JP2538541B2 - 変異型ヒトリゾチ―ムをコ―ドする遺伝子 - Google Patents
変異型ヒトリゾチ―ムをコ―ドする遺伝子Info
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- JP2538541B2 JP2538541B2 JP20427195A JP20427195A JP2538541B2 JP 2538541 B2 JP2538541 B2 JP 2538541B2 JP 20427195 A JP20427195 A JP 20427195A JP 20427195 A JP20427195 A JP 20427195A JP 2538541 B2 JP2538541 B2 JP 2538541B2
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- Japan
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- dna
- plasmid
- mutant human
- lysozyme
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、組み換えDNA技術に
よる変異型ヒトリゾチームおよびその製造に関するもの
である。さらに詳しくは、天然型ヒトリゾチーム(以
下、単にヒトリゾチームともいう)のアミノ酸配列の第
77位および第95位のシスティンがアラニンで置き換
えられた変異型ヒトリゾチームをコードしている変異ヒ
トリゾチーム遺伝子、およびこの遺伝子を、シグナルペ
プチドをコードしているヌクレオチド配列と共に含有し
てなる変異型ヒトリゾチーム発現ベクターに関するもの
である。
よる変異型ヒトリゾチームおよびその製造に関するもの
である。さらに詳しくは、天然型ヒトリゾチーム(以
下、単にヒトリゾチームともいう)のアミノ酸配列の第
77位および第95位のシスティンがアラニンで置き換
えられた変異型ヒトリゾチームをコードしている変異ヒ
トリゾチーム遺伝子、およびこの遺伝子を、シグナルペ
プチドをコードしているヌクレオチド配列と共に含有し
てなる変異型ヒトリゾチーム発現ベクターに関するもの
である。
【0002】
【従来技術とその問題点】リゾチームは細菌細胞壁のペ
プチドグルカンに作用してN−アセチルムラミン酸とN
−アセチルグルコサミンのβ−1,4−結合を加水分解
する酵素である。該酵素を細菌に作用させると溶菌を引
き起こし、その反応生成物である少糖を同定することに
よって細胞壁の化学構造の研究における手懸かりを得る
ことができる。従って、リゾチームは、細菌学、蛋白質
化学、生化学等、様々な研究分野において有用な酵素で
ある。リゾチームは、ヒトをも含めた動物の各種組織、
分泌液、卵白等に広く分布しており、一部の植物にも見
出されている。
プチドグルカンに作用してN−アセチルムラミン酸とN
−アセチルグルコサミンのβ−1,4−結合を加水分解
する酵素である。該酵素を細菌に作用させると溶菌を引
き起こし、その反応生成物である少糖を同定することに
よって細胞壁の化学構造の研究における手懸かりを得る
ことができる。従って、リゾチームは、細菌学、蛋白質
化学、生化学等、様々な研究分野において有用な酵素で
ある。リゾチームは、ヒトをも含めた動物の各種組織、
分泌液、卵白等に広く分布しており、一部の植物にも見
出されている。
【0003】卵白からは比較的容易に純度の高いリゾチ
ームが単離できるため、この酵素は食品保存の目的で、
チーズ、ソーセージ、水産食品などに添加されたり、あ
るいはまた、牛乳のヒト母乳化の目的で使用されている
[林 勝哉、井本泰治、リゾチーム、南江堂(197
4)]。リゾチームはまた、止血、抗炎症、組織再生、抗
腫瘍活性などの薬理活性を有することも知られており
(例えば“最近の新薬34集"107頁、薬事日報社、東
京、1983)、消炎酵素剤として市販されている。
ームが単離できるため、この酵素は食品保存の目的で、
チーズ、ソーセージ、水産食品などに添加されたり、あ
るいはまた、牛乳のヒト母乳化の目的で使用されている
[林 勝哉、井本泰治、リゾチーム、南江堂(197
4)]。リゾチームはまた、止血、抗炎症、組織再生、抗
腫瘍活性などの薬理活性を有することも知られており
(例えば“最近の新薬34集"107頁、薬事日報社、東
京、1983)、消炎酵素剤として市販されている。
【0004】これらニワトリ卵白由来のリゾチームを医
薬目的で使用する場合には、しばしば発疹、発赤などの
過敏症状の現れることがあり、これらは異種蛋白による
免疫応答による副作用であると考えられている。従っ
て、特に医薬用途に用いる場合には、ヒトリゾチームを
使用することが好ましい。
薬目的で使用する場合には、しばしば発疹、発赤などの
過敏症状の現れることがあり、これらは異種蛋白による
免疫応答による副作用であると考えられている。従っ
て、特に医薬用途に用いる場合には、ヒトリゾチームを
使用することが好ましい。
【0005】ヒトリゾチームのアミノ酸配列は公知であ
り(図1)、130個のアミノ酸からなる[日本生化学会
編:生化学データブック巻1.189頁(1979)]。ま
たこのアミノ酸配列に基づき、ヒトリゾチームをコード
するDNAが化学合成されている[Ikehara, M.ら、ケ
ミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブリテン
(Chem.Pharm.Bull.)34、2202(1986)]。
り(図1)、130個のアミノ酸からなる[日本生化学会
編:生化学データブック巻1.189頁(1979)]。ま
たこのアミノ酸配列に基づき、ヒトリゾチームをコード
するDNAが化学合成されている[Ikehara, M.ら、ケ
ミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブリテン
(Chem.Pharm.Bull.)34、2202(1986)]。
【0006】ヒトリゾチームの生産については、組み換
えDNA法を用いてムラキ(Muraki)らが大腸菌での発
現を試みたが、この発現系では活性のあるヒトリゾチー
ムが得られていない[Muraki,M.ら、アグリカルチュラ
ル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agric.B
iol.Chem.)50、713(1986)]。一方、酵母を用
いて培地中にリゾチームを分泌させる分泌生産では、活
性のあるヒトリゾチームが得られることが明らかにされ
たが[Jigami,Y.ら、ジーン(Gene)43、273(1
986)]、その生産量(菌体内外の総和)は十分なもので
はなく、かつ、生産量に対する分泌量も55〜65%と
十分なものではない。
えDNA法を用いてムラキ(Muraki)らが大腸菌での発
現を試みたが、この発現系では活性のあるヒトリゾチー
ムが得られていない[Muraki,M.ら、アグリカルチュラ
ル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agric.B
iol.Chem.)50、713(1986)]。一方、酵母を用
いて培地中にリゾチームを分泌させる分泌生産では、活
性のあるヒトリゾチームが得られることが明らかにされ
たが[Jigami,Y.ら、ジーン(Gene)43、273(1
986)]、その生産量(菌体内外の総和)は十分なもので
はなく、かつ、生産量に対する分泌量も55〜65%と
十分なものではない。
【0007】この様に、ヒトリゾチームを効率良く生産
する方法がないことが、ヒトリゾチームの治療その他へ
の適用を困難にしている。その上、ヒトリゾチームに関
しては、生体内での機能等に未解明の部分が多く、研究
の促進が待たれている。これらの目的のためには、充分
な量の一定したヒトリゾチーム活性を有するタンパク質
が供給されることが必要である。
する方法がないことが、ヒトリゾチームの治療その他へ
の適用を困難にしている。その上、ヒトリゾチームに関
しては、生体内での機能等に未解明の部分が多く、研究
の促進が待たれている。これらの目的のためには、充分
な量の一定したヒトリゾチーム活性を有するタンパク質
が供給されることが必要である。
【0008】以上から明らかなように、一定したヒトリ
ゾチーム活性を有するタンパク質を効率よく、大量に得
る方法が得られたならば、医療分野はもとより、該酵素
の生理学的役割の研究等、様々な分野に大いに貢献し得
ると考えられる。
ゾチーム活性を有するタンパク質を効率よく、大量に得
る方法が得られたならば、医療分野はもとより、該酵素
の生理学的役割の研究等、様々な分野に大いに貢献し得
ると考えられる。
【0009】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、組み換
