれ利用できる。なお発現にエンハンサ−
の利用も効果的である。
本発明のプラスミドpER+ 8852は、酵母宿主
内で変異型ヒ) IJゾチームを発現させ、分泌させる
のに好適である。とくに好ましい宿主はサッカ0?イセ
ス・セレビシェ(S accharomyces ce
revisiae)A H22R−である。
内で変異型ヒ) IJゾチームを発現させ、分泌させる
のに好適である。とくに好ましい宿主はサッカ0?イセ
ス・セレビシェ(S accharomyces ce
revisiae)A H22R−である。
本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子を、動物細胞用ベク
ターに挿入することにより、マウスLt(El胞、チャ
イシーズハムスター卵母細胞(CHO)、さらには他の
真核細胞を宿主として用い得る。
ターに挿入することにより、マウスLt(El胞、チャ
イシーズハムスター卵母細胞(CHO)、さらには他の
真核細胞を宿主として用い得る。
真核細胞の形質転換方法は当業者既知であり、例えば酵
母の形質転換は、ヒ不ン(Hinnen)らの方法[プ
ロシージンゲス・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス(P roe、 N at 1.ΔC
ad、Sci、USA)75S 1927(1978)
]により、また、真核細胞の形質転換は、「蛋白質・核
酸・酵素・28巻、1983年、“組み換え遺伝子の細
胞への導入と発現”(共立出版)」記載の方法で行うこ
とができる。
母の形質転換は、ヒ不ン(Hinnen)らの方法[プ
ロシージンゲス・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス(P roe、 N at 1.ΔC
ad、Sci、USA)75S 1927(1978)
]により、また、真核細胞の形質転換は、「蛋白質・核
酸・酵素・28巻、1983年、“組み換え遺伝子の細
胞への導入と発現”(共立出版)」記載の方法で行うこ
とができる。
形質転換体の培養も、当業者既知の方法のいずれを用い
ても行うことができる。
ても行うことができる。
酵母を使用する場合、培地としては、例えばバ−クホル
ダー(B urkholder)最小培地[ボスチャン
(Bostian、 K、 L、)ら、プロシージンゲ
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンスUSA、7ヱ、4505(1980)コが挙げられ
る。
ダー(B urkholder)最小培地[ボスチャン
(Bostian、 K、 L、)ら、プロシージンゲ
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンスUSA、7ヱ、4505(1980)コが挙げられ
る。
培養は通常15℃〜40°C1好ましくは24℃〜37
°Cで10〜144時間、好ましくは24〜96時間行
い、必要に応じて通気や攪拌を加えてもよい。
°Cで10〜144時間、好ましくは24〜96時間行
い、必要に応じて通気や攪拌を加えてもよい。
動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした形質転換体を
使用する場合には、培地として例えばイーグル(E a
gle)のM E M [H、E agle、サイエン
ス(Science)1旦0,432(+ 959)]
、ダルベツコ(D u 1becco)の改良イーグル
培地(Modified Eagle’s Mediu
Ill)[Orgad LaubおよびWilliam
J 、 Rutter、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー(J、Biol、Che+s、)2
58,6043(1983)]などが挙げられる。培養
は通常30〜42°C1好ましくは35℃〜37℃で約
1〜10日間行う。
使用する場合には、培地として例えばイーグル(E a
gle)のM E M [H、E agle、サイエン
ス(Science)1旦0,432(+ 959)]
、ダルベツコ(D u 1becco)の改良イーグル
培地(Modified Eagle’s Mediu
Ill)[Orgad LaubおよびWilliam
J 、 Rutter、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー(J、Biol、Che+s、)2
58,6043(1983)]などが挙げられる。培養
は通常30〜42°C1好ましくは35℃〜37℃で約
1〜10日間行う。
培養終了後、当業者既知の方法で細胞と上清とを分離す
る。本発明の発現ベクターによれば、生成した変異型ヒ
トリゾチームは効率良く分泌されるので、上清から得ら
れるが、細胞内に残存する場合には、当分野における通
常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレスなどを
利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵
素による破砕法などにより細胞を破砕した後抽出する。
る。本発明の発現ベクターによれば、生成した変異型ヒ
トリゾチームは効率良く分泌されるので、上清から得ら
れるが、細胞内に残存する場合には、当分野における通
常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレスなどを
利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵
素による破砕法などにより細胞を破砕した後抽出する。
さらに必要ならば、トリトン−X100、デオキシシー
レートなどの界面活性剤を加え、産生された変異型ヒト
リゾチームを抽出する。得られた変異型ヒトリゾチーム
は、通常のタンパク質精製法、例えば塩析、等電点沈澱
、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー(HPLC,FPLC等)などに従
って精製することができる。
レートなどの界面活性剤を加え、産生された変異型ヒト
リゾチームを抽出する。得られた変異型ヒトリゾチーム
は、通常のタンパク質精製法、例えば塩析、等電点沈澱
