JPH01501939A

JPH01501939A - 免疫抑制ペプチドおよび使用法

Info

Publication number: JPH01501939A
Application number: JP63502107A
Authority: JP
Inventors: クレツツアー，ウイリアム・エス; ナソ，ロバート・ビー; ウオーナー，ジヨン・アール
Original assignee: オーソ・フアーマシユーチカル・コーポレーシヨン
Priority date: 1987-01-28
Filing date: 1988-01-25
Publication date: 1989-07-06
Also published as: AU1366088A; WO1988005783A1; DK535988A; EP0300031A4; KR890700602A; DK535988D0; EP0300031A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】疫抑制ペプチドおよび使用法発明の背景免疫抑制、非再生貧血および好中球減少は、レトロウィルスで持続的に感染した動物の主要な臨床的症候である。ネコ白血病ウィルス（ＦＬＶ）は、また、持続的にウィルス血症のネコにおいて無形成貧血および免疫抑制を誘発することができる、白血病誘発レトロウィルスである。

ヒト後天性免疫欠損症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫欠損ウィルス、例えば、ＨＩＶ−１８よびＨＩＶ−１７，以後総合的（：ＨＩＶと呼ぶ、と呼ばれるレトロウィルスによって引き起こされる。ＨＩＶは、また、ウィルス血症の個体において免疫抑制を引き起こす。ネコ白血病およびヒトＡＩＤＳにおけるレトロウィルス仲介免疫抑制は、事実、機会的感染に対して感受性とさせる。免疫抑制された個体において、最も頻繁に病的状態および致死の原因となるのはこれらの感染である。ＦＬＹ誘発病気において、免疫抑制は、少なくとも部分的に、ｐ１５Ｅ、すなわち、ウィルス膜内外蛋白質と呼ばれるウィルス遺伝子産生物に起因するように思われる。ＡＩＤＳにおいて、免疫抑制はヘルパーＴ細胞におけるＨＩＶ複製に関係する事象の複雑な系列の結果であることがある。しかしながら、）ＨＩＶ中の免疫抑制ペプチドの存在（後述する）は、ｇｐ４１、ｐ１５ＥのＨＩＶ免疫抑制類似体が、また、ＨＩＶ感染の初期の確立に関連する免疫抑制において、ある役割を演することを示唆する。

ネコ白血病ウィルス成ペプチドは、他の研究者らによって、完全なウィルス蛋白質まｔ；は無傷のウィルスによって誘発されるものに類似する生体外免疫抑制作用を発揮することが示された［チアンチオロ（Ｃ１ａｎｃｊｏｌｏ）ら、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２３０＝４５３．１９８５］、この免疫抑制作用の１つの測度は、ミトゲン誘導リンパ球増殖の生体外阻害である。チアンチオロ（Ｃ１ａｎｃｉｏｌｏ）らが開示するペプチドは、ＭＬＶから誘導され、そしてアミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＤＬ　ＩＦＬＫＥＧＧＬを有するに０この配列をいくつかの他のレトロウィルスの膜内外景白質の配列と比較すると、この領域は、ＦＬＹ、相同性Ｔ細胞リンパ栄養性ウィルス（ＨＴＬＶ−１およびＩＩ）、ウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）、および非常に小さい程度にＨＩＶを包含するレトロウィルスの間に比較的よく保存されることを示す。チアンチオロ（Ｃ１ａｎｃｉｏｌｏ）らは、まに、ネズミｐ１５Ｅペプチドは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に架橋したカーポジイミドである場合にのみ、活性な免疫抑制剤であることを報告した。

蛍光活性化細胞の分類によって、ヒト癌から誘導された種々の細胞系における抗原を検出する、ｐ１５Ｅの特徴づけられない抗原決定基に対するモノクローナル抗体は、また、記載された［ジャーナル・オブ・イクスペリメンタに−Ｊディシン（Ｊ　、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　）、１５９：９６４．１９８４］　、Ｌかしながら、ｐ１５Ｅ関連抗原の生化学的性質は開示されておらず、そして、それと、３５．０００ダルトンの蛋白質あるいは種々のヒト白血病そして癌細胞系によって発現されｆ：１１０．０００ダルトンの蛋白質の間の関係は示されたおらず、そしてそこに記載されていない。モノクローナル抗体を使用して生体外抑制活性を吸収および除去することができるが、これらの抗体がウィルスｐ１５Ｅの高度に保存された免疫抑制領域に結合すること、あるいはこのような結合が免疫抑制をブロッキングすることは示されていない。事実、著者らが最近の会合で口頭で述べたところによると、抗体はｐ１５Ｈの保存された領域からの１７アミＬ酸ペプチドに結合しない。最近の報告は、また、生物学的に活性なｐ１５Ｅ関連抗原はヒト腫瘍から誘導された細胞系によって解放される［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ　、　Ｉ　ｍ１ｍ＋ｕｎｏ１．）、１３７：２７２６．１９８６］。

ヒト白血病は、ある方法で、レトロウィルスが中華する免疫抑制に類似する、造血抑制によってしばしば特徴づけられる。ヒト白血病から誘導される細胞系、すなわち、に５６２およびＨＬ−６０細胞は、正常な骨髄細胞の生体外増殖および牌細胞のミトゲン誘導分化をブロッキングする因子を分泌することが報告された。また、これらの細胞のあるもの、すなわち、Ｋ５６３およびＨＬ−６０を、細胞分化剤で生体外処理すると、抑制因子の発現を減少することが報告された。追加の情報として、次の文献が上げられる：オルフソン（Ｏｌｆｓｓｏｎ）　、Ｔ、　、オルソン（Ｏｌｓｓｏｎ）、■、（１９８０）、ヒト前骨髄細胞系（ＨＬ−６０）から誘導された白血病関連阻害剤（Ｌ　Ｉ　Ａ）による正常顆粒球形成の生体外抑制、白血病の研究（Ｌａｕｋｅｍｉａ　Ｒｅｓ、　）、４：４３７゜オル７ソン（Ｏｌｆｓｓｏｎ）　、Ｔ、　、エルシン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）　、Ｅ、　、オルソ”／　（Ｏｌｓｓｏｎ）、！、（１９８４）、白血病関連阻害剤（ＬＡＩ）を産生ずる骨髄性白血病における細胞の特性づけおよび正常骨髄におけるＬＡＩ産生細胞の立証、白血病の研究（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｒｅｓ、　）、８：３８７゜ス、テイバーグ（Ｓ　ｔｅｔｎｂｅｒｇ）　、Ｈ−Ｎ　−、チアドソゲロウ（７ｇｉｇｔｓ。

ｇｌｏｕ）　％　Ａ、　Ｓ　−、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）　、Ｓ、　Ｈ，（１９８５）、化学的因子による誘発された分化後における白血病細胞系による正常骨髄コロニー形成の抑制の損失。血液（Ｂｌｏｏｄ）　、　６５　：　１００゜チアオ（Ｃｈｉａｏ）　、Ｇ、　Ｗ、　、ヘイル（Ｈｅｉｌ）、ｚｏ、ルットン（Ｌｕｔｔｏｎ）、Ｊ、Ｄ、、チ會イ（Ｃｈｏｉ）　Ｎ　Ｙ−Ｓ−、レウング（Ｌ　ｅｕｎｇ）、Ｋ、（１９８６）、白血病誘導阻害°剤による白血球の活性化および機能の抑制、ＰＮＡＳ、８３：３４３２゜本発明の目的は、ｐ１５Ｈの免疫抑制ペプチド領域およびｐ１５Ｅそれ自体と反応する抗体を提供することである。

お他の目的は、ＦＬＹに対するワクチンとし丁使用できるペプチドを開発することである。

さらになお他の目的は、治療的適用のための免疫抑制ペプチドおよびそれに対する抗体を提供することである。

本発明のなお隼の目的は、ウィルス的に、非ウィルス的に、あるいは内因性のウィルスによって誘導された、ｐ１５Ｅ関連免疫抑制因子を検出するための抗体を提供することである。

発明の要約担体分子に接合すると、免疫関連不全、例えば、自己免疫病、・移植拒絶およびアレルギーの処理におシーて治療剤として使用できる、新規な免疫抑制ペプチド配列が提供される。また、レトロウィルス、例えば、ＦＬＶ％ＢＬＶ、ＨＴＬＶ、および）（ＩＶに暴露したときの免疫抑制および病気を防止するためのワクチンとして、これらのペプチドを使用することが提供される。さらに、イムノアッセイにおいてｐ１５Ｅ関連蛋白質の発現を同定することによって、ヒト癌を診断できる、抑制ペプチドに対する抗体が提供される。

本発明は、また、担体分子に架橋しないで、生物学的に活性な、可溶性免疫抑制ペプチドを提供する。ｐ１５Ｅ内に包含され（１６Ｂと表示する）かつアミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱを有する１つのペプチドは、異常な接着性を示す。１６Ｂペプチドの抗血清は、ウィルスの感染性を中和することが発見された。

１６Ｂペプチドで抗血清をブロッキングする（これは抗体仲介中和を撤廃する）と、増大しｔ；ウィルスの感染性が検出された。より最近、１６Ｂ抗血清を使用する免疫細胞化学の研究は、ＦＬＹ感染した細胞中の抗原を検出した。１６Ｂペプチドでこの抗血清をブロッキングする（これは抗原の抗体認識を妨害する）と。

見掛けの非特異的方法で細胞の着色を増大した。

ｐｌｓＥ内に包含され（Ｉ　ＳＰと表示する）かつアミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＤＩ　ＬＦＬＱＥＧＧＬＣを有する他の新規なペプチド（Ｉ　ＳＰと表示する）は、まｔ：、免疫抑制活性を示す。

本発明は、ＩＳＰドメイン（ｄｏｍａｉｎ）に結合しかつ次のアミノ酸配列を有する１６Ｂの部分からなる、免疫抑制ポリペプチド、８１６Ｂ’：ＩＳＰと表示する、を提供する：ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱＬＱＮＲＲＧＬＤＩ　ＬＦＬＱＥＧＧＬｃｌ−一−δ １６Ｂ−−１１−−−−−−Ｉ　５Ｐ−−−−−−−ｌδ１６Ｂ：ＩＳＰは、ネズミ牌Ｔリンパ球の生体外ミトゲン誘発分化を阻害する、可溶性ポリペプチドである。観測される阻害増殖は、細胞毒性の機能であると、占われない。また、活性である他のペプチドの立体配置は、七ツマ−、シマーおよびマルチマーの形態の、レトロウィルスおよび細胞の蛋白質からお関連する配列、倒立した構造体（ＩＳＰ：１６Ｂ）、先端を切つ？＝１６Ｂ：ＩＳＰおよびＩＳＰ：１６Ｂペプチドを包含する。担体分子結合ペプチドを越えｔ；これらのペプチドの利点は、より高い可溶性、低い免疫原性およびより低い（Ｗ／Ｖ）濃度における生物学活性を包含する。

本発明は、また、約１１０．０００ダルトンの分子量を宵し、哺乳動物の白血病および癌細胞上で検出される、精製されたポリペプチドに関する。このポリペプチドは、ネコ白血病ウィルスｐ１５Ｅの予測したアミノ酸配列からの免疫抑制ポリペプチドに対してレイズされた抗血清で検出される。この１１０．０００ダルトンのペプチドを検出する抗体は、多数の悪性疾患の診断に、および軽快した白血病の患者の抹消血液を残留する病気について監視するｔ；めに有用である。その上、このポリペプチドは癌の免疫性の白血病および腫瘍細胞仲介破壊において機能的役割を演するので、それに向けられｔ；合成ペプチドまたはその受容体、ならびにその予測されたアミノ酸配列から誘導された合成ペプチドは、抑制されｔ；腫瘍免疫性を変調するために治療的用途を有する。