えDNA技術による分泌タンパク質の製造において、生
成したタンパク質を効率よく分泌せしめるリーダー配列
の開発研究に取り組み、その結果、卵白リゾチームのシ
グナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列にあ
る種の修飾を施し、得られた改良ヌクレオチド配列をヒ
トリゾチームをコードしているヌクレオチド配列と一緒
に、自律的に複製し得るベクターに挿入し、該ベクター
を用いて酵母内でヒトリゾチームを発現させ、効率良く
分泌させることに成功した(特願昭62−069764
号および特願昭62−69765号)。他方、本発明者
らは、ヒトリゾチームをより効率よく分泌させるため
に、ヒトリゾチームのアミノ酸配列の一部を改変する試
みも行って来た。その結果、天然型ヒトリゾチームのア
ミノ酸配列の第77位と第95位のシスティンをアラニ
ンで置き換えた変異型ポリペプチドをコードしている変
異ヒトリゾチーム遺伝子を調製し、該遺伝子を、シグナ
ルペプチドをコードしているヌクレオチド配列と共に、
適切な発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを
酵母宿主に導入し、得られた形質転換体を適当な条件下
で培養すると、培地中に充分なリゾチーム活性を有する
タンパク質が分泌されることを見出し、本発明を完成す
るに至った。
えDNA技術による分泌タンパク質の製造において、生
成したタンパク質を効率よく分泌せしめるリーダー配列
の開発研究に取り組み、その結果、卵白リゾチームのシ
グナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列にあ
る種の修飾を施し、得られた改良ヌクレオチド配列をヒ
トリゾチームをコードしているヌクレオチド配列と一緒
に、自律的に複製し得るベクターに挿入し、該ベクター
を用いて酵母内でヒトリゾチームを発現させ、効率良く
分泌させることに成功した(特願昭62−069764
号および特願昭62−69765号)。他方、本発明者
らは、ヒトリゾチームをより効率よく分泌させるため
に、ヒトリゾチームのアミノ酸配列の一部を改変する試
みも行って来た。その結果、天然型ヒトリゾチームのア
ミノ酸配列の第77位と第95位のシスティンをアラニ
ンで置き換えた変異型ポリペプチドをコードしている変
異ヒトリゾチーム遺伝子を調製し、該遺伝子を、シグナ
ルペプチドをコードしているヌクレオチド配列と共に、
適切な発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを
酵母宿主に導入し、得られた形質転換体を適当な条件下
で培養すると、培地中に充分なリゾチーム活性を有する
タンパク質が分泌されることを見出し、本発明を完成す
るに至った。
【0010】即ち、本発明は、天然型ヒトリゾチームの
アミノ酸配列の第77位および第95位のシスティンが
アラニンで置き換えられた変異型ヒトリゾチームをコー
ドしている変異ヒトリゾチーム遺伝子を提供するもので
ある。
アミノ酸配列の第77位および第95位のシスティンが
アラニンで置き換えられた変異型ヒトリゾチームをコー
ドしている変異ヒトリゾチーム遺伝子を提供するもので
ある。
【0011】更に、本発明は、該遺伝子を、シグナルペ
プチドをコードしているヌクレオチド配列と共に含有し
ている変異型ヒトリゾチーム発現ベクターを提供するも
のである。
プチドをコードしているヌクレオチド配列と共に含有し
ている変異型ヒトリゾチーム発現ベクターを提供するも
のである。
【0012】また本発明は、上記発現ベクターを用いて
酵母宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、
培養液中に分泌されたヒトリゾチーム活性を有するタン
パク質を分離することからなる変異型ヒトリゾチームの
製造方法、およびこの様にして製造された変異型ヒトリ
ゾチームを提供するものである。
酵母宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、
培養液中に分泌されたヒトリゾチーム活性を有するタン
パク質を分離することからなる変異型ヒトリゾチームの
製造方法、およびこの様にして製造された変異型ヒトリ
ゾチームを提供するものである。
【0013】本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子は、後
述の実施例に記載の如く、当業者既知の方法で調製され
た。天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列およびそれを
コードしている化学合成したDNAのヌクレオチド配列
を図1に示す。
述の実施例に記載の如く、当業者既知の方法で調製され
た。天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列およびそれを
コードしている化学合成したDNAのヌクレオチド配列
を図1に示す。
【0014】本発明の変異型ヒトリゾチーム発現ベクタ
ー、即ちプラスミドpERI 8716の構築における
出発プラスミドとして、天然のヒトリゾチームアミノ酸
配列をコードしている合成遺伝子を含有する公知のプラ
スミドpGEL125[ヨシムラ(K.Yoshimura)バイオ
ケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ション(Biochem.Biophys.Res.Commun.)145、7
12(1987)]を用いた。このプラスミドpGEL12
5は、酵母内で機能する2μ複製起源を有し、GLDプ
ロモーター、卵白リゾチームのシグナルペプチドおよび
ヒトリゾチームをコードしているヌクレオチド配列をこ
の順番で含有している。このプラスミドpGEL125
を、BamHIによる消化に付した後、XhoIで部分消化
することにより、GLDプロモーター、シグナルペプチ
ド、およびヒトリゾチームのコード領域を含んだ1.6k
bDNA断片と、プラスミドpGEL125の残余のヌク
レオチド配列に相当する8.3kbのDNA断片とを別個
に切り出し、SmaI認識配列(以下、単に制限部位とい
う)を有するSmaIリンカーを用い、それぞれのXhoI制
限末端をSmaI制限末端に変換する。次いでこれらのD
NA断片を再結合させると、シグナルペプチドの上流に
のみXhoI制限部位を有するプラスミドpERI860
2が得られる。プラスミドpERI 8602の組立て模
式図、並びにプラスミドpGEL125およびプラスミ
ドpERI 8602の制限酵素切断地図を図2に示す。
ー、即ちプラスミドpERI 8716の構築における
出発プラスミドとして、天然のヒトリゾチームアミノ酸
配列をコードしている合成遺伝子を含有する公知のプラ
スミドpGEL125[ヨシムラ(K.Yoshimura)バイオ
ケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ション(Biochem.Biophys.Res.Commun.)145、7
12(1987)]を用いた。このプラスミドpGEL12
5は、酵母内で機能する2μ複製起源を有し、GLDプ
ロモーター、卵白リゾチームのシグナルペプチドおよび
ヒトリゾチームをコードしているヌクレオチド配列をこ
の順番で含有している。このプラスミドpGEL125
を、BamHIによる消化に付した後、XhoIで部分消化
することにより、GLDプロモーター、シグナルペプチ
ド、およびヒトリゾチームのコード領域を含んだ1.6k
bDNA断片と、プラスミドpGEL125の残余のヌク
レオチド配列に相当する8.3kbのDNA断片とを別個
に切り出し、SmaI認識配列(以下、単に制限部位とい
う)を有するSmaIリンカーを用い、それぞれのXhoI制
限末端をSmaI制限末端に変換する。次いでこれらのD
NA断片を再結合させると、シグナルペプチドの上流に
のみXhoI制限部位を有するプラスミドpERI860
2が得られる。プラスミドpERI 8602の組立て模
式図、並びにプラスミドpGEL125およびプラスミ
ドpERI 8602の制限酵素切断地図を図2に示す。
【0015】天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の第
77位および第95位のシスティンがアラニンで置換さ
れた変異型ヒトリゾチームをコードしているヌクレオチ
ド配列を得るために、プラスミドpERI 8602か
ら、シグナルペプチドとヒトリゾチームとをコードして
いるヌクレオチド配列を含んだXhoI−SmaI制限断片
を切り出し、これを、M13mp19RF[M13mpファ
ージDNAの複製型(RF)]にXhoI制限部位を挿入し
