JPH02107191A - 化合物製造生合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は化合物の生合成、殊にデヒドロアミノ酸残基お
よび（または）チオエーテル架橋を含む化合物の生合成
に関する。

若干のポリペプチド抗生物質例えばナイシン、スブチリ
ン、ズラマイシン（ｄｊｒａｍｙｃｉｎ）、シンナマイ
シン（ｃｉｎｎａｍｙｃｉｎ）　、アンコベニン（ａｎ
ｃｏｖ−ｅｎｉｎ　）、Ｒｏ０９−０１９８およびエピ
デルミン（ｅｐ　ｉｄｅｒｍ　ｉ　ｎ）はデヒドロアミ
ノ酸およびランチオニン架橋を含む。

これらのポリペプチドは種々のそれぞれの株の微生物に
より生成される。例えばナイシンはストレプトコッカス
・ラクチン（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｎ
）の株の培養により、スブチリンはバシラス・サチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の培養により
製造することができる。

これらの抗生物質の生合成に対する遺伝学根拠はこれま
で明らかにされなかった。従って、例えばそのよう、な
抗生物質の生合成、殊にそれらの中に見出された異常な
アミノ酸の形成がリポソーム合成を経由するかまたは多
酵素複合体を経由して生ずるか知られなかった。

さらに、そのような抗生物質の前駆物質タンパク質が明
瞭な構造遺伝子によりコードされるかまたはより大きい
タンパク質の分解生成物であるか知られなかった。

エピデルミンの構造遺伝子を確証するために行なった研
究の過程において、我々は意外にも前記抗生物質、殊に
エピデルミンが明瞭な構造遺伝子によりコードされるこ
と、およびプレ配列ポリペプチドのプロセッシングがデ
ヒドロアミノ残基および（または）千オニーチル架橋の
形成を行なう酵素複合体により行なわれることを確証す
ることができた。

さらに、多酵素複合体が細胞膜を通る培養上澄み中への
タンパク質の分泌、並びにプレポリペブチ１′のプロセ
ッシングに関連されることができる。

これに関連して、そのような活性が例えば後記するプレ
ーエピデルミンの−３０〜−１配列の場合のように、プ
レーポリペプチドにより所有されるプレー配列に関連さ
せることができる。

概括的に記載すると、本発明は１観点においてプラスミ
ドが宿主により通常生成されないポリペプチドをコード
し、培養の間に前記宿主が多酵素複合体を与え、それに
より少くとも１つのデヒドロアミノ酸および（または）
少くとも１つのランチオニン架橋を含むポリペプチドが
生成され、前記生成ポ・リペプチドが前記宿主にとって
外来である、プラスミドを含む細菌宿主を提供する。

適当な多酵素複合体は、次の作用、すなわち水脱離およ
びスルフィド架橋形成、の少くとも１つを行なうことが
でき；複合体はまた脱炭酸および二重結合形成を行なう
ことができる。

本発明の方法の実施に適する宿主は、それらの遺伝物質
の修飾なく、デヒドロアミノ酸残基および（または）ラ
ンチオニン架橋並びに（または）メチルランチオニン架
橋を含むポリペプチドを生成することができる。そのよ
うな宿主の例はストレプトコッカス−ラクチス（５ｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）　、バシラス・サ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ５ｕｔｉｌｉｓ）、ストレプ
トマイセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ　ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）　、ストレプトマイセス
種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、）　、ストレプ
トベルティカラム・グリセオベルティシラム（Ｓ　ｔｒ
ｅｐ　Ｌｏｖｅｒｔｉｃｕｌｌｕｍ　ｇｒｉｓｅｏｖｅ
ｒｔｉｃｉｌｌｕｍ）、スタヒロコッカス・エピデルミ
ス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｓ）、スタヒロコッカス・エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）株５およびス
クヒロコソカス・ガリナラム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ　ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）である。

殊に関心のある株は、１９８８年５月１８０にフタベス
ト条約の条件下にドイツチエ・ザムルング・フォノ・ミ
クロオルガニスメン（Ｄｅｕ　ｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕ
ｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）に寄
託され、受託番号ＤＳＭ４６１６を受けたスタヒロコソ
カス・ガリナラム（Ｆ１６／Ｐ５７）Ｔｉｉ　３９２８
および本出願人により１９８４年１０月２６日にブダペ
ス１〜条約の条件下にドイツチエ・ザムルング・フォノ
・ミクロオルガニスメンに寄託されたスタヒロコッカス
・エピデルミスＤＳＭ３０９５である。

適当な宿主を形質転換するために適当なプラスミドを公
知遺伝子工学技術により修飾することができる。

望ましくは少くとも１つのデヒドロアミノ酸残基および
（または）少くとも１つのスルフィド架橋を含むポリペ
プチドを生成する宿主のプラスミドを、プレーポリペプ
チドをコードする遺伝子の修飾または置換により処理し
て前記宿主にとって外来のポリペプチドをコードするプ
ラスミドを与え、次いで前記宿主を改変プラスミドで形
質転換する。

種々の方法のいずれもプレーポリペプチドをコードする
遺伝子の置換または修飾に使用することができる。

所望化合物のプレーポリペプチド配列をコードするＤＮ
Ａは化学合成により製造することができる。適当な化学
合成はアナリティカル・バイオケミストリー　（へｎａ
１．旧ｏｃｈｅｍ、）　、　　１２１．　３６５（１９
８２）中に開示されている。公知技術は例えば６０〜１
（１０塩基までのポリヌクレオチドの調製物の製造を可
能にする。

適当に保護されたヌクレオチドをホスボジエステルン去
〔アガルウォル（八ｇａｒｗａｌ）ほか、アンゲハンテ
・ヘミ−（八ｎｇｅＷ、　Ｃｔ＋ｅｍ、）　、　　８４
４．８９　　（１９７２））、ホ゛スホトリエステル法
〔リーセム（Ｒｃｃｓｅｍ）　、　テトラヘドロン（Ｔ
ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、　　３．９．　３　（１９８
３）　）またはホスフィツトトリエステル法〔レソツィ
ンガ−（Ｌｃｔｓｉｎｇｃｒ）ほか、ジャーナル・オブ
・ジ・アメノカン・ケミカル・ツナイアティー（Ｊ、　
Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）　、　９８．３６５５　（１９
７６）　）あるいはホスホルアミジット法により連結さ
せることができる。固相法はポリヌクレオチドの合成の
単純化を可能にする。