ネコ、ヒトＴ細胞およびネコ白血病ウィルスの抑制ペプチド（ＩＳＰ）に対してレイズされたポリクローナルウサギ抗体を、発生させ、そして親和精製して、ＦＬＹ−ＩＳＰ抗体を得た。このようなＦＬＹ−ＩＳＰ抗体による免疫細胞化学的着色は、ＦＬＶ感染ネコ細胞中の抗原を強く検出する。しかしながら、ＩＳＰ抗体は、また、ヒト白血病患者から確立された種々の細胞系における抗原を検出するが、正常ネズミ線維芽細胞中において検出しない。正常個体からの抹消血液の白血球（ＰＢＬ）の抗体の着色は、白血病細胞またはフィトヘマグルチニン（１１２３球ミトゲン）刺激ＰＥＬ類と比較して非常に弱い。［！５５］メチオニンで４時間代謝的に標識したＦＬ７４からの免疫沈殿は、ウィルスのｎｖｇｐ８５　および約１１０，０００ダルトンの分子量を有する本発明の新規なポリペプチドを検出した。ヒト白血病細胞系ＲａｊｉＷする同様な実験は、約３５．０００　（３５Ｋ）、３７．０００　（３７Ｋ）および１１０．０００　（ｌ　ｌ０Ｋ）ダルトンの分子量を有する３種類の蛋白質を検出しｔ；。ｌｌ０Ｋ蛋白質はヒト白血病細胞系に５６２、ＥＭ２およびＨＬ６０において検出されたが、３５におよび３７には検出されなかった。ｌｌ０Ｋは、また、ヒト表皮癌細胞系Ａ４３１において発見されたが、正常ネズミ３Ｔ３線維芽細胞において発見されなかった。ウィルス関連ｐ１５Ｅを沈殿させる遠心速度を使用すると、ヒト白血病細胞からのｌｌ０Ｋ蛋白質は、コンディジ１ニングした生長培地の上澄み分画中に検出された。この可溶性１１０に蛋白質は、種々の白血病および充実腫瘍から確立された細胞系によって生長培地中に解放され、ＦＬＶｐ１５Ｅの免疫抑制ペプチドドのメインに対して構造および機能が類似するエピトープを示す。

Ｂａ１ｂ／ｃ牌細胞を、ネズミＴ細胞ミトゲンＣｏｎＡ　（４μｇ／ｍｌ）　８よび滴定量のδ１６Ｂ：ＩＳＰペプチドの存在下で４日間培養した。δ１６Ｂ：ｒＳＰペプチドにＪｊｈ露しｔ；ミトゲン刺激培養物の分化は、対照培養物（細胞およびミトゲンのみ）の百分率として表わす。破線は、陽性の対照培養物（細胞＋ミトゲンのみ）の分化を示す。

Ｂａ１ｂ／ｃ牌細胞を、ＣｏｎＡおよび滴定量のこれらのペプチドの存在下で４日間培養した。破線は、陽性の対照培養物（細胞上ミトゲンのみ）の分化を示す。

一一一−１６Ｂ・−・婁ＩＳＰムーム冨δ１６Ｂ：ＩＳＰ第３図。δ１６Ｂ：ＴＳＰ誘導　疫抑制Ｂａ１ｂ／ｃ牌細胞を、ＣｏｎＡ　（Ａ）またはＬＰＳ（Ｂ）で滴定量の８１５Ｂ：ＩＳＰペプチドの存在下に刺激した。細胞培養物は４日または５日の間インキュベーションした。（Ａ）Ｔ細胞分化への作用。（Ｂ）　Ｂ細胞分化への作用。

ムームー第４日・−・菖第５日第４図。リンパ球増殖の抑制Ｂａ１ｂ／ｃ牌細胞を、ＣｏｎＡおよび滴定量の８１６Ｂ：ＩＳＰペプチドの存在下に、収穫前、３．４まｔ；は５日培養した。増殖の値は対照培養物（細胞およびＣｏｎＡのみ）の百分率である。

・−・−第３日 ■−■−第４日ムーム＝第５日 δ１６Ｂ：ＩＳＰペプチドをマイクロタイターのウェルへ結合し、そして標準の酵素結合免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において異なる好ペプチド抗体調製物とともにインキユベーシーンした。ＡＰ４４８−２８、ＩＳＰペプチドに対する親和精製したウサギ抗血清；９−１４Ｆ２−３，１ＳＰペプチドに対するマウスモノクローナル抗体、Ｒ１１２−５，１６Ｂペプチドに対するウサギ抗血清；ＡＰ６７、ｃ−ａｂｌ岸遺伝子産生物に対する親和精製したウサギ抗血清（陰性の対照）。

・−・−σ−Ｉ　ＳＰ　（ＡＰ５５−２８）ムーム−ａ−ＩＳＰ　（９−１４Ｆ２−３）−一■＝ａ−１６Ｂ　（Ｒ１１２−５）０−０−　ａ　−ａｂｌ　（ＡＰ　６７）本　明および特定の実施態様の詳細な説明法の表は、本願の範囲内で使用するアミノ酸および略号を列挙する二アミノＥ１　３文字　１文字Ｌ−チロシン　ｔｙｒ　Ｙグリシン　ｇｌｙ　ＧＬ−フェニルアラニン　ｐｈｅ　ＦＬ−メチオニン　ｍｅｔ　ＭＬ−アラニン　ａｌａ　ＡＬ−セリン　ｓｅｒ　ＳＬ−インロイシン　ｉｓｏ　ＩＬ−ロイシン　ｌｅｕ　ＬＬ−スレオニン　ｔｈｒ　ＴＬ−バリン　ｖａｌ　ＶＬ−プロリン　ｐｒｏ　ＰＬ−リジン　１７ｓ　ＫＬ−ヒスチジン　ｈｉｓ　ＨＬ−グルタミン　ｇｉｎ　ＱＬ−グルタミン酸　ｇｌｕ　ＥＬ−トリプトファン　ｔｒｐ　ＷＬ−アルギニン　ａｒ（ＲＬ−アスパラギン　ａｓｐ　ＤＬ−アスパラギン　ａｓｎ　ＮＬ−システィン　ｃｙｓ　Ｃ特定されず　Ｘ本発明は、約４０より少ないアミノ酸残基を有するペプチドからなり、前記アミノ酸残基は少なくとも５つのアミノ酸残基のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列はアミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣＣＦの範囲内に含まれるアミノ酸配列から選択される、免疫抑制ペプチドを提供する。この出願の範囲内において、「ペプチド」は２〜約１００アミノ酸を有するアミノ酸残基の連鎖を意味し、そして天然に産出する産生物から精製されたペプチド、あるいは合成または組み換えＤＮＡ法によって生成されＩ；ペプチドを包含する。約１００より大きいアミノ酸残基を有するアミノ酸連鎖はここではポリペプチドと呼ぶ。本発明の１つの実施態様において、ペプチドは担体分子に接合して免疫抑制化合物を形成する。この出願の範囲内において、「担体分子」は、問題の配位子に、接合する、例えば、架橋すると、配位子の免疫原性を増大するか、あるいは配位子の生物学的活性、例えば、免疫抑制活性を活性化する分子を意味する。配位子の免疫原性を増大する担体分子は、この分野において知られており、そして大きい蛋白質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オバルプミン、ブタチログロブリンおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脂質、およびペプチドを包含する。配位子の生物学的活性を活性化する担体分子は、また、この分野において知られており、例えば、ポリエチレングリコールである。担体分子へペプチドを接合する方法は、この分野において知られており、そして次の文献に記載されている：ラーナー（Ｌ　ｅｒｎｅｒ）ら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）（１９８１）ヱ盈：３４０３−３４０７、チャーチ（Ｃｈｕｒｅｈ）ら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）（１９８３）８０　：　２５０、およびエルランガ −（Ｅｒｌａｎｇｅｒ）　ｓ　メソツズ・オブ・エンジモロジー（Ｍｅｔｈ　ｏｆ　Ｅｎｚｙ＋＋＋ｏｌｏｇｙ）　（１９８０）ヱ０：８５−１０４ｅペプチド：担体分子接合体を調製するために有用なカップリング剤は、この分野において知られており、そして慣用の架橋剤、例えば、アルデヒド、例えば、グルタルアルデヒド、カーポジイミド、スクシンイミド、ビス−ジアゾ化ベンズアジン、およびイミデートを包含する。出願人は、また、ある種のアミノ酸、すなわち、システィンまたはリジンを、本発明のペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端に、担体分子への架橋の目的で、付加することを考える。本発明の好ましい実施態様において、担体分子はキーホールリンペットヘモシアニンである。本発明の他の実施態様において、担体分子をペプチドにグルタルアルデヒドを使用して接合する。

本発明は、また、約４０より少ないアミノ酸残基を有するペプチドからなり、前記アミノ酸残基は少なくとも５つのアミノ酸残基のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列は、ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣ。

Ａ−ＡＬＫＥＥＣＣＦＬＫＥＥＣ。

ＱＥＧＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣ。

ＫＳＬＴＳＬＳＥＶＶＬＱＮＲＲＧ。

ＬＱＡＲＩ　ＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬｌＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧ　ＩＷＧＣ３ＧＫＬ　Ｉ　Ｃ。

ＱＲＥＫＲＡＶＧ　Ｉ　ＧＡＬＦＬＧＦＬＧ。

ＱＬＴＶＷＧ　Ｉ　ＫＱＬＱＡＲＩ　Ｌ。

ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＬＫＥＲＧＬＣ。

ＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ。

ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＱＧＧ　Ｉ　Ｃ。

ＡＱＮＲＲＧＬＤＷＬＹ　Ｉ　ＲＬＧＦＱＳｌＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱ。

ＬＲＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬＡＱＭＧＲＩ　Ｓ。

ＬＤＮＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＳＲＩ　Ｓ。

ＬＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬＡＱＭＲＲＩ　５１ＬＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬＧＱＭＧＲＩ　Ｓ。

ＬＮＮＲＲＴＬＭＬＭＡＱＭＲＲＩ　Ｓ。

ＰＶＮＰＲ５ＬＥＫＬＥ、Ｉ　ＩＰＡＳＱ、　おＪ：びＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＫ　Ｉ　Ｓ。

から成るアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸配列の範囲内に包含されるアミノ酸配列から選択され、前記ペプチドは担体分子に接合されている、免疫抑制化合物を提供する。

本発明は、なおさらに、約４０より少ないアミノ酸残基を有するペプチドからなり、前記アミノ酸残基は少なくとも５つのアミノ酸残基のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列はアミノ酸配列ＱＲＥＫＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＧまたはアミノ酸配列ＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬの範囲内に含まれるアミノ酸配列から選択される、免疫抑制ペプチドを提供する。なお他の免疫抑制ペプチドが提供され、このペプチドは、アミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣを有するペプチドの抗原決定基に対して相同性の抗原決定基からなる。この出願の範囲内において、抗原決定基は、抗原決定基の各々が同一の抗体に結合する場合、他の抗原決定基に対して相同性である。

さらになお、本発明は、少なくとも５つのアミノ酸残基の第１アミノ酸配列、前記第１アミノ酸配列はアミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱの範囲内に含まれるアミノ酸配列から選択される、および少なくとも５つのアミノ酸残基の少なくとも１つの他のアミノ酸配列、前記能のアミノ酸配列は、ＬＱＮＲＲＧＬＤＩ　ＬＦＬＱＥＧＧＬＣ。

ＡＡＬＫＥＥＣＣＦＬＫＥＥＣ。

ＱＥＧＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣ。

ＫＳＬＴＳＬＳＥＶＶＬＱＮＲＲＧ。

ＬＱＡＲＩ　ＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬ。

ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ５ＧＫＬ　Ｉ　Ｃ。

ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＬＫＥＲＧＬＣ。

ＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ。

ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＱＧＧＩＣ。

ＡＱＮＲＲＧＬＤＷＬＹＩ　ＲＬＧＦＱＳ。

ＬＲＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬＡＱＭＧＲＩ　Ｓ。

ＬＤＮＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＳＲＩ　Ｓ。

ＬＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬＡＱＭＲＲＩ　Ｓ。

ＬＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬＧＱＭＧＲＩ　Ｓ。

ＬＮＮＲＲＴＬＭＬＭＡＱＭＲＲＩ　５１ＰＶＮＰＲ５ＬＥＫＬＥ　Ｉ　Ｉ　ＰＡＳＱ。

ＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＫ　Ｉ　Ｓ。

ＱＲＥＫＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧ、およびＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ。

