CN214937363U - 一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及免疫层析设备技术领域,具体涉及一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,包括培养容器,在培养容器的底部设有软质固体层,所述软质固体层中***有样品。本方案解决了现有技术的菌斑生物膜立体培养操作繁琐或成本高昂的技术问题,本方案对样品的材质或者形状没有特别要求,且使用本设备只要遵守普通无菌操作原则,在实验过程中不易产生污染,且能实现取出单个样品进行测试而不影响其它样品试验进程,特别适合用于大规模测试验证过程。
Description
技术领域
本实用新型涉及免疫层析设备技术领域,具体涉及一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备。
背景技术
菌斑生物膜是多种微生物细胞和胞外多聚物基质组成的复杂的三维结构,它粘附和定植于固体支持物表面(例如牙齿表面)。同浮游状态的同种细菌相比,菌斑生物膜上的细菌具有更强的耐药性、毒力及对抗宿主免疫防御的能力。因此,在抗菌物质的研究中,不仅需要研究这些抗菌物质对浮游状态的细菌的抑制作用,更需要研究抗菌物质对菌斑生物膜上的细菌的抑制作用。建立菌斑生物膜的体外模型,是研究抗菌物质对菌斑生物膜上的细菌的抑制作用的常规方式,也是抗菌物质临床前或上市前研究的必经过程。
市面上有多种多样的用于建立菌斑生物膜的体外模型的设备,例如:Innovotech公司已商品化的生物膜测定专用96孔板MBEC该设备在培养盖上设置了多个活动椿钉,在椿钉上涂抹涂层(羟基磷灰石、纤维素和二氧化钛等),在该涂层上形成菌斑生物膜,可同时对多种不同浓度的抑菌物质进行测试,是一种有效的抑菌剂筛选工具(Innovotech,MBEC)。但是,该工具不适合于不能制作成涂层的物质,且该工具价格昂贵。针对于有些不适合于制备成涂层的物质,例如牙片等,Sande等设计了一种使用正畸用铁丝将牙片样品固定的方法,然后将固定后的牙片以垂直于培养皿底部的方式放入培养皿,从而在立体的牙片上形成菌斑生物膜(F.H.van de Sande,M.S.Azevedo,R.G.Lund,M.C.D.N.J.M.Huysmans,and M.S.Cenci,“An in vitro biofilm model for enameldemineralization and antimicrobial dose-response studies,”Biofouling,vol.27,no.9,pp.1057–1063,2011,doi:10.1080/08927014.2011.625473.)。此方法成本低廉,且能同时对多种样品进行测试,但是制备过程相当繁琐,且易在操作过程中造成污染。Exterkate等采用直接将牙片等物质竖直地固定在培养皿盖上的方法,从而在立体的牙片上形成菌斑生物膜(R.A.M.Exterkate,W.Crielaard,and J.M.Ten Cate,“Differentresponse to amine fluoride by streptococcus mutans and polymicrobial biofilmsin a novel high-throughput active attachment model,”Caries Res.,vol.44,no.4,pp.372–379,2010,doi:10.1159/000316541.)。但是采用这种方法,牙片的角度不能调整,不能对菌斑生物膜形成的环境进行充分地模拟。并且该法制作过程繁琐,在操作过程中易造成污染,影响测试结果。
综上,由于现有技术中的建立生物膜立体培养的体外模型的方法和设备均存在不同程度的缺陷,亟需开发出一种操作简便、避免污染产生且能够在不适合作为涂层的物质上进行菌斑生物膜的立体培养的设备。
实用新型内容
本实用新型意在提供一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,解决了现有技术的菌斑生物膜立体培养操作繁琐的技术问题。
为达到上述目的,本实用新型采用如下技术方案:
一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,包括培养容器,在培养容器的底部设有软质固体层,所述软质固体层中***有样品。
本方案的使用方法、原理及优点是:首先制备琼脂溶液,然后将灭菌后的琼脂溶液在凝固前注入培养容器中。待琼脂冷却凝固形成软质固体后,将样品以一定角度***软质固体层,然后在培养容器中加入用以培养菌斑生物膜的培养液(例如分散有细菌的液体培养基)。盖上培养容器盖,经过一定时间的培养,可在样品的表面上形成菌斑生物膜。采用本方案,将样品固定在培养容器中的操作非常简便,不像现有技术中方法,不用将样品通过螺钉等结构固定在培养容器盖上,也不用使用正畸用铁丝特制固定样品的结构。本方案不但给样品的固定带来了方便,也简化了样品的取出过程,且每个样品可以单独取出。并且采用本方案的方式,可以将样品以任意角度***软质固体层中。因为样品的倾斜角度可以影响细菌沉积和附着的速度,以及影响菌斑生物膜的形态和富集程度等。本方案可以很方便地对样品的空间位置和菌斑生物膜的形成之间的关系进行研究。
综上所述,本方案的用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备简化了样品在培养容器的固定过程,特别是能够很方便地将样品固定于不同的空间位置(可实现不同的倾斜角度),实现体外立体培育生物膜,模拟菌斑生长结构。并且,立体培养菌斑生物膜,相对于平面培养(例如在培养容器的底部培养一层菌斑生物膜),可避免未黏附的浮菌对测试结果造成的影响。本方案适用性广泛,待测样品可以是棒状、片状以及管状等多种形状,也可以是金属、羟基磷灰石、玻璃、牙组织切片等多种材质,只要能够被***软质固体层中固定,便可进行试验测试。若无特别需求,无需制成特定形状,对材质没有特别要求。由于操作流程的简化,使用本方案不易在正确的无菌操作中发生污染现象,且能实现取出单个样品进行测试而不影响其它样品试验进程,特别适合用于大规模测试验证过程。
优选的,作为一种改进,所述样品为硬质片状物。
采用上述技术方案,片状的物质表面平整,更有利于形成菌斑生物膜后对其进行观测。
优选的,作为一种改进,所述软质固体层的厚度为0.25-0.3mm;所述软质固体层的材质为琼脂凝胶。
采用上述技术方案,上述厚度能够在稳固样品的前提下,最大限度地暴露待测的样品参与试验。琼脂凝胶具有一定硬度,可以用于固定样品,并且琼脂凝胶不含细菌可吸收利用的营养物质,对细菌生长无影响,不会影响细菌在样品上形成菌斑生物膜的过程。
优选的,作为一种改进,所述培养容器的数量为若干个。
采用上述技术方案,可以同时研究不同抑菌剂的作用效果,或者同种抑菌剂不同作用浓度的效果(研究获得浓度-效应曲线),或者可以同时研究同一抑菌剂在同一浓度、不同的作用时间下的效果(研究获得时间-效应曲线)。
优选的,作为一种改进,所述硬质片状物与所述软质固体层之间的夹角为30°、60°或者90°。
采用上述技术方案,上述情况是实验中经常采用的硬质片状物的倾斜角度。实际上硬质片状物与软质固体层可以呈任意夹角,硬质片状物的倾斜角度的不同可以影响细菌在硬质片状物上沉积和附着的速度,以及影响菌斑生物膜的形态和富集程度等。本方案的设备可以实现多方位和多角度的菌斑生物膜的培养,对充分研究菌斑生物膜的形成规律以及相关的抑菌剂创造条件。
优选的,作为一种改进,还包括用以辅助硬质片状物以指定角度***软质固体层的角度辅助单元。
采用上述技术方案,使用角度辅助单元可以更精确地确认硬质片状物的倾斜角度,而不是凭经验将硬质片状物以一定角度***软质固体层,使得研究过程更为准确。
优选的,作为一种改进,所述角度辅助单元为三棱柱状。
采用上述技术方案,上述角度辅助单元结构简单易于制作。
优选的,作为一种改进,所述角度辅助单元的横截面的三个顶角的角度分别为30°、60°和90°。
采用上述技术方案,30°、60°或者90°是经常采用的硬质片状物的倾斜角度,所以也将三个顶角的角度分别定为30°、60°和90°
优选的,作为一种改进,还包括用于限定所述软质固体层厚度的厚度辅助单元。
采用上述技术方案,因为软质固体层的厚度需要维持在0.25-0.3mm,在将琼脂溶液注入培养容器时,操作者都是根据经验添加,很容易出现软质固体层过厚或者过薄的情况,所以在本方案中特别设置了厚度辅助单元。