二本鎖ＤＮＡは化学的に製造した短かいが、しかし重な
りセグメントから酵素的に構築することができる。

例えば、両ＤＮＡ鎖の重なりポリヌクレオチド配列を用
いることができ、それらは塩基対合により正しい配座中
にともに保持され、酵素ＤＮＡリガーゼにより化学的に
連結される〔コラナ（Ｋｈｏｒａｎａ）ほか、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミスト−（Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、）　、　　２−５１５６５　（１９７
６））。

他の可能性には、それぞれの場合に短かい重なり配列を
有する２つのＤＮＡ鎖の１ポリヌクレオチド配列を４所
要デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下に、ＤＮＡポ
リメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼ■、ポリメラー
ゼＩのフレノウフラグメントまたはＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼとともに、あるいは逆転写酵素とともにインキュベ
ートすることが含まれる。２つのポリヌクレオチド配列
がそれにより塩基対合により正しい配列に保持され、酵
素により所要ヌクレオチドを補足されて完全末鎖ＤＮＡ
を与える〔ナラニー　（Ｎａｒａｎｙ）ほか、アナリテ
ィカル・バイオケミストーリー（八ｎａ１゜１１ｉｏｃ
ｈｅｍ、）、１２１　３６５　　（１９８２）’Ｊ。

ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る他の適当な方法
は微生物の組織または細胞培養のゲノムＤＮＡから前記
ＤＮＡを分離し、細胞を例えばＳＤＳまたはプロテイナ
ーゼにで、または望むならば機械的に、溶解し、ＤＮＡ
をフェノールによる反復抽出により除タンパクすること
を含む。

ＲＮＡは好ましくはＲＮａｓ８で消化することができる
。得られたＤＮＡは適当な制限酵素例えばＨ、、、ＩＴ
ＩおよびＡｊ２ｕＵで部分消化され、フラグメントが分
ＵＮＩされ、適当なファージまたはコメミド中、例えば
シャロン４八または［？、ＭＢＬ−３ファージ中で増殖
され、例えば放射性標識Ｄ　Ｎ　Ａプローブで所望配列
について検定される。

所望ポリペプチドをコードするＤＮＡはまた分離された
ｍＲＮＡをｃＤＮＡ中へ逆転写することにより得ること
ができる。これはＤＮＡ構造が知られていなければ好ま
しい方法であろう。この方法においてＤＮＡばｃＤＮＡ
ライブラリー中のゲノムＤＮＡからｍ　Ｒ’Ｎ　Ａを経
て得られる。

ｃｌ’ｌＮΔライブラリーは細胞から分離されたｍＲＮ
Ａに相補的である遺伝子情報を含む。

ｃＤＮＡライブラリーを得るためにｍＲＮＡが所望の塩
基（できる限り非修飾）タンパク質を発現する細胞から
分離される。このｍＲＮＡが二本鎖ｃ　ＤＮＡに転化さ
れる。

よく知られた標準法がｍＲＮＡの製造に適用される。細
胞膜が破壊され、細胞内容物が遊離され、それからｍＲ
ＮＡが分離される。細胞膜は、好ましくは物理的方法ま
たは洗剤例えばＳＤＳ、グアニジンチオシアネート、一
定塩条件または均質化による溶解により、好ましくは混
合により破壊される。ｍＲＮＡはフェノール抽出、エタ
ノール沈殿、遠心分離およびクロマトグラフィーの標準
的方法、好ましくは若干の方法の組合せ、により分離さ
れる。遠心分離は好ましくは勾配で、例えばＣ５Ｃ（！
勾配で行なわれる。クロマトグラフィーには好ましくは
カラム、殊にオリゴ−ｄＴカラムが使用される。

全ｍＲＮＡは該技術の方法に従い直接ＤｓｃＤＮＡに転
化することができる。好ましくは、所望ポリペプチドを
コードするｍＲＮＡは若干の技術例えば電気泳動法、ク
ロマトグラフ法および遠心分離法、好ましくはショ糖勾
配遠心分離法を用いてさらに濃ｉ宿される。

所望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む両分は
種々の方法、例えば生体内または試験管内翻訳、次いて
適切な活性の検出または、ヌクレオチド配列が知られて
いるときにオリゴヌクレオチドプローブとのハ・イゾリ
ノ１゛形成により検出することができる。

生体内翻訳系は原核または真核系であることができる。

好ましい生体内翻訳系はアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏ
ｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ）卯母細胞系である〔マニアナイ
ス（ＭａｎｉａＬｉｓ）ほか、分子クローニング、実験
室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉＢ、　
Ａ１、ａｂｏｒａＬｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド
・スプリング・ハバー・ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　　
（１９８２）参照〕。試験管内系は例えば小麦胚および
ウサギ網状赤血球溶解物であり、それらのいずれも市販
されている。

非分画または分画ｍＲＮＡ山来ｒｎ　ＲＮへの任意のプ
ールから、よく知られた方法によりｄＳ−ｃＤＮＡを４
−Ｈｌることができる〔好ましい一般法はマニアナイス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ほか（前掲）、オカヤムはか（Ｏ
ｋａｙａｍ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ）、　モレキュラー・ア
ンド・セル・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎ
ｄＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｆ！ｙ）　、　　２．　１６１
〜１７０　（１９８２）およびハイデツカ−（ｌｌｅｉ
ｄｅｃｋｅｒ）　−ニュクリーク・アシド・リサーチ（
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）土工、
４８９１〜４９０６　（１９８３）中に記載されている
〕。一般に、ｍＲＮＡは初めにリハーストランスクリプ
ターゼまたはＤＮＡポリメラーゼ■　〔フレノウ（Ｋｌ
ｅｎｏｗ）フラグメント〕を用いて５ｓ−ｃＤＮＡに転
化される。２つの方法がｄｓ−ｃＤＮＡの合成の開始に
択一的に使用される。第１法は５ｓ−ｃＤＮＡの自然ル
ープ形成であった。第２法は５ｓ−ｃＤＮＡをホモポリ
マー尾例えばｄＣまたはポリＤＴでテーリングすること
である。