たファージDNAの大きい方のXhoI−SmaI制限断片
と結合(ライゲート)させることにより、シグナルペプチ
ドとヒトリゾチームとをコードしている一本鎖ファージ
DNA、M13mp19XhLZMを得る。M13mp19
XhLZMの組立て模式図を図3に示す。
77位および第95位のシスティンがアラニンで置換さ
れた変異型ヒトリゾチームをコードしているヌクレオチ
ド配列を得るために、プラスミドpERI 8602か
ら、シグナルペプチドとヒトリゾチームとをコードして
いるヌクレオチド配列を含んだXhoI−SmaI制限断片
を切り出し、これを、M13mp19RF[M13mpファ
ージDNAの複製型(RF)]にXhoI制限部位を挿入し
たファージDNAの大きい方のXhoI−SmaI制限断片
と結合(ライゲート)させることにより、シグナルペプチ
ドとヒトリゾチームとをコードしている一本鎖ファージ
DNA、M13mp19XhLZMを得る。M13mp19
XhLZMの組立て模式図を図3に示す。
【0016】一方、アミノ酸配列の第77位および95
位のシスティンがアラニンで置換された短いアミノ酸配
列をコードしている2本のオリゴヌクレオチドを合成
し、これら、変異を含んだオリゴマーの5'末端をりん
酸化し、M13mp19XhLZMを含む一本鎖DNAと
混合し、常法に従い、アニーリングおよびライゲーショ
ンに付す。次いで、変異していないDNAを除去した
後、得られた変異ヒトリゾチームDNAを含有する混合
物を用い、大腸菌、E.coli TG1をトランスフェクシ
ョン(感染)した。プラークを形成させた後、さらにこの
プラークをE.coliTG1に感染させ、その形質転換体
を培養し、その培養上清からPEG/NaCl沈澱、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱により単鎖DNAを分離
し、ジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法による塩基配
列決定に付し、所望の変異DNAの生成を確認する。
位のシスティンがアラニンで置換された短いアミノ酸配
列をコードしている2本のオリゴヌクレオチドを合成
し、これら、変異を含んだオリゴマーの5'末端をりん
酸化し、M13mp19XhLZMを含む一本鎖DNAと
混合し、常法に従い、アニーリングおよびライゲーショ
ンに付す。次いで、変異していないDNAを除去した
後、得られた変異ヒトリゾチームDNAを含有する混合
物を用い、大腸菌、E.coli TG1をトランスフェクシ
ョン(感染)した。プラークを形成させた後、さらにこの
プラークをE.coliTG1に感染させ、その形質転換体
を培養し、その培養上清からPEG/NaCl沈澱、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱により単鎖DNAを分離
し、ジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法による塩基配
列決定に付し、所望の変異DNAの生成を確認する。
【0017】次いで、常法に従い、一本鎖DNAをE.c
oli TG1に導入して2本鎖DNAを得、このDNAか
らシグナルペプチドと変異型ヒトリゾチームをコードし
ているXhoI−SmaI制限断片を切り出し、上記プラス
ミドpERI 8602の9.5kb XhoI−SmaI制限断
片とのライゲーション反応に付す。得られた混合物を用
いてE.coli DH1を形質転換し、形質転換体から所望
の変異型ヒトリゾチーム発現ベクター、プラスミドpE
RI 8716を単離する。プラスミドpERI 871
6の組立て模式図、並びに制限酵素切断地図を図4に示
す。
oli TG1に導入して2本鎖DNAを得、このDNAか
らシグナルペプチドと変異型ヒトリゾチームをコードし
ているXhoI−SmaI制限断片を切り出し、上記プラス
ミドpERI 8602の9.5kb XhoI−SmaI制限断
片とのライゲーション反応に付す。得られた混合物を用
いてE.coli DH1を形質転換し、形質転換体から所望
の変異型ヒトリゾチーム発現ベクター、プラスミドpE
RI 8716を単離する。プラスミドpERI 871
6の組立て模式図、並びに制限酵素切断地図を図4に示
す。
【0018】以上の一連の操作における個々の操作は当
業者によく知られており、例えば、大腸菌の形質転換
は、コーエン(Cohen)らの方法[Cohen,S.N.ら、プロ
シージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)69、
2110(1972)]によって行うことができる。宿主
としてはE.coli294、E.coliDH1、E.coliW3
110、E.coliC600などを用いることができる。
業者によく知られており、例えば、大腸菌の形質転換
は、コーエン(Cohen)らの方法[Cohen,S.N.ら、プロ
シージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)69、
2110(1972)]によって行うことができる。宿主
としてはE.coli294、E.coliDH1、E.coliW3
110、E.coliC600などを用いることができる。
【0019】また、形質転換体から、所望の遺伝子が挿
入されたプラスミドDNAを単離するには、アルカリ抽
出法[Birnboim,H.C.およびDoly,J.、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)7、1
513(1979)]等を利用することができる。次い
で、プラスミドDNAを適当な制限酵素で処理すること
によって、挿入された該遺伝子を切り出し、たとえばア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミド電気
泳動によってこれを単離する。これらの一連の操作は公
知であり、文献、例えば「モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning)(1982),Cold Spring
Harbor Laboratory」に詳しく記載されている。
入されたプラスミドDNAを単離するには、アルカリ抽
出法[Birnboim,H.C.およびDoly,J.、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)7、1
513(1979)]等を利用することができる。次い
で、プラスミドDNAを適当な制限酵素で処理すること
によって、挿入された該遺伝子を切り出し、たとえばア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミド電気
泳動によってこれを単離する。これらの一連の操作は公
知であり、文献、例えば「モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning)(1982),Cold Spring
Harbor Laboratory」に詳しく記載されている。
【0020】またDNAの化学合成は、たとえばCrea
らの方法[Crea,R.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA)75、765(1978)]などに
従って行うことができる。
らの方法[Crea,R.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA)75、765(1978)]などに
従って行うことができる。
【0021】またDNAの所望の部位に、特異的に変異
を起こさせるためには、市販のキット(例えばアマーシ
ャム社製キットなど)が用いられ、その配列の確認に
は、ジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法[Sanger,
F.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sc
i.)USA,74、5463(1977)]が用いられる。
を起こさせるためには、市販のキット(例えばアマーシ
ャム社製キットなど)が用いられ、その配列の確認に
は、ジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法[Sanger,
F.ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sc
i.)USA,74、5463(1977)]が用いられる。
【0022】発現プラスミドは、真核細胞内で自律的に
複製可能な発現ベクター群の内から選択されたベクター
のプロモーターの下流に、シグナルペプチドをコードし
