JPH02107191A - 化合物製造生合成法 - Google Patents
化合物製造生合成法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
よび(または)チオエーテル架橋を含む化合物の生合成
に関する。
ン、ズラマイシン(djramycin)、シンナマイ
シン(cinnamycin) 、アンコベニン(an
cov−enin )、Ro09−0198およびエピ
デルミン(ep iderm i n)はデヒドロアミ
ノ酸およびランチオニン架橋を含む。
より生成される。例えばナイシンはストレプトコッカス
・ラクチン(5treptococcuslactin
)の株の培養により、スブチリンはバシラス・サチリス
(Bacillus 5ubtilis)の培養により
製造することができる。
で明らかにされなかった。従って、例えばそのよう、な
抗生物質の生合成、殊にそれらの中に見出された異常な
アミノ酸の形成がリポソーム合成を経由するかまたは多
酵素複合体を経由して生ずるか知られなかった。
瞭な構造遺伝子によりコードされるかまたはより大きい
タンパク質の分解生成物であるか知られなかった。
究の過程において、我々は意外にも前記抗生物質、殊に
エピデルミンが明瞭な構造遺伝子によりコードされるこ
と、およびプレ配列ポリペプチドのプロセッシングがデ
ヒドロアミノ残基および(または)千オニーチル架橋の
形成を行なう酵素複合体により行なわれることを確証す
ることができた。
タンパク質の分泌、並びにプレポリペブチ1′のプロセ
ッシングに関連されることができる。
ーエピデルミンの−30〜−1配列の場合のように、プ
レーポリペプチドにより所有されるプレー配列に関連さ
せることができる。
ドが宿主により通常生成されないポリペプチドをコード
し、培養の間に前記宿主が多酵素複合体を与え、それに
より少くとも1つのデヒドロアミノ酸および(または)
少くとも1つのランチオニン架橋を含むポリペプチドが
生成され、前記生成ポ・リペプチドが前記宿主にとって
外来である、プラスミドを含む細菌宿主を提供する。
びスルフィド架橋形成、の少くとも1つを行なうことが
でき;複合体はまた脱炭酸および二重結合形成を行なう
ことができる。
の修飾なく、デヒドロアミノ酸残基および(または)ラ
ンチオニン架橋並びに(または)メチルランチオニン架
橋を含むポリペプチドを生成することができる。そのよ
うな宿主の例はストレプトコッカス−ラクチス(5tr
eptococcuslactis) 、バシラス・サ
チリス(Bacillus5utilis)、ストレプ
トマイセス・シンナモネウス(Streptomyce
s cinnamoneus) 、ストレプトマイセス
種(Streptomyces sp、) 、ストレプ
トベルティカラム・グリセオベルティシラム(S tr
ep Loverticullum griseove
rticillum)、スタヒロコッカス・エピデルミ
ス(Staphylococcus epidermi
s)、スタヒロコッカス・エピデルミス(Staphy
lococcus epidermin)株5およびス
クヒロコソカス・ガリナラム(Staphylococ
cus gallinarum)である。
ト条約の条件下にドイツチエ・ザムルング・フォノ・ミ
クロオルガニスメン(Deu tscheSammlu
ng von Microorganismen)に寄
託され、受託番号DSM4616を受けたスタヒロコソ
カス・ガリナラム(F16/P57)Tii 3928
および本出願人により1984年10月26日にブダペ
ス1〜条約の条件下にドイツチエ・ザムルング・フォノ
・ミクロオルガニスメンに寄託されたスタヒロコッカス
・エピデルミスDSM3095である。
知遺伝子工学技術により修飾することができる。
(または)少くとも1つのスルフィド架橋を含むポリペ