相当するポリペプチドが検出系中で最高の活性を示すｍ
ＲＮＡ画分はよく知られた方法により相補的ｃＤＮＡ中
へ転写される。ｍＲＮＡおよびオリゴ−ｄＴがブライマ
ーとして混合され、次いでｄＮＴＰｓが出発物質として
添加され、ｃＤＮＡｒｎ　ＲＮ　Ａハイブリッド分子の
合成が酵素リノ＼−ストランスクリプターゼにより実現
される。

ＲＮＡ分子はＮａ０Ｉｌの添加により分解される。

ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡポリメラーゼ■
のフレノウフラグメントが混合され、混合物が適当な温
度、好ましくは１２〜１５°Ｃでインキュへ−１〜され
る。ン昆合物はヌクレアーゼＳ１とともにインキュへ−
１・され、所望ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相
当するｄＳ−ＣＤＮＡ力（得られる。

増幅のために、得られたｄｓ−ｃＤＮＡは適当なベクタ
ー、例えばプラスミ）”　ｐ　ｔＪ　Ｃ−Ｋ　Ｏにスプ
ライシングするごとができ、得られたハイブリッドベク
ターを適当な宿主、例えばＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）
　　Ｉ（１３１０１の使用により増殖させることができ
る。ハイブリッドベクターの再分離およびそれから分ｎ
（されたｃＤＮＡの回収が所望ポリペプチドをコードす
るＤＮＡの＋１４造決定を可能にする。

ハイブリッドベクターの調製 本発明のハイブリッドベクターは、所望配列のポリペプ
チドをコードするＤＮＡを適当なベクターにスプライシ
ングすることにより３周製することができる。

適当なベクターは宿主最生物の形質転換に使用できる組
込まれたパラセンジャーｌ）ＮＡに対スる担体である。

非形質転換状態でデヒドロ了ミノおよび（または）スル
フィド基を含むポリペプチドを生ずるｉ微生物から３Ｗ
　導されたプラスミ１′かベクターとして適当である。

適当なベクターは挿入断Ｊ’ｊ−Ｄ　ＮＡを一定の位置
に保持する。

−ＪＣに、そのようなベクターはレプリコンおよび制御
配列、すなわちプロモーター、を含むことができ、それ
らは、それらが使用される宿主細胞と適合する宿主細胞
または種からｊ６　＞、ｔＪされる。ベクターは通常レ
プリコン部位を保持し、形質転換された細胞中に表現型
選択を与えることができる配列（標識遺伝子）を含むこ
とができる。適当な標識遺伝子は抗生物質耐性または重
金属に対する耐性を与えるごとができ、あるいはそれら
が宿主の遺伝欠？７３を９１１ｊ足することができる。

そのようなベクター中のさらに有用な配列はエンハンナ
ーおよびアクチヘーター配列である。

適当な出発ベクターの１つは株スタヒロコッカス・エピ
デルミスＤＳＭ３０９５からの５４Ｋｈｐプラスミドｐ
ｌＥｐｉ３２である。ごのプラスミドは下記特徴を有し
、５２−プレペプチドをコードするｅｐｉ　Ａ遺伝子を
含み、それは四ｌ０２１−ペプチドアミド抗生物質にプ
ロセッシングされる。

パラセンジャーＤＮＡを保持するベクターはハイブリッ
ドベクターと称される。

所望ＤＮＡは常法により出発−・フタ−にスプライシン
グされる。

例えば出発プラスミドは初めに適当な制限酵素により、
例えばプラスミドｐｌＦ、ｐｉ３２を１ｌｉｎｄｌｌｌ
、Ｂａｍ１ｌｌおよびＩＥ　ＣＯＲ［により、綿状化し
、次いでｄ　Ｇ　Ｔ　Ｐおよび末端デオキンヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼの存在下にｄ／Ｇテーリングす
ることができる。二本鎖ＣＤＮＡ挿入断片はｄＣＴＰお
よび末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの
存在下にｄＣ−テーリングされる。両Ｃ，ＤＮＡおよび
ベクターを結合さ−Ｕるとハイブリッドベクターを生ず
る。バクテリオファージ例えばラムダはゲノムライブラ
リーの構築に好ましい。ラムダクローニング系はマニア
ティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）により記載されている（油
出）。適当なベクターＤＮＡは適当な制限酵素で完全に
消化され、左右のアームが中心フラグメントから速度勾
配遠心分離またはゲル電気泳動により分離される。他の
方法は左右のア−Ｊ、中に認識部位を欠く制限酵素でス
タッファ−フラグメン１の部位を消化することである。

分離されたゲノムＤＮＡは長さ１３〜２０ｋｂのフラグ
メントに部分的に消化されることができる。その後アー
ムはアー１、の末端と適合する末端を有する外来ＤＮＡ
のフラグメントと連結される。

適当なりＮＡ挿入１所片は初めのクローニングに使用さ
れた初めのベクターからｊ♂当な発現へクタ−中へ再ク
ローニングされる。この目的のために適当な制限酵素が
、おそらくオキソヌクレオン（ｏｘｏｎｕｃｌｅｏｎｅ
ｓ）と組合せて使用され、所望ＤＮＡフラグメントが生
成される。

ＤＮＡ挿入断片は適当なよく知られたプラスミドベクタ
ー例えばｐｃ１９４、ｐ　Ｔ　＋　８１およびｐｔＪＢ
ｌｌｏの誘３３体の多部忙中へ制限部位１１ｉｎｄＴＩ
Ｉ／ｒ３ａｍｌｌ　Ｉ／Ｅｃ　ｏＲＩでり・ブタローユ
ングすることができる。

従って本発明の方法は、非修飾ペプチド中のシスティン
残基がスルフィド架橋アミノ酸により置換され、セリン
およびチアミンが相当するデヒドロアミノ酸残基により
置換される公知ペプチドおよびホルモンの誘導体の製造
に使用できる。