ている遺伝子と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連結させて
挿入することにより組立てられる。本明細書中では、G
LDプロモーターを用いて天然型のヒトリゾチームをコ
ードしている発現プラスミドpERI 8602の構築を
用いて例示したが、その他、プラスミドpPHO17、p
cDX[Okayama,H.およびBerg,P.、モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)
3、280(1983)]、pKSV−10(ファルマシア
社製)なども好適に使用される。
複製可能な発現ベクター群の内から選択されたベクター
のプロモーターの下流に、シグナルペプチドをコードし
ている遺伝子と変異ヒトリゾチーム遺伝子を連結させて
挿入することにより組立てられる。本明細書中では、G
LDプロモーターを用いて天然型のヒトリゾチームをコ
ードしている発現プラスミドpERI 8602の構築を
用いて例示したが、その他、プラスミドpPHO17、p
cDX[Okayama,H.およびBerg,P.、モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)
3、280(1983)]、pKSV−10(ファルマシア
社製)なども好適に使用される。
【0023】宿主として酵母を用いた場合には、プロモ
ーターとして、たとえばPHO5プロモーター、GLD
プロモーター、PGKプロモーター、ADHプロモータ
ー、PHO81プロモーター、GAL1プロモーター、
GAL10プロモーターなどが、宿主として動物細胞を
用いた場合には、プロモーターとして、たとえばSV4
0初期遺伝子プロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、ヒートショックプロモーターなどがそれぞれ利用
できる。なお発現にエンハンサーの利用も効果的であ
る。
ーターとして、たとえばPHO5プロモーター、GLD
プロモーター、PGKプロモーター、ADHプロモータ
ー、PHO81プロモーター、GAL1プロモーター、
GAL10プロモーターなどが、宿主として動物細胞を
用いた場合には、プロモーターとして、たとえばSV4
0初期遺伝子プロモーター、メタロチオネインプロモー
ター、ヒートショックプロモーターなどがそれぞれ利用
できる。なお発現にエンハンサーの利用も効果的であ
る。
【0024】
【発明の作用および効果】本発明のプラスミドpERI
8716は、酵母宿主内で変異型ヒトリゾチームを発現
させ、分泌させるのに好適である。とくに好ましい宿主
はサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cere
visiae)AH22R-である。その外、動物細胞用ベクタ
ーを用いれば、マウスL細胞、チャイニーズハムスター
卵母細胞(CHO)、さらには他の真核細胞も用い得る。
酵母の形質転換は当業者既知の方法のいずれによっても
行うことがてき、例えば、ヒネン(Hinnen)らの方法[プ
ロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)7
5,1927、(1978)]を採用することができる。
8716は、酵母宿主内で変異型ヒトリゾチームを発現
させ、分泌させるのに好適である。とくに好ましい宿主
はサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cere
visiae)AH22R-である。その外、動物細胞用ベクタ
ーを用いれば、マウスL細胞、チャイニーズハムスター
卵母細胞(CHO)、さらには他の真核細胞も用い得る。
酵母の形質転換は当業者既知の方法のいずれによっても
行うことがてき、例えば、ヒネン(Hinnen)らの方法[プ
ロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)7
5,1927、(1978)]を採用することができる。
【0025】真核細胞の形質転換も当業者に既知であ
り、例えば「蛋白質・核酸・酵素・28巻、1983
年、“組み換え遺伝子の細胞への導入と発現“(共立出
版)」記載の方法で行うことができる。形質転換体の培養
は、当業者既知の方法のいずれを用いても行うことがで
きる。
り、例えば「蛋白質・核酸・酵素・28巻、1983
年、“組み換え遺伝子の細胞への導入と発現“(共立出
版)」記載の方法で行うことができる。形質転換体の培養
は、当業者既知の方法のいずれを用いても行うことがで
きる。
【0026】酵母を使用する場合、培地としては、例え
ばバークホルダー(Burkholder)最小培地[ボスチャン
(Bostian,K.L.)ら、プロシージングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA,7
7、4505(1980)]が挙げられる。培養は通常1
5℃〜40℃、好ましくは24℃〜37℃で10〜14
4時間、好ましくは24〜96時間行い、必要に応じて
通気や攪拌を加えてもよい。
ばバークホルダー(Burkholder)最小培地[ボスチャン
(Bostian,K.L.)ら、プロシージングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA,7
7、4505(1980)]が挙げられる。培養は通常1
5℃〜40℃、好ましくは24℃〜37℃で10〜14
4時間、好ましくは24〜96時間行い、必要に応じて
通気や攪拌を加えてもよい。
【0027】動物細胞などの真核生物細胞を宿主とした
形質転換体を使用する場合には、培地として例えばイー
グル(Eagle)のMEM[H.Eagle、サイエンス(Scienc
e)130、432(1959)]、ダルベッコ(Dulbecco)
の改良イーグル培地(Modified Eagle's Medium)[Or
gad LaubおよびWilliam J.Rutter、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)
258、6043(1983)]などが挙げられる。培養
は通常30〜42℃、好ましくは35℃〜37℃で約1
〜10日間行う。
形質転換体を使用する場合には、培地として例えばイー
グル(Eagle)のMEM[H.Eagle、サイエンス(Scienc
e)130、432(1959)]、ダルベッコ(Dulbecco)
の改良イーグル培地(Modified Eagle's Medium)[Or
gad LaubおよびWilliam J.Rutter、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)
258、6043(1983)]などが挙げられる。培養
は通常30〜42℃、好ましくは35℃〜37℃で約1
〜10日間行う。
【0028】培養終了後、当業者既知の方法で細胞と上
清とを分離する。変異型ヒトリゾチームは上清から得ら
れるが、細胞内に残存する場合には、当分野における通
常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレスなどを
利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵
素による破砕法などにより細胞を破砕した後抽出する。
さらに必要ならば、トリトン−X100、デオキシコー
レートなどの界面活性剤を加え、産生された変異型ヒト
リゾチームを抽出する。得られた変異型ヒトリゾチーム
は、通常のタンパク質精製法、例えば塩析、等電点沈
澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー(HPLC、FPLC等)などに従
って精製することができる。
清とを分離する。変異型ヒトリゾチームは上清から得ら
れるが、細胞内に残存する場合には、当分野における通
常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレスなどを
利用した破砕法、摩砕などの機械的破砕法、細胞溶解酵
素による破砕法などにより細胞を破砕した後抽出する。
さらに必要ならば、トリトン−X100、デオキシコー
レートなどの界面活性剤を加え、産生された変異型ヒト
リゾチームを抽出する。得られた変異型ヒトリゾチーム
は、通常のタンパク質精製法、例えば塩析、等電点沈
澱、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー(HPLC、FPLC等)などに従
って精製することができる。
【0029】このようにして得られた形質転換体培養物
から分離した培養上清並びに菌体中のヒトリゾチーム活
性を後述のアッセイ法で測定し、天然型のヒトリゾチー
ムをコードしている発現ベクターを用いて調製された形