から成るアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸配列の範囲内に包含されるアミノ酸配列から選択される、免疫抑制化合物を提供する。

本発明によって提供されるペプチドは、環状であることができ、あるいはポリマーまたはシマーの反復単位からなることができる。

本発明の１つの寅施態様において、アミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱ内に包含されるアミノ酸配列のアミン末端は、ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣ。

ＡＡＬＫＥＥＣＣＦＬＫＥＥＣ。

ＱＥＧＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣ。

ＫＳＬＴＳＬＳＥＶＶＬＱＮＲＲＧ。

ＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬ。

ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ。

ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＬＫＥＲＧＬＣ。

ＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ。

ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＱＧＧＩＣ。

ＡＱＮＲＲＧＬＤＷＬＹＩＲＬＧＦＱＳ。

ＬＲＮＲＲＡＬＩ　ＬＬＡＱＭＧＲＩ　Ｓ。

ＬＤＮＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＳＲＩＳ。

ＬＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬＡＱＭＲＲＩ　Ｓ。

ＬＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬＧＱＭＧＲＩ　Ｓ。

ＬＮＮＲＲＴＬＭＬＭＡＱＭＲＲＩ　Ｓ。

ＰＶＮＰＲ５ＬＥＫＬＥ　Ｉ　Ｉ　ＰＡＳＱ。

ＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＫ　Ｉ　Ｓ。

ＱＲＥＫＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧ、およびＱＬＴＶＷＧ　Ｉ　ＫＱＬＱＡＲＩ　Ｌ。

から成るアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸配列の範囲内に包含されるアミノ酸配列のカルボキシ末端に結合している。

本発明の他の寅施態様において、アミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱ内に包含されるアミノ酸配列のカルボキシ末端は、ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣ。

ＡＡＬＫＥＥＣＣＦＬＫＥＥＣ。

ＱＥＧＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣ。

ＫＳＬＴＳＬＳＥＶＶＬＱＮＲＲＧ。

ＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬ。

ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ。

ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＬＫＥＲＧＬＣ。

ＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ。

ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＱＧＧＩＣ。

ＡＱＮＲＲＧＬＤＷＬＹＩＲＬＧＦＱＳ。

ＬＲＮＲＲＡＬＩＬＬＡＱＭＧＲＩＳ。

Ｌ、ＤＮＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＳＲＩＳ。

ＬＧＮＲＲＡＬＩＬＬＡＱＭＲＲＩＳ。

ＬＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬＧＱＭＧＲＩ　Ｓ。

ＬＮＮＲＲＴＬＭＬＭＡＱＭＲＲＩ　Ｓ。

ＰＶＮＰＲ５ＬＥＫＬＥ　Ｉ　Ｉ　ＰＡＳＱ。

ＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＫ　Ｉ　Ｓ。

ＱＲＥＫＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧ、　およびＱＬＴＶＷＧ　Ｉ　ＫＱＬＱＡＲＩ　Ｌ。

から成るアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸配列の範囲内に包含されるアミノ酸配列のアミノ末端に結合している。

本発明のなお他の寅施態様において、アミノ酸配列ＡＫＬＲ−ＥＲＬＫＱＲＱＱ内に包含されるアミノ酸配列のカルボキシ末端およびアミノ末端の各々は、ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣ。

ＡＡＬＫＥＥＣＣＦＬＫＥＥＣ。

ＱＥＧＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣ。

ＫＳＬＴＳＬＳＥＶＶＬＱＮＲＲＧ。

ＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬ。

ＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ。

ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＬＫＥＲＧＬＣ。

ＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬＣ。

ＬＱＮＲＲＧＬＤＬＬＴＡＥＱＧＧＩＣｌＡＱＮＲＲＧＬＤＷＬＹＩＲＬＧＦＱＳ。

ＬＲＮＲＲＡＬＩＬＬＡＱＭＧＲＩ　Ｓ。

ＬＤＮＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＳＲＩＳ。

ＬＧＮＲＲＡＬＩＬＬＡＱＭＲＲＩＳ。

ＬＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬＧＱＭＧＲＩ　Ｓ。

ＬＮＮＲＲＴＬＭＬＭＡＱＭＲＲＩ　Ｓ。

ＰＶＮＰＲ３ＬＥＫＬＥ　Ｉ　Ｉ　ＰＡＳＱ。

ＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＫ　Ｉ　Ｓ。

ＱＲＥＫＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧ、　お！ＵＱＬＴＶＷＧ　Ｉ　ＫＱＬＱＡＲＩ　Ｌ。

から成るアミノ酸配列の群から選択されたアミノ酸配列の範囲内に包含されるアミノ酸配列に結合している。

アミノ酸配列の範囲内に包含されるアミノ酸配列のカルボキシ末端に結合したアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＡＫＬＩ’１ＥＲＬＫＱＲＱＱ内に包含されるアミノ酸配列に結合したアミノ酸配列と同一であるか、あるいは異なることができる０本発明の好ましい実施態様において、免疫抑制ペプチドはＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣからなる９本発明の他の好ましい実施態様において、免疫抑制ペプチドはＡＫＬＲＥＬＫＱＲＱＱＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣからなる。

本発明は、また、アミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣを有するアミノ酸配列に対して発生した抗体がそれに対する親和性を有する、抗原決定基からなるＶ４製されたポリペプチドを提供する。ここで、前記ポリペプチドは吐乳動物の癌細胞中で発現される。この出願内で、抗原決定基に対する親和性を有する抗体は、抗原決定基に結合できる抗体を意味する０本発明の１つの実施態様において、Ｍ！！！されたポリペプチドは約１１０，０００ダルトンの見掛けの分子量を有する０本発明の他の実施態様において、精製されたポリペプチドは約３５．０００ダルトンの見掛は分子量を有する。

また、ここに提供される精製されたポリペプチドの各々をエンコード（ｅ　ｎ　ｃ　ｏ　ｄ　ｅ）する精製された核酸配列が提供される。このような核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列を包含し１本発明の精製されたポリペプチドを発現できる発現ベクターを調製するために有用である。さらに、精製されたポリペプチドの各々に対して親和性を有する抗体が提供される０本発明の１つの実施態様において、抗体はポリクローナル抗体である０本発明の他の実施態様において、抗体は七ツクローナル抗体である。

さらになお１本発明は、本発明の精製されたポリペプチドに対して親和性を有する精製された蛋白質を提供する。この精製された蛋白質は。

造血性細胞の表面上に存在する。

本発明の抗体および製薬学的に許容されうる担体からなる治療用組成物が、また、提供される。この治療用組成物は、被検者に有効免疫抑制ブロッキング量の治療用組成物を投与することによって、被検者を免疫学的にあるいは造血的に抑制された被検者を処理する方法において有用なお他の治療用組成物は、本発明によって提供される。この治療用組成物は１本発明の精製されたポリペプチド、または少なくとも５つのアミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチド、前記アミノ酸配列は前記精製されたポリペプチド内に含まれる、および製薬学的に許容されうる担体からなる。この治療用組成物は、被検者に有効免疫抑制量の治療用組成物を投与することによって、被検者の免疫系を抑制する方法において有用である。

なおさらに、免疫抑制ペプチド結合活性を有する本発明の精製された蛋白質の一部、および製薬学的に許容されうる担体からなる治療用組成物が提供される。この治療用組成物は、被検者に有効免疫抑制ブロッキング量の治療用組成物を投与することによって、免疫学的にあるいは造血的に抑制された被検者を処理する方法において有用である。

試料、例えば、全血試料または骨髄試料中の癌細胞を検出する方法が提供され、この方法は、アミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣを有するペプチドに対してレイズされた抗体に結合する抗原決定基を有するポリペプチドを発現する細胞を試料から検出することからなり、前記ポリペプチドは哺乳動物の癌細胞中で発現される。

さらに、被検者における癌を診断する方法が提供され、この方法は、被検者から採取した体液試料中において、アミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣを有するペプチド、あるいは前記抗原決定基を含む前記ポリペプチドの一部、に対してレイズされた抗体に結合する抗原決定基を有するポリペプチドを検出することからなり、前記ポリペプチドは哺乳動物の癌細胞中において発現される。

なおさらに、本発明の免疫抑制ペプチドおよび製薬学的に許容されうる担体からなるワクチンが提供される。このワクチンは、被検者に有効免疫化量のワクチンを投与することによって、被検者をレトロウィルスの感染に対して免疫化するために有用である。

なおさらに他のワクチンが提供され、このワクチンは本発明の免疫抑制化合物および製薬学的に許容されうる担体からなる。このワクチンは、被検者に有効免疫化量のワクチンを投与することによって、被検者をレトロウィルス感染に対して免疫化するために有用である。

本発明は、さらに、本発明の免疫抑制ペプチドおよび製薬学的に許容されうる担体からなる治療用組成物を提供する。この治療用組成物は。

被検者に有効免疫抑制量の治療用組成物を投与することによって、被検者の免疫系を抑制するために有用である。

最後に１本発明の免疫抑制化合物および製薬学的に許容されうる担体からなる治療用組成物を提供する。この治療用組成物は、被検者に有効免疫抑制量の治療用組成物を投与することによって、被検者の免疫系を抑制するために有用である。

出願人は、合成的に生成されかつキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にグルタルアルデヒドで架橋したＩＳＰが、生体外でミドケン刺ｍＴ細胞を抑制するが、ＫＬＨ単独は免疫抑制活性を示さないことを示した。アンチオロ（ＣｉａｎｃｉｏＪｏ）が報告したペプチドを使用するときのように、ＩＳＰは担体分子に接合しないとき、免疫抑制的ではなかった。

グルタルアルデヒドでＫＬＨに架橋した合成ＩＳＰを、また、フロインドアジュバントを使用して配合し、そして標準の免疫化技術を使用してウサギポリクローナル抗血清を発生させた。この抗血清は固定化抗体としてＩＳＰおよびペルオキシダーゼＩａ：ａ好ウサギ抗体を使用する。標準ＥＬＡＳＡイムノアッセイにおいてＩＳＰを特異的に認識することが観察された。

予期せざることには、また、抗血清は標準ウェスタンプロットによって分析して、ＦＬＶ　Ｒ１５ＥおよびＦＬＶ感染細胞からのその前駆体ポリ蛋白質（ｇＰｒ８５ｅｎｖ）と強く反応することが観察された。これは驚くべきことであった。

なぜなら、ペプチドに対する抗体は自然蛋白質をしばしば認識しながいか、あるいは認識する場合、それらは弱く認識するだけであったからである。ペプチド親和精製されたした抗体を使用する免疫細胞化学的分析は、ＦＬＹ感染細胞中の抗原についての抗体の特異的を確証した。なぜなら、溶液中でＩＳＰと一緒に抗体をインキュベーションすると、ｐ１５Ｅ関連蛋白質との抗体の反応性をブロッキングすることがわかったからである。

ＩＳＰに対するペプチド親和精製されたウサギ抗体を使用して、ウェスタンプＣＦ＋、ト分析によって、レトロウィルスによって明瞭にあるいは外因的に感染されない、いくつかのヒト白血病細胞系の細胞リゼイトから誘導した蛋白質抗体をスクリーニングした。この研究にに５６２．ＥＭ２．ＣＥＭおよびＲａｊｉヒト白血病細胞を含めた。驚くべきことには、抗体は、また、これらの細胞の各々において、約３５，０００ダルトンの見掛は分子量を有する蛋白質または蛋白質類と反応しかつ特異的にそれらを同定した。この蛋白質をｐ３５と表示する。正常ヒト抹消血液の白血球および正常線維芽細胞は、この蛋白質または蛋白質類を含有せず、こうして抗ペプチド抗体のための結合部位を提供しなかった。