、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー(HPLC,FPLC等)などに従
って精製することができる。
このようにして得られた形質転換体培養物から分離した
培養上清並びに菌体中のヒトリゾチームを精製単離し、
その活性を後述のアッセイ法で測定し、比活性を求めた
ところ、天然型のヒトリゾチームをコードしている発現
ベクターを用いて調製された形質転換体の場合と比較す
ると、本発明の変異型ヒトリゾチーム形質転換体は、従
来のものよりも高い比活性を有するタンパク質を生産す
ることが分かった。
培養上清並びに菌体中のヒトリゾチームを精製単離し、
その活性を後述のアッセイ法で測定し、比活性を求めた
ところ、天然型のヒトリゾチームをコードしている発現
ベクターを用いて調製された形質転換体の場合と比較す
ると、本発明の変異型ヒトリゾチーム形質転換体は、従
来のものよりも高い比活性を有するタンパク質を生産す
ることが分かった。
即ち、本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子を含んだ発現
ベクターを適当な宿主に導入し、得られた形質転換体を
適当な条件下で培養し、培養上清のヒトリゾチーム活性
を有するタンパク質を単離し、所望により常法にしたが
って精製することにより、容易かつ簡便に一定した、高
活性の、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質(変異
型ヒトリゾチーム)を得ることができる。
ベクターを適当な宿主に導入し、得られた形質転換体を
適当な条件下で培養し、培養上清のヒトリゾチーム活性
を有するタンパク質を単離し、所望により常法にしたが
って精製することにより、容易かつ簡便に一定した、高
活性の、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質(変異
型ヒトリゾチーム)を得ることができる。
以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。
尚、以下の実施例は単なる例示にすぎず、如何なる意味
においても、本発明を制限するものではない。
においても、本発明を制限するものではない。
実m例1 クローニングベクターpBR322Xの構築
大腸菌ベクターpBR322(5μg)に制限酵素Ba
1l(1,5ユニツト)を加え、40a(lの反応液[
10mM Tris−HCI(pH7,5)、10m
MMgC1,,1mMジチオスレイトール]中で37℃
、5時間反応させた後、常法通りフェノール抽出し、次
いで、DNAをエタノール沈殿させた。このDNAにリ
ン酸化したX ho Iリンカ−d[pCCT CGA
GG][ニュー・イングランド・バイオラホ(NEB)
社製150ngを加え、常法に従ってT4DNリガーゼ
で両者を結合させた。
1l(1,5ユニツト)を加え、40a(lの反応液[
10mM Tris−HCI(pH7,5)、10m
MMgC1,,1mMジチオスレイトール]中で37℃
、5時間反応させた後、常法通りフェノール抽出し、次
いで、DNAをエタノール沈殿させた。このDNAにリ
ン酸化したX ho Iリンカ−d[pCCT CGA
GG][ニュー・イングランド・バイオラホ(NEB)
社製150ngを加え、常法に従ってT4DNリガーゼ
で両者を結合させた。
この反応液で大腸菌DHI株を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性コロニーから、
アルカリ抽出法でプラスミドを抽出し、Ba1l認識部
位がXhol認識部位に変換されたプラスミドpBR3
22Xを得た。
ンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性コロニーから、
アルカリ抽出法でプラスミドを抽出し、Ba1l認識部
位がXhol認識部位に変換されたプラスミドpBR3
22Xを得た。
実施例2 プラスミドpERI 8602の構築i)
1.6kb、 8.3kb断片の調製BamHI
用緩衝液[6mM T ris −HC1(pH79)
、150mM NaCI、 6mM MgC1,] 1
00μe中で化学合成したヒトリゾチーム遺伝子を含有
しているプラスミドpGEL125[ヨンムラ(K 、
Y oshimura)前掲]48.5μgに600
のBamHl(ベーリンガーマンハイム山之内製)を加
えて37°Cで2時間反応させたのち、常法通り、冷エ
タノールを加えてDNAを集めた。このDNAを、上記
BamHI用緩衝液(100,cl)中で40UのXh
ol(ベーリンガーマンハイム山之内)を加えて37℃
で15分間部分消化したのち、60°Cで15分間加熱
して反応を停止させた。この反応液を07%アガロース
電気泳動にかけ、1.6kb断片を含むゲルを切り取り
、電気泳動溶出によってゲルから抽出した。
1.6kb、 8.3kb断片の調製BamHI
用緩衝液[6mM T ris −HC1(pH79)
、150mM NaCI、 6mM MgC1,] 1
00μe中で化学合成したヒトリゾチーム遺伝子を含有
しているプラスミドpGEL125[ヨンムラ(K 、
Y oshimura)前掲]48.5μgに600
のBamHl(ベーリンガーマンハイム山之内製)を加
えて37°Cで2時間反応させたのち、常法通り、冷エ
タノールを加えてDNAを集めた。このDNAを、上記
BamHI用緩衝液(100,cl)中で40UのXh
ol(ベーリンガーマンハイム山之内)を加えて37℃
で15分間部分消化したのち、60°Cで15分間加熱
して反応を停止させた。この反応液を07%アガロース
電気泳動にかけ、1.6kb断片を含むゲルを切り取り
、電気泳動溶出によってゲルから抽出した。
同様の方法で48.5μgのpGEL125を600<
7)BamHIで消化し、常法に従ってエタノールでD
NAを沈澱させた。このDNAにBamH1用緩衝液中
で80UのXholを37°Cで2時間作用させたのち
、前記1.6kb断片と全く同様の方l去で、プラスミ
ドpGEL125からプロモータ、シグナル配列、およ
びヒトリゾチームコード領域が除去された8、3kbの
BamHI−Xhol断片を調製した。
7)BamHIで消化し、常法に従ってエタノールでD
NAを沈澱させた。このDNAにBamH1用緩衝液中
で80UのXholを37°Cで2時間作用させたのち