プチドを生成する宿主のプラスミドを、プレーポリペプ
チドをコードする遺伝子の修飾または置換により処理し
て前記宿主にとって外来のポリペプチドをコードするプ
ラスミドを与え、次いで前記宿主を改変プラスミドで形
質転換する。
遺伝子の置換または修飾に使用することができる。
Aは化学合成により製造することができる。適当な化学
合成はアナリティカル・バイオケミストリー (へna
1.旧ochem、) 、 121. 365(19
82)中に開示されている。公知技術は例えば60〜1
(10塩基までのポリヌクレオチドの調製物の製造を可
能にする。
〔アガルウォル(八garwal)ほか、アンゲハンテ
・ヘミ−(八ngeW、 Ct+em、) 、 84
4.89 (1972))、ホ゛スホトリエステル法
〔リーセム(Rccsem) 、 テトラヘドロン(T
etrahedron)、 3.9. 3 (198
3) )またはホスフィツトトリエステル法〔レソツィ
ンガ−(Lctsingcr)ほか、ジャーナル・オブ
・ジ・アメノカン・ケミカル・ツナイアティー(J、
Am。
76) )あるいはホスホルアミジット法により連結さ
せることができる。固相法はポリヌクレオチドの合成の
単純化を可能にする。
りセグメントから酵素的に構築することができる。
いることができ、それらは塩基対合により正しい配座中
にともに保持され、酵素DNAリガーゼにより化学的に
連結される〔コラナ(Khorana)ほか、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミスト−(J、 Bio
l、 Chem、) 、 2−51565 (197
6))。
有する2つのDNA鎖の1ポリヌクレオチド配列を4所
要デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下に、DNAポ
リメラーゼ、例えばDNAポリメラーゼ■、ポリメラー
ゼIのフレノウフラグメントまたはT4DNAポリメラ
ーゼとともに、あるいは逆転写酵素とともにインキュベ
ートすることが含まれる。2つのポリヌクレオチド配列
がそれにより塩基対合により正しい配列に保持され、酵
素により所要ヌクレオチドを補足されて完全末鎖DNA
を与える〔ナラニー (Narany)ほか、アナリテ
ィカル・バイオケミストーリー(八na1゜11ioc
hem、)、121 365 (1982)’J。
は微生物の組織または細胞培養のゲノムDNAから前記
DNAを分離し、細胞を例えばSDSまたはプロテイナ
ーゼにで、または望むならば機械的に、溶解し、DNA
をフェノールによる反復抽出により除タンパクすること
を含む。
。得られたDNAは適当な制限酵素例えばH、、、IT
IおよびAj2uUで部分消化され、フラグメントが分
UNIされ、適当なファージまたはコメミド中、例えば
シャロン4八または[?、MBL−3ファージ中で増殖
され、例えば放射性標識D N Aプローブで所望配列
について検定される。
mRNAをcDNA中へ逆転写することにより得ること
ができる。これはDNA構造が知られていなければ好ま
しい方法であろう。この方法においてDNAばcDNA
ライブラリー中のゲノムDNAからm R’N Aを経
て得られる。
Aに相補的である遺伝子情報を含む。
基(できる限り非修飾)タンパク質を発現する細胞から
分離される。このmRNAが二本鎖c DNAに転化さ
れる。
胞膜が破壊され、細胞内容物が遊離され、それからmR
NAが分離される。細胞膜は、好ましくは物理的方法ま
たは洗剤例えばSDS、グアニジンチオシアネート、一
定塩条件または均質化による溶解により、好ましくは混
合により破壊される。mRNAはフェノール抽出、エタ
ノール沈殿、遠心分離およびクロマトグラフィーの標準
的方法、好ましくは若干の方法の組合せ、により分離さ
れる。遠心分離は好ましくは勾配で、例えばC5C(!