これらのフラグメントは粘着末端を用いることにより直
接、または適当な化学合成オリゴヌクレオチド架橋の付
加により適当な発現ベクター中へ取込まれる。末端の修
飾には、例えばｌｌ１ｎｄＩｌ［およびＢｇＬｒＴを用
いることができる。方法は任意の特異制限酵素に限定さ
れない。適当な制限酵素を化学合成オリゴヌクレオチド
と組合せて用いて任意の所望連鎖を発現ベクターとＤＮ
Ａ挿入断片との間に作ることができる。

部分特異的変異誘発を有するポリペプチドをコードする
適当なりＮＡ挿入断片もまた得ることができる。

種々の方法を基礎となるＤＮＡの変異の誘発に用いて所
望変異体を調製することができる。

１つの方法は初めに変異させる領域をコードする配列を
含む自生または基礎遺伝子のフラグメントを複製形態の
ファージ例えばＭＩ３ｍｐ８中に挿入してＭＩ３ｍｐ８
ＰＡを形成することを含むことができる。従って挿入配
列に相補的な、しかし置換されるアミノ酸をコードする
１つまたはそれ以上のヌクレオチドトリプレットを含む
合成オリゴヌクレオチドを一本鎖形態のＭ　Ｉ　３　ｍ
　ｐ　８　Ａにアニールして二本鎖領域を形成させる。

この領域は残留相補鎖のＤＮＡポリメラーゼＩ合成に対
するプライマーとして役立つ。複製および確認後、変異
体配列をさらに修飾するかまたはそれを用いて変異ポリ
ペプチドを発現する適当なベクターを構築することがで
きる。

エピデルミンで行なった研究において、対合を緩めたＤ
ＮＡプローブ、 ５　　’　　−ＧＴＧ（八）ＣＡＴ　（Ｇ／Ａ）ＡＴＧ
　（八）へへＴ（Ｃ）ＴＴ−３’　　がエ　ビデルミン
の提案プレー配列の適当なペンタペプチドセグメントか
ら演鐸された。ＬｙｓＰｈｅｌｌｅＣｙｌＴｌぼが調製
された。このＤＮＡプローブをＳ、エピデルミンＤＳＭ
３０９５からのプラスミドＤＮＡに対してハイブリッド
形成させた。

分離したプラスミドの制限分析はＥＥ　ｃ　ｏ　Ｉ？　
Ｉによる？ＤＮＡフラグメント（１６，１１１０，６，
５，５，５，３，５および２．５　ｋｂｐ　）　、ｌ１
ｉｎｄｕｌによる９ＤＮＡフラグメン１−（１７，１４
，１Ｏ２５，３，２，８，１，８，０，８，０，６およ
び０．５　ｋｂｐ）並びに３ａｍｌｌｌによる５ＤＮ八
フラグメント（２０，１９、ｌ０１３および１ｋｂｐ）
を示す。

５、４　ｋｂｐ　ｌ１ｉｎｄ　Ｉ１１フラグメン１−を
サブクローンし、再ハイブリッド化させ、それにより構
造遺伝子ｅｐｉ　Ａを２．２ｋｂｐ　Ｆ、ｃ　ｏＲＩ／
Ｂａ　（ｌ　［１フラグメント内に位置させた。

２４の混合物として異なる１４−マーをハイブリッド形
成プローブとして用いた。プローブは、ノビツク（Ｎｏ
ｖｉｃｋ）ほか、アナルズ・オブ・ザ・ニュー・ヨーク
・アカデミイ・オブ・サイエンス（八ｎｎ、　　Ｎ、　
　Ｙ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）、　　　１　８　
２．　　２　７　９　〜２９４　（１９７１）　、サザ
ン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）　、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．旧ｏ１．）、　９
８．　５０３〜５１７（１９７５）およびハイブリッド
（Ｉｌｅｉｎｒｉｃｂ）ほか、モレキュラー・アンド・
ゼネラル・シネティクス（Ｍｏｌｅｃｕｌ、　ｇｅｎ、
　Ｇｅｎｅｔ、）、　　２０９　、　５６３〜５６９　
（１９Ｂ？）中に記載された方法に従って配列決定プラ
イマーとして３０倍過剰に適用した。

エピデルミンのペプチド配列はオープン読み枠の確認を
可能にした。単メチオニンコドンはシャイン・ダルガル
ノ配列に対して適当な距離中にある。

プレ−エピデルミンの構造遺伝子はＴＡＡ終止コドンで
終結し、従ってプレ−エピデルミンは５２アミノ酸から
なり（第１図）、それはＡｒｇ　−’とＴｈｅ″１との
間でエピデルミンにプ１コセソシングされる。従って、
明らかに認められるように、プレ−エピデルミンは大タ
ンパク質の分離生成物ではなくて明らかな構造遺伝子に
よりコードされる。

従って、意外にも抗生物質の前駆物質タンパク質が明白
な構造遺伝子によりコードされることが明らかである。

二次構造（α、β、折返し）、屈曲性、ヒトロバシー、
親水性およびヘリックスホイールプロットに対する予想
プロフィルの組合せがハイコン（ｌｌｙｃｏｎ）プログ
ラムを用いて作られた（第２図）。

高α−ヘリックス確率はプレ−エピデルミン３０〜−−
８に対し予想され、−一方プレ−エピデルミンに相当す
るＣ束端部１〜２２は非常に高い折返し確率を示す。さ
らに予想ブｒコツトは明らかにＮ未Ｃ１１ｉ３０〜−１
が非常に親水性であり、Ｃ末端部が一層親油性であるこ
とを示す。Ｎ末端部３０〜−８は部分的に両親媒性α−
へリノクスに折りた〜まれると思われる。

プレ−エピデルミン−３０〜−１のＮ　末端セグメント
はシスティン残基を含まず、Ｃ末端セグメント１〜２２
はスルフィド架橋形成に含まれる・１システイン残基を
含む。配列−３０〜−１はエンドプロテアーゼに対する
多くの切断部位を含み、一方プレーエピデルミン状態に
おいても配列１〜２２はタンパク質加水分解に対して非
常に耐性である。

成熟抗生物質は単に位置１３中のｌｙｓでトリプシンに
より攻撃されるごとができる。ブロモ・７シンク部位Ａ
ｒｆＸ″ｌ−［ｌｅ″１は折返し形成Ｐｒｏ−”残基の
ために親水性であり、接近できる。