こうして、本発明のＩＳＰに対する抗体は、ヒト白血病細胞中のＰ１５Ｅ関連蛋白質を検出するために、およびＰ１５Ｅ用蛋白質がその中で発現される１種々の自然に発生するヒト癌を診断するために有用である。さらに、レトロウィルスで感染した細胞は、また、Ｐ１５Ｅ関連蛋白質１例えば、ＦＬＹ感染細胞を発現するので、ＩＳＰまたは関連する配列に対する抗体は、このようなウィルスを含有する組織また１士対液中のウィルスの抗原を検出するために、およびレトロウィルス誘導病気、例えば、Ｈｘｖａ導ＡＩＤＳ、ＦＬＹ誘導Ａ：ｉ白ｊｆｌ病、ＢＬＶ：ｆｉ−１１ウシ白血病、および内因性レトロウィルス配列によって誘導されたまだ未知の他の病気を診断するために有用である。

レトロウィルスのｐ１５ＥおよびＩＳＰに対する抗血清と反応するＰ３５蛋白質の間のの抗原の相同性に基づいて、ｐ３５は、ｐ１５Ｅに似て、免疫抑制蛋白質または関連する蛋白質類の組であると出願人は主張する。免疫抑制およびｐ３５の間のリンク（ｌｉｎｋ）は、に５６２と表示するヒト腫瘍細胞系についての研究から推定することができる。に５６２細胞は赤自白血球プラストクライシス（ｂｌａｓｔ　ｃｒｉｓｉＳ）における慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）から誘導された。確立された細胞系は、ｂａｒ−ａｂｌと呼ぶ癌遺伝子の発現によって特性づけられる。この遺伝子の発現は、フィラデルフィア（Ｐｈｉ　１ａｄｅｌｐｈｉａ）染色体と呼ばれる迷走染色体の形成を生ずる。患者における染色体間の遺伝子情報の交換の結果である。この変更された染色体の形成は。

いわゆるｂｃｒ配列およびａｂｌ配列から構成されたハイブリッド遺伝子の発現を生ずる。この遺伝子の発現は、ａｂｌ遺伝子が既知の癌遺伝子であるので、慢性の骨髄性白血病を生ずると考えられる。

ｂｃｒおよびａｂｌ蛋白質に向けられた抗Ｉｋ１清が、Ｂｌ］発され、そしてｂｃｒ−ａｂｌハイブリッド遺伝子産生物（Ｐ　２　ｔ　ｏ　ｂ　Ｃｒ−＆ｂ　１またはＰ２１０と呼ぶ）をこれらのに５６２細胞中において同定するために使用された［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１５：５５０．１９８５］、Ｐ２１０は、その抗体の複合体（免疫複合体）中にある間、自動リン酸化に対するその能力によって検出できる。ある種の薬物、例えば、フォルパル１２−イリスチー）１３アセテ−）　（ＰＭＡ）およびメゼレインでに６２０細胞を処理すると、Ｐ２１０の細胞内発現が劇的に減少されるように、活性化された癌遺伝子Ｐ２１０の発現の変化が誘発される。これらの因子による処理は、また、に５６２細胞の分化および形質転換された表現型の損失を起こす。

前述のように、に５６２は、本発明の抗ＩＳＰ抗体で検出することによって示されるように、ｐ３５を含有する。ヒト細胞系の１つである。

Ｐ２１０の水産生物へのその作用に加えて、ＰＭＡによるに５６２細胞の処理は、また、ｐ３５のレベルの劇的な減少を起こす、こうして、ｐ３５の発現はＣＭＬ癌遺伝子Ｐ２１０の発現と直接相関関係づけられる。前述のように、に５６２細胞およびヒト白血病患者から誘導された他の確立された細胞系は、前置細胞の生体外増殖を阻害する［オロフソン（０１ｏ　ｆ　ｓ　ｓ　ｏ　ｎ）およびオルソン（０１５ｓｏｎ）、Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ＲＥｓ　６５：４３７．１９８０；および８：３８７．１９８４；ステイベルグ（Ｓｔｅｉｂｅｒｇ）ら、Ｂｌｏｏｄ　６５：１００．１９８５］および抹消リンパ球のミトゲン誘導分化を阻害する［チアオ（Ｃｈｉａｏ）ら、ＰＮＡＳ　８３：３４２３，１９８６］いくつかの因子を分泌することが知られている。また、これらの抑制内子の発現は、に６２０において、ヘミンで分化を誘発すると減少することが示された。これらの結果が示すように、Ｐ３５はに５６２細胞によって分泌されると従来記載された抑制因子であり、そしてＰ３５はに５６２細胞の病気の状態において含まれる。ｐ３５の発現およびＰ２１０の酵素活性の直接の相関関係は、また、ＣＭＬ　ＥＭ２細胞において観察された［Ｗ、クレトザー（Ｋ　ｌ　ｏ　ｅ　ｔ　ｚ　ｅ　ｒ）　、未公表の結果］、この細胞系において１両者Ｐ２１０およびｐ３５のレベルはＰＭＡで処理すると増大し、そして細胞はそれらの形質転換した表現型を解放しない、ＥＭ２細胞を骨髄性プラストフライシスにおける患者から誘導する。

これらの発見は異なる細胞系統のＣＭＬ細胞はＰＭＡに対して異なるように応答することを示唆するが、結果は、また、癌遺伝子の発現およびｐ３５発現の間の相関関係を確証する。

ｐ３５水生成物と活性化癌遺伝子の発現との間の相関関係に基づいて、Ｐ３５は新しい治療剤またはワクチンの開発のためのターゲットを表わす、ｐ３５に対する抗体またはｐ１５ＥまたはＰ３５配列から訝導される免疫抑制ペプチドに対する抗体は、それゆえ、ヒト腫瘍およびレトロウィルス誘導病気におけるこれらのｐ１５Ｅ関連蛋白質の抑制作用をブロッキングするとき、有用である。あるいは１合成ペプチド類似体は抑制的蛋白質の抑制作用をプロ７キングするであろう、このような類似体は免疫抑制ペプチドの受容体について競争し、これによって免疫抑制蛋白質の結合をブロッキングするが、それら自体免疫抑制に対する事象の順序を開始することができないので、生物学的に不活性である。

レトロウィルス誘導病気の予防のためのワクチンとして、免疫抑制ｐ１５Ｅ関連ペプチドの価値を例示するために、出願人はグルタルアルデヒドでＫＬＨに接合し、そしてフロインドアジュバントで配合した。ＩＳｒで４匹のネコを免疫化した。４匹のネコのうち３匹は、ＦＬＹとの対抗のときウィルス血症から保護されたが、８匹の対照のうち６匹はウィルス血症となった。これらの結果が示すように、ＩＳＰはＦＬＹウィルス血症の予防において有効なワクチンとして有用である。

出願人は、さらに、生体外でＴ細胞のミトゲン誘導分化を抑制できる。３つのペプチドをＨＩＶ配列から誘導した。アミノ酸配列ＱＲＥＫＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＧをもつ１つのペプチド（ＳＵＰ２と表示する）は、ＨＩＶ主要エンベロープ糖蛋白質ｇＰ１２０および膜内外糖蛋白質ｇｐ４１　（アミノ酸５１４−５３１）の接合部にまたがる。このペプチドはＩＳＰとのわずかの程度の相同性を示す、アミノ酸配列ＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬを有する他の免疫抑制ペプチド（ＳＵＰｌと表示する）を、ＨＩＶのｇｐ４１領域（アミノ酸５８３−５９９）から誘導し、そしてこれはＩＳＰに対する有意の相同性をもたなかった。

５ＵＰＩおよび５ＵＰ２の両者は、Ｋｌ、Ｈに接合すると、ミトゲン刺激に応答してＴ細胞の分化を抑制する。しかしながら、予期せざることには、５ＵＰ２は、また、接合しないで、免疫抑制性である。

他の免疫抑制ペプチド（３４，１と表示し、そしてアミノ酸配列ＡＹＥＲＹＬＫＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣ５ＧＫＬＩＣを有する）を、ｇｐ４１から誘導し、そしてこれはＩＳＰまたは５ＵＰ２と相同性をもたないが。

５ＵＰ１配列と重複する。３４．１は、また、ＫＬＨに接合したとき。

あるいは接合しないで使用するとき、生体外で免疫抑制であることが示された。

出願人は、これらのペプチドはＨＩＢの感染を防止するための治療用免疫抑制剤およびワクチンとして有用であることを主張する。これらのＨＩＶ免疫抑制ペプチドに対する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル抗体）は、また、ＡＩＤＳにおける診断および治療の可能性を有することが期待される。

本発明のペプチド、ポリペプチド、蛋白質、化合物および方法を、以下の実験および実施例を参照することによって、いっそうよく理解されるてらおう、これらの実験および実施例は１例示を目的とし、そして、請求の範囲によって規定される本発明の範囲をいかなる方法においても限定しないと解釈すべきである。

第１組五東胎実施例１−ペプチド−キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＨＬ）接合体の調製ペプチドを慣用の固相法によって合成し、そして次の方法でＫＬＨに架橋（接合）した、ペプチド（水中５ｍｇ／ｍｌ）およびＫＬＨ（水中５　ｍ　ｇ　／　ｍ　１　）を−緒に混合した。グルグルアルデヒドをこの混合物に０．０４％（ｖ／ｖ）の最終濃度で添加した。この反応混合物を室温で３０分間攪拌し１次いでリン酸塩緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に対して４℃において１夜透析した。

実施例２−抗体の発生および精製ニューシーラント自ウサギに、０．５０ｍ１のＰＢＳおよび０．０５ｍ１の完全フロインドアジュバント中の２００ｐｇの接合体を注射した。不完全フロインドアジュバント中の２００．ｇｔＲ合体／ＰＢＳの２回のブースター注射を４週の間隔で投与した。毎週、ｎｎ清の試料をＥＬＩＳＡによる固定化した合成ペプチドに対する抗体の力価について監視した０次いで１合成ペプチドを認識することがわかった血清抗体試料を、下の実施例３の方法に従って、免疫プロット分析により完全抗原の認識について試験した。この試験において、ＦＬＹ感染細胞（細胞系ＦＬ７４）の抽出物をＳＤＳスラブゲルの電気泳動によって分割し、そして電気泳動的にニトロセルロース膜に移した。３％のゼラチンを含有するトリスＩＩＩ！＃１化溶液でブロッキングした後、膜を垂直方向に同一のストリップにスライスした。これらの分割した細胞蛋白質のストリップを。

１％のゼラチンを含有するトリス緩衝化塩類溶液中に希釈したＰ１５Ｅ合成ペプチドに対する抗血清およびペルオキシダーゼ標識ウサギＩｇでプロービングした。抗体反応性の最後の可視化は、４−クロロ−１−ナフトールの酵素基質溶液中でストリップをインキュベーションすることによって実施した。ウィルスのｐ１５Ｅを強く認識する血清試料のすべてをプールし、そしてペプチドに対してＥＬＩＳＡによりおよび完全（ｐ１５Ｅ）抗体に対して免疫プロット研究によって力価決定した。免疫プロット研究のすべてにおいて、非特異的抗体の着色は特異的抗体の検出から、結合しないペプチドでブロッキングした抗血清で同一プロットをプロービングすることによって、容易に区別された。

ペプチドのブロッキング実験において定められた。抗原の免疫細胞化学的検出は、抗体の親和精製を獲得した。ウサギ抗ペプチド抗体は、ＣＭ−７７４ゲル・ブルー（Ａｆｆｉｇｅｌ−Ｂｌｕｅ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムに抗血清を通過させることによって精製して、濃縮されたＩｇ分画を得た。このＩｇ分画を、エポキシ活性化セファロース４Ｂ−？調製したペプチド親和カラムに適用した。このカラムをリン酸塩ｌｓ衝液１０．５モルのＫＣＩで洗浄し、そして抗体を３モルのリン酸塩緩衝液。

