JPH02114163A - 生物培養容器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生物を培養するための容器に関するものであ
り、特に培養中の生物（微生物、動物細胞、植物細胞等
）ａ度のオンライン計測が可能となる生物培養容器に関
するものであり、さらに詳細には、１！気容量（誘電率
）を測定することにより生物濃度、生物の増殖活性を同
時に計測できる容器に関するものである。したがって本
発明は、バイオインダストリをはじめ、医療１食品工業
といった分野において非常に重要な役割を果たすもので
ある。

（従来の技術） 各種微生物、動・植物細胞等を用いて有用物質を生産す
るバイオリアクタや培養装置は、その内部の生物細胞濃
度が時々刻々変化するものであり、バイオリアクタ、培
養装置の制御を行ったり、発酵槽内部状態を知る上で生
物１度、生物増殖活性を１ｌｌｑ定することが非常に重
要である。

バイオリアクタ等において、細胞の大きさが小さい各種
微生物の場合は、！＠濁濁液液した場合に限り、培養液
中の微生物の各種光学的性質に基づいて微生物濃度を測
定することが一応は可能である。しかし、ａ度が高くな
るとフロックを形成するカビや、微生物に比較して体積
が大きく、またフロックを形成する場合が多い植物細胞
や動物細胞では、乾燥重量や細胞の湿体績を求めたり、
懸濁液の一部を取り出し細胞や核を染色した後、顕微鏡
下で細胞数をカウントする等の方法がとられるのが通例
である。また光学的手法により計測可能な微生物におい
ても、濃度が高くなったり、また静置培養の場合のよう
に沈降した状態で増殖する際には、　１ｌ１１１定が困
難であった。

特に、リンホカインその他方用な生理活性物質を産生ず
る動物細胞にあっては、培養容器の器壁に付着ししかも
単層でしか人工培養できない種類のものが多数存在する
が、このような細胞自体を測定するための有効な決定的
な方法すらなく、ましてやオンラインで測定しながら、
システマティックに培養を行うことのできる容器は全く
知られていない。

これら既知の培養容器を用いて濃度測定をしながら培養
するには、いずれのタイプの容器を採用しようとも、オ
ンライン計測することはできないためリアクタや培養装
置からその都度細胞をサンプリング法により採取しなけ
ればならず、培養系への雑菌汚染の危険性が大きく、雑
菌汚染のため高価な培養液を廃棄しなければならないこ
とが多く、培養効率の向上が望まれていたのである。ま
た生物濃度等の情報をリアクタや培養装置のオンライン
制御等に反映することは不可能であり、細胞をサンプリ
ングすることなく、オンラインで生物濃度を測定できる
方法の開発が重要視されてきたのである。

上記の問題点の解決策として、本発明者により、電気容
量（誘電率）および／又は電気伝導度（導電率）を利用
して生物濃度を測定する方法が見いだされ、フロック状
になった菌体・細胞や固定化菌体・細胞を壊すことなく
測定することが一応は可能となった（特願昭６２−２２
４８１）。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、従来のこの計測方法では一般に測定電極を相対
する位置に置き平行電極を形成して両電極間の電気容量
、電気伝導度を測定していた。しかしｉｌｌ’ｌ定対象
が培養器の底面付近に沈降した状態や、付着して増殖す
る場合にはａｊす定が困難であった。

特に、上記したように付着培養によって増殖する細胞に
はリンホカイン産生性等特に有用なものが多いが、この
ような細胞の培養にあっては、上記した電気的方法を利
用して細胞濃度を測定しながら培養することは非常に困
難であった。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記の技術の現状に鑑みてなされたものであ
って、光学的測定システム等既知のシステムにとって代
る新しいシステムを備えた培養容器を開発する目的でな
されたものである。

そして特に本発明は、上記した電気的測定システムに着
目し、それを大巾に改良して、浮遊生物のみならず付着
ないし沈降生物にあっても、培養液を遂−サンプリング
することなく、生物濃度および生物の増殖活性を電気容
量により容易に測定するためになされたものである。