抗生物質例えばエピデルミンの生成中に生ずる種々の酵
素反応はプ１゛１−ポリペプチド部１〜２２の（１’ｌ
飾；Ｎ末端プレペプチドフラグメン１−３０〜−−−１
の切断および成熟抗生物質の分泌を含む（第３および４
図参照）。

酵素修飾はプレペプチドフラグメントの切断１ｉｉｉに
生ずる。酵素修飾はそれぞれデヒドロアラニンおよびデ
ヒドロブチリン残基を形成する位置５．１６．１９、お
よび８．１４中のＳｅｒおよびＴｈｒ残基からの水の脱
離をえむ。位置２．１１．２Ｉおよび２２中のＣｙｓ残
基のチオール基のＣ−Ｃ二重結合に対する付加もまた生
じ、メソーランチオコンまたは（２Ｓ、３Ｓ、ｆ３Ｒ）
−３−メチルランチオコン架橋を／ＩＥする。さらに、
残基２２の脱炭酸および二重結合形成がＣ−末０ｉｉｊ
　Ｓ　　（２アミノビニル）−Ｄ−システィンを生ずる
。Ｃ末端に位置するシスティンチオール！古のＮ−末端
に位置するデヒドロアミノ酸との反応がエピデルミン、
ナ・イシンおよびスブチリン中に完全な＼″ｆ体特体性
異性ずる。従って、修飾の間にこれらの税目（付加反応
がブ１／−エピデルミン残基Ｌ−５ｅｒおよびｌ、−Ｔ
ｔ＋ｒ（、こおけるＣ、炭素原子の配置のＤ配置Ｃ，原
子を〜”、える反転を意味する。一方、シスシーインの
半分のＬ配置がなお維持される。

次に同一触媒部位に４スルフイド環もまた形成され、そ
れはＮ末◇：；；両親媒性α−ヘリックスとの用１作用
により支１、〜される。Ｔｈｒ　”’のみがシスティン
を見出す、二、となく脱水する。この位置（Ｌｙｓ　”
　−Ｄｈｂ　”’　）は、トリプシンが抗生物質エピデ
ルミンを不活性化する酵素切断部位を構成する。スルフ
ィド環形成の間にＣ末◇；）ｉの硬さおよび疎水性が増
大し、プレ−エピデルミンと脂″ｉ１′二重層との相互
反応を容易にすることができ、ランスロケーションを誘
発することができる。

最後に、親水性α−ヘリカルＮ宋ｊ：：：　−、、、３
０〜１が１、Ｔ異プロテアーセにより前記１１−有切断
部位で切断される。

前記技術を用いてランチバイオティックスくｌ口ｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃｓ）をコードするプラスミドを、それぞれ
のポリペプチドをコードする遺伝子の変）′・二による
かまたはそのよ・うな遺伝子を一′？なるポリペブチ１
をコ・−ドする遺伝子により置換することにより修飾し
、原宿主または異なる宿主の形質転換に、そのような宿
主がまたその自生状態においてランチバイオティックス
を発現できれば、使用することができる。

一般的に言えば、原機能性遺伝子がプレー配列をコード
する場合に、例えばエピデルミンの場合に記載したよう
に、そのようなプレー配列をコ−ドするＤＮＡ配列が修
飾されたプラスミド「１弓こ保持されることができ；こ
の場合に新または変異ブローポリペプチドに対するＤＮ
Ａ配列が原プロポリペプチド配列と同様にプレー配列Ｄ
ＮＡのすぐ上流に位置するであろう。

本発明による細菌宿主の培養は、例えば１９８８年５月
１８日に提出された我々の同時係属英国特許出願第８８
１１７６０．１号および欧州特許出願公表第０１８１５
７８号中に記載された背進に使用される培養条件下に行
なうことができる。所望タンパク質の精製および分離も
また、吸着剤、イオン交換樹脂、および望むならば＋１
　Ｐ　Ｌ　Ｃの使用を含めて、前記特許出願中にエピデ
ルミンおよびガリデルミンについて記載された技術また
はその改変を用いて行なうことができる。

本発明の方法は実験ｌ」的に対する新規化合物の形成に
、あるいは新宿主中の公知化合物または公知化合物の誘
導体の形成に適用できる。例えば、エピデルミンをコー
ドする遺伝子を含むプラスミドを、種ストレプトコッカ
ス・ラクチスを形質転換してその宿主からエピデルミン
を生成させるために用いることができ、またはガリデル
ミン（前に参照した我々の同時係属英国特許出願参照）
をコードする遺伝子を、例えばプラスミドｐＥｐ　＋３
２中のエピデルミンに対するブローポリペプチドをコー
ドする遺伝子の置換に用い、スタヒロコッカス・エピデ
ルミスＤＳＭ３０９５を形質転換してこの宿主からガリ
デルミンを生成させるのに使用することができる。同様
に、デヒドロアミノ酸残基および（または）ランチオニ
ン架橋あるいは（または）メチルランチオニン架橋を含
む他の生物活性ペプチド誘導体、ホルモンの誘導体例え
ばヒトインシュリン、オキシトシン、バソプレッシン、
ペプチド抗生物質、ホルモン抑制物質例えばエラスター
ゼ抑制物質および線維素溶屑活性物質例えばヒト組織プ
ラスミノーゲン活性化物質を生成させることができる。

そのような誘導体並びに親化合物の保持生物活性が高い
安定性および改良された半減期を有することができる。

理想的には、所望ブローポリペプチドをコードするＤＮ
Ａはシスティンおよびセリンに対して、並びに（または
）システィンおよびトレオニンに対してチオエーテル架
橋を形成するコドンを含むべきである。

比１咬的短↑〕′ｉのポリペプチドに対し、これらのそ
れぞれのコドンは通常８個を越えず、好ましくは６個を
越えないコドン、離れているべきであるが、しかし最終
ポリペプチド分子の立体配座により一層大きい間陥が可
能であることが工１画される。

デヒドロアミノ酸の形成に関して、これらは通常セリン
および（・レオニンから誘導され、従って所望プ１コー
ペプチドをコードするＤＮＡはそのようなアミノ酸に対
するコドンを含む。