ｐＨ８を含有する管中に１モルの酢酸入れることによって溶離した。活性分画をプールし、透析し、そして限外濾過によって濃縮した。抗体の濃縮のすべての工程は、ペプチドＥＬＩＳＡによって監視した。免疫細胞化学の手順は、欧州特許出願公告１５８，７４６号に記載されるように、全標識第２抗体および銀の増強を使用した。

実施例３−免疫プロット分析のための試料のｇｌ！！！脂肪族は、免疫プロット分析により、まずＰＢＳ中ですすぎ、次いで凍結乾燥することによってｒＡ製した。得られる細胞粉末（６−Ｏｍｇ／ｍ　１　）をＳＤＳ試料緩衝液中に懸濁し、そしてさらに急速に沸騰する水中で変性した。細胞リゼイトを室温で清浄にした（３Ｑ、ＱＯＯｒｐｍ：べ７クマン５０　Ｔ　ｉローター）、２００．ｇからの抽出物を、ドデシル硫酸ナトリウムのポリアクリルゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、３％の積重ね７１２％の分割ゲルを使用して分離した。蛋白質は、電気泳動的に、１９２ミリモルのグリシン／２０％のメタノール／１０モリモルのトリス、ＰＨ８，３中で１００ボルドで３時間および４０ポルトで１夜ニトロセルロース膜に移した。

実施例４−ウィルスＩｌ！瘍細胞系の抽出物中のウェスタンプロット分析による抗体の抗血清検出の比較非抑制ネコｐ１５ＥペプチドおよびＩＳＰに対するウサギ抗血清を。

ウィルス感染細胞抽出物中の抗体の検出について免疫プロット試験した。無傷のネズミｐ３０ｇａｇおよびｇｐ７０ｅｎｖに対するヤギポリクローナル抗血清を、ＦＬ７４　（ＦＬＹ感染リンすＩＩ！誘導細胞系）およびＮＲＫ２０６−２／ＩＣ（ネズミ白血病／黒腫ウィルス［ＭＬｖ／ＳＶ］感染した）細胞におけるウィルス蛋白質の存在を確証した。ｐ１５Ｅ合成ペプチドに対する両者の抗血清は、ＦＬ７４細胞中のＰｒ８５ｅｌｖ、ｐ１５ＥおよびＰ１２Ｅ（蛋白質分解処理したｐ１５Ｅ）を検出したが、ＭＬＶ／ＳＶまたはアダルト（ａｄｕ　ｌ　ｔ）Ｔ細胞白血病ウィルス（）ＩＴＬＶ　Ｉ）相同体を検出しなかった。抗ＩＳＰ血清は、ＨＴの蛋白質（ｐ３５）を検出したが、他の２つの細胞系を検出しなかった。

抗ＩＳＰを使用して、清浄ＰＢＬ類およびヒト急性白血病から主に誘導された種々の細胞系の抽出物を免疫プロットした（表１）、検査したすべての白血病細胞系は、正常ＰＢＬ類を除外して、Ｐ３５蛋白質を発現した。抗原との抗血清の反応性は、可溶性の接合しないペプチドによって、すべての細胞系においてブロッキングされた。３５にの蛋白質の発現の最高レベルは、Ｒａｊｉ細胞系において検出された。

表１細胞の抗原の抗ＩＳＰ血清の検出本免疫プロット分析細胞　ｐ３５　免疫細胞化学ＦＬ７４　Ｐｒ８５ｅｎｖ、ｐ１５Ｅ　＋＋＋Ｒａｊｉ　＋　＋＋＋＋ＥＭ　十　＋＋＋ＨＵＴ１０２　＋　＋＋＋ＨＬ６０　＋　＋＋＋に５６２　＋　＋＋＋ＥＭ２　＋　＋＋＋ヒトＰＢＬ類　十Ａ４３１８　＋　＋＋木錯結合ないペプチドでブロッキングされた抗原の抗血清検出；こうして、（− ）は抗原が検出されないことを示す：　（＋）　＝弱い；　（＋＋）＝中程度；および（＋＋＋）　＝強い。

Ｃキナーゼ活性化因子に暴露すると、活性された癌蛋白質Ｐ２１０ｂｅｒ−ａｂｌの発現の変化が誘発される［クレンザ−（Ｋ　１　ｏ　ｅ　ｔ　ｚ　ｅｒ）ら、未公表の結果］、訝導された細胞対誘導されない細胞の免疫細胞化学的比較は、Ｐ２１０ｂｃｒ−ａｂｌおよびＰ３５の発現の間の直接の相関関係を確立した（表２）、この理由で、出願人は、ｐ１５Ｅ関連蛋白質の発現は分化を調節する事象でることを主張する。Ｐ３５検出の量の変動が合成の速度の変更の結果であるか、あるいｔ’ｈ検出された前駆体蛋白質の変更した処理の結果であるかどうかは、まだ決定されてきていない。

表５ＰＭＡ暴露は３５にの蛋白質の発現を変更した細胞　１０ｎＭのＰＭＡ　Ｐ２１０ｂｃｒ−ａｂｌ　ｐ３５に５６２　なし　＋＋＋＋に５６２　５日　−− ＥＭ２　なし　＋　＋ＥＭ２　５日　十＋＋＋＋Ｐ２１０ｂｃｒ−ａｂｌのレベルは生体外キナーゼアッセイによって決定した。

Ｐ２１０ｂｃｒ−ａｂｌおよび３５に蛋白質の検出は、なしく−）、弱い（＋）、中程度（＋＋）または強い（十＋　＋）として検査した。

実施例５−抗ＩＳＰ血清により認識された腫瘍エピトープの定義抗ＩＳＰ血清は、ＦＬＹ感染細胞中のＰｒ８５ｅｅｎｖ、ｐ１５ＥおよびＰ１２Ｅ、および検査したすべてのヒト白血病細胞系中の３５，０００ダルトンの細胞抗原を特異的に認識した。Ｉ＃、傷蛋白質についての抗ＩＳＰ血清の特異性は、相同性をもつ、すなわち、ネズミ、ヒトおよびウシ山崩病ウィルスｅｎｖ配列から合成されたペプチドに類似するが、同一でない、抗血清をブロッキングすることによって試験した０重複すれもの能力について試験した。これの試験の結果は、ＳＤＳ変性蛋白質に結合した抗体が主としてネコＩＳＰの可変部分に対して向けられていることを示す。

表３ウィルスの杭１（ＦＬ７４）および細胞の抗原木の抗ＩＳＰ血清認識のペプチドのブロッキングブロッキング配列　Ｐｒ８５ｅｎｖ／ｐ１５Ｅ’　ｐ３５本ＱＥＧＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣ÷　÷ ＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣＡＡＬＫ（ＩＳＰ）　ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣＥＶＶＬＯＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬ　＋　＋ＫＳＬＴＳＬＳＥＶＶＬＱＮＲＲＣ＋　＋（ＭＬＶ）　ＬＱＩＪＲＲＧＬＤＬＬＦＫＥＧＧＬＣ（ＨＴＬＶＩ／２）　ＡＱＮＲＲＧＬＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬｃ　＋　＋（ＢＬＶ）　ＡＱＮＲＲＧＬＤＷＬＹＩＲＩＧＦＱＳ　＋　＋ＹＯＮＲＬＡＬＤＹＬＬＡＡＥ（、ＧＶＣ（内因性ヒトウィルス）＊抗原の検出は陽性（＋）まｔ；は陰性（−）として評価した：内因性ヒトウィルス配列は試験しなかった。

ウィルスのｐ１５ＨのＩＳＰドメインは、ＲＮＡ腫瘍ウィルスのうちで最も高度に保存され！：ペプチドドメインである。この保存は、下（表４）に、ＦＬＶおよびＨＴＬＶ１エンベロープのドメインについて予測したアミノ酸配列（配列決定したヌクレオチドから）のコンビ二一夕で発生したアラインメント（ａ　Ｉ　ｉ　ｇｎｎｏｅ　ｎ　ｔ）である（ニー同一の合致）。

表４ＦＲＱＬＱｉｌＡＩＩＨＴＤＩＱへＬＥＥＳＩＳＡＬＥＫＳＬ丁５ＬＳＥ％°％ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣＣＦP＾ＤＨＴＧＧＫＳＬＬ）ＩＥｔ’ＤＫ　ＤＩＳＱＬＴＯ，へＩ％’　ＫＮＨいＬＬＫＩＡ　ＱＹＡＡＱＮＲＲＧＬ　ＤＬＬＦＩＥＱにＧＬ　ＣＫＡＬＱd区ＲＦ　ＰＮＩＴＮＳＨＴＬＩ°１３５２　３６２　３７２　３ｇ２　３９２　４０２有意の相同性の唯一の領域は、Ｃｌ８Ｂと呼ぶジョン・エルグ−（Ｊｏｈｎ　Ｅｌｄｅｒ）博± ［スクリップス研究所（Ｓｃｒｉｐｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ３個人的コミュニケーション）が同定したペプチドを包含するＩＳＰペプチドおよび中和性抗体（例えば、生体外ウィルスの感染をブロッキングする抗体）のほぼ中央に存在する。

コンピュータのアラインメントを、同様なハイドロパシサイテイーズ（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｉｅｓ）のアミノ酸が、まｔ；、「合致（ｍａｔｃｈｅｓ）Ｊとスコアを付けることを除外して、実施する場合、次のアラインメントが達成される（表５）。

同一の合致十次の同等性：中性または弱い親水性：Ａ−Ｇ−Ｐ−３−Ｔ小さい側面の基をもつ親水性：Ｄ− Ｎ−Ｅ−Ｑ大きい側面の基をもつ親水性：　Ｒ−Ｈ−に小さい側面の基をもつ疎水性：Ｄ−Ｎ−Ｅ−Ｑ大きい側面の基をもつ疎水性：Ｒ−Ｈ−に１・・−・−− −−ＩＳＰ−−−−−−・−−−−（ＦＬＹ　ｌ　５４０　５５０１　５６０ＫＮＨＫＮＬＩＪＩＡ　ＱＹＡＡＱＮＲＲＧＬ　ＤＬＬＦＷＥＱＧＧＬ　ＣＫＡＬＱＥＱＣＲＦ　ＰＮＩＴＮＳＨＶＨＴＬ％’　１３７２　３８２　３９２　４０２正確な配列の相同性は夏ＳＰドメインのＣ末端の半分において保持されないが、親木性は高度に保存されることが明らかである。この理由で、出願人は、Ｃ末端部分、および多分ＦＬＹアミノ酸５６０におよぶアミノ酸配列はｐ１５Ｅ免疫抑制活性において重要な役割を演すると考える。

ＦＬＶおよびＨＴＬＶＩまたは２のエンベロープ配列の間の全体の相同性は、ＩＳＰドメインにおいて、わずかであるが、非常に明確である。

われわれは、また、ＦＬＹとヒト免疫欠損ウィルス（ＨＩ　Ｖ）エンベロープ遺伝子生成物との間の非常に明確に関連する配列の相同性を同定した（表６）。

表６＜−−−−−ノｌ５ｒ−−−−−−一ンＦＬＶ　ＰＩ５Ｅ　５６−１０３　６３　５ＬＳＥ％’Ｖ　ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥｃＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣＣｎ ’ＡＤＨＴ　１００本　錦　零韓零ネ零　零　零零　零零　本：は同一の一致を示す。

＊は同一の一致および次の同等を示す：Ａ−Ｇ＝Ｐ−５＝ＴＦ＝Ｗ＝Ｙ１−Ｌ−Ｍ−ＶＱ−Ｄ−Ｅ＝ＮＫ＝）ｌ＝Ｒ実施例６−ウィルスのｐ１５Ｅおよびｐ１５Ｅ様タンパク質に起因する免疫抑制の抗体ブロッキングネコ白血病ウィルスによる持続的感染は、抑制された細胞仲介免疫性から生ずる、非再生無形成貧血および機会的な感染に、しばしば関連付けられる。これらの臨床的特徴は、ウィルスのｐ１５Ｅの直接の作用に帰属される。ネズミｐ　１５Ｅアミノ酸配列から選択された生物学的に活性な合成ペプチドは、他の研究者らにより、生体外で無傷のウィルスタンパク質に類似する作用を示すことが証明されＩ；。出願人は、ネコウィルスｐ１５Ｅの相同領域からの合成ペプチドが同様な作用を有することを確証した。出願人は、また、ＩＳＰ：ＫＬＨ接合体が、抗体のペプチドブロッキングによって決定して、ネコウィルスｐ１５Ｅおよび多くのヒト白血病細胞における交差反応性抗原を特異的に認識することを発見した。