、前記1.6kb断片と全く同様の方l去で、プラスミ
ドpGEL125からプロモータ、シグナル配列、およ
びヒトリゾチームコード領域が除去された8、3kbの
BamHI−Xhol断片を調製した。
)Smal認識配列を含む合成オリゴマーの調製pGE
L125のヒトリゾチーム遺伝子の3′末端側のXho
l切断部位をSw+al切断部位に変換するために、常
法に従い、” T CG A CCCG G G ”を
合成した。
L125のヒトリゾチーム遺伝子の3′末端側のXho
l切断部位をSw+al切断部位に変換するために、常
法に従い、” T CG A CCCG G G ”を
合成した。
1ii) 1.6kb断片と合成オリゴマーの連結i
i)で得た合成オリゴ? (100ng)と1 、6
kb断片(2μg)を20μQのライゲーション用緩
衝液[50mM Tris−HCI(pH7,8)、1
0 ’IIIM M gCl、、20−Mジチオスレイ
トール(DTT)、1mMATP]に溶かし、T4DN
Aリガーゼ(NEB製)8000を加えて14°Cで一
夜反応させ、DNAを結合させた。常法に従い、エタノ
ールを加えてDNAを集めたのち、lOOμQのBam
HI用緩衛液に溶かし、36UのBamHIを加えて3
7°Cで1時間反応させ、同様にエタノールを加えてD
NAを集めた。次にこのDNAを50μQのSmal用
緩衝波緩衝液mM KCI、10mM Tris−HC
I(pH8,0)、10 mM MgCIt、1mMD
TT]に溶かし、21UのS+IIal(宝酒造製)を
加えて30℃で1時間反応させた。これを0.7%アガ
ロース電気泳動にかけ、常法通り所望の部分を切り出し
、電気泳動溶出によって1.5kbのBamHI−Sm
al断片を得た。
i)で得た合成オリゴ? (100ng)と1 、6
kb断片(2μg)を20μQのライゲーション用緩
衝液[50mM Tris−HCI(pH7,8)、1
0 ’IIIM M gCl、、20−Mジチオスレイ
トール(DTT)、1mMATP]に溶かし、T4DN
Aリガーゼ(NEB製)8000を加えて14°Cで一
夜反応させ、DNAを結合させた。常法に従い、エタノ
ールを加えてDNAを集めたのち、lOOμQのBam
HI用緩衛液に溶かし、36UのBamHIを加えて3
7°Cで1時間反応させ、同様にエタノールを加えてD
NAを集めた。次にこのDNAを50μQのSmal用
緩衝波緩衝液mM KCI、10mM Tris−HC
I(pH8,0)、10 mM MgCIt、1mMD
TT]に溶かし、21UのS+IIal(宝酒造製)を
加えて30℃で1時間反応させた。これを0.7%アガ
ロース電気泳動にかけ、常法通り所望の部分を切り出し
、電気泳動溶出によって1.5kbのBamHI−Sm
al断片を得た。
1V)8.3kb断片と合成オリコマ−の連結iii
)と全く同様にして、lμgの8.3kb断片と110
0nの合成オリゴマーとを連結したのら、同様にBam
HI、およびSmalで処理して電気泳動にかけ8.3
kbの13 aml−I I −S ma f断片を得
た。
)と全く同様にして、lμgの8.3kb断片と110
0nの合成オリゴマーとを連結したのら、同様にBam
HI、およびSmalで処理して電気泳動にかけ8.3
kbの13 aml−I I −S ma f断片を得
た。
v)1.6kbBam)目−S ma I断片と8.3
kbBamH1−Smal断片との連結 iv)で得た8、3kb断片(120ng)と1.6k
b断片(360ng)を100μQのライゲージクン川
緩li液((iii)ニ同じ)中T800UのT4DN
Aリガーゼ(NEB製)を加えて14°C−夜反応させ
た。
kbBamH1−Smal断片との連結 iv)で得た8、3kb断片(120ng)と1.6k
b断片(360ng)を100μQのライゲージクン川
緩li液((iii)ニ同じ)中T800UのT4DN
Aリガーゼ(NEB製)を加えて14°C−夜反応させ
た。
そのl / 5 !itを用いてE、coli Dll
1を形11転換し、プラスミドpER18602を1
1)だ。
1を形11転換し、プラスミドpER18602を1
1)だ。
プラスミドpGE1.125およびプラスミドpER+
8602の制限nマ素切断地図およびプラスミドp
lR18602の構築模式図を第1図に示す。
8602の制限nマ素切断地図およびプラスミドp
lR18602の構築模式図を第1図に示す。
lJf!JI3 M13mp18XhLZMの構築)
ヒトリゾチーム遺伝子を含むXhol −Smal断片
の調製 実施例2で調製したプラスミドpERI 8602
1100nを実施例2記載の方法に従ってXh。
ヒトリゾチーム遺伝子を含むXhol −Smal断片
の調製 実施例2で調製したプラスミドpERI 8602
1100nを実施例2記載の方法に従ってXh。
1.5IIlalで切断し、シグナル配列フード領域お
よびヒトリゾチーム遺伝子を含むXhol −Smal
断片を調製した。
よびヒトリゾチーム遺伝子を含むXhol −Smal
断片を調製した。
)Ml 3mpl 8へのXhol制限部位の導入M1
3mp18の複製型(RF)(宝酒造製)2.4μgを
30uQのHindIIl用緩衝液[50mM NaC
1,10mM Tris−HCI(pH7,5)、10
n+M MgCl2.1mMDTT]中で27UのHi
ndr[l(ベーリンガーマンハイム山之内製)と37
°Cで2時間反応させたのち、常法通り冷エタノールを
加えてDNAを沈澱させた。
3mp18の複製型(RF)(宝酒造製)2.4μgを
30uQのHindIIl用緩衝液[50mM NaC
1,10mM Tris−HCI(pH7,5)、10
n+M MgCl2.1mMDTT]中で27UのHi
ndr[l(ベーリンガーマンハイム山之内製)と37
°Cで2時間反応させたのち、常法通り冷エタノールを
加えてDNAを沈澱させた。
一方、常法に従って合成した2本のオリゴマー5°TC
GAGGCCA”°(100ng)および”AGCTT
GGCC(loOng)をATPを含まないライゲーシ
ョン用緩衝液(前出)20μQ中て80°C15分処理
したのち、室温まで徐々に冷却して二本鎖とした。この
反応液に上で得たHindIII処理したM13mpl
8RF500ngとATPをlaMとなるように加え
、14°Cで一夜反応させた。次にこのl/10型をE
、coliTG lに感染させ、常法に従いXhol切