勾配で行なわれる。クロマトグラフィーには好ましくは
カラム、殊にオリゴ−dTカラムが使用される。
化することができる。好ましくは、所望ポリペプチドを
コードするmRNAは若干の技術例えば電気泳動法、ク
ロマトグラフ法および遠心分離法、好ましくはショ糖勾
配遠心分離法を用いてさらに濃i宿される。
種々の方法、例えば生体内または試験管内翻訳、次いて
適切な活性の検出または、ヌクレオチド配列が知られて
いるときにオリゴヌクレオチドプローブとのハ・イゾリ
ノ1゛形成により検出することができる。
pus 1aevis)卯母細胞系である〔マニアナイ
ス(ManiaLis)ほか、分子クローニング、実験
室マニュアル(Molecular CIoniB、
A1、aboraLory Manual)、コールド
・スプリング・ハバー・ラボラトリ−(Co1d Sp
ring 1larborLaboratory)
(1982)参照〕。試験管内系は例えば小麦胚および
ウサギ網状赤血球溶解物であり、それらのいずれも市販
されている。
ールから、よく知られた方法によりdS−cDNAを4
−Hlることができる〔好ましい一般法はマニアナイス
(Maniatis)ほか(前掲)、オカヤムはか(O
kayam and Berg)、 モレキュラー・ア
ンド・セル・バイオロジー(Molecular an
dCell Biolof!y) 、 2. 161
〜170 (1982)およびハイデツカ−(llei
decker) −ニュクリーク・アシド・リサーチ(
Nucleic Ac1d Re5earch)土工、
4891〜4906 (1983)中に記載されている
〕。一般に、mRNAは初めにリハーストランスクリプ
ターゼまたはDNAポリメラーゼ■ 〔フレノウ(Kl
enow)フラグメント〕を用いて5s−cDNAに転
化される。2つの方法がds−cDNAの合成の開始に
択一的に使用される。第1法は5s−cDNAの自然ル
ープ形成であった。第2法は5s−cDNAをホモポリ
マー尾例えばdCまたはポリDTでテーリングすること
である。
RNA画分はよく知られた方法により相補的cDNA中
へ転写される。mRNAおよびオリゴ−dTがブライマ
ーとして混合され、次いでdNTPsが出発物質として
添加され、cDNArn RN Aハイブリッド分子の
合成が酵素リノ\−ストランスクリプターゼにより実現
される。
のフレノウフラグメントが混合され、混合物が適当な温
度、好ましくは12〜15°Cでインキュへ−1〜され
る。ン昆合物はヌクレアーゼS1とともにインキュへ−
1・され、所望ポリペプチドをコードするmRNAに相
当するdS−CDNA力(得られる。
ー、例えばプラスミ)” p tJ C−K Oにスプ
ライシングするごとができ、得られたハイブリッドベク
ターを適当な宿主、例えばE、コリ(E、 coli)
I(13101の使用により増殖させることができ
る。ハイブリッドベクターの再分離およびそれから分n
(されたcDNAの回収が所望ポリペプチドをコードす
るDNAの+14造決定を可能にする。
チドをコードするDNAを適当なベクターにスプライシ
ングすることにより3周製することができる。
込まれたパラセンジャーl)NAに対スる担体である。
フィド基を含むポリペプチドを生ずるi微生物から3W
導されたプラスミ1′かベクターとして適当である。
に保持する。
配列、すなわちプロモーター、を含むことができ、それ
らは、それらが使用される宿主細胞と適合する宿主細胞
または種からj6 >、tJされる。ベクターは通常レ
プリコン部位を保持し、形質転換された細胞中に表現型
選択を与えることができる配列(標識遺伝子)を含むこ
とができる。適当な標識遺伝子は抗生物質耐性または重
金属に対する耐性を与えるごとができ、あるいはそれら
が宿主の遺伝欠?73を911j足することができる。
ーおよびアクチヘーター配列である。
デルミスDSM3095からの54Khpプラスミドp
lEpi32である。ごのプラスミドは下記特徴を有し
、52−プレペプチドをコードするepi A遺伝子を
含み、それは四l021−ペプチドアミド抗生物質にプ
ロセッシングされる。
ドベクターと称される。
グされる。
例えばプラスミドplF、pi32を1lindlll
、Bam1llおよびIE COR[により、綿状化し