本発明により生成されるポリペプチド中に存在できる異
常なアミノ酸にはデヒドロアラニン、２．３−デヒドロ
−２−アミノ酪酸、メソーランチオニン、（２Ｓ、３Ｓ
、６Ｒ）−３−メチルランチオニン、Ｓ−（２−（Ｚ）
−アミノビニル）−〇−システィン、リシノアラニンお
よびβ−ヒドロキシアスパラギン酸があり、これらの残
基の構造は第５図中に示される。

実施例　１ １、　ガリデルミンの過剰生成 ガリデルミンのオープン読み枠を含むＤＮＡフラグメン
トをスタヒロコソカス・エビデルミゾイスＤＳＭ３０９
５、エピデルミン生産株、中に、中間コピープラスミド
例えばｐｃ１９４、ｐＥ１９４、ｐＵＢｌｌｏ、ｐＴ１
８１またはｐＭＫ　１４８ガリデルミンの使用によりク
ローニングすることができる。遺伝子星の増加はｊ］常
生成物生成の増加と相関し；相関は必らずしも直線的で
はない。ｐｃ１９４またはｐＴ１８１の高コピー数プラ
スミド誘導体はまたクローニングビヒクルとして使用で
きる。

２、　リーダー配列の交換 アミノ酸−１〜−３０に相当するエピデルミンのリーダ
ー配列はエピデルミンの分泌中に含まれる。その配列は
Ｓ、エビデルミゾイス中の他のペプチド例えばガリデル
ミンの分泌に使用できる。

リーダー配列Ｉ）　Ｎ　Ａはそれぞれのリンカ−をその
配列の初めおよび末端に挿入することにＪり移動可能に
することができる。従ってリーダー配列ＤＮＡはプラス
ミドから多量に分１４１１することができ、他のペプチ
ドおよびタンパク質のそれぞれの位置ｊＪ挿入すること
ができる。リーダー配列Ｉ）　Ｎ　Ａはまた化学合成に
より生成されることができる。

実箱例　２゜ Ｓ、エピデルミスを宿主みして用いたガリデルミンの製
造 （１）　　プラスミドの調製（第６０１１照）（ａ）ミ
、ンー＼ン工Ｌ１人学の図書館Ｃ′閲覧可能なローセン
スタイン（Ｄｒ、Ｒａ１ｆ　Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ）の
学位論文「スクヒロコ：・勾スによるプラスミドコード
化アルセニノトおよびアルセナートレステ、イステント
の分子遺伝学的研究（Ｍｏｌｅｋｕｌａｒ　ｇｅｎｔ＋
ｓｔ＋５ｃｈｅ　Ｌｌｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ　　
ｚｕｒ　　ｐｌａｓｍ＋ｄｋｏｄｉｅｒｔｅｎ　　八ｒ
ｓｅｎｉｔ　　ｕｎｄＡｒｓｅｎａｔｒｅｓｔ＋５ｔｅ
ｎｔ　ｌ１ｅｌ　５ｊａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｅｎ）　Ｊ
中に記載されたよ・うにＰｓｔ　　］消化ｐ　Ｃｌ＝　
ＰｌｏｏおよびＮｄｅｌ消化ｐ［Ｊｃ１８をフレノウを
用いて連結することによりプラスミドｐＣＩＪ　Ｉを調
製した。

得られたプラスミドを次にＥｃｏＲｌで消化した。

ｂ）　染色体Ｄ　Ｎ　Ａ、　”；ｚＳ、　カ’）　ナラ
ム（Ｄ　Ｓ　Ｍ４６１６）から分離１、ｆ’、ｃｏＲｌ
で消化した６ＩＩ　１ｎｃｌ　ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ
制限部位間の２、４　ｋｂ長配列中のガリデルミン措造
逍伝Ｙを含む４．７ｋｂフラグメントをプラ・イマーと
し２て配列 ５　　　’　　ＣＡＣＡＴＣＣＡＧ　　ＧＡＧ　　ＴＡ
Ｃ３を用いて分離１．た。

Ｃ）　次いで４．７　ｋｂクラグメントを段階、１）か
らの消化したｐ　ＣｔＪ　！プラスミドのＥｃｏｌシ■
部位中へ連結し、ｐ　ＣＬＪ　ｇ　ｄ　ｍ　１と称され
るプラスミドが得られた。

（２）Ｓ、エピデルミス宿りの調製 この実施例において、エピデルミスを一’ｌ　ｒ＆でき
るＳ、エピデルミスＤＳＭ３０９５ノｆｆ異株が分１服
された。

変５’ｌ：　５Ａ発は染色体にコードしたりファンビシ
ン耐性をコードする、株（２０ＩＩ　ｔ：　／ｍＲ＞に
行なった。

寒天１７板上で増殖したＳ、エピデルミス１つ３Ｍ３０
９５を用いて３０　ｍｅ　ｉＪ礎ジブロス培地接種し、
それを−宥ν培養しまた。次いで一夜給俣物０．５　ｍ
ｅを用いて４［産培地、’、、）　Ｑ　ｍｐ、に接種し
１、それを３７°Ｃで；（■、冒；）１振と一′１ｊｒ
ｊ負（７た。

才、［１１胞を培地から移し、４．５ｍｌ！ｌｉ↑ｆ、
１ＪＩＩ温１’　Ｍ　ｉｆｆ街液Ｃ３０ｍＭｌ・リスー
マレアー１−　ｐＨ６，５）中に懸ｌ慣した（／ｌした
７容ン夜４ン容〈夜へと称する）。

：’Ｊ　？！ｌΔを自然変巽および細胞数について調べ
た（１．２５　×１０１０細胞／　ｒｔｄ　）。

１’Ｊ／＆Ａ４＊認を１．　ｍｌエチルメー丁−ルスル
ホーノ”−１・ととも（こ（最終；・８度４７１ｊｇ、
／ｍｌ＞　　十分振とうし５６次いで振と−）下に３７
°Ｃで目、胃１１１維持した。

次いで１！］　ｉＦａを培なブロスから抽出し７．２凹
′１゛Ｍ緩衝液で洗浄し、５　ｍｌ！、　’Ｔ’　Ｍ緩
衝液中に再懸ン蜀した（生じた）合液は溶ン夜Ｉ３と（
；トされ、変異才、１■胞を金石した）４、 ？容’／（ｌ　Ｂば２　Ｘ　１０　’　ｔｌ旧１ａ　ｙ
　ｍｌを含み、１．６％の生存中に相当する。