断部位をもったM13mp18RFを得た。この5μg
を実施例2、iii )記載の方法でXholおよびS
aha Iで処理し、エタノールで沈澱させた。
GAGGCCA”°(100ng)および”AGCTT
GGCC(loOng)をATPを含まないライゲーシ
ョン用緩衝液(前出)20μQ中て80°C15分処理
したのち、室温まで徐々に冷却して二本鎖とした。この
反応液に上で得たHindIII処理したM13mpl
8RF500ngとATPをlaMとなるように加え
、14°Cで一夜反応させた。次にこのl/10型をE
、coliTG lに感染させ、常法に従いXhol切
断部位をもったM13mp18RFを得た。この5μg
を実施例2、iii )記載の方法でXholおよびS
aha Iで処理し、エタノールで沈澱させた。
iii)Ml 3mpl 8XhLZMの構築i)で調
製したXhol −3mal断片300ngとii)で
調製したM13mp18を含む大きいXhol−S m
a i断片1100nとを50μQのライゲージコン用
緩1i液(前出)中400Llの74DNAリガーゼ(
NEB製)と14°Cで一夜反応させ、その115ri
tをE、coliTG lに感染させ、M13mp18
XhLZMRFを得た。
製したXhol −3mal断片300ngとii)で
調製したM13mp18を含む大きいXhol−S m
a i断片1100nとを50μQのライゲージコン用
緩1i液(前出)中400Llの74DNAリガーゼ(
NEB製)と14°Cで一夜反応させ、その115ri
tをE、coliTG lに感染させ、M13mp18
XhLZMRFを得た。
M13+p18XhLZMの構築模式図を第2図に示す
。
。
実施例4 ヒトリゾチーム遺伝子へのB ant−1l
オよびC1al認識部位の造成 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の110位バリン
を池のアミノ酸に変換するために、オリゴヌクレオチド
−デイレクチイツト、インビトロ、ムタゲネシスシステ
ム(了マージャム社製キット)を用い、カセット式変異
法で、上記110位バリンをコードするコドンの両側に
Ba@HlおよびC1al認識部位を造成した。
オよびC1al認識部位の造成 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の110位バリン
を池のアミノ酸に変換するために、オリゴヌクレオチド
−デイレクチイツト、インビトロ、ムタゲネシスシステ
ム(了マージャム社製キット)を用い、カセット式変異
法で、上記110位バリンをコードするコドンの両側に
Ba@HlおよびC1al認識部位を造成した。
i ) Baall I認識部位およびC1al認識部
位造成のためのオリゴマーの合成 常法に従って次のオリゴマー(50マー)を合成した。
位造成のためのオリゴマーの合成 常法に従って次のオリゴマー(50マー)を合成した。
(T) (TXA)
GAGCCTGGGTCGCTTGGAにA(0犯)
Xは変更後の塩基を、()内は本来の塩基を示す。
また、下線は、5゛側から順番に、新たに造成されたB
amHI認識部位およびC1al認識部位を示す。なお
、この変換でもコードするアミノ酸の種類はもとのまま
である。
amHI認識部位およびC1al認識部位を示す。なお
、この変換でもコードするアミノ酸の種類はもとのまま
である。
上線で示したGTCコドンは、110位バリンをコード
している。
している。
11)アニーリングおよびライゲージジン実施1r13
で得たMl 3mpl 8XhLZMの単鎖DNAl0
μ9を含む溶液(5μQ)、5°をリン酸化したオリゴ
マー(〜1.6pmol/μc)(5μm2)、緩衝液
1(7μQ)および水(17μQ)を混合し、80°C
で3分間処理したのち、室温で30分間放置した。この
反応液にMgC+7(10μQ)、ヌクレオチド混液1
(38μ12)、水(10μQ)、クレノーフラグメン
)(121J)、T4DNAリガーゼ(12U)を加え
、14°Cで一夜反応させた。反応液をニトロセルロー
スフィルターで濾過し、未反応のfll鎖D N Aを
除去したのち、常法に従いエタノールでDNAを沈澱さ
せ、50μQの緩衝液2に溶解した。
で得たMl 3mpl 8XhLZMの単鎖DNAl0
μ9を含む溶液(5μQ)、5°をリン酸化したオリゴ
マー(〜1.6pmol/μc)(5μm2)、緩衝液
1(7μQ)および水(17μQ)を混合し、80°C
で3分間処理したのち、室温で30分間放置した。この
反応液にMgC+7(10μQ)、ヌクレオチド混液1
(38μ12)、水(10μQ)、クレノーフラグメン
)(121J)、T4DNAリガーゼ(12U)を加え
、14°Cで一夜反応させた。反応液をニトロセルロー
スフィルターで濾過し、未反応のfll鎖D N Aを
除去したのち、常法に従いエタノールでDNAを沈澱さ
せ、50μQの緩衝液2に溶解した。
iii )変異DNAを含むプラスミドによる大腸菌の
形質転換 11)で得たDNA溶液50μQの内lOμQに、65
uQの緩衝液3と5UのNci Iを加え37°Cで9
0分間反応させて変異していないDNAにニックを入れ
た。反応後さらに500aM NaC1(12μの、緩
衝液4(10μQ)、エキソヌクレアーゼl1l(50
U)(2μQ)を加えて、37°Cで30分間反応させ
、二・ツクを入れたDNAを消化した。
形質転換 11)で得たDNA溶液50μQの内lOμQに、65
uQの緩衝液3と5UのNci Iを加え37°Cで9
0分間反応させて変異していないDNAにニックを入れ
た。反応後さらに500aM NaC1(12μの、緩
衝液4(10μQ)、エキソヌクレアーゼl1l(50
U)(2μQ)を加えて、37°Cで30分間反応させ
、二・ツクを入れたDNAを消化した。
次に70°Cで15分間加熱して酵素を失活させた。冷
ill後、ヌクレオチドi11.液2(13μQ)、M
gC1tl夜(5μQ)、DNAポリメラーゼl (3
U)、T4DNAリガーゼ(2U)を加えて14°C1
’4時間反応させた。この反応液20μQを用い、E、
c。
ill後、ヌクレオチドi11.液2(13μQ)、M
gC1tl夜(5μQ)、DNAポリメラーゼl (3
U)、T4DNAリガーゼ(2U)を加えて14°C1
’4時間反応させた。この反応液20μQを用い、E、