、次いでd G T Pおよび末端デオキンヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼの存在下にd/Gテーリングす
ることができる。二本鎖CDNA挿入断片はdCTPお
よび末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの
存在下にdC−テーリングされる。両C,DNAおよび
ベクターを結合さ−Uるとハイブリッドベクターを生ず
る。バクテリオファージ例えばラムダはゲノムライブラ
リーの構築に好ましい。ラムダクローニング系はマニア
ティス(Maniatis)により記載されている(油
出)。適当なベクターDNAは適当な制限酵素で完全に
消化され、左右のアームが中心フラグメントから速度勾
配遠心分離またはゲル電気泳動により分離される。他の
方法は左右のア−J、中に認識部位を欠く制限酵素でス
タッファ−フラグメン1の部位を消化することである。
メントに部分的に消化されることができる。その後アー
ムはアー1、の末端と適合する末端を有する外来DNA
のフラグメントと連結される。
れた初めのベクターからj♂当な発現へクタ−中へ再ク
ローニングされる。この目的のために適当な制限酵素が
、おそらくオキソヌクレオン(oxonucleone
s)と組合せて使用され、所望DNAフラグメントが生
成される。
ー例えばpc194、p T + 81およびptJB
lloの誘33体の多部忙中へ制限部位11indTI
I/r3amll I/Ec oRIでり・ブタローユ
ングすることができる。
残基がスルフィド架橋アミノ酸により置換され、セリン
およびチアミンが相当するデヒドロアミノ酸残基により
置換される公知ペプチドおよびホルモンの誘導体の製造
に使用できる。
接、または適当な化学合成オリゴヌクレオチド架橋の付
加により適当な発現ベクター中へ取込まれる。末端の修
飾には、例えばll1ndIl[およびBgLrTを用
いることができる。方法は任意の特異制限酵素に限定さ
れない。適当な制限酵素を化学合成オリゴヌクレオチド
と組合せて用いて任意の所望連鎖を発現ベクターとDN
A挿入断片との間に作ることができる。
適当なりNA挿入断片もまた得ることができる。
望変異体を調製することができる。
含む自生または基礎遺伝子のフラグメントを複製形態の
ファージ例えばMI3mp8中に挿入してMI3mp8
PAを形成することを含むことができる。従って挿入配
列に相補的な、しかし置換されるアミノ酸をコードする
1つまたはそれ以上のヌクレオチドトリプレットを含む
合成オリゴヌクレオチドを一本鎖形態のM I 3 m
p 8 Aにアニールして二本鎖領域を形成させる。
するプライマーとして役立つ。複製および確認後、変異
体配列をさらに修飾するかまたはそれを用いて変異ポリ
ペプチドを発現する適当なベクターを構築することがで
きる。
NAプローブ、 5 ’ −GTG(八)CAT (G/A)ATG
(八)へへT(C)TT−3’ がエ ビデルミン
の提案プレー配列の適当なペンタペプチドセグメントか
ら演鐸された。LysPhelleCylTlぼが調製
された。このDNAプローブをS、エピデルミンDSM
3095からのプラスミドDNAに対してハイブリッド
形成させた。
Iによる?DNAフラグメント(16,1110,6,
5,5,5,3,5および2.5 kbp ) 、l1
indulによる9DNAフラグメン1−(17,14
,1O25,3,2,8,1,8,0,8,0,6およ
び0.5 kbp)並びに3amlllによる5DN八
フラグメント(20,19、l013および1kbp)
を示す。
サブクローンし、再ハイブリッド化させ、それにより構
造遺伝子epi Aを2.2kbp F、c oRI/
Ba (l [1フラグメント内に位置させた。
成プローブとして用いた。プローブは、ノビツク(No
vick)ほか、アナルズ・オブ・ザ・ニュー・ヨーク
・アカデミイ・オブ・サイエンス(八nn、 N、
Y、 Acad、 Sci、)、 1 8
2. 2 7 9 〜294 (1971) 、サザ
ン(Southern) 、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー(J、Mo1.旧o1.)、 9