重複する配列を使用するペプチドのブロッキングの実験は、抗体が向けられｔ；主要なニピトープがＩＳＰ配列のカルボキシ末端の半分内に存在することを示しｔ；。コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびマイルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（Ｎａｔｕｒｅ　２２５．１９７５）の基本的方法を使用して発生させたＩＳＰに対するモノクローナル抗体を、有効な相同性重複ペプチドの認識についてスクリーニングした（表３）。

別のアプローチは、精製したネコ１５に対するモノクローナル抗体を発生させ、そしてハイブリドーマのクローンを！ｓＰのＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ認１１１：ついてスクリーニングすることである。このアプローチの独特の利点は、自然タンパク質上の生物学的に活性な部位に対するモノクローナル抗体の発生である。抗原の認識についてクローンを予備的に選択したのち、すべての抗体をミトゲン処理した牌細胞のウィルス仲介阻害をプロツキングする能力についてスクリーニングすることができる。活性部位に結合することによってウィルスのｐ１５Ｅの抑制活性をブロッキングするモノクローナル抗体を、ウィルス誘導病気の症候を軽減する能力について試験することができる０種々のヒト癌において検出されたｐｌｓＥ様タンパク質への作用の同様な試験は、また、受動免疫治療剤として、あるいは癌細胞に対して標識する他の薬物として試験することができる。

実施例７−免疫抑制治療剤としての合成ペプチドウィルスｐ１５Ｅの保存されたドメイン（表５に示す全ＦＬＹドメイン）またはｐｌｓＥ様タンパク質から誘導されるアミノ酸配列をもつ合成または組み換え（ＤＮＡ）誘導ペプチドは、免疫抑制剤として作用することができる。こようなペプチドは、組織または器官の移植後の免疫系を抑制するために有用である。さらに、生物学的に活性なペプチドは、自己免疫病をもつ患者に治療的利益を提供できる。

実施例８−レトロウィルスのワクチンとしての合成ペプチドネコＩｓＰ：ＫＬＨ接合体を使用して４匹のネコを免疫化した。０゜５ｍｌのＤＰＧＳ中の２００μ ｇの接合体＋０．５ｍｌのメチオニド／ドレコール（Ｄｒａｅｋｏｌ）中の１．Ｏｍｇの７−メチル−８−オキソグアノシン（免疫刺激剤）の２回の注射を、１４週の間隔で投与しｔ；。

ＦＬＹユンベロープタンパク質のｇｐ７ｏ領域からの、中和性抗体誘導ペプチド、１８５Ｂと呼ぶ、を２匹のネコに与えた。最後の注射後２８週に、６匹のワクチン接種しｔ；ネコおよび６匹の処置しないネコを、グルココルチコイドで免疫抑制し、そしてネコ白血病ウィルスの生きているリッカード（Ｒ４ｃｋａｒｄ）菌株で対抗した。感染の徴候を、捕獲剤として主要なウィルスのコア抗原（ｐ　２７）に対するモノクローナル抗体およびペルオギシダーゼ接合免疫グロブリンＧ（ＬｅｕｋＡｓｓａｙ）”、ニュージャーシイ州、Ｐ　ｉ　ｔ　ｍａｍ＝Ｍｏ　ｏ　ｒ　ｅｓがら入手可能）を使用して、ＥＬＩＳＡによって、ウィルスの対抗の前および後に監視した。対抗後５週に、両者の１８５８：ＫＬＨで免疫化したネコをアンチゲ不ミック（ａｎｔ　ｉｇｅｎｅｍｉｃ）とした（ｐ２７は血清中で検出された）。ＩＳＰ：ＫＬＨでワクチン接種した４匹のネコのうち１匹のみは、血清中のウィルスの徴候を示した。対照群（ワクチン接種せず）における６匹のネコのうち４匹は、対抗後、アンチゲネミックとなった。こうして、出願人は、ＩＳＰ接合体を使用する免疫化がＦＬＹ感染感染対してネコを保護することを最初にした。同＠１＝、適当なウィルスル１５Ｅペプチド接合体をもつ被検者の免疫化（表３）は、引き続くウィルスの感染から被検者を保護するであろう。

表７ＣｏｎＡ誘導Ｔ誘導場細胞増殖によって測定した、ネコ白血病ウィルスＩＳＰの重複ペプチド接合体の抑制活性ペプチドの配列　抑制　ペプチド活性　のコードＫＳＬＴＳＬＳＥＶＶＬＱＮ・・・・・・・・・・・―・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・十　ｃ９３ＫＳＬＴＳＬＳＥＶＶＬＱＮＲＲＣ，・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・＋＋　ｃ９４（Ｃ）ＳＬＳＥＶＶＬＱＮＲＩ？ＧＬＤＩ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・−／＋　ｃ９５（Ｃ）ＥＶＶＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・−／＋　ｃ９６（ｃ）ｔ、ｏＮＲＲｃｔ、ｐ＋ｒ−ｐｔｏＥｃ−−−・−−−−−−−−−−−−・ −−−−−−−／＋　ｃ９７ＲＲにＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・＋　ｃ９８ＬＤＩＬＦＬＯＥＧＧＬＣＡＡＬＫ−−− −−−−−−−−−−−−−−／＋　ｃ９９ＬＦＬＱＥＧＧＬＣＡＡＬ五・・・・・・・・・・・・・・・・−ｃｌｏｏｏＥにＧＬＣＡＡＩＪＥＥＣ−−−−− ・・−−−−−−＋＋　ｃｌｏｌＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣＣＦＬＫ−骨・・・−− −−−ｃ１０２ＡＡＬＫＥＥＣＣＦＬＫＥＥＣ・・−−−−＋＋＋　ｃ１０３ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・十＋＋　（ＩＳＰ）（−）−活性なし、（−／＋）−わずかの活性、（＋）− かなりの活性、（十＋）−すぐれＩ：活性、（＋　十＋）−非常にすぐれた活性；　（Ｃ）−システィンは予測されたアミノ酸配列中に存在しないが、他の研究において交差結合のために添加した。

寅ｊｌ［ＰＩ９−免疫抑制活性をもつＨＩＶペプチドＨ＝ＩＶ配列から誘導したペプチド配列を、標準の同相技術を使用して合成し、そしてマウスＴｍ胞のミトゲン誘導増殖を抑制する能力について試験しｔ；（表８）。出願人は、抑制活性を有することが観察されたペプチドは獲得免疫欠損症候群に対して有用であると考える。

表８ＨＩＶペプチドによって仲介される免疫抑制Ｃ２３２ＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ　＋Ｃ２３３ＧｒＫＯＬＱＡＲＩＬＡＶＥＩ？Ｙ４Ｂ　ＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＳＵＰＩ　ＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＱＬＳＵＰＩ−ＫＬＨ＋＋Ｃ２３４ＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱＯＬＩＳＩ　ＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＯＱＬＬＧＩＷＧＣＳ　−Ｃ２３５ＡＶＥＲＹＬＫＤＯＱＬＬに　ＩＩＥ３４．ｌ　ＡＶＥＲＹＬＫＤＯＯＬＬＧＩＷＧＣ５ＧｉｌＣ−Ｅ３４．１−ＫＬＨ＋＋＋＋Ｅ３４．２　ＬＫＤＱＯＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣ−５ＬｌＰ２　ＱＲＥＫＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧ　−＋＋５ＬＩＰ２−Ｆ、ＬＨ＋＋＋Ｃ９２ＴＫＡＫＲＲＷＱＲＥＫＲＡＣ２２１ＡＶＥＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＦＬＹペプチド：ＩＳＰ　ＬＱＮＲＲ（、ＬＤＩＬＦＬＱＥＧ（、ＬＣＩＳＰ−ＫＬＨ＋＋＋ＫＬＨ−グルタルアルデヒドの対照零ＫＬＨ−グルタルアルデヒドを介するＫＬＨへ結合したペプチド。

（−）−存在せず：（＋）・弱い；（＋十）・中程度；（十＋十）＝強い：（÷ ＋＋り客非常に強い。

実施したアッセイの手順は、実施例１０に記載する手順を利用するネズミ（Ｃ５８Ｂ＋／６系統）牌細胞のコンカナバ誘導Ａ誘導Ｔ細胞の増殖である。

実施例１〇−免疫抑制についてのアッセイーネズミ（Ｃ５８ＢＬ／６系統）牌細胞のコンカナバリンＡ誘導Ｔ細胞の増殖ｌ、牌細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６系統マウスから無菌技術によって調製した。

２、牌細胞懸濁液を、予備洗浄しかつ予備加温した（３７℃）ナイロン−ウールカラム（約１０’細胞１０．６ｇナイロン−ウール）上に適用した。細胞を４５分間インキユベーシーンし、そして加温した培地で滴々溶離した。濃縮したＴ細胞の集団を集めた。

３、集めＩ；細胞（１０’／ウエル）を無菌の９６ウエルのマイクロタイタープレートに添加し、これらのウェルに種々の濃度のペプチド（４００−２５μｇ／ｍ＋）を前置て添加した。次いで、プレートを５％のＣｏ、３７℃で３００分間インキュページンした。

４、次いで、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）ミトゲン（１／Ｊｇ／ウェル）をプレート中のそれぞれのウェルに添加しｔ；。対照のウェルはＣ。

ｎＡを有するおよびもたない細胞を含んだ。各ウェルにおける最終の体積は２００μｌであっＩ；。次は構成した典型的なプロトコルの培養を例示する：牌細胞＝　５０．ｕｌ／ウェル（２Ｘ１０＠／ｍ＋）ペプチドの希釈：　ｌ　ＯＯｐ　１／ウエルミトゲン（ＣｏｎＡ）　５０／７１／ウェル−（４μｇ／ｍ１）５、次いで、プレートを５％のＣＯ□中で３７℃において３日間インキュベーションしＩ；。トリチウム化した（３Ｈ）チミジン（ｌマイクロキューリー／ウェル）を、収穫前１６時間にウェルの各々に添加しＩ；。

６、次いで、：ＨチミジンでパルスしたプレートをＰＨＤ細胞収穫装置で収穫した。収穫装置のフィルターディスクをここのシンチレーションバイアル中に入れ、シンチレーション流体を添加し、そしてバイアルをラジオアイソトープの存在について計数した。

７、増殖は、計数７分（ＣＰＭ）として、あるいは対照の増殖の百分率（すなわち、実験のＣＰＭ／’Ｃｏ　ｎ　Ａ対照のＣＰＭＸｌ　００）として決定した。

培地：　ＲＰＭＩ　１６４０　培地Ｌ−グルタミン（２ミリモル）ピルビン酸ナトリウム（１ミリモル）センタミシンｔＬ酸溶液（２０μｓ／ｍ＋）選択した加熱不活性化胎児子ウシ血清（５％）里ｌ艶立ス鼠ｇ二二竺工：基本的増殖アッセイは、９６ウエルのマイクロタイタープレート中で実施、そしてネズミ牌細胞（ＩＸＩＯ’細胞／ウェル）をミトゲン、例えば、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）でＴ細胞についておよびＢ細胞についてリポ多糖刺激することを含み、これはリンパ様細胞を誘導して活性化し、モして培養において増殖させる。リンパ様細胞培養物を、実験に依存して、３〜７日間インキュベージ１ンし、そして培養物最後の１２〜２４時間放射線ｍ１ｌｌたヌクレオチドｓＨ−チミジンでパルスし、後者は増殖する細胞のデオキシリポ核酸（ＤＮＡ）中に組み込まれる。個々の培養ウェルかもの細胞を、多チヤンネル細胞収穫装置でガラス繊維のディスク中に収穫し、そして個々のディスクを蛍光体含有シンチレーション流体中に入れ、そしてシンチレーション分光光度計中で放射能の存在について分析した。細胞の活性化、すなわち、増殖のレベルを、刺激しない対照培養物、すなわち、細胞単独の培養物のそれに関する、ミトゲン刺激培養物中で検出されたＤＮＡ組み込み１Ｈ−チミジンの量として測定した。データは、刺激指数（Ｓ、１．）（実験の計数７分（ＣＰＭ）／対照培養物ＣＰＭとして計算した）として、あるいは対照の増殖の百分率、すなわち、実験のＣＰＭ／陽性の対照（細胞中ミトゲン）Ｘ１００として記録した。