c。
1iTGlを形質転換した。
iv)変異DNAの調製と変異の確認
I■1)で得た形質転換体をYT寒天培ttll(バタ
トトリプトン8g、バクト酵母エキス5g、NaCl2
5g、寒天15g、水1にまき、プラークを生じさせた
。プラークを採取し、E、coliTG 1に感染させ
、−ごれをYT培地で37°Cにおいて一夜、液体培養
し、培養上清を集めた。この上清1mgにPEG/Na
CI(20%ポリエチレングリコール6000.2.5
MNaC1)200μm2を加え、よく混合して15分
間放置したのち、遠心分離して上清を除去した。沈澱に
TE緩衝e、(10+nM TrisHCL 1+M
EDTA、pH8,0)(100μlりおよび、TE
緩衝液飽和フェノール(50μa>を加えてよく攪拌し
たのち、遠心分離し、水層を採取した。この水層に冷エ
タノールを加えて、単鎖DNAを沈澱させた。この単1
!li D N Aを鋳型としてジテオキンヌクレオチ
ド合成鎖停止法によって塩基配列を決定し、目的通り変
異したDNAを数種得た。
トトリプトン8g、バクト酵母エキス5g、NaCl2
5g、寒天15g、水1にまき、プラークを生じさせた
。プラークを採取し、E、coliTG 1に感染させ
、−ごれをYT培地で37°Cにおいて一夜、液体培養
し、培養上清を集めた。この上清1mgにPEG/Na
CI(20%ポリエチレングリコール6000.2.5
MNaC1)200μm2を加え、よく混合して15分
間放置したのち、遠心分離して上清を除去した。沈澱に
TE緩衝e、(10+nM TrisHCL 1+M
EDTA、pH8,0)(100μlりおよび、TE
緩衝液飽和フェノール(50μa>を加えてよく攪拌し
たのち、遠心分離し、水層を採取した。この水層に冷エ
タノールを加えて、単鎖DNAを沈澱させた。この単1
!li D N Aを鋳型としてジテオキンヌクレオチ
ド合成鎖停止法によって塩基配列を決定し、目的通り変
異したDNAを数種得た。
実施例5 変異したヒトリゾチーム遺伝子のp’BR3
22Xへの組み込み )EcoRI、Xhol認識部位を末端にもつpBR3
22Xの調製 実施例1で調製したpB R322X(3ng)l−制
限酵素EcoRI(15U)とXhol(16U)とを
加工、EcoRI緩衝i&(ベーリンガーマンハイム社
製)100μg中で37°Cにおいて2時間反応させた
後、フェノール抽出、エタノール沈殿に付し、DNA混
合物を得た。
22Xへの組み込み )EcoRI、Xhol認識部位を末端にもつpBR3
22Xの調製 実施例1で調製したpB R322X(3ng)l−制
限酵素EcoRI(15U)とXhol(16U)とを
加工、EcoRI緩衝i&(ベーリンガーマンハイム社
製)100μg中で37°Cにおいて2時間反応させた
後、フェノール抽出、エタノール沈殿に付し、DNA混
合物を得た。
得られたDNA混合物を1.0%アガロースゲル電気泳
動にかけて大きい断片を切り出し、電気泳動溶出によっ
てゲルから抽出した。
動にかけて大きい断片を切り出し、電気泳動溶出によっ
てゲルから抽出した。
)Ml 3+npl 8XhLZM(BC)からのBa
mHI。
mHI。
C1al認識部位を有するヒトリゾチーム遺伝子の調製
上記1)と同様にして、制限酵素処理、電気泳動溶出を
行い、実施例3で得たM13mp18XhLZM(BC
)(20μg)からヒトリゾチーム遺C云子を含むEc
oRI−Xhol断片を調製した。
行い、実施例3で得たM13mp18XhLZM(BC
)(20μg)からヒトリゾチーム遺C云子を含むEc
oRI−Xhol断片を調製した。
iii)pBR322XhLZM(BC)の調製1)で
得た1)BR322X(7)大きい方(II)EcoR
IXhol断片(250ng)とii)で得たヒトリゾ
チーム遺伝子を含むEcoR1−Xhol断片(120
ng)とをT4リガーゼ(800U)の存在下、14℃
で一夜反応させてライゲート(連結)した。このライゲ
ーション混合物を用いて大腸菌DHIを形質転換し、プ
ラスミドpB R322XhL ZM(BC)を得た。
得た1)BR322X(7)大きい方(II)EcoR
IXhol断片(250ng)とii)で得たヒトリゾ
チーム遺伝子を含むEcoR1−Xhol断片(120
ng)とをT4リガーゼ(800U)の存在下、14℃
で一夜反応させてライゲート(連結)した。このライゲ
ーション混合物を用いて大腸菌DHIを形質転換し、プ
ラスミドpB R322XhL ZM(BC)を得た。
プラスミドpB R322XhL ZM(BC)の構築
模式図を第3図に示す。
模式図を第3図に示す。
実施例6 110位のアミノ酸がアラニンに変換された
ヒトリゾチームの遺伝子の調製 ’)Val”oをAla”’に変換するためのオリコマ
−の合成 常法に従って、以下の2本のオリゴマーを合成した。
ヒトリゾチームの遺伝子の調製 ’)Val”oをAla”’に変換するためのオリコマ
−の合成 常法に従って、以下の2本のオリゴマーを合成した。
(2) GCT CGG ACCCGA CG
A ACCTCT ’tTA GC’。
A ACCTCT ’tTA GC’。
i)pBR322XhLZM(BC)のBamHIおよ
びC1al処理 実施例5で得?、:pBR322XhLZM(BC)(
100ng)を、C1al(60U)を含んだTA(J
衝液(0’ F arrellら、Mo1ec、 G
en、 G enet、、179.421−435(1
980))500μQ中、37℃で3時間反応させた後
、DNAをエタノール沈殿させた。このDNAに蒸留水
440μσを加えて溶解させ、BamH1緩衝液(ベー
リンガー社製)50 uQSBamHI I Oμ12
(90U)を加え、30℃で一夜反応させた。この半m
を1%アガロースゲル電気泳動にかけ、大きい方の断片
を切り出し、電気泳動溶出してpBR322XhLZM
(BC)の大きい断片を得た。
びC1al処理 実施例5で得?、:pBR322XhLZM(BC)(
100ng)を、C1al(60U)を含んだTA(J
衝液(0’ F arrellら、Mo1ec、 G
en、 G enet、、179.421−435(1
980))500μQ中、37℃で3時間反応させた後
、DNAをエタノール沈殿させた。このDNAに蒸留水
440μσを加えて溶解させ、BamH1緩衝液(ベー
リンガー社製)50 uQSBamHI I Oμ12