优选的,作为一种改进,其特征在于,所述厚度辅助单元包括定位片,所述定位片中间开设有中间孔,所述定位片距所述培养容器的底部的距离为0.25-0.3mm,所述定位片挂在所述培养容器的上端。
采用上述技术方案,如果使用的培养容器来自于商业化的孔板或者培养皿,通常这些产品上都不会有标识软质固体层的厚度的结构,本方案的厚度辅助单元可适用于多种商业化的孔板或者培养皿。
附图说明
图1的实施例1的一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备的立体示意图。
图2为实施例1的培养容器的正视图(含硬质片状物,硬质片状物与软质固体层的夹角为60°)。
图3为实施例1的培养容器的正视图(含硬质片状物,硬质片状物与软质固体层的夹角为90°)。
图4为实施例2的一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备的正视图
图5为实施例2的角度辅助单元的立体示意图。
图6为实施例3的培养容器组的俯视图。
图7为实施例4的一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备的纵向剖视图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明:
说明书附图中的附图标记包括:培养容器1、软质固体层2、硬质片状物3、角度辅助单元4、第一平面5、第二平面6、第三平面7、水平杆8、连接杆9、定位片10、连接筒11、中间孔12、培养容器组13、培养容器盖14。
实施例1
如图1所示,一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备包括培养容器1和软质固体层2,软质固体层2位于培养容器1底部。培养容器1可以为现有技术中的各种型号的培养皿(即上方开口的圆柱形的容器),也可以为其他形状的上方开口的容器(例如长方体状或者三棱柱状)。培养容器1上方盖有培养容器盖14,软质固体层2中***有样品。软质固体层2的厚度为0.25-0.3mm,且其成分为琼脂凝胶,上述厚度能够在稳固样品的前提下,最大限度地暴露待测的样品参与试验。样品是供菌斑生物膜附着的基质,可以是任意形状的可***软质固体层2的固体物质,可以是棒状、片状以及管状等,也可是不规则形状。样品的材质可以是金属、羟基磷灰石、玻璃、牙组织切片等,选择不同材质的样品可以实现不同的检测目的。例如选择牙组织切片作为样品,使用本方案的设备可以研究菌斑生物膜在牙组织中形成的规律,或者抗菌物质对牙组织上的菌斑生物膜的抑制效果等等。例如选择金属作为样品,可以研究菌斑生物膜对金属材料(例如需在水环境中使用的金属材料)的腐蚀规律,或者测试抗菌抗腐蚀剂对金属材料上附着的菌斑生物膜的抑制作用。在本方案中选择使用片状的样品,即为硬质片状物3,因为片状的物质表面平整,更有利于形成菌斑生物膜后对其进行观测(例如在激光共聚焦显微镜下观察等),避免由于菌斑生物膜的培养失败造成的实验模型建立失败。硬质片状物3可以为金属片、岩石片、玻璃片、羟基磷灰石压片和牙片等。
本方案的软质固体层2由如下方法制备:将琼脂分散于去离子水中,琼脂的质量分数为1.5-2%,获得琼脂分散液,然后将琼脂分散液使用常规的湿热灭菌法进行灭菌(通常为121℃湿热灭菌15min),获得无菌的琼脂溶液。同样的,培养容器1和培养容器盖14也需要通过湿热灭菌实现无菌化处理,或者也可以选用商业化的无菌培养皿。然后在无菌操作台中,将灭菌处理的琼脂溶液倒入培养容器1中,待琼脂溶液冷却后,可凝固形成琼脂凝胶,进而形成本方案的软质固体层2。另外,琼脂的质量分数是决定琼脂凝胶硬度的关键因素,质量分数越大,琼脂凝胶就会越硬,形成的琼脂溶液就会越粘稠。本方案的设备不同于现有技术中常规的培养基平板(即在培养皿底部设置一层固体培养基层)。现有技术中的培养基平板的固体培养基层的厚度远大于0.3mm,并且固体培养基层的成分除了琼脂还包含有营养成分。因为固体培养基层是为细菌生长提供支持和营养,厚度过小以及不含营养都不能为细菌生长提供必要条件。
以研究在羟基磷灰石压片上研究菌斑生物膜为例进行具体的实施过程的详述:
硬质片状物3为羟基磷灰石压片,羟基磷灰石压片是一种常见的菌斑生物膜附着的基质(也称为成膜介质),由于其疏松多孔的特性,能够使微生物聚集并致密地附着于其表面形成稳定的生物膜。在培养菌斑生物膜之前,需要对硬质片状物3进行现有技术中常规的无菌处理,避免杂菌影响菌斑生物膜的形成。按照上述方法,制备在底部附着有一层软质固体层2的培养容器1,然后将硬质片状物3以一定角度***软质固体层2,如图2和图3所示,硬质片状物3与软质固体层2分别呈60°夹角和90°夹角。在本方案中,硬质片状物3与软质固体层2可以呈任意夹角,硬质片状物3的倾斜角度的不同可以影响细菌在硬质片状物3上沉积和附着的速度,以及影响菌斑生物膜的形态和富集程度等。本方案的设备可以实现多方位和多角度的菌斑生物膜的培养,对充分研究菌斑生物膜的形成规律以及相关的抑菌剂创造条件。将硬质片状物3***之后,再在培养容器1中加入菌悬液(加入菌悬液的过程也称为接种),盖上培养容器盖14,将培养容器1置于特定条件下培养一段时间后,即可在硬质片状物3表面形成菌斑生物膜。菌悬液是将特定的口腔常见菌按照一定的浓度分散到特定的液体培养基中形成的。口腔常见菌包括但不限于血链球菌、变异链球菌、粘性放线菌、鼠李糖乳杆菌和牙龈卟啉单胞菌等。另外,为了研究不同抑菌剂对菌斑生物膜的抑制作用,可使用抑菌剂对硬质片状物3进行表面预处理(例如涂抹在硬质片状物3表面),通过观测菌斑生物膜的形成情况来评价抑菌剂的效果。
对于一些细菌,软质固体层2为琼脂凝胶,不含营养物质,细菌不倾向于附着在软质固体层2上,细菌会附着在硬质片状物3大量附着(例如使用羟基磷灰石压片和牙片的时候)。有时候。为了使得细菌在硬质片状物3更有效地附着,而不是附着在琼脂凝胶上,可对硬质片状物3的表面做一些修饰,例如利用现有技术的常规手段在硬质片状物3的表面修饰蛋白质。特别是对于像变异链球菌这样的细菌,使用盖玻片作为硬质片状物3的时候,变异链球菌倾向于呈团块状沉淀生长于液体中(即悬浮生长)。在这种情况下,在硬质片状物3上进行表面修饰,使其外表形成一层蛋白质层就比较关键。
实施例2
本实施例是在实施例1的基础上进行的改进,增加设置了角度辅助单元4(使用时,需要使用经过无菌处理的角度辅助单元4)。如图4和图5所示,角度辅助单元4为三棱柱状结构。角度辅助单元4的横切面为三角形,三个顶角分别为90°、30°和60°,也可以按照实际需要设计三个顶角的角度。角度辅助单元4包括如图4所示的三个平面:第一平面5、第二平面6和第三平面7。角度辅助单元4的长度大于培养容器1上方开口的口径,这样角度辅助单元4可以放置于培养容器1的上端。
以使用角度辅助单元4将硬质片状物3竖直***软质固体层2为例进行说明:先将角度辅助单元4放于培养容器1的上端,第三平面7与培养容器1接触,竖直的第一平面5作为引导面,将硬质片状物3的左侧面贴近第一平面5,然后沿第一平面5将硬质片状物3向下滑动,最后使得硬质片状物3的下端以竖直的状态***软质固体层2中。角度辅助单元4起到了提示硬质片状物3的***角度的作用,比起不使用本角度辅助单元4,硬质片状物3的***角度更为可控。
实施例3
本实施例是在实施例1或者实施例2的基础上进行的改进,如图6所示,培养容器1的数量为八个,且八个培养容器1均位于培养容器组13中,在培养容器组13上方该有一块长方形的培养容器盖14(图中未示)。事实上,培养容器1的数量可为若干个,培养容器组13可以是商业化的24孔板等多种类型的细胞培养板。例如,使用本实施例的带有八个培养容器1的培养容器组13时,每个培养容器1中可加入不同的抑菌剂,或者可加入不同浓度的同种抑菌剂,这样就可以同时研究不同抑菌剂的作用效果、或者同种抑菌剂不同作用浓度的效果(研究获得浓度-效应曲线)。培养容器1也可以是现有技术中的单个的培养皿,取多个培养皿进行菌斑生物膜研究,可研究同一抑菌剂在同一浓度、不同的作用时间下的效果(即每个培养皿的培养时间不同,研究获得时间-效应曲线)。
实施例4