8. 503〜517(1975)およびハイブリッド
(Ileinricb)ほか、モレキュラー・アンド・
ゼネラル・シネティクス(Molecul、 gen、
Genet、)、 209 、 563〜569
(19B?)中に記載された方法に従って配列決定プラ
イマーとして30倍過剰に適用した。
可能にした。単メチオニンコドンはシャイン・ダルガル
ノ配列に対して適当な距離中にある。
終結し、従ってプレ−エピデルミンは52アミノ酸から
なり(第1図)、それはArg −’とThe″1との
間でエピデルミンにプ1コセソシングされる。従って、
明らかに認められるように、プレ−エピデルミンは大タ
ンパク質の分離生成物ではなくて明らかな構造遺伝子に
よりコードされる。
な構造遺伝子によりコードされることが明らかである。
親水性およびヘリックスホイールプロットに対する予想
プロフィルの組合せがハイコン(llycon)プログ
ラムを用いて作られた(第2図)。
8に対し予想され、−一方プレ−エピデルミンに相当す
るC束端部1〜22は非常に高い折返し確率を示す。さ
らに予想ブrコツトは明らかにN未C11i30〜−1
が非常に親水性であり、C末端部が一層親油性であるこ
とを示す。N末端部30〜−8は部分的に両親媒性α−
へリノクスに折りた〜まれると思われる。
はシスティン残基を含まず、C末端セグメント1〜22
はスルフィド架橋形成に含まれる・1システイン残基を
含む。配列−30〜−1はエンドプロテアーゼに対する
多くの切断部位を含み、一方プレーエピデルミン状態に
おいても配列1〜22はタンパク質加水分解に対して非
常に耐性である。
より攻撃されるごとができる。ブロモ・7シンク部位A
rfX″l−[le″1は折返し形成Pro−”残基の
ために親水性であり、接近できる。
素反応はプ1゛1−ポリペプチド部1〜22の(1’l
飾;N末端プレペプチドフラグメン1−30〜−−−1
の切断および成熟抗生物質の分泌を含む(第3および4
図参照)。
生ずる。酵素修飾はそれぞれデヒドロアラニンおよびデ
ヒドロブチリン残基を形成する位置5.16.19、お
よび8.14中のSerおよびThr残基からの水の脱
離をえむ。位置2.11.2Iおよび22中のCys残
基のチオール基のC−C二重結合に対する付加もまた生
じ、メソーランチオコンまたは(2S、3S、f3R)
−3−メチルランチオコン架橋を/IEする。さらに、
残基22の脱炭酸および二重結合形成がC−末0iij
S (2アミノビニル)−D−システィンを生ずる
。C末端に位置するシスティンチオール!古のN−末端
に位置するデヒドロアミノ酸との反応がエピデルミン、
ナ・イシンおよびスブチリン中に完全な\″f体特体性
異性ずる。従って、修飾の間にこれらの税目(付加反応
がブ1/−エピデルミン残基L−5erおよびl、−T
t+r(、こおけるC、炭素原子の配置のD配置C,原
子を〜”、える反転を意味する。一方、シスシーインの
半分のL配置がなお維持される。
れはN末◇:;;両親媒性α−ヘリックスとの用1作用
により支1、〜される。Thr ”’のみがシスティン
を見出す、二、となく脱水する。この位置(Lys ”
−Dhb ”’ )は、トリプシンが抗生物質エピデ
ルミンを不活性化する酵素切断部位を構成する。スルフ
ィド環形成の間にC末◇;)iの硬さおよび疎水性が増
大し、プレ−エピデルミンと脂″i1′二重層との相互
反応を容易にすることができ、ランスロケーションを誘
発することができる。
0〜1が1、T異プロテアーセにより前記11−有切断
部位で切断される。
biotics)をコードするプラスミドを、それぞれ
のポリペプチドをコードする遺伝子の変)′・二による
かまたはそのよ・うな遺伝子を一′?なるポリペブチ1
をコ・−ドする遺伝子により置換することにより修飾し
、原宿主または異なる宿主の形質転換に、そのような宿
主がまたその自生状態においてランチバイオティックス
を発現できれば、使用することができる。
する場合に、例えばエピデルミンの場合に記載したよう
に、そのようなプレー配列をコ−ドするDNA配列が修
飾されたプラスミド「1弓こ保持されることができ;こ
の場合に新または変異ブローポリペプチドに対するDN
A配列が原プロポリペプチド配列と同様にプレー配列D
NAのすぐ上流に位置するであろう。