質転換体の場合と比較すると、本発明の変異型ヒトリゾ
チーム形質転換体の培養上清には、従来のものよりもは
るかに多くのヒトリゾチーム活性を有するタンパク質が
分泌されていることが分かった。
から分離した培養上清並びに菌体中のヒトリゾチーム活
性を後述のアッセイ法で測定し、天然型のヒトリゾチー
ムをコードしている発現ベクターを用いて調製された形
質転換体の場合と比較すると、本発明の変異型ヒトリゾ
チーム形質転換体の培養上清には、従来のものよりもは
るかに多くのヒトリゾチーム活性を有するタンパク質が
分泌されていることが分かった。
【0030】即ち、本発明の変異ヒトリゾチーム遺伝子
を含んだ発現ベクターを適当な宿主に導入し、得られた
形質転換体を適当な条件下で培養し、培養上清のヒトリ
ゾチーム活性を有するタンパク質を単離し、所望により
常法にしたがって精製することにより、容易かつ簡便に
一定したヒトリゾチーム活性を有するタンパク質(変異
型ヒトリゾチーム)を得ることができる。以下、実施例
を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。尚、以下の実
施例は単なる例示にすぎず、如何なる意味においても、
本発明を制限するものではない。
を含んだ発現ベクターを適当な宿主に導入し、得られた
形質転換体を適当な条件下で培養し、培養上清のヒトリ
ゾチーム活性を有するタンパク質を単離し、所望により
常法にしたがって精製することにより、容易かつ簡便に
一定したヒトリゾチーム活性を有するタンパク質(変異
型ヒトリゾチーム)を得ることができる。以下、実施例
を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。尚、以下の実
施例は単なる例示にすぎず、如何なる意味においても、
本発明を制限するものではない。
【0031】実施例1 プラスミドpERI 8602の
構築 i) 1.6kb, 8.3kb断片の調製 BamHI用緩衝液[6mM Tris−HCl(pH7.9)、1
50mM NaCl、6mMMgCl2]100μl中で化学合成
したヒトリゾチーム遺伝子を含有しているプラスミドp
GEL125[ヨシムラ(K.Yoshimura)前掲]48.5μ
gに60UのBamHI(ベーリンガーマンハイム山之内製)
を加えて37℃で2時間反応させたのち、常法通り、冷
エタノールを加えてDNAを集めた。このDNAを、上
記BamHI用緩衝液(100μl)中で40UのXhoI(ベ
ーリンガーマンハイム山之内)を加えて37℃で15分
間部分消化したのち、60℃で15分間加熱して反応を
停止させた。この反応液を0.7%アガロース電気泳動
にかけ、1.6kb断片を含むゲルを切り取り、電気泳動
溶出によってゲルから抽出した。
構築 i) 1.6kb, 8.3kb断片の調製 BamHI用緩衝液[6mM Tris−HCl(pH7.9)、1
50mM NaCl、6mMMgCl2]100μl中で化学合成
したヒトリゾチーム遺伝子を含有しているプラスミドp
GEL125[ヨシムラ(K.Yoshimura)前掲]48.5μ
gに60UのBamHI(ベーリンガーマンハイム山之内製)
を加えて37℃で2時間反応させたのち、常法通り、冷
エタノールを加えてDNAを集めた。このDNAを、上
記BamHI用緩衝液(100μl)中で40UのXhoI(ベ
ーリンガーマンハイム山之内)を加えて37℃で15分
間部分消化したのち、60℃で15分間加熱して反応を
停止させた。この反応液を0.7%アガロース電気泳動
にかけ、1.6kb断片を含むゲルを切り取り、電気泳動
溶出によってゲルから抽出した。
【0032】同様の方法で48.5μgのpGEL125
を60UのBamHIで消化し、常法に従ってエタノール
でDNAを沈澱させた。このDNAにBamHI用緩衝液
中で80UのXhoIを37℃で2時間作用させたのち、
前記1.6kb断片と全く同様の方法で、プラスミドpGE
L125からプロモーター、シグナル配列、およびヒト
リゾチームコード領域が除去された8.3kbのBamHI
−XhoI制限断片を調製した。
を60UのBamHIで消化し、常法に従ってエタノール
でDNAを沈澱させた。このDNAにBamHI用緩衝液
中で80UのXhoIを37℃で2時間作用させたのち、
前記1.6kb断片と全く同様の方法で、プラスミドpGE
L125からプロモーター、シグナル配列、およびヒト
リゾチームコード領域が除去された8.3kbのBamHI
−XhoI制限断片を調製した。
【0033】ii) SmaI認識配列を含む合成オリゴマー
の調製 pGEL125のヒトリゾチーム遺伝子の3'末
端側のXhoI切断部位をSmaI切断部位に変換するため
に、常法に従い、5'TCGACCCGGG3'を合成し
た。
の調製 pGEL125のヒトリゾチーム遺伝子の3'末
端側のXhoI切断部位をSmaI切断部位に変換するため
に、常法に従い、5'TCGACCCGGG3'を合成し
た。
【0034】iii) 1.6kb断片と合成オリゴマーの連結 ii)で得た合成オリゴマー(100ng)と1.6kb断片(2
μg)を20μlのライゲーション用緩衝液[50mM Tri
s−HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、20mM ジチ
オスレイトール(DTT)、1mM ATP]に溶かし、T
4DNAリガーゼ(NEB製)800Uを加えて14℃で
一夜反応させ、DNAを結合させた。常法に従い、エタ
ノールを加えてDNAを集めたのち、100μlのBam
HI用緩衝液に溶かし、36UのBamHIを加えて37
℃で1時間反応させ、同様にエタノールを加えてDNA
を集めた。次にこのDNAを50μlのSmaI用緩衝液
[20mM KCl、10mM Tris−HCl(pH8.0)、1
0mM MgCl2、1mM DTT]に溶かし、21UのSma
I(宝酒造製)を加えて30℃で1時間反応させた。これ
を0.7%アガロース電気泳動にかけ、常法通り所望の
部分を切り出し、電気泳動溶出によって1.6kbのBam
HI−SmaI断片を得た。
μg)を20μlのライゲーション用緩衝液[50mM Tri
s−HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、20mM ジチ
オスレイトール(DTT)、1mM ATP]に溶かし、T
4DNAリガーゼ(NEB製)800Uを加えて14℃で
一夜反応させ、DNAを結合させた。常法に従い、エタ
ノールを加えてDNAを集めたのち、100μlのBam
HI用緩衝液に溶かし、36UのBamHIを加えて37
℃で1時間反応させ、同様にエタノールを加えてDNA
を集めた。次にこのDNAを50μlのSmaI用緩衝液
[20mM KCl、10mM Tris−HCl(pH8.0)、1
0mM MgCl2、1mM DTT]に溶かし、21UのSma
I(宝酒造製)を加えて30℃で1時間反応させた。これ
を0.7%アガロース電気泳動にかけ、常法通り所望の
部分を切り出し、電気泳動溶出によって1.6kbのBam
HI−SmaI断片を得た。
【0035】iv) 8.3kb断片と合成オリゴマーの連結 iii)と全く同様にして、1μgの8.3kb断片と100ng
の合成オリゴマーとを連結したのち、同様にBamHI、
およびSmaIで処理して電気泳動にかけ8.3kbのBam
HI−SmaI制限断片を得た。
の合成オリゴマーとを連結したのち、同様にBamHI、
およびSmaIで処理して電気泳動にかけ8.3kbのBam
HI−SmaI制限断片を得た。
【0036】v) 1.6kbBamHI−SmaI断片と8.3k
bBamHI−SmaI断片との連結 iv)で得た8.3kb断片(120ng)と1.6kb断片(360
ng)を100μlのライゲーション用緩衝液((iii)に同
じ)中で800UのT4DNAリガーゼ(NEB製)を加
えて14℃一夜反応させた。その1/5量を用いてE.c
oli DH1を形質転換し、プラスミドpERI 8602
を得た。プラスミドpGEL125およびプラスミドpE
RI 8602の制限酵素切断地図およびプラスミドpE
RI 8602の構築模式図を図2に示す。
bBamHI−SmaI断片との連結 iv)で得た8.3kb断片(120ng)と1.6kb断片(360
ng)を100μlのライゲーション用緩衝液((iii)に同
じ)中で800UのT4DNAリガーゼ(NEB製)を加
えて14℃一夜反応させた。その1/5量を用いてE.c
oli DH1を形質転換し、プラスミドpERI 8602
を得た。プラスミドpGEL125およびプラスミドpE
RI 8602の制限酵素切断地図およびプラスミドpE
RI 8602の構築模式図を図2に示す。
【0037】実施例2 M13mp19XhLZMの構築 i) ヒトリゾチーム遺伝子を含むXhoI−SmaI断片の