本实施例是在实施例3的基础上进行改进,因为软质固体层2的厚度需要维持在0.25-0.3mm,在将琼脂溶液注入培养容器1时,操作者都是根据经验添加,很容易出现软质固体层2过厚或者过薄的情况,所以在本方案中特别设置了厚度辅助单元(使用时,需要使用经过无菌处理的厚度辅助单元)。如图6所示,厚度辅助单元包括定位片10,定位片10的外径略小于培养容器1的内径,定位片10的圆心处设有中间孔12,定位片10的下表面距培养容器1的底壁的距离为0.25-0.3mm。定位片10的上表面一体成型有连接筒11,连接筒11的数量为两个,两个连接筒11以定位片10的中轴线为对称轴呈轴对称分布。连接筒11中***有连接杆9,连接杆9依靠其与连接筒11内部的摩擦力与连接筒11可拆卸地固定在一起。连接杆9的上端粘接有水平杆8,水平杆8挂在培养容器1上端。使用时,在中间孔12中注入琼脂溶液,直至琼脂溶液的液面到达定位片10的下表面,然后将整个厚度辅助单元取出,待琼脂溶液冷却之后,可形成厚度为0.25-0.3mm的软质固体层2。另外,连接杆9与连接筒11可拆卸,在培养容器1的深度有变化的情况下,可更换不同长度的连接杆9,从而控制定位片10与培养容器1的底部之间的距离。如果使用的培养容器1来自于商业化的孔板或者培养皿,通常这些产品上都不会有标识软质固体层2的厚度的结构,所以本实施例特别设计了可适用于多种商业化的孔板或者培养皿的厚度辅助单元。连接杆9可为硅胶材质,初始状态可将连接杆9的长度设计得较长,可根据培养容器1的深度来确定是否需要将连接杆9切断一截来调节定位片10与培养容器1的底部之间的距离。
以上结合附图对本实用新型的实施方式作了详细说明,所述的仅是本实用新型的优选实施方式,应当指出,对于本领域的技术人员来说,在不脱离本实用新型的发明构思的前提下,还可以作出若干变形和改进,本实用新型并不限于上述实施方式,在本领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以对其作出各种变化。这些也应该视为本实用新型的保护范围,这些都不会影响本实用新型实施的效果和专利的实用性。本发明所省略描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
Claims (10)
1.一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,其特征在于,包括培养容器,在培养容器的底部设有软质固体层,所述软质固体层中***有样品。
2.根据权利要求1所述的一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,其特征在于,所述样品为硬质片状物。
3.根据权利要求2所述的一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,其特征在于,所述软质固体层的厚度为0.25-0.3mm,所述软质固体层的材质为琼脂凝胶。
4.根据权利要求3所述的一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,其特征在于,所述培养容器的数量为若干个。
5.根据权利要求4所述的一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,其特征在于,所述硬质片状物与所述软质固体层之间的夹角为30°、60°或者90°。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,其特征在于,还包括用以辅助硬质片状物以指定角度***软质固体层的角度辅助单元。
7.根据权利要求6所述的一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,其特征在于,所述角度辅助单元为三棱柱状。
8.根据权利要求7所述的一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,其特征在于,所述角度辅助单元的横截面的三个顶角的角度分别为30°、60°或者90°。
9.根据权利要求6所述的一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,其特征在于,还包括用于限定所述软质固体层厚度的厚度辅助单元。
10.根据权利要求9所述的一种用于建立生物膜立体培养的体外模型的设备,其特征在于,所述厚度辅助单元包括定位片,所述定位片中间开设有中间孔,所述定位片距所述培养容器的底部的距离为0.25-0.3mm,所述定位片挂在所述培养容器的上端。
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