18日に提出された我々の同時係属英国特許出願第88
11760.1号および欧州特許出願公表第01815
78号中に記載された背進に使用される培養条件下に行
なうことができる。所望タンパク質の精製および分離も
また、吸着剤、イオン交換樹脂、および望むならば+1
P L Cの使用を含めて、前記特許出願中にエピデ
ルミンおよびガリデルミンについて記載された技術また
はその改変を用いて行なうことができる。
、あるいは新宿主中の公知化合物または公知化合物の誘
導体の形成に適用できる。例えば、エピデルミンをコー
ドする遺伝子を含むプラスミドを、種ストレプトコッカ
ス・ラクチスを形質転換してその宿主からエピデルミン
を生成させるために用いることができ、またはガリデル
ミン(前に参照した我々の同時係属英国特許出願参照)
をコードする遺伝子を、例えばプラスミドpEp +3
2中のエピデルミンに対するブローポリペプチドをコー
ドする遺伝子の置換に用い、スタヒロコッカス・エピデ
ルミスDSM3095を形質転換してこの宿主からガリ
デルミンを生成させるのに使用することができる。同様
に、デヒドロアミノ酸残基および(または)ランチオニ
ン架橋あるいは(または)メチルランチオニン架橋を含
む他の生物活性ペプチド誘導体、ホルモンの誘導体例え
ばヒトインシュリン、オキシトシン、バソプレッシン、
ペプチド抗生物質、ホルモン抑制物質例えばエラスター
ゼ抑制物質および線維素溶屑活性物質例えばヒト組織プ
ラスミノーゲン活性化物質を生成させることができる。
安定性および改良された半減期を有することができる。
Aはシスティンおよびセリンに対して、並びに(または
)システィンおよびトレオニンに対してチオエーテル架
橋を形成するコドンを含むべきである。
れぞれのコドンは通常8個を越えず、好ましくは6個を
越えないコドン、離れているべきであるが、しかし最終
ポリペプチド分子の立体配座により一層大きい間陥が可
能であることが工1画される。
および(・レオニンから誘導され、従って所望プ1コー
ペプチドをコードするDNAはそのようなアミノ酸に対
するコドンを含む。
常なアミノ酸にはデヒドロアラニン、2.3−デヒドロ
−2−アミノ酪酸、メソーランチオニン、(2S、3S
、6R)−3−メチルランチオニン、S−(2−(Z)
−アミノビニル)−〇−システィン、リシノアラニンお
よびβ−ヒドロキシアスパラギン酸があり、これらの残
基の構造は第5図中に示される。
トをスタヒロコソカス・エビデルミゾイスDSM309
5、エピデルミン生産株、中に、中間コピープラスミド
例えばpc194、pE194、pUBllo、pT1
81またはpMK 148ガリデルミンの使用によりク
ローニングすることができる。遺伝子星の増加はj]常
生成物生成の増加と相関し;相関は必らずしも直線的で
はない。pc194またはpT181の高コピー数プラ
スミド誘導体はまたクローニングビヒクルとして使用で
きる。
ー配列はエピデルミンの分泌中に含まれる。その配列は
S、エビデルミゾイス中の他のペプチド例えばガリデル
ミンの分泌に使用できる。
配列の初めおよび末端に挿入することにJり移動可能に
することができる。従ってリーダー配列DNAはプラス
ミドから多量に分1411することができ、他のペプチ
ドおよびタンパク質のそれぞれの位置jJ挿入すること
ができる。リーダー配列I) N Aはまた化学合成に
より生成されることができる。
造 (1) プラスミドの調製(第6011照)(a)ミ
、ンー\ン工L1人学の図書館C′閲覧可能なローセン
スタイン(Dr、Ra1f Rosenstein)の
学位論文「スクヒロコ:・勾スによるプラスミドコード
化アルセニノトおよびアルセナートレステ、イステント
の分子遺伝学的研究(Molekular gent+
st+5che Llntersuchungen
zur plasm+dkodierten 八r
senit undArsenatrest+5te
nt l1el 5japhylococcen) J
中に記載されたよ・うにPst ]消化p Cl=
PlooおよびNdel消化p[Jc18をフレノウを
用いて連結することによりプラスミドpCIJ Iを調
製した。
ム(D S M4616)から分離1、f’、coRl
で消化した6II 1ncl IIIおよびEcoRI