調製 実施例1で調製したプラスミドpERI 8602 10
0ngを実施例1記載の方法に従ってXhoI、SmaIで切
断し、シグナル配列コード領域およびヒトリゾチーム遺
伝子を含むXhoI−SmaI制限断片を調製した。
調製 実施例1で調製したプラスミドpERI 8602 10
0ngを実施例1記載の方法に従ってXhoI、SmaIで切
断し、シグナル配列コード領域およびヒトリゾチーム遺
伝子を含むXhoI−SmaI制限断片を調製した。
【0038】ii) M13mp19へのXhoI制限部位の導
入 M13mp19の複製型(RF)(宝酒造製)2.4μgを30
μlのHindIII用緩衝液[50mM NaCl、10mM Tri
s-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mMDTT]中
で27UのHindIII(ベーリンガーマンハイム山之内製)
と37℃で2時間反応させたのち、常法通り冷エタノー
ルを加えてDNAを沈澱させた。一方、常法に従って合
成した2本のオリゴマー5'TCGAGGCCA3'(10
0ng)および5'AGCTTGGCC(100ng)をATP
を含まないライゲーション用緩衝液(前出)20μl中で
80℃、5分処理したのち、室温まで徐々に冷却して二
本鎖とした。この反応液に上で得たHindIII処理したM
13mp19RF500ngとATPを1mMとなるように
加え、14℃で一夜反応させた。次にこの1/10量を
E.coliTG1に感染させ、常法に従いXhoI切断部位
をもったM13mp19RFを得た。この5μgを実施例
1、iii)記載の方法でXhoIおよびSmaIで処理し、エ
タノールで沈澱させた。
入 M13mp19の複製型(RF)(宝酒造製)2.4μgを30
μlのHindIII用緩衝液[50mM NaCl、10mM Tri
s-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mMDTT]中
で27UのHindIII(ベーリンガーマンハイム山之内製)
と37℃で2時間反応させたのち、常法通り冷エタノー
ルを加えてDNAを沈澱させた。一方、常法に従って合
成した2本のオリゴマー5'TCGAGGCCA3'(10
0ng)および5'AGCTTGGCC(100ng)をATP
を含まないライゲーション用緩衝液(前出)20μl中で
80℃、5分処理したのち、室温まで徐々に冷却して二
本鎖とした。この反応液に上で得たHindIII処理したM
13mp19RF500ngとATPを1mMとなるように
加え、14℃で一夜反応させた。次にこの1/10量を
E.coliTG1に感染させ、常法に従いXhoI切断部位
をもったM13mp19RFを得た。この5μgを実施例
1、iii)記載の方法でXhoIおよびSmaIで処理し、エ
タノールで沈澱させた。
【0039】iii) M13mp19XhLZMの構築 i)で調製したXhoI−SmaI断片300ngとii)で調製
したM13mp19を含む大きいXhoI−SmaI制限断片
100ngとを50μlのライゲーション用緩衝液(前出)
中400UのT4DNAリガーゼ(NEB製)と14℃で
一夜反応させ、その1/5量をE.coliTG1に感染さ
せ、M13mp19XhLZMRFを得た。M13mp19X
hLZMの構築模式図を図3に示す。
したM13mp19を含む大きいXhoI−SmaI制限断片
100ngとを50μlのライゲーション用緩衝液(前出)
中400UのT4DNAリガーゼ(NEB製)と14℃で
一夜反応させ、その1/5量をE.coliTG1に感染さ
せ、M13mp19XhLZMRFを得た。M13mp19X
hLZMの構築模式図を図3に示す。
【0040】実施例3 変異ヒトリゾチーム遺伝子の調
製 変異ヒトリゾチーム遺伝子の調製には、オリゴヌクレオ
チド−デイレクテッド・インビトロ、ムタゲネシスシス
テム(アマーシャム社製キット)を用いた。また、操作方
法はアーマシャム社製キット用マニュアルに従った。
製 変異ヒトリゾチーム遺伝子の調製には、オリゴヌクレオ
チド−デイレクテッド・インビトロ、ムタゲネシスシス
テム(アマーシャム社製キット)を用いた。また、操作方
法はアーマシャム社製キット用マニュアルに従った。
【0041】i) Cys77およびCys95をAlaに変換する
ためのオリゴマーの合成 常法に従って次の二本のオリゴマーを合成した。
ためのオリゴマーの合成 常法に従って次の二本のオリゴマーを合成した。
【化1】 ×は変更後の塩基を、( )内は本来の塩基を示す。
【0042】ii) アニーリングおよびライゲーション 実施例2で得たM13mp19XhLZMの単鎖DNA1
0μgを含む溶液(13μl)、5'をリン酸化したオリゴ
マー(I)と(II)(〜1.6pmol/μl)(5μl)、緩衝液I
(7μl)および水(4μl)を混合し、80℃で3分間処理
したのち、室温で30分間放置した。この反応液にMg
Cl2液(10μl)、ヌクレオチド混液1(38μl)、水
(12μl)、クレノーフラグメント(12U)、T4DN
Aリガーゼ(12U)を加え、14℃で一夜反応させた。
反応液をニトロセルロースフィルターで濾過し、未反応
の単鎖DNAを除去したのち、常法に従いエタノールで
DNAを沈澱させ、50μlの緩衝液2に溶解した。
0μgを含む溶液(13μl)、5'をリン酸化したオリゴ
マー(I)と(II)(〜1.6pmol/μl)(5μl)、緩衝液I
(7μl)および水(4μl)を混合し、80℃で3分間処理
したのち、室温で30分間放置した。この反応液にMg
Cl2液(10μl)、ヌクレオチド混液1(38μl)、水
(12μl)、クレノーフラグメント(12U)、T4DN
Aリガーゼ(12U)を加え、14℃で一夜反応させた。
反応液をニトロセルロースフィルターで濾過し、未反応
の単鎖DNAを除去したのち、常法に従いエタノールで
DNAを沈澱させ、50μlの緩衝液2に溶解した。
【0043】iii) 変異DNAを含むプラスミドによる
大腸菌の形質転換 ii)で得たDNA溶液50μlの内10μlに、65μlの
緩衝液3と5UのNciIを加え37℃で90分間反応さ
せて変異していないDNAにニックを入れた。反応後さ
らに500mM NaCl(12μl)、緩衝液4(10μl)、
エキソヌクレアーゼIII(50U)(2μl)を加えて、37
℃で30分間反応させ、ニックを入れたDNAを消化し
た。次に70℃で15分間加熱して酵素を失活させた。
冷却後、ヌクレオチド混液2(13μl)、MgCl2液(5
μl)、DNAポリメラーゼI(3U)、T4DNAリガー
ゼ(2U)を加えて14℃で3時間反応させた。この反応
液10〜20μlを用い、E.coliTG1を形質転換し
た。
大腸菌の形質転換 ii)で得たDNA溶液50μlの内10μlに、65μlの
緩衝液3と5UのNciIを加え37℃で90分間反応さ
せて変異していないDNAにニックを入れた。反応後さ
らに500mM NaCl(12μl)、緩衝液4(10μl)、
エキソヌクレアーゼIII(50U)(2μl)を加えて、37
℃で30分間反応させ、ニックを入れたDNAを消化し
た。次に70℃で15分間加熱して酵素を失活させた。
冷却後、ヌクレオチド混液2(13μl)、MgCl2液(5
μl)、DNAポリメラーゼI(3U)、T4DNAリガー
ゼ(2U)を加えて14℃で3時間反応させた。この反応
液10〜20μlを用い、E.coliTG1を形質転換し
た。
【0044】iv) 変異DNAの調製と変異の確認 iii)で得た形質転換体をYT寒天培地(バクトトリプト
ン8g、バクト酵母エキス5g、NaCl5g、寒天15g、
水1l)にまき、プラークを生じさせた。プラークを採取
し、E.coliTG1に感染させ、これをYT培地で37
℃において一夜、液体培養し、培養上清を集めた。この
上清1mlにPEG/NaCl(20%ポリエチレングリコ
ール6000、2.5MNaCl)200μlを加え、よく
混合して15分間放置したのち、遠心分離して上清を除
去した。沈澱にTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1m
M EDTA、pH8.0)(100μl)および、TE緩衝
液飽和フェノール(50μl)を加えてよく攪拌したの
ち、遠心分離し、水層を採取した。この水層に冷エタノ
ールを加えて、単鎖DNAを沈澱させた。この単離DN
Aを鋳型としてジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法に
よって塩基配列を決定し、目的通り変異したDNAを数
種得た。
ン8g、バクト酵母エキス5g、NaCl5g、寒天15g、
水1l)にまき、プラークを生じさせた。プラークを採取
し、E.coliTG1に感染させ、これをYT培地で37