溶液Ｆ３５０μｅを５ｍβ生産培地に加え、３７℃で一
夜増殖させたく表現型発現）。生じた溶液を溶液Ｃと称
した。細胞数は ７．３ＸＩＯ’細胞／ｍ／４示した。

）合液を１３　Ｍ寒天平板−１−で培養し７、個々のク
ローンを採集した。これを用いて試験平板（ミクｌココ
ノカス・ルラーウスを表面）−に；斤いた８Ｍ寒天から
なる）に接■Φし、た。Ｍ、ルう一つス乙、′、関する
阻止効果を有１，７なかったコＬ−】ニーをエピデルミ
ス非／を産休とし−Ｔ選んだ。

８Ｍ寒天は毎召当り １０ｇ　　ペプトンＮｏ、　１４０ ５ｇ　酵母エキス １ｍｇ　　グルコース ５ｍｇ　　ＮａＣｊ７ １ｍｇ　　Ｋ２８Ｐ○。

ｐＨ７，５ を含有する。

約３％の変異率が認められた。

見出された４５非生産体を２０回サブクローンし、１６
安定非生産体が得られた。

安定非生産体はすべて野生型プラスミドｐＥｐ　ｉ　３
２を含むと認められた。制限パターンから、これは野生
型株中のプラスミドに等しいと同定される。

非生産性Ｓ、エピデルミスの形質転換 Ｂ　Ｘｖｉ培地培地７５０ｍ全安定非生産体株の一夜培
養により得た培地５ｄで接種し、接種した培地を２１フ
ラスコ中で３７℃で１２０ｒｐｍの振とぅ速度で振とう
培養した。

接種した８Ｍ培地の初期光学濃度は０．０３〜０．０４
であった。光学濃度が０．４５〜ｏ５５５に達したとき
、細胞をＧ５−３−ｔｌ−ター中、８５（１０ｒｐｍで
４℃で１５分間の遠心分離により除去した。

分離した細胞を次いで、順次７５０．３５０．４０およ
びｌＱ＋ｎｆの１０％グリセリン中で洗浄し、２〜３　
ｍｌの１０％グリセリン中に）脈濁し、Ｅ　ＲＧ中に１
１０μ１部中で一７０℃で凍結した。細胞数は１５ｘｌ
Ｏ＋°／　ｍｌになった。

凍結細胞を室温で５分間融解させ、次いで細胞懸濁液５
０μｌをＥＲＧ中でＴＥ緩衝液中の２μｌのプラスミド
ｐｃＵｇｄｍｌとともに室温で３０分間インキュベート
した。

次いで混合物を０．２ｃｍ電極間隙を有する電気泳動セ
ル中へ導入して直ちに電気泳動した。その後細胞を速や
かに９５０μｆｆｓＭＭＰ５０培地中に再懸濁し、２．
５　ｍｌｌ　Ｅ　ＲＧ中へ移し、３７　’Ｃで９０分分
間上うした。ＥＲＧは培地の良好な通気を与えるために
４５６に傾斜させた。

ＳＭＭＰ５０培地は１（１０ｄ当り、５５　ｍ１２Ｓ　
Ｍ　Ｍ、４０ｍ１４ＰＡＢおよび５モへ５冗ＢＳ八を含
有する。２３ＭＭは１モルサッカロース、０．０４　モ
ル？　Ｌ／イン酸、０．０４　モノｌ／ＭｇＣｌ　２お
よびＮａ　０１１　ｐＨ６，５までを含み１．Ｉ　ＰＡ
Ｉ３は７ｇ／　ｌ　ＯＯｍＲギブコ（Ｇｉｂｃｏ）抗生
物質培地３の溶液である。

細胞！懸濁液を希釈し、ガリデルミンを含む１３Ｍ寒天
上ζこ広げ、それを３７°Ｃで２０分間インキュへ−１
−シた。

ガリデルミンを生ずる増殖株の試験を、Ｍ、ルテウス試
験平板からのコロニーの選択により、それぞれの選１尺
コロニーを；ｄ拐し、Ｉ（Ｐ　Ｌ　Ｃによりガリデルミ
ンの存在を測定することにより行なった。

ガリデルミンを生成できる３ｐＣＵｇｄｍｌ形質転換変
異体が突きとめられた。

ｐ　ＣＵ　ｇ　ｄ　ｍ　ｌ形質転換Ｓ、エピデルミンに
ょ財戊されたガリデルミンのｔ　の ａ）生物検定 ＦＰ寒天をＭ、ルテウスＡ’ｌ’ｃｃ　９３４１で接種
し、３７℃で１８時間インキュベートした。

生じた培養株の２をループで移し、１（１０ｍｆＦＰ培
地中に懸濁し、３６℃で８時間培養した。

光学濃度が１．０に達したときに培養を止めた。

ＦＰ寒天をこの）懸濁液０．５％で接種し、各１０−を
ペトリ皿に入れ、４℃で３週間貯蔵した。

プレート拡散試験をツァーナーほか（Ｚａｈｎｅｒａｎ
ｄ　Ｍａａｓ）　、ｒ抗生物質の生物学（Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ　ｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）　ｊ　、スプリンガ
ー・フエルラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　
、Ｂｅｒｌｉｎ）　１９７２中に記載のように行ない、
形質転換したＳ、エピデルミンの培養の培養濾液１０μ
βを濾紙上に捕捉し、乾燥した。濾紙を試験プレート上
に置き、次いでそれを３７℃で２４時間インキュベート
した。

ｂ）　　＋１　Ｐ　Ｌ　Ｃ 選んだ形質転換株を住産培地中で２６時間培養した。培
養ブロスを１０分間１３．（１０Ｏｒｐｍで遠心分離し
た。

分離培養液を次いでＳ　Ｐ　８．７（１０液体クロマト
グラフィー装置〔スペク）・う・フィジンクス（Ｓｐｅ
ｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、　Ｆ
　ＲＧ）　）上で移・、ＦＩＪ相として、Ａ）０．５％
７０％過塩素酸を有するｌ−１２０およびＢ）アセトニ
トリルを用いてＨＰ　Ｌ　Ｃにかけた。カラム充填物は
粒径７μｍのヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）−１
（１０Ｃ１８であり、カラムサイズは１２５ｍｍＸ　４
．６ｍｍ　ｌ　、　Ｄ。