ペプチドの免疫抑制活性を決定するように設計しｔ；アッセイにおいて、培養物は上に記載するように調製したが、ただし、変化する濃度で、抑制ペプチドを最初の培養物中に混合した。細胞増殖の抑制は、５．１゜またはペプチドに暴露しない培養物と比較した、抑制ペプチドを含有する培養物中の対照の増殖の百分率（％）として解釈した。４０％より大きいとき、抑制は有意であると考慮した。

これらの実験はいかなる特定のマウスの系統にも制限されなかっｔ；。

８１６Ｂ：ＩＳＰ仲介抑制：Ｂａ１ｂ／ｃ牌細胞をＣｏｎＡ　（４＊ｇ／ｍ＋）でトリチウム化８１６Ｂ：ＩＳＰの存在下に刺激し、そしてＩＨ−チミジンの組み込みのレベルを第４日に決定した。８１６Ｂ＝ＩＳＰは１２．５μｇ／ｍ１の濃度でＴ細胞の有意の抑制（６０％）を誘発した（第１図）。興味あることには、ペプチドのより高い濃度、例えば、１００μｇ／ｍｌは抑制を起こさなかった。これらの結果は、追加のじっけにおいて再現性があった。これの培養物を検査すると、細胞の数および生存能力は、対照およびペプチド処理した対照のウェルの両者において匹敵するものであった。これが示すように、抑制は培養物中のペプチドの毒性の結果ではなかった。

それ以上の実験を実施して、８１６Ｂ、ＩＳＰ、およびδ１６Ｂ：ＩＳＰペプチドのＴ細胞を抑制する相対的能力を検査した。細胞をミトゲンで刺激し、そしてそれぞれのペプチドの存在下に４日間培養した。８１６Ｂ：ＩＳＰペプチドは、 δ１６Ｂ（３５％）またはｌ５Ｐ（２８％）のいずれに比較しても、有意の抑制、すなわち、７８％を誘発した（第２図）。ＩＳＰペプチドはＫＬＨに接合したときにのみ抑制を誘発し、これに対して８１６Ｂ：ＩＳＰは遊離のペプチドとして活性であった。

さらに、Ｉ　５Ｐ−ＫＬＨ接合体は、１００〜２００μｇ／ｍｌの濃度において、絶えず抑制を誘発した（データは示されていない）。

関連する研究において、自然ウィルス配列の意味においてＩＳＰの延長ならびに類似体の形態であるペプチドを合成した。これらのペプチドは、より長いペプチドが担体への接合を必要としないで抑制的であるかどうか、あるいは抑制活性が改良されるかどうかを決定するために、検査した。これらの延長ペプチド配列は、ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧ（：、ＬＣＡＡＬＫＥＣＣＦＹＡＤＨまたはＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣＡＡＬＫＥＣＣＦＬＫＥＥであった。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス牌細胞を、４日間ミトゲン（Ｃｏ　ｎ　Ａ）の存在下におよび２つの延長ペプチドの濃度を変化させて培養した。いずれのペプチドも！ウスＴ細胞の増殖のアッセイにおいて抑制活性を示さなかつｔ：。

貢物を、δ１６Ｂ：ＩＳＰの存在下にＣｏｎＡまたはリポ多糖で刺激した。培養物は第４日および第５日にアッセイした。８１６Ｂ：ＩＳＰペプチドは、Ｔ細胞の増殖を抑制した（第３Ａ図）が、Ｂ細胞の増殖を抑制しなかった（第３Ｂ図）。

追加の実験において、ＪＹ細胞、ヒトＢリンパ芽球細胞系、による■ｇＧ分泌への８１６Ｂ：ＩＳＰの作用を検査しｔ；。分泌したＩｇＧのレベルを処理しないおよび処理した細胞培養物の間で比較して、δ１６Ｂ：ＩＳＰは抗体の産生を抑制ないことが示された。

生体外抑制の時間の反応速度論＝８１６Ｂ：ＩＳＰ誘発抑制を検査する方法の間、出願人は、ネズミおよびヒト細胞を使用するｌ系列の実験において、ペプチドが増殖しないことを観察した。アッセイは４または５日間よりはむしろ３日間インキユベーシッンし、そしてミトゲン誘発増殖は、一般に、培養の５日後に有意であるという事実が認められた。

したがって、実験は、Ｔ細胞の増殖を抑制する８１６Ｂ：ＩＳＰの能力への生体外培養時間の影響を決定するために、実験を実施した。結果が劇的に示すように、抑制は３Ｈの培養では観察されず、４日後にはじめて起こった（第４図９゜これが示すように、ペプチドは代謝の通路で相互作用し、そしてこの作用を発揮するためにはある量の時間を必要とする。

また、アメリカヤマゴボウのミトゲン（ＰＷＭ）刺激ヒト牌細胞の増殖は８１６Ｂ：ＩＳＰによって抑制されることが発見された。

抗ペプチド血清によるδ１６Ｂ：　ｒｓｐの認識：出願人は、抗１６Ｂ血清（Ｒ１１２−５）８よびＩＳＰペプチドに対する親和精製したウサギ抗血清（ＡＰ５５ｇ−２８）、ならびにＩＳ″ｐと反応するモノクローナル抗体（９−１４Ｆ２ −３）のδ１６Ｂ：ＩＳＰに結合する能力を検査して、それぞれの抗体結合部位が、８１６ＢおよびＩＳＰ配列の組み合わせ後、無傷で残るかどうかを決定した。まｆ：、ｃ−ａｂｌ腫瘍遺伝子に対する対照の親和精製したウサギ抗体（Ａ　Ｐ　６７）を使用した。得られた結果が示すように、両者の抗１６Ｂおよび抗ＩＳＰ抗体はδ１６Ｂ＝ＩＳＰと反応する（第５図）。

′＄３組の実験タンパク質配列のアラインメント法：選択したポリペプチドに関係する配列をもつタンパク質の同定を、ＰＣ遺伝子（Ｇｅｎｅ）［インテリジェ不ティックス・インコーホレーテッド（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｅｓ、Ｉｎｃ、）から解放（ｒｅ　１ｅａｓｅ）４゜０５〕の　ＳＣＡＮＳＩＭプログラム（変法３．０２）およびスイスタンパク質データーベース（解放２）を使用して達成した。選択した厳しいアラインメントのために、ネードルマンーウンシュ（Ｎｅｅｄ　ｌｅｍａｎ−Ｗｉｎｓｃｈ）アルゴリズム（ＰＥＰ／ＡＬＩＧＮ）のアプリケーションを、インテリジェネティックス・インコーホレーテッドからのバイオネット（Ｂｉｏｎｅｔ）へ介してアクセスした。

ポリペプチド配列：ポリペプチドはＦＬＹエンベロープ遺伝子前駆体の予測されたタンパク質配列Ｅエルダー（Ｅｌｄｅｒ）ら、ウィルス字詰（Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、４６：８７１−８８０．１９８３］から選択し、そして慣用の固相法によって合成した。

合成ポリペプチドに対する抗血清の発生二合成ポリペプチドをキーホールリンペットのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）とｌ＝１で０．０４％のグルタルアルデヒド中で室温において３０分間混合することによって結合した。ニューシーラント自ウサギに、完全フロインドアジュバント中の透析した接合体の２００ｐｇを注射し、次いで不完全７０インドアジユバント中の２００μｇの２回以上のブースター注射を投与した。

［３ｓｓｌアミノ酸の代謝的組み込みによるタンパク質の標識つけ：免疫沈澱物の各々について％２Ｘ１０’細胞を、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グルタミンおよび５％の透析した仔ウシ血清アルブミンを補充した２、０ｍｌのメチオニン欠乏ＲＰＭＩ　１６４０中で、０．５ｍＣ１の［ｓ１５］メチオニン（または［”Ｓｌ　ｍｅ　ｔ　／　［”Ｓｌ　ｃ　ｙ　ｓ混合物）で代謝的に標識した。

■Ｓ　ｍｅｔ標識抗原の免疫沈澱による検出：２Ｘ１０’ｌｌ［識細胞を１．Ｏｍ＋の溶菌緩衝液（０，０５％のＳＤＳ、１％のトリトンＸ−１００，１％のデオキシコレート、１ミリモルのＥＤＴＡ、１５０ミリモルのＮａＣｌ、１００ＵＫのトラシノール／ｍｌ、５０ミリモルのＭＯＰＳ％ｐｈ７．０）中で溶解し、そして１０分間１０．ＯＯＯｒｐｍで遠心することによって清浄化した（Ｓｏｒｖａｌｌ　５Ｓ３４　ローター）。

抗原を０−０２０ｍ１の抗血清の添加によって１８時間氷上で沈澱させた。免疫複合体を０．１００ｍ１のセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ニブロチインＡ［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］とともにローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）−免疫化複合体を細胞溶解緩衝液で洗浄し、０−０５０ｍ１のＳＤＳ試料緩衝液（２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、０．１２５モルのトリス−ＭＣＩ、ｐＨ６，８）の添加によって変性し、そして急速に沸騰する水中に３分間浸漬した。ビーズを遠心によって沈澱させ、上澄み液を２０倍に細胞溶解緩衝液中に希釈し、そして免疫沈澱工程を反復した。生ずる免疫複合体を、１０％の２−メルカプトエタノ−）しを含有する２％のＳＤＳ試料緩衝液で会合させた。試料は、３％の積み重ねたゲルおよび単一濃度（１２％）まｔ；は勾配（ｌＯ−２０％）の分離ゲル「ラエミ（Ｌａｅｍｍｉ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７− １６８０−６８５　（１９７０）］　を使用する５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により分割した。放射線標識した抗原を慣用のフルオログラフ法によって検出した。

抗原の免疫細胞化学的検出二合成ペプチドに対するウサギ抗体を２工程で精製した。免疫グロブリン分画を血清から２５％〜５０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウム沈澱から集めｔ；。リン酸塩緩衝塩類溶液に対する透析後、試料をエポキシ活性化４８［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］で調製したペプチド親和カラムに適用した。カラムをリン酸塩緩衝液／０．５モルのＫＣＩで洗浄し、そして抗体を３モルのリン酸塩緩衝液、ｐＨ８を含有する１モルの酢酸で溶離した。活性分画をプールし、透析し、そして限外ろ過によって濃縮した。免疫細胞化学的手順は、全標識した第２抗体および引き統いて欧州特許出願公告１５８，７４６号に記載される銀増強を使用した。

ＩＳＰに対して相同性の配列を含有するタンパク質の同定：ＦＬＶｐ１５ＥのＩＳＰドメインは、ＲＮＡ腫瘍ウィルスの間に高度に保存される。全体のスイスタンパク質データベースのＳＣＡＮＳＩＭプログラムサーチ（解放２）は、ＦＬＹ −ＩＳＰに非常に類似するペプチドのドメインをもつ９つのウィルスのエンベロープ配列゛を同定した。すべての９つのｅｎｖペプチドのカルボキシル末端における共通配列ｒＱＮＲＲＧＬＤＸＬＪを使用して、関連する配列についてタンパク質データベースをサーチした。下表９は、キーワード「インターフェロン」、「インタロイキン」および「腫瘍壊死因子」を使用して選択したスイスタンパク質データベースのサブセット中でＱＮＲＲＧＬＤＸＬ含有配列についてのサーチの結果を要約する。同様な結果（示さず）は、タンパク質情報リソース（Ｐ　Ｉ　Ｒ：インテリジェネティックス）の同等のサブセットでＰＥＰ／５ＥＡＲＣＨ／ＲＯＭ０ＬＯＧＹを使用して得た。

表９ウィルスＩｓＰの高度に保存された部分をもつインターフェロン／インターロイキン／腫瘍壊死因子アラインメント（ＱＮＲＲＧＬＤＸＬ）位置　配列　説明３３−４１　ＲＮＲＲＡＬＩＬＬ　ヒトＩＦＮ　ａ　−１０前駆体３３−４１　ＲＮ　Ｋ　ＲＡ　Ｌ　Ｋ　Ｖ　Ｌ　マウスＩＦＮ　ａ　−２前駆体３３−４１　ＲＮ　Ｋ　ＲＡ　Ｌ　Ｔ　Ｌ　Ｌ　マウスＩＦＮσ−１前駆体３３−４１　Ｄ　Ｎ　ＲＲＴ　Ｌ　Ｍ　Ｌ　Ｌ　ヒトＩＦＮｒ−１前駆体３３−４１　ＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬ　ヒトＩＦＮ　ａ　−４前駆体３３−４１　Ｇ凡ｌ且Ａ旦■旦ｋ　ヒトＩＦＮα−５前駆体３３−４１　ＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬ　ヒトＩＦＮ　ａ　−５前駆体３３−４１　ＧＮＲＲＡＬ　Ｉ　ＬＬ　ヒトＩＦＮ　ａ　−９前駆体４０−４８　ｖ凡Ｐ尺ＳＬＥ五ｋ　ヒトＩＦＮτ誘導タンパク質前駆体３３− ４１　ＮＮＲＲＴＬＭＬＭ　ヒトＩＦＮ（＋−８前駆体３３−４１　Ｇ　Ｓ　ＲＲＴ　Ｌ　Ｍ　Ｌ　Ｌ　ヒトＩＦＮ　ａ　−２前駆体１０−１８　ＧＳＲＲＴＬＭＬＬ　ヒトＩＦＮ　ａ　−３前駆体１２８−１３６　ＶＱＲＫＡＩＨＥＬ　ヒトＩＦＮｒＲ駆体３０−３８　立ＱＲＲ５旦ＡＬＣウシＩＦＮβ−２前駆体１１０−１１８　Ｋ　Ｋ　ＲＤ　Ｄ　Ｆ　Ｅ　Ｋ　Ｌ　ヒトＩＦＮτ前駆体１１４− １２２０ＱＬＮＤＬＥＶＬ　ヒトＩＦＮ　ａ　−４前駆体１２６−１３４　ＶＱＲＱＡＦＮＥＬ　マウスＩＦＮτ前駆体１０５−１１３　ＬＮ尺ＲＡＮＡ旦Ｌ　ヒトＴＮＦ前駆体７２−８０　０ＫＴＱＡＩＳＶＬ　ヒトＩＦＭ　ａ　−９前駆体７２−８０　０ＫＴＱＡ　Ｉ　ＳＶＬ　ヒトＩＦＭ　ａ　−１０前駆体１２７（３５１ＱＨＪ　ＡＶＮＥ　Ｌ　５’／　）ＩＦＭｒ前ＩＫ体１２６−１３４　ＥＥＲＶＧＥＴＰＬ　ヒトＩＦＭａ−１０前駆体７２−８０　０ＫＡＱＡＩＳＶＬ　ヒトＩＦＭ　ａ　−４前駆体７２−８０　０ＫＡＱＡ　Ｉ　ＳＶＬ　ヒトＩＦ）Ｊ　ａ　−５前駆体７２−８０　立ＫＡＱＡＩＳＶＬ　ヒトＩＦＭ　ａ　− ６前駆体１６−２４　０ＫＡＱＡ　Ｉ　ＳＶＬ　ヒトＩＦＭ　ａ　−７前駆体７２−８０　０ＫＡＱＡ　Ｉ　ＳＶＬ　ヒ目Ｆ）Ｊ　ａ　−８前駆体４２−５０　ＶＱＭＲＲＬＳＰＬ　マウ７．ＩＦＭａ−１前Ｎ体７７−８５　ＰＥ５ＫＡＩＫＮＬ　ヒトＩＦＭτ誘導タンパク質前駆体ｌ１ｌ−１１９Ｄ　Ｌ　ＨＱ　Ｑ　Ｌ　Ｎ　Ｄ　Ｌ　マウス］ＦＭａ−１前駆体４２−５０　ＡＱＭＲＲＬＰ上」４　マウスＩＦＭ　ａ　−２前駆体１１１−１１９　ＤＬＨＱＱＬＮＤＬ　マウスＩＦＭ　ａ　−２前駆体より厳しいアラインメントプログラムの適用（ネードレハム／ウィンチ［ＰＥＰ／５ＥＡＲＣＨ／ＡＬＩＧＮＩは、ウィルスｐ１５ＥのＩＳＰドメインおよびヒトアルファインターフェロン配列のアミノ末端のアミノ８２１−４７の間の領域の類似性を示す。オリゴヌクレオチドの部位特異的突然変異を使用する最近の研究は、ヒトアルファインターフェロンの受容体結合部位がアミノ末端のｌ　Ｏ−４４アミノ酸内に存在することを示しｔ；【シャフェルマン（Ｓｈａ　ｆ　ｆ　ｅ　ｒｍｎ）ら、ジャーｆｔし・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２６２．６２２７−６２７３　（１９８７）］、出願人は、生物学的に活性なＩＳＰおよびＩＳＰ関連抗原は、アルファインターフェロンのための細胞受容体によってそれらの作用のあるものを仲介すると考える。

ＩＳＰ関連抗原は種々のヒト白血病細胞系の成長培地中に解放される：４つの白血病誘導細胞系を、［”Ｓ］　ｍｅ　ｔで４〜６時間代謝的に標識し、そして完全成長培地で４０時間［チェース］Ｌｆ：：細胞系　！！ＨＬ６０　ヒト急性、脳を髄発生白血病Ｒａｊｉ　ヒトプルキット８Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ腫に５６２　ヒ）Ｒｈ’″慢性脳を髄発生白血病赤血白血球芽細胞発症Ｆ　Ｌ　７４　Ｆ　ＬＶ”Ｊ）　ｊＪ　ンｔ＜腫コンディショニングした成長培地を低いおよび高い遠心によって清浄化した。次いで、抗原を得られる上澄み液の分画から免疫沈澱しｔ；。精製した抗原を１０−２０％の勾配のＳＤＳゲルで分離し、そしてフルオログラフィーによって検出した。可溶性１１０に抗原を、ＦＬＹ’ＦＬ７４１ｉ１胞を含む試験したすべての白血病細胞系のコンディショニングした成長培地中で検出した。

重複するＦＬＶ　Ｉ　ＳＰＩ；ｔＲａ　ｊ　：ｍ胞から＋７）１１０．０００ダルトＩＳＦペプチドの作用は、［”Ｓ］　ｍｅ　を標識したＦＬＶ　ｇＰｒ’″ ″／ｐ　１５ＥおよびＲａｊｉ細胞抗原のＦＬＶ　ＩＳＰ抗血清をブロッキングする能力について比較した。表１Ｏに要約する結果が示すように、重複するＦＬＹペプチドは、ネコウィルスおよびヒト白血病細胞誘導の検出をブロッキングする非常に類似する能力を示す。

表１Ｏ免疫沈澱したＦＬＶ−ｐ１５ＥおよびＲａｊｉ　ｌｌ０Ｋタンパク質のＦＬＶ　ＩＳＰ抗血清の認識のＦＬＹペプチドのブロッキング［”Ｓｌ　ｍｅｔ抗原の検出ペプチド　配列　ＦＬＶ　ｐ１５Ｅ　Ｒａｊｉ　ｌｌ０Ｋなし　＋＋４＋　＋＋ＦＬＶ　ＩＳＰ　ＬＱＮＲＲＧＬＤ　ＩＬＦＬＱ　ＦＧＧＬＣＦ１９８　ＶＶＬＱＮＲＲＧＬＤ　ＩＬ　＋＋　＋Ｆ］９７　ＶＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦ　＋Ｆ１９５　０ＮＲＲＧＬＤ　ＩＬＦＬＱＦ１９４　ＮＲＲＧＬＤ　ＩＬＦＬＱ　ＥＦ１８６　ＬＤ　ＩＬＦＬＱ　ＥＧＧＬＣ＋＋＋＋　＋＋Ｆ’１８７　Ｄ　ＩＬＦＬＯＥＧＣ，ＬＣＡ　＋＋＋＋　＋＋Ｆ１８８　１ＬＦＬＱ　ＥＧＧＬＣＡＡ　＋　−Ｆ１８９　ＬＦＬＱ　ＥＧ（、ＬＣＡＡＬ　＋＋＋＋　＋＋Ｆ１９０　ＦＬＯＥＧＧＬＣＡＡＬＫ　＋＋＋＋　十＋（−）−存在せず；（＋）＝弱い；（＋＋）＝中程度；（＋＋＋＋）＝非常に強い。

Ｔ細胞ミトゲン（ＰＨＡ）は正常なヒトＰＢＬ中の［３″Ｓ１ｍｅｔ標識１１０に抗原の合成を刺激する：正常の健康な供与体からのヒストバーク（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）濃縮抹消血液白血球を、ｌＯμｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニンで刺激した。４日間の培養後、刺激しないおよび刺激した細胞を、４時間％　［” Ｓｌ　ｍｅ　ｔで標識し、そして免疫沈澱のために溶菌した。結果が示すところによると、非常に低いレベルの［３１５］標識した抗原は刺激しない細胞中で検出され、そして非常に高いレベルの抗原はミトゲン刺激した細胞中で検出されｊ；。

スアルビノ（Ａｌｂｉｎｏ）３Ｔ３細胞において検出されなかった。初期の免疫沈澱の実験は、４時間の［”Ｓ］ｍｅｔ標識抽出物を使用して実施して、ｌｌ０Ｋ抗原がいずれの細胞系において検出されるかどうかを検出しｌ；。ｌｌ０Ｋタンパク質は、Ａ４３１細胞において明らかに検出されたが、３Ｔ３細胞において検出されなかった。

以上、本発明を明瞭および理解を目的として、例示および実施例によって多少詳細に説明したが、明らかなように、変化および変更は添付した請求の範囲内用実施することができる。例えば、本発明のペプチドはペプチド中の保存的または非保存的アミノ酸を置換することによって変更することができる。同様、に、本発明のペプチドは種々の変化、例えば、アミノ酸の挿入または欠失に付すことができ、ここでこのような変化は、生体外ま１：は生体内の所望の免疫抑制活性に、実質的に影響を及ぼすか、あるい及ぼさないことがある。

ＦＩＧＵＲＥ　１２００　１００　５０　２５　１２ｊ　６．２５　３．１　１．５ＦＩＧＬＩＲＥ　２ＦＩＧＵＲＥ　３ＡＦＩＧＬＩＲＥ　３ＢＦＩＧＵＲＥ　４ＦＩＧυＲε５国際調査報告 °”ｌ＃ｈ＠ＭＩ　＆−ゝ−”１２Ｃτ露託”Ｉ　ｕ　：τ６

Claims

【特許請求の範囲】１．約４０より少ないアミノ酸残基を有するペプチドからなり、前記アミノ酸残基は少なくとも５つのアミノ酸残基のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列はアミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣＡＡＬＫＥＥＣＣＦの範囲内に含まれるアミノ酸配列から選択される免疫抑制ペプチド。２．担体分子に接合した請求の範囲１項記載のペプチドからなる免疫抑制化合物。３．約４０より少ないアミノ酸残基を有するペプチドからなり、前記