制限部位間の2、4 kb長配列中のガリデルミン措造
逍伝Yを含む4.7kbフラグメントをプラ・イマーと
し2て配列 5 ’ CACATCCAG GAG TA
C3を用いて分離1.た。
らの消化したp CtJ !プラスミドのEcolシ■
部位中へ連結し、p CLJ g d m 1と称され
るプラスミドが得られた。
るS、エピデルミスDSM3095ノff異株が分1服
された。
ン耐性をコードする、株(20II t: /mR>に
行なった。
95を用いて30 me iJ礎ジブロス培地接種し、
それを−宥ν培養しまた。次いで一夜給俣物0.5 m
eを用いて4[産培地、’、、) Q mp、に接種し
1、それを37°Cで;(■、冒;)1振と一′1jr
j負(7た。
1JII温1’ M iff街液C30mMl・リスー
マレアー1− pH6,5)中に懸l慣した(/lした
7容ン夜4ン容〈夜へと称する)。
た(1.25 ×1010細胞/ rtd )。
ホーノ”−1・ととも(こ(最終;・8度471jg、
/ml> 十分振とうし56次いで振と−)下に37
°Cで目、胃111維持した。
′1゛M緩衝液で洗浄し、5 ml!、 ’T’ M緩
衝液中に再懸ン蜀した(生じた)合液は溶ン夜I3と(
;トされ、変異才、1■胞を金石した)4、 ?容’/(l Bば2 X 10 ’ tl旧1a y
mlを含み、1.6%の生存中に相当する。
夜増殖させたく表現型発現)。生じた溶液を溶液Cと称
した。細胞数は 7.3XIO’細胞/m/4示した。
ローンを採集した。これを用いて試験平板(ミクlココ
ノカス・ルラーウスを表面)−に;斤いた8M寒天から
なる)に接■Φし、た。M、ルう一つス乙、′、関する
阻止効果を有1,7なかったコL−】ニーをエピデルミ
ス非/を産休とし−T選んだ。
安定非生産体が得られた。
2を含むと認められた。制限パターンから、これは野生
型株中のプラスミドに等しいと同定される。
養により得た培地5dで接種し、接種した培地を21フ
ラスコ中で37℃で120rpmの振とぅ速度で振とう
培養した。
であった。光学濃度が0.45〜o555に達したとき
、細胞をG5−3−tl−ター中、85(10rpmで
4℃で15分間の遠心分離により除去した。
びlQ+nfの10%グリセリン中で洗浄し、2〜3
mlの10%グリセリン中に)脈濁し、E RG中に1
10μ1部中で一70℃で凍結した。細胞数は15xl
O+°/ mlになった。
0μlをERG中でTE緩衝液中の2μlのプラスミド
pcUgdmlとともに室温で30分間インキュベート
した。
ル中へ導入して直ちに電気泳動した。その後細胞を速や
かに950μffsMMP50培地中に再懸濁し、2.
5 mll E RG中へ移し、37 ’Cで90分分
間上うした。ERGは培地の良好な通気を与えるために
456に傾斜させた。
M M、40m14PABおよび5モへ5冗BS八を含
有する。23MMは1モルサッカロース、0.04 モ
ル? L/イン酸、0.04 モノl/MgCl 2お
よびNa 011 pH6,5までを含み1.I PA
I3は7g/ l OOmRギブコ(Gibco)抗生
物質培地3の溶液である。
上ζこ広げ、それを37°Cで20分間インキュへ−1
−シた。
験平板からのコロニーの選択により、それぞれの選1尺
コロニーを;d拐し、I(P L Cによりガリデルミ
ンの存在を測定することにより行なった。
異体が突きとめられた。
ょ財戊されたガリデルミンのt の a)生物検定 FP寒天をM、ルテウスA’l’cc 9341で接種
し、37℃で18時間インキュベートした。
地中に懸濁し、36℃で8時間培養した。
ペトリ皿に入れ、4℃で3週間貯蔵した。
d Maas) 、r抗生物質の生物学(Biolog
y ofAntibiotics) j 、スプリンガ
ー・フエルラーク(Springer Verlag
、Berlin) 1972中に記載のように行ない、
形質転換したS、エピデルミンの培養の培養濾液10μ
βを濾紙上に捕捉し、乾燥した。濾紙を試験プレート上
に置き、次いでそれを37℃で24時間インキュベート
した。
養ブロスを10分間13.(10Orpmで遠心分離し
た。
グラフィー装置〔スペク)・う・フィジンクス(Spe
ctra Physics Darmstadt、 F