(90U)を加え、30℃で一夜反応させた。この半m
を1%アガロースゲル電気泳動にかけ、大きい方の断片
を切り出し、電気泳動溶出してpBR322XhLZM
(BC)の大きい断片を得た。
■)アニーリングおよびライゲーション)で得た合成オ
リゴマー(1)および(2)夫々500ngを用い、T
4DNAキナーゼ2μ&(14U)、lomM ATP
3μf2,10Xライゲーシヨン緩衝液(前出)3μg
を含む30μρ中で、37°Cにおいて30分間反応さ
せた後、65°Cで15分間加熱して反応を止めた。
リゴマー(1)および(2)夫々500ngを用い、T
4DNAキナーゼ2μ&(14U)、lomM ATP
3μf2,10Xライゲーシヨン緩衝液(前出)3μg
を含む30μρ中で、37°Cにおいて30分間反応さ
せた後、65°Cで15分間加熱して反応を止めた。
次いで、このようにして得たD N A断片17 ng
と11)テ得りpB R322XhL ZM(B C)
の大きい断片50ngとをタカラ(TAKARA)ライ
ゲーションキット(宝酒造製)中で14℃において1時
間反応させ、この半量を使ってE、coli DHlを
形質転換した。このようにして得られたプラスミドを大
腸菌から抽出しrp13 R322XhL Z M(A
1a110)と命名した。この変異ヒトリゾチーム遺伝
子を常法通りジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法でそ
の塩基配列を決定し、所望のDNAが挿入されているこ
とを確認した。プラスミドpBR322XhLZM(A
la”’)の構築模式図を第4図に示す。
と11)テ得りpB R322XhL ZM(B C)
の大きい断片50ngとをタカラ(TAKARA)ライ
ゲーションキット(宝酒造製)中で14℃において1時
間反応させ、この半量を使ってE、coli DHlを
形質転換した。このようにして得られたプラスミドを大
腸菌から抽出しrp13 R322XhL Z M(A
1a110)と命名した。この変異ヒトリゾチーム遺伝
子を常法通りジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法でそ
の塩基配列を決定し、所望のDNAが挿入されているこ
とを確認した。プラスミドpBR322XhLZM(A
la”’)の構築模式図を第4図に示す。
実施例7 プラスミドpERI 8852の構築実施
例6、iii ) テ得りpB R322XhL ZM
(Alallo)を大腸菌DHIから常法に従って調製
した後、実施例2 、iii )に記載の方法に従って
X ho IおよびS ma Iで処理して、シグナル
配列のコード領域と変異ヒトリゾチーム遺伝子とを含む
XholSmal断片(a)を得た。一方プラスミドp
ER18602を同様にXholおよびS ma Iで
処理したのち、常法通り電気泳動によって9.5kbの
Xh。
例6、iii ) テ得りpB R322XhL ZM
(Alallo)を大腸菌DHIから常法に従って調製
した後、実施例2 、iii )に記載の方法に従って
X ho IおよびS ma Iで処理して、シグナル
配列のコード領域と変異ヒトリゾチーム遺伝子とを含む
XholSmal断片(a)を得た。一方プラスミドp
ER18602を同様にXholおよびS ma Iで
処理したのち、常法通り電気泳動によって9.5kbの
Xh。
1−3mal断片(b)を単離した。
次いで、これらのDNA断片(a)および(b)のそれ
ぞれ、10ngと30ngを20tt(lのライデー/
ジン用緩衝液中で実施例2、山)と同様に反応させて連
結し、この反応混合物でE、coli DI−11を形
質転換した。形質転換体から、変異ヒトリゾチーム遺伝
子を含有しているプラスミド数種を得、その一つをpE
RI 8852と命名した。プラスミドpER188
52の構築模式図を第5図に示す。
ぞれ、10ngと30ngを20tt(lのライデー/
ジン用緩衝液中で実施例2、山)と同様に反応させて連
結し、この反応混合物でE、coli DI−11を形
質転換した。形質転換体から、変異ヒトリゾチーム遺伝
子を含有しているプラスミド数種を得、その一つをpE
RI 8852と命名した。プラスミドpER188
52の構築模式図を第5図に示す。
実施例8 酵母形質転換体の調製
実施例7で得た発現プラスミドpER18852を用い
、ヒネンらの方法(前出)に従い、S、セレビシェAH
22R−を形質転換し、形質転換体S、セレビシェAH
22R−/pERI 8852を得た。この菌株は、
工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号FERM
P−10259で寄託されている(受託臼:昭和63年
8月31日)。
、ヒネンらの方法(前出)に従い、S、セレビシェAH
22R−を形質転換し、形質転換体S、セレビシェAH
22R−/pERI 8852を得た。この菌株は、
工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号FERM
P−10259で寄託されている(受託臼:昭和63年
8月31日)。
実施例9 S、セレビシェAH22R−/pER+8
852の培養 実施例8で得た形質転換体S、セレビシェAH22R−
/pERI 8852を、試験管中のパークホルダー
(B urkholder) [アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・ボタニー(Amer、 J 、 Bot、)
30.206(1943)]の改変培地III(112
中、KH,Po。
852の培養 実施例8で得た形質転換体S、セレビシェAH22R−
/pERI 8852を、試験管中のパークホルダー
(B urkholder) [アメリカン・ジャーナ
ル・オブ・ボタニー(Amer、 J 、 Bot、)
30.206(1943)]の改変培地III(112
中、KH,Po。
0.4g、グルコース10g、アラニン5g、シューク
ロース80gを含有)5+n+2に接種し、30°Cで
72時間振盪培養した。得られた培養液1m12をそれ
ぞれ上記培地[14tt+Qを含む試験管へ移し、30
°Cで1日振盪培養した。この培養液2m(lを上記培
地In18m(lを含む200IIIQ容三角フラスコ
に移し、30°Cで振盪培養し、72時間後に培養液を