この目的を達成するために、上記した電気的測定システ
ムを利用した培養装置について各方面から鋭意検討した
結果、特に電極に注目すべきであるとの知見を得た。そ
して更に電極の種類、材料、設置数、設置位置、設置方
法等について広範な研究を行った。その結果、先ず、設
置方法が重要であるとの新知見を得た。

そこで、この目的を達成するため電極の設置方法につい
て検討した。まず培養容器内に電極をとりつけたセンサ
を挿入する方法と、容器内面に電極を装着する方法とを
比較したが、電極間距離が短かくてよい場合には、電極
から３１ｇ定装置までの距離を短かくできる装着型が優
れている６また装着型は、容器壁面に電極を張り付けて
いるだけであるため、培養容器内の生物にダメージを与
える可能性は皆無である。これに対して、挿入型ではセ
ンサ部に細胞等が衝突することによって破壊される等の
ｉｉｆ能性がある。そのうえ、挿入型にあっては、挿入
されたセンサ部のために、培養容器内の空間部がせまく
なり、撹拌器を設けて撹拌するのが難しくなるし、温度
計の挿入等にも支障をきたす。したがって、電気的シス
テムを利用する場合であっても、これらの面では挿入型
は好ましくないことが判明した。

そこで、装着型に着目して、電極の装着位置について検
討した。

電極を壁面に装着した場合に比較して、培養容器の底面
に装着することにより次のような利点があることが分っ
た。１）培養器と誘電測定装置とのアダプタの標準化が
可能となる。２）培養液が少量の場合にも測定できる。

３）生物が沈降した状態のままｉｌｌ！Ｉ定できる。と
くに２）、３）については、電極を壁面に装着するタイ
プのものでは劃定か非常に困難である。このようにして
、電極装着位置等の検討を加えた結果、複数の電極を底
面に装着した培養容器を用いることにより、生物濃度お
よび増殖活性を容易に測定することを可能にしたのであ
る。

本発明においては、このように装着した電極を用いて、
誘電率、導電率等電気伝導度、電気容量を測定し、もっ
て菌体量を測定するのである。

誘電率の測定から菌体量を算出するには、前記した本発
明者らの開発したシステムを利用するのがよい。例えば
、誘電率は、電極、リアクタ等の形状の影響を受けるた
め、予じめ菌体を含まない状態での周波数特性を求めて
おき、測定対象の周波数特性から減じることにより１周
波数変化に対する誘電率変化を求める。この際、菌体量
の変化に対して最も著しい変化を示す周波数での値を採
用してもよいし、適当な周波数帯域（数Ｈｚ〜数Ｍｌｌ
ｚ）の値から算出してもよい。

この場合子じめ、６１す定に用いる電極、リアクタにお
いて誘電率と菌体量との関係を求めておけば。

誘電率から容易に菌体量の算出が可能となる。

次に導電率は、電気の通り易さを示すものであるから、
溶液中のイオン濃度に大きく影響される。

そこで、菌体を含まない状態での導電率を求め、この値
で正規化した相対導電率を求めておく。この相対導電率
を求めることにより、測定系のイオン１度の影響を除去
して菌体量の測定をすることが可能となったのである。

導電率測定においては、周波数を数ｌｌｚ〜数Ｍｌ＋７
゜まで変化させて測定すると周波数の変化に拘らずほぼ
一定の値を示す範囲が存在するので、この値を導電率と
して採用する。

そして実際に菌体量を算出するには、まず１ｌｌｌ＋定
対象の導電率を求め、これから相対導電率を算出する。

このとき菌体を含まない場合の導電率を予じめ求めても
よく又は同時に求めてもよい。そして、これらの導電率
及び予じめ求めておいた菌体量を求めるための係数から
、実際の菌体量を算出するのである。

このようにして、培養容器、リアクタ等を破壊すること
なく、オンラインで菌体量の測定をしながら培養ができ
るのである。

本発明の培養容器は、電気伝導度、電気容量を測定する
ための複数の電極を容器底部に装着してなるものであっ
て、例えば第１図に図示したような各種容器が例示され
る。

第１図は１本発明に係る培養容器の実施例を図示したも
のであって、図中１は′ｒ！！極を表わし、２は培養容
器本体ないしリアクタを表オ〕す。いずれの実施例にお
いても、電極１は容器２の底部に複数個設置されている
（ただしくＣ）においては電極数は３個であり、他は２
個設置した実施例を図示した）。