℃において一夜、液体培養し、培養上清を集めた。この
上清1mlにPEG/NaCl(20%ポリエチレングリコ
ール6000、2.5MNaCl)200μlを加え、よく
混合して15分間放置したのち、遠心分離して上清を除
去した。沈澱にTE緩衝液(10mM Tris−HCl、1m
M EDTA、pH8.0)(100μl)および、TE緩衝
液飽和フェノール(50μl)を加えてよく攪拌したの
ち、遠心分離し、水層を採取した。この水層に冷エタノ
ールを加えて、単鎖DNAを沈澱させた。この単離DN
Aを鋳型としてジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法に
よって塩基配列を決定し、目的通り変異したDNAを数
種得た。
【0045】実施例4 プラスミドpERI 8716の
構築 実施例3、iv)で得た変異DNAをE.coliTG1から常
法によって調製したのち、実施例1、iii)、記載の方法
に従ってXhoIおよびSmaIで処理して、シグナル配列
のコード領域と変異ヒトリゾチーム遺伝子とを含むXho
I−SmaI制限断片(a)を得た。一方プラスミドpERI
8602を同様にXhoIおよびSmaIで処理したの
ち、常法通り電気泳動によって9.5kbのXhoI−Sma
I制限断片(b)を単離した。
構築 実施例3、iv)で得た変異DNAをE.coliTG1から常
法によって調製したのち、実施例1、iii)、記載の方法
に従ってXhoIおよびSmaIで処理して、シグナル配列
のコード領域と変異ヒトリゾチーム遺伝子とを含むXho
I−SmaI制限断片(a)を得た。一方プラスミドpERI
8602を同様にXhoIおよびSmaIで処理したの
ち、常法通り電気泳動によって9.5kbのXhoI−Sma
I制限断片(b)を単離した。
【0046】次いで、これらのDNA断片(a)(b)各10
ngと30ngを20μlのライゲーション用緩衝液中で実
施例1、iii)と同様に反応させて連結し、このライゲー
ション反応混合物でE.coliDH1を形質転換した。形
質転換体から、変異ヒトリゾチーム遺伝子を含有してい
るプラスミド数種を得、その一つをpERI 8716と
命名した。プラスミドpERI 8716の構築模式図を
図4に示す。
ngと30ngを20μlのライゲーション用緩衝液中で実
施例1、iii)と同様に反応させて連結し、このライゲー
ション反応混合物でE.coliDH1を形質転換した。形
質転換体から、変異ヒトリゾチーム遺伝子を含有してい
るプラスミド数種を得、その一つをpERI 8716と
命名した。プラスミドpERI 8716の構築模式図を
図4に示す。
【0047】実施例5 酵母形質転換体の調製 実施例4で得た発現プラスミドpERI 8716を用
い、ヒネンらの方法(前出)に従い、S.セレビシエAH
22R-を形質転換し、形質転換体S.セレビシエAH2
2R-/pERI 8716を得た。この菌株は、工業技
術院微生物工業技術研究所に受託番号FERM P−9
621で寄託されている(寄託日:昭和62年9月24
日)。
い、ヒネンらの方法(前出)に従い、S.セレビシエAH
22R-を形質転換し、形質転換体S.セレビシエAH2
2R-/pERI 8716を得た。この菌株は、工業技
術院微生物工業技術研究所に受託番号FERM P−9
621で寄託されている(寄託日:昭和62年9月24
日)。
【0048】実施例6 S.セレビシエAH22R-/p
ERI 8716の培養 実施例5で得た形質転換体S.セレビシエAH22R-/
pERI 8716を、試験管中のバークホルダー(Burk
holder)[アメリカン・ジャーナル・オブ・ボタニー(A
mer.J.Bot.)30、206(1943)]の改変培地III
(1l当たりKH2PO40.4g、グルコース10g、アス
パラギン5g、シュークロース80gを含有)5mlに接種
し、30℃で72時間振盪培養した。得られた培養液1
mlをそれぞれ上記培地III4mlを含む試験管へ移し、3
0℃で1日振盪培養した。この培養液2mlを上記培地II
I18mlを含む200ml容三角フラスコに移し、30℃
で振盪培養し、48、72、96および120時間後に
培養液を採取し、アッセイ用試料の調製に用いた。
ERI 8716の培養 実施例5で得た形質転換体S.セレビシエAH22R-/
pERI 8716を、試験管中のバークホルダー(Burk
holder)[アメリカン・ジャーナル・オブ・ボタニー(A
mer.J.Bot.)30、206(1943)]の改変培地III
(1l当たりKH2PO40.4g、グルコース10g、アス
パラギン5g、シュークロース80gを含有)5mlに接種
し、30℃で72時間振盪培養した。得られた培養液1
mlをそれぞれ上記培地III4mlを含む試験管へ移し、3
0℃で1日振盪培養した。この培養液2mlを上記培地II
I18mlを含む200ml容三角フラスコに移し、30℃
で振盪培養し、48、72、96および120時間後に
培養液を採取し、アッセイ用試料の調製に用いた。
【0049】実施例7 アッセイ試料の調製 実施例6で得た培養液を遠心分離し、上清と菌体を分離
した。上清はアッセイに供し、菌体は1.2Mスクロー
スを含む50mMリン酸バッファー(pH7.0)で洗浄し
た後、ツィモリアーゼ(Zymolyase)[生化学工業(株)製]
を0.5mg/mlになるように加えた同バッファーに懸濁
し、室温で2時間反応させた。この反応液に4倍量の5
0mMリン酸バッファー(pH7.0)[10mM EDTA、
1mM PMSFを含む]を加え、室温で1時間反応させ
たのち、上清を集めて菌体抽出液とした。
した。上清はアッセイに供し、菌体は1.2Mスクロー
スを含む50mMリン酸バッファー(pH7.0)で洗浄し
た後、ツィモリアーゼ(Zymolyase)[生化学工業(株)製]
を0.5mg/mlになるように加えた同バッファーに懸濁
し、室温で2時間反応させた。この反応液に4倍量の5
0mMリン酸バッファー(pH7.0)[10mM EDTA、
1mM PMSFを含む]を加え、室温で1時間反応させ
たのち、上清を集めて菌体抽出液とした。
【0050】実施例8 変異型ヒトリゾチーム産生量の
測定 実施例7で得た上清と菌体抽出液とを変異型ヒ
トリゾチームのアッセイに供した。ヒトリゾチーム活性
の測定は、ほぼワーシントン・エンザイム・マニュアル
(Worthigton Enzyme Manual、p100、Worthigton
Biochemical Corporation,USA、1972)によっ
た。標準ヒトリゾチームとしてはシグマ(Siguma)社製
を使用した。1単位は、0.1Mリン酸バッファー(pH
6.9)中でマイクロコッカス・ルテウス(Micrococcus
luteus)(生化学工業社製)を基質として25℃で1分間
反応させ、450mμの吸収を0.001減少させるに必
要な酵素量とした。同様の実験を3回行って得たヒトリ
ゾチームの産生量は、以下の表1に示す通りであった。
なお、天然型のヒトリゾチームを産生する形質転換体
S.セレビシエAH22R-/pGEL・CL10(FER
Mp−9285)を対照として同様に培養し、ヒトリゾチ
ーム活性を有するタンパク質の産生量を比較した。結果
を表1に示す。
測定 実施例7で得た上清と菌体抽出液とを変異型ヒ
トリゾチームのアッセイに供した。ヒトリゾチーム活性
の測定は、ほぼワーシントン・エンザイム・マニュアル
(Worthigton Enzyme Manual、p100、Worthigton
Biochemical Corporation,USA、1972)によっ
た。標準ヒトリゾチームとしてはシグマ(Siguma)社製
を使用した。1単位は、0.1Mリン酸バッファー(pH
6.9)中でマイクロコッカス・ルテウス(Micrococcus
luteus)(生化学工業社製)を基質として25℃で1分間
反応させ、450mμの吸収を0.001減少させるに必
要な酵素量とした。同様の実験を3回行って得たヒトリ
ゾチームの産生量は、以下の表1に示す通りであった。
なお、天然型のヒトリゾチームを産生する形質転換体
S.セレビシエAH22R-/pGEL・CL10(FER
Mp−9285)を対照として同様に培養し、ヒトリゾチ
ーム活性を有するタンパク質の産生量を比較した。結果
を表1に示す。
【0051】
【表1】 形質転換体 ヒトリゾチーム(mg/l培養) 上清 菌体 S.cerevisiaeAH22R- 16.4 0.1 /pERI 8716(No.1) S.cerevisiaeAH22R- 18.5 0.1 /pERI 8716(No.2) S.cerevisiaeAH22R- 19.3 0.2 /pERI 8716(No.3) S.cerevisiaeAH22R- 16.7 0.1 /pERI 8716(No.4) S.cerevisiaeAH22R- 3.5 1.5 /pGEL・CL10