採取し、アッセイ用試料の調製に用いた。
ロース80gを含有)5+n+2に接種し、30°Cで
72時間振盪培養した。得られた培養液1m12をそれ
ぞれ上記培地[14tt+Qを含む試験管へ移し、30
°Cで1日振盪培養した。この培養液2m(lを上記培
地In18m(lを含む200IIIQ容三角フラスコ
に移し、30°Cで振盪培養し、72時間後に培養液を
採取し、アッセイ用試料の調製に用いた。
実施例10 アッセイ試料の調製
実施例9で得た培養液を遠心分離し、上清と菌体を分離
した。上清はアッセイに供し、菌体は12Mスクロース
を含t; 50 mMリン酸ハソファ−(pH7,0)
で洗浄した後、ライモリアーゼ(Zy亀o1yase)
[生化学工業(株)製コを0 、5 m9/ mQに
なるように加えた同バッファーに懸濁し、室温で2時間
反応させた。この反応液に4倍量の50mMリン酸バッ
フy (pH7,0)[10mM EDTΔ、1mM
PMSFを含む]を加え、室温で1時間反応させたのち
、上清を集めて菌体抽出液とした。
した。上清はアッセイに供し、菌体は12Mスクロース
を含t; 50 mMリン酸ハソファ−(pH7,0)
で洗浄した後、ライモリアーゼ(Zy亀o1yase)
[生化学工業(株)製コを0 、5 m9/ mQに
なるように加えた同バッファーに懸濁し、室温で2時間
反応させた。この反応液に4倍量の50mMリン酸バッ
フy (pH7,0)[10mM EDTΔ、1mM
PMSFを含む]を加え、室温で1時間反応させたのち
、上清を集めて菌体抽出液とした。
実施例11 変異型ヒトリゾチーム産生量の測定実施
例10で得た上清と菌体抽出液とを変異型ヒトリゾチー
ムのアッセイに供した。
例10で得た上清と菌体抽出液とを変異型ヒトリゾチー
ムのアッセイに供した。
ヒトリゾチーム活性の測定は、実質上ワーシントン・エ
ンザイム・マニュアル(Worthigton E n
zyme ManuaL pi 00、Worthig
ton B iochemical Corporat
ion、 U S A、 1972)によった。
ンザイム・マニュアル(Worthigton E n
zyme ManuaL pi 00、Worthig
ton B iochemical Corporat
ion、 U S A、 1972)によった。
標準ヒトリゾチームとしてはシグマ(S iguma)
社製を使用した。1単位は、0.1Mリン酸バッファー
(pH6,9)中でマイクロコツカス・ルテウス(Mi
crococcus 1uteusX生化学工業社製)
を基質として25℃で1分間反応させ、450究μの吸
収を0.001減少させるに必要な酵素量とした。同様
の実験を3回行って得たヒトリゾチーム活性で表した産
生量は、以下の表1に示す通りであった。
社製を使用した。1単位は、0.1Mリン酸バッファー
(pH6,9)中でマイクロコツカス・ルテウス(Mi
crococcus 1uteusX生化学工業社製)
を基質として25℃で1分間反応させ、450究μの吸
収を0.001減少させるに必要な酵素量とした。同様
の実験を3回行って得たヒトリゾチーム活性で表した産
生量は、以下の表1に示す通りであった。
なお、天然型のヒトリゾチームを産生ずる形質転換体S
、セレビシェA H22R−/pGE L −CLlo
<FERMp−9285)を対照として同様に培養し、
本発明の形質転換体におけるヒトリゾチーム活性を有す
るタンパク質の産生量と比較した。
、セレビシェA H22R−/pGE L −CLlo
<FERMp−9285)を対照として同様に培養し、
本発明の形質転換体におけるヒトリゾチーム活性を有す
るタンパク質の産生量と比較した。
結果を表1に示す。
表 1
ヒトリゾチーム
実施例11 分泌された変異型ヒトリゾチームの精製
実施例7で得た形質転換体S、セレビ/工AH22R−
/pER+ 8852を実施例9に示した培地5ml
!を含む試験管に接種し、30°Cで3日間振盪培養し
た。次に、上記培地18dを含有する200mI2容三
角フラスコに、上の培養液2mCを移し、30°Cで1
日振盪培養した。次に上記培地250+IIQを含有す
るIQ容三角フラスコにこの培養1(i20+ngを移
し、30℃で3日間培養した。この培養液を遠心分離機
にかけ、上清と菌体を分離した。この上清く約1のを5
0mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6,5)で平衡化
した陽イオン交換樹脂(I ndion)カラム(0,
7cmX 15 c+a)に吸着させ、同緩衝液30I
IIQで洗浄後、0.5MNaCl2を含む同緩衝液で
溶出した。溶出液を1n12ずつ分取し、各フラクショ
ンについて実施例1Oに従ってリゾチーム活性を測定し
た。リゾチーム活性が最大となるフラクションを取り、
これを高速液体クロマトグラフィー(Asahipak
502 C)により、さらに精製した。50+Mリン酸
ナトリウム緩衝液を含む0.6M硫酸ナトリウム0−3
0%の直線濃度勾配により30分間溶出を行い、保持時
間23480分に現れる280nmの吸収ピークを分取
し、これをA110とした。この溶出パターンを第6図
に示す。
/pER+ 8852を実施例9に示した培地5ml
!を含む試験管に接種し、30°Cで3日間振盪培養し
た。次に、上記培地18dを含有する200mI2容三
角フラスコに、上の培養液2mCを移し、30°Cで1
日振盪培養した。次に上記培地250+IIQを含有す
るIQ容三角フラスコにこの培養1(i20+ngを移
し、30℃で3日間培養した。この培養液を遠心分離機
にかけ、上清と菌体を分離した。この上清く約1のを5
0mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6,5)で平衡化
した陽イオン交換樹脂(I ndion)カラム(0,
7cmX 15 c+a)に吸着させ、同緩衝液30I
IIQで洗浄後、0.5MNaCl2を含む同緩衝液で
溶出した。溶出液を1n12ずつ分取し、各フラクショ
ンについて実施例1Oに従ってリゾチーム活性を測定し
た。リゾチーム活性が最大となるフラクションを取り、
これを高速液体クロマトグラフィー(Asahipak
502 C)により、さらに精製した。50+Mリン酸
ナトリウム緩衝液を含む0.6M硫酸ナトリウム0−3
0%の直線濃度勾配により30分間溶出を行い、保持時