第１図において、（ａ）は角型培養フラスコ、（ｂ）は
振どう培養等も可能な三角培養フラスコ、（Ｃ）はメリ
クロンローラ回転培養等も可能な試験管培養フラスコ、
（ｄ）はビン型培養フラスコ、（ｅ）は、細胞培養フラ
スコにそれぞれ電極を底面装着したものである。容器の
材料としては、ガラス、プラスチック、各種複合材等業
界既知の材料が適宜使用される。（ｆ）は、生物量の計
ｉ！＋１１を行う場合を図示したものであって、リアク
タ（培養容器：ここでは角型培養フラスコを図示）２に
は、その内部に培養液３を収容するとともに、その底部
には電極１を設置しておく。電極の設置数は１対又はそ
れ以上とする。図中、４は培養液３の液面を表わし、５
は生物（ここでは細胞）を表わす。

測定装置６としては、測定周波数が固定の装置でも使用
可能であるが、複数の周波数で電気容量の測定ができる
タイプのものを使用するのが好ましい。測定結果は、ヒ
トが読み取りマニュアルによって生物量を算出してもよ
いし、インターフェースを介してコンピュータ（図示せ
ず）にデータを転送し、自動的に生物量を算出してもよ
い。

なお培養中の生物濃度を連続的に測定することが可能で
あるが、従来と同様、静置培養、振とう培養、メリクロ
ンローラ回転培養器等の方法で培養し、生物濃度、増殖
活性等をチエツクする必要のあるとき計測装置上にセッ
トして測定すれば、多数の試料について測定できる。第
１図（ｆ）においては、計測装置６として、ＬＣＲメー
タ等誘等率電率測定装置示した。

つぎに上記の培養容器を用いた実施例について述べるが
、これらは単なる例示であって、なんら本発明を制限す
るものではない。

実施例１ 植物細胞の増殖培養に通常用いられる第１表の組成の基
本培地（植物細胞培養マニュアル；講談社）に、ナフタ
レン酸５ＸｌＯ−’Ｍ、ベンジルアデニンｌ　Ｘ　１０
−’Ｍを添加シタ培地１００ｍＱを、第１図（ｂ）ニ示
す電極を装着した５００Ｉ１１１２三角フラスコに分注
し１２０℃で１５分間殺菌した。これにあらかじめ培養
して得た、ごま（Ｓｅｓａｍｕｍ　ｉｎｄｉｃｕｍ　Ｌ
）の増殖細胞を１０１１１１移植して、２８℃、１２，
０００ルツクス、７５回転／毎分の撹拌装置の条件で２
週間培養した。なお同じ試料を複数個作製し、電気容量
を測定するとともに、湿重量を同時に求めた。

第２図に培養中の電気容量値（８１１１定周波数１００
に１１Ｚ）および湿重量の変化をしめした。両者間に非
常に良い一致をみることができ、底面に電極を装着した
培養容器をもちいて細胞濃度、増殖活性を容易に測定で
きた。