RG) )上で移・、FIJ相として、A)0.5%
70%過塩素酸を有するl−120およびB)アセトニ
トリルを用いてHP L Cにかけた。カラム充填物は
粒径7μmのヌクレオシル(Nucleosil)−1
(10C18であり、カラムサイズは125mmX 4
.6mm l 、 D。
. D、であった。
77.5 22.5生じたクロマトグラムは第7
八図中に示される。標準曲線は第7B図中に示され、ガ
リデルミンが7.54分で溶出することを示す。
ルシウム 3.8g 水 1 βpH6,
5 泌物のHPLCクロマトグラム(第7A図)および標準
曲線(第7B図)を示す図である。
あり、第2図は二次構造、屈曲性、ヒドロハシ−1親水
性およびヘリックスホイールプロットに対する予想プロ
フィルを示す図であり、第3図および第4図は抗生物質
の生成中に生ずる酵素反応を示す図であり、第5図はタ
ンパク質プロ抗生物質から3A ’rlされたランチオ
ニンペプチド抗生物質(ランデバイオティックス)中に
認められる異常アミノ酸を示す図であり、第6図はプラ
スミドp CIJ d B rn lの調製を示ずし1
であり、第7図はpCU B d rn l形質転換S
、エピデルミン分第2A図 残基番号 第2B [!! 第7A図 EMS 5 プラス pcUGa (ガリデルミン) 筒7B図 ガリデルミン −標準 測定 よ11定 MIN ファクタ−= 1.oooOE”cつMIN
ファクター: (X)OOE+O○
Claims (11)
- (1)プラスミドが宿主により通常生成されないポリペ
プチドをコードし、培養の間に前記宿主が多酵素複合体
を与え、それにより少くとも1つのデヒドロアミノ酸お
よび(または)少くとも1つのランチオニン架橋を含む
ポリペプチドが生成され、前記生成ポリペプチドが前記
宿主にとって外来である、プラスミドを含む細菌宿主。 - (2)多酵素複合体が水脱離および(または)スルフィ
ド架橋形成、並びにおそらくまた脱炭酸および二重結合
形成を行なうことができる、請求項(1)記載の細菌宿
主。 - (3)ストレフトコッカス・ラクチス(Strepto
co−ccus lactis)、バシラス・サチリス
(Bacillussubtilis)、ストレプトマ
イセス・シンナモネウス(Streptomyces
cinnamoneus)、ストレプトマイセス種(S
treptomyces Sp.)、ストレプトベルテ
ィカラム・グリセオベルティシラム(Strcptov
erticullum griseoverticil
lum)、スタヒロコッカス・エピデルミス(Stap
hyloc−occus epidermis)、スタ
ヒロコッカス・エピデルミン(Staphylococ
cus epidermin)株5またはスタヒロコッ
カス・ガリナラム (Staphylococcus gallinaru
m)である、請求項(1)または(2)記載の細菌宿主
。 - (4)プラスミドが抗生物質、ホルモンまたは線維素溶
解物質をコードする、請求項(1)記載の細菌宿主。 - (5)宿主がスタヒロコッカス・エピデルミスDSM3
095であり、プラスミドがガリデルミンをコードする
遺伝子を含む、請求項(1)記載の細菌宿主。 - (6)請求項(1)〜(4)のいずれか一項に記載の細
菌宿主を培養すること並びに生じた少くとも1つのデヒ
ドロアミノ酸残基および(または)1つのランチオニン
架橋を含むペプチド生成物を分離することを含む方法。 - (7)請求項(5)記載の細菌宿主の培養により生成さ
れたガリデルミン。 - (8)請求項(1)〜(6)のいずれか一項に記載の宿
主の形質転換に適するプラスミドであって、プレ−エピ
デルミンのプレ−ペプチド配列−30〜−1およびエピ
デルミンとは異なるプロ−ペプチド配列をコードするプ
ラスミド。 - (9)プロ−ペプチド配列がガリデルミンをコードする
、請求項(8)記載のプラスミド。 - (10)エピデルミン以外の抗生物質、またはホルモン
、あるいは線維素溶解物質をコードするヌクレオチド配
列を含むように修飾されたプラスミドpEpi32。 - (11)ガリデルミンをコードする、請求項(10)記
載のプラスミド。
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