間23480分に現れる280nmの吸収ピークを分取
し、これをA110とした。この溶出パターンを第6図
に示す。
実施例12 精製変異型ヒトリゾチームA I I Q
の分析 実施例11で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品に
ついて比活性を測定した。タンパク質の定量は市販のヒ
トリゾチーム(シグマ社)を標準としてBCAプロティ
ンアッセイ試薬(ピアス社)を用いて行った。その結果
、市販の天然型ヒトリゾチームの比活性を100とした
とき、変異型ヒトリゾチームの比活性は121と高いこ
とが分かった。
の分析 実施例11で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品に
ついて比活性を測定した。タンパク質の定量は市販のヒ
トリゾチーム(シグマ社)を標準としてBCAプロティ
ンアッセイ試薬(ピアス社)を用いて行った。その結果
、市販の天然型ヒトリゾチームの比活性を100とした
とき、変異型ヒトリゾチームの比活性は121と高いこ
とが分かった。
第1図はプラスミドpER+ 8602の構築模式図
、並びにプラスミドpGEL125およびプラスミドp
ER+ 8602の制限酵素切断地図、第2図はM1
3mpl 8XhLZMの構築模式図、第3図はプラス
ミドpBR322XhLZM(BC)の構築模式図、並
びに制限酵素切断地図、第4図はプラスミドpBR32
2XhLZM(Ala”’)の構築模式図、並びに制限
酵素切断地図、第5図はプラスミドpERI B2S
3の構築模式図、並びに制限酵素切断地図、第6図はA
sahipak502CによるA110の溶出状態を示
すグラフである。 第3図 特許出願人 株式会社蛋白工学研究所代 理 人
弁理士 青白 葆(外2名)第6図 保持時間(ガ) 補正の内容。 (内容に変更なし)を提出致します。 手続補正言動式) 発明の名称 変異型ヒトリゾチーム 3゜ 補正をする者 事件との関係
、並びにプラスミドpGEL125およびプラスミドp
ER+ 8602の制限酵素切断地図、第2図はM1
3mpl 8XhLZMの構築模式図、第3図はプラス
ミドpBR322XhLZM(BC)の構築模式図、並
びに制限酵素切断地図、第4図はプラスミドpBR32
2XhLZM(Ala”’)の構築模式図、並びに制限
酵素切断地図、第5図はプラスミドpERI B2S
3の構築模式図、並びに制限酵素切断地図、第6図はA
sahipak502CによるA110の溶出状態を示
すグラフである。 第3図 特許出願人 株式会社蛋白工学研究所代 理 人
弁理士 青白 葆(外2名)第6図 保持時間(ガ) 補正の内容。 (内容に変更なし)を提出致します。 手続補正言動式) 発明の名称 変異型ヒトリゾチーム 3゜ 補正をする者 事件との関係
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第110位
のバリンがアラニンで置き換えられたポリペプチドをコ
ードしている変異ヒトリゾチーム遺伝子。 2 請求項1に記載の変異ヒトリゾチーム遺伝子と、シ
グナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列とを
含有し、真核生物内で自律的に複製可能な発現ベクター
。 3、プラスミドpERI8852である請求項2に記載
の発現ベクター。 4、請求項2または3に記載の発現ベクターで形質転換
されており、変異型ヒトリゾチームを産生し、分泌し得
る宿主細胞。 5、形質転換体サッカロマイセス・セレビシェAH22
R^−/pERI8852である請求項4に記載の宿主
細胞。 6、請求項4または5に記載の形質転換体を培養し、培
養液中に分泌されたヒトリゾチーム活性を有するタンパ
ク質を分離し、所望により精製することからなる変異型
ヒトリゾチームの製造方法。 7、請求項6に記載の方法で製造された変異型ヒトリゾ
チーム。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27189588A JPH02117387A (ja) | 1988-10-27 | 1988-10-27 | 変異型ヒトリゾチーム |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP27189588A JPH02117387A (ja) | 1988-10-27 | 1988-10-27 | 変異型ヒトリゾチーム |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02117387A true JPH02117387A (ja) | 1990-05-01 |
Family
ID=17506393
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP27189588A Pending JPH02117387A (ja) | 1988-10-27 | 1988-10-27 | 変異型ヒトリゾチーム |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02117387A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002070715A1 (fr) * | 2001-03-02 | 2002-09-12 | Long Yu | Lysozime de type g humain, sa sequence codante, son procede de preparation et ses utilisations |
-
1988
- 1988-10-27 JP JP27189588A patent/JPH02117387A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2002070715A1 (fr) * | 2001-03-02 | 2002-09-12 | Long Yu | Lysozime de type g humain, sa sequence codante, son procede de preparation et ses utilisations |
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