およびプレカラムに対する２　０ｍｍＸ　４．６ｍｍ１
．　Ｄ、であった。

勾配は次のとおりであった： 時間（分）Ａ〔％）　　Ｂ（％〕 ０　　　　　７７、５　　　２２．５ ８　　　　　６３．０　　　３７．０ ８．５　　　　　０　　　１（１０ ９．５　　　　　０　　　　ｔｏｏ ｌ　０　　　　　７７、５　　　２２．５１４　　　　
　７７．５　　　２２．５生じたクロマトグラムは第７
八図中に示される。標準曲線は第７Ｂ図中に示され、ガ
リデルミンが７．５４分で溶出することを示す。

次のものが培地として使用された。

１゜ ２゜ ＦＰ寒天 陶工：トス ペプトン ＮａＣβ Ｎａｚ　ｆ−（Ｐ　Ｏｓ グルコース 複合寒天 水 ρＩＩ ＦＰ培地 肉エキス ペプトン ａＣｎ Ｎａｚ　Ｉ−（Ｐ　Ｏ。

グルコース 水 ｐＨ ｇ ０　ｇ ｇ ｇ 　０ｇ ５ｇ ７．２ ｇ ０ｇ ｇ ｇ １０ｇ １　ρ ７．２ ３、生産培地 肉エキス　　　　　　　３３　　ｇ 麦芽エキス　　　　　　３０　　ｇ ｌｌａｃ　（！　　　　　　　　　４０　　Ｈ水酸化カ
ルシウム　　　　３．８ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　１　　βｐＨ６，
５ 泌物のＨＰＬＣクロマトグラム（第７Ａ図）および標準
曲線（第７Ｂ図）を示す図である。

【図面の簡単な説明】

第１図はプレーエピデルミンのアミノ酸配列を示す図で
あり、第２図は二次構造、屈曲性、ヒドロハシ−１親水
性およびヘリックスホイールプロットに対する予想プロ
フィルを示す図であり、第３図および第４図は抗生物質
の生成中に生ずる酵素反応を示す図であり、第５図はタ
ンパク質プロ抗生物質から３Ａ　’ｒｌされたランチオ
ニンペプチド抗生物質（ランデバイオティックス）中に
認められる異常アミノ酸を示す図であり、第６図はプラ
スミドｐ　ＣＩＪ　ｄ　Ｂ　ｒｎ　ｌの調製を示ずし１
であり、第７図はｐＣＵ　Ｂ　ｄ　ｒｎ　ｌ形質転換Ｓ
、エピデルミン分第２Ａ図 残基番号 第２Ｂ　［！！ 第７Ａ図 ＥＭＳ　　５　　プラス　ｐｃＵＧａ （ガリデルミン） 筒７Ｂ図 ガリデルミン　−標準 測定 よ１１定 ＭＩＮ　ファクタ−＝　１．ｏｏｏＯＥ”ｃつＭＩＮ　
ファクター： （Ｘ）ＯＯＥ＋Ｏ○

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）プラスミドが宿主により通常生成されないポリペ
   プチドをコードし、培養の間に前記宿主が多酵素複合体
   を与え、それにより少くとも１つのデヒドロアミノ酸お
   よび（または）少くとも１つのランチオニン架橋を含む
   ポリペプチドが生成され、前記生成ポリペプチドが前記
   宿主にとって外来である、プラスミドを含む細菌宿主。
2. （２）多酵素複合体が水脱離および（または）スルフィ
   ド架橋形成、並びにおそらくまた脱炭酸および二重結合
   形成を行なうことができる、請求項（１）記載の細菌宿
   主。
3. （３）ストレフトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
   ｃｏ−ｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）、バシラス・サチリス
   （Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマ
   イセス・シンナモネウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
   ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）、ストレプトマイセス種（Ｓ
   ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｓｐ．）、ストレプトベルテ
   ィカラム・グリセオベルティシラム（Ｓｔｒｃｐｔｏｖ
   ｅｒｔｉｃｕｌｌｕｍ　ｇｒｉｓｅｏｖｅｒｔｉｃｉｌ
   ｌｕｍ）、スタヒロコッカス・エピデルミス（Ｓｔａｐ
   ｈｙｌｏｃ−ｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、スタ
   ヒロコッカス・エピデルミン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
   ｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）株５またはスタヒロコッ
   カス・ガリナラム （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｇａｌｌｉｎａｒｕ
   ｍ）である、請求項（１）または（２）記載の細菌宿主
   。
4. （４）プラスミドが抗生物質、ホルモンまたは線維素溶
   解物質をコードする、請求項（１）記載の細菌宿主。
5. （５）宿主がスタヒロコッカス・エピデルミスＤＳＭ３
   ０９５であり、プラスミドがガリデルミンをコードする
   遺伝子を含む、請求項（１）記載の細菌宿主。
6. （６）請求項（１）〜（４）のいずれか一項に記載の細
   菌宿主を培養すること並びに生じた少くとも１つのデヒ
   ドロアミノ酸残基および（または）１つのランチオニン
   架橋を含むペプチド生成物を分離することを含む方法。
7. （７）請求項（５）記載の細菌宿主の培養により生成さ
   れたガリデルミン。
8. （８）請求項（１）〜（６）のいずれか一項に記載の宿
   主の形質転換に適するプラスミドであって、プレ−エピ
   デルミンのプレ−ペプチド配列−３０〜−１およびエピ
   デルミンとは異なるプロ−ペプチド配列をコードするプ
   ラスミド。
9. （９）プロ−ペプチド配列がガリデルミンをコードする
   、請求項（８）記載のプラスミド。
10. （１０）エピデルミン以外の抗生物質、またはホルモン
    、あるいは線維素溶解物質をコードするヌクレオチド配
    列を含むように修飾されたプラスミドｐＥｐｉ３２。
11. （１１）ガリデルミンをコードする、請求項（１０）記
    載のプラスミド。