硝酸カルシウム 塩化カリウム 硫酸マグネシウム リン酸第１カリウム ホウ酸 硫酸マンガン 硫酸亜鉛 ヨーソカリウム モリブデン酸ナトリウム 塩化コバルト 硫酸銅 エチレンジアミン４酢酸ナトリウム 硫酸第１鉄 ミオイノシトール グリシン 塩酸ピリドキシン ニコチン酸 塩酸チアミン しよ糖 水 ｐＨ５，７ １、９００ ／１４０ ０．５ ０．５ ０．１ ０ｇ １、　ＯＯＯ＋ｓＱ 実施例２ 動物細胞の培養に通常用いられている方法（細胞培養マ
ニュアル：ｍ談社）により、ヒト由来の骨髄性白血病絹
胞株に−５６２の細胞を培養した。すなわち通常用いら
れているＲＰＭＩ−１６４０培地（大日本製薬１）に１
０％の牛胎児血清を加えた培養液１０１を、第１図（ａ
）に示す一対の電極を装着した直径１０ｃ＋ｏの細胞培
養用プラスチックデイツシュに分注した。これに前記の
ヒト細胞を２ＸＩＯ’個／ＩＩＩＱになるようにして、
移植し、５％炭酸ガスインキュベータ中で３７℃にて４
日間静置培養した。なお実施例１と同様複数の試料を作
製し、電気容量を測定するとともに、測定後、ビリケル
チュールク血球計数板により各試料中のヒト細胞の数を
顕微鏡により測定した。なお電気容量から細胞濃度の算
出はあらかじめ求めておいたｉｌｌ’Ｊ定周波数３００
ＫＩＩｚにおける電気容量値と細胞濃度との関係から算
出した。

第３図のように両者間に非常に良い一致をみることがで
き、底面に電極を装着した培養容器をもちいて細胞濃度
、増殖活性を容易に測定できた。

実施例３ 第２表に示した組成の培地１０ｎ＋Ｕを試験管にとり、
常法により蒸気滅菌して培地を調製した。これに酵母（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに
７）を移植した後、２８℃で約２４ｈｒ静置培養した。

次に第１図（ｂ）に示す電極を装着した５００ＩＩＩＮ
三角フラスコに別に調製した培地１５０ｍＱを分注し、
　１２０℃で１５分間殺菌した培地に移植し約５０ｈｒ
振どう培養した。なお同じ試料を複数個作製し、電気容
量を測定するとともに、乾燥重量により菌体量を求めた
。

第４図は菌体量（乾燥型：！ｉ）と測定周波数３００Ｋ
Ｈｚにおける電気容量値との関係であるが１両者間に非
常に高い直線関係（相関係数０．９９）のあることがわ
かった。第５図に培養中の電気容量（測定周波数３００
ＫＩＩｚ）の変化を示す。図のように誘導期、対数増殖
期をへて定常期にいたる増殖特性かえられ、底面に電極
を装着した培養容器をもちいて菌体濃度、増殖活性を容
易に測定できた。

第２表 グルコース 酵母エキス リン酸二水素カリウム 硫酸アンモニウム 硫酸マグネシウム 水 ００ｇ ０．５ １００軸Ｑ （発明の効果） 本発明は、従来サンプリング操作が必要であった生物濃
度や増殖活性を、電気容量（誘電率）を測定するという
全く新規な方法を採用することによって可能とするため
の培養容器において、培養液が少量の場合でも、また生
物が沈降した状態でもオンラインで測定可能とする従来
なしえなかった新規にして卓越した効果を有するもので
ある。

したがって本発明によれば、動物細胞および植物細胞量
を非破壊的に測定することができ、バイオテクノロジー
、ワクチン製造、動物細胞および植物細胞を用いる実験
、研究の技術分野、その地番方面において広く本発明を
利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係る培養容器（ａ＝ｅ）、及び生物
量計測システム（ｆ）を図示したものである。 第２図は、ゴマ細胞の培養日数と、電気容量、湿重量と
の関係を図示したものであり、図中。 ・−は電気容量、−〇−は湿重量をそれぞれ表わす。 第３図は、ヒト由来の骨髄性白血病細胞の培養１］数と
細胞数との関係を図示したものであり、図中、−・−は
ヘマサイトメータによる測定値、及び○−は電気容量に
よる測定値をそれぞれ表わす。 第４図は、酵母（サツカロミセス・セレビシェ）の菌体
濃度と電気容量との関係を図示したグラフであり、第５
図は、同酵母培養中の電気容量の変化を図示したグラフ
である。 第　　１ ［７１ｆｄｌ ｆ１ 了（〔） 代理人　弁理士　戸　１）親　男 第 図 焙表日数／ 日 第 図 歯体濃度／　ｍｇｍｔ’

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 複数の電極を容器底部に装着してなることを特徴とする
   ガラスまたはプラスチック製生物培養容器。