【0052】表1から、本発明の変異型ヒトリゾチーム
をコードしている形質転換体は、従来のものと比較し
て、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質の分泌量ま
たは分泌効率が飛躍的に改善されていることが分る。
をコードしている形質転換体は、従来のものと比較し
て、ヒトリゾチーム活性を有するタンパク質の分泌量ま
たは分泌効率が飛躍的に改善されていることが分る。
【0053】実施例9 分泌された変異型ヒトリゾチー
ムの精製 実施例5で得た形質転換体S.セレビシエAH22R-/
pERI 8716を実施例6に示した培地5mlを含む試
験管3本に接種し、30℃で3日間振盪培養した。上記
培地18mlを含有する200ml容三角フラスコを5本用
意し、その各々に、上の培養液2mlを移し、30℃で1
日振盪培養した。次に上記培地200mlを含有する1l
容三角フラスコを5本用意し、その各々にこの培養液2
0mlを移し、30℃で4日間培養した。この培養液を遠
心分離機にかけ、上清と菌体を分離した。この上清(約
1l)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)で平
衡化した陽イオン交換樹脂(CM−Toyopearl 650
C)カラム(1.6cm×36cm)に吸着させ、同緩衝液50
0mlで洗浄後、0.5M NaClを含む同緩衝液で溶出し
た。溶出液を5mlずつ分取し、各フラクションについて
実施例8に従ってリゾチーム活性を測定した。リゾチー
ム活性が最大となるフラクションから200μlを取
り、逆相高速液体クロマトグラフィー(TSKgel OD
S120Tカラム)により、さらに精製した。溶出は、
0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの0〜
100%の30分間の直線濃度勾配により行い、280
nmの吸収ピークを分取した。この分取液の溶媒を減圧
下、蒸発させ、乾燥粉末として変異型ヒトリゾチームの
精製標品を得た。
ムの精製 実施例5で得た形質転換体S.セレビシエAH22R-/
pERI 8716を実施例6に示した培地5mlを含む試
験管3本に接種し、30℃で3日間振盪培養した。上記
培地18mlを含有する200ml容三角フラスコを5本用
意し、その各々に、上の培養液2mlを移し、30℃で1
日振盪培養した。次に上記培地200mlを含有する1l
容三角フラスコを5本用意し、その各々にこの培養液2
0mlを移し、30℃で4日間培養した。この培養液を遠
心分離機にかけ、上清と菌体を分離した。この上清(約
1l)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)で平
衡化した陽イオン交換樹脂(CM−Toyopearl 650
C)カラム(1.6cm×36cm)に吸着させ、同緩衝液50
0mlで洗浄後、0.5M NaClを含む同緩衝液で溶出し
た。溶出液を5mlずつ分取し、各フラクションについて
実施例8に従ってリゾチーム活性を測定した。リゾチー
ム活性が最大となるフラクションから200μlを取
り、逆相高速液体クロマトグラフィー(TSKgel OD
S120Tカラム)により、さらに精製した。溶出は、
0.1%トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの0〜
100%の30分間の直線濃度勾配により行い、280
nmの吸収ピークを分取した。この分取液の溶媒を減圧
下、蒸発させ、乾燥粉末として変異型ヒトリゾチームの
精製標品を得た。
【0054】実施例10 精製変異型ヒトリゾチームの
分析 実施例9で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品につ
いて比活性を測定した。タンパク質の定量は市販のヒト
リゾチーム(シグマ社)を標準としてプロティンアッセイ
試薬(バイオラッド社)を用いて行った。その結果、市販
の天然型ヒトリゾチームの比活性を100としたとき、
変異型ヒトリゾチームの比活性は90±5であった。次
に、この精製した変異型ヒトリゾチームについてN末端
9残基のアミノ酸配列の決定を行った。N末端配列の決
定は、精製標品7μgを用い、プロティン・シーケンサ
ー(Applied Biosystems社、477A)により自動的に
行った。結果を以下の表に示す。
分析 実施例9で精製した変異型ヒトリゾチーム精製標品につ
いて比活性を測定した。タンパク質の定量は市販のヒト
リゾチーム(シグマ社)を標準としてプロティンアッセイ
試薬(バイオラッド社)を用いて行った。その結果、市販
の天然型ヒトリゾチームの比活性を100としたとき、
変異型ヒトリゾチームの比活性は90±5であった。次
に、この精製した変異型ヒトリゾチームについてN末端
9残基のアミノ酸配列の決定を行った。N末端配列の決
定は、精製標品7μgを用い、プロティン・シーケンサ
ー(Applied Biosystems社、477A)により自動的に
行った。結果を以下の表に示す。
【0055】
【表2】
【図1】 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列、およ
びそれをコードしている化学合成したヌクレオチド配列
を示す配列図である。
びそれをコードしている化学合成したヌクレオチド配列
を示す配列図である。
【図2】 プラスミドpERI 8602の構築模式図、
並びにプラスミドpGEL125およぴプラスミドpER
I 8602の制限酵素切断地図である。
並びにプラスミドpGEL125およぴプラスミドpER
I 8602の制限酵素切断地図である。
【図3】 M13mp19XhLZMの構築模式図であ
る。
る。
【図4】 プラスミドpERI 8716の構築模式図、
並びに制限酵素切断地図である。
並びに制限酵素切断地図である。
Claims (3)
- 【請求項1】 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の
第77位および第95位のシスティンがアラニンで置き
換えられたポリペプチドをコードしている変異ヒトリゾ
チーム遺伝子。 - 【請求項2】 天然型ヒトリゾチームのアミノ酸配列の
第77位および第95位のシスティンがアラニンで置き
換えられたポリペプチドをコードしている変異ヒトリゾ
チーム遺伝子と、シグナルペプチドをコードしているヌ
クレオチド配列とを含有し、真核生物内で自律的に複製
可能な変異型ヒトリゾチーム発現ベクター。 - 【請求項3】 プラスミドpERI 8716である請求
項2記載の発現ベクター。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20427195A JP2538541B2 (ja) | 1995-08-10 | 1995-08-10 | 変異型ヒトリゾチ―ムをコ―ドする遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP20427195A JP2538541B2 (ja) | 1995-08-10 | 1995-08-10 | 変異型ヒトリゾチ―ムをコ―ドする遺伝子 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP24528487A Division JPH0829092B2 (ja) | 1987-09-29 | 1987-09-29 | 変異型ヒトリゾチーム |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0838180A JPH0838180A (ja) | 1996-02-13 |
JP2538541B2 true JP2538541B2 (ja) | 1996-09-25 |
Family
ID=16487716
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP20427195A Expired - Lifetime JP2538541B2 (ja) | 1995-08-10 | 1995-08-10 | 変異型ヒトリゾチ―ムをコ―ドする遺伝子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2538541B2 (ja) |
-
1995
- 1995-08-10 JP JP20427195A patent/JP2538541B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0838180A (ja) | 1996-02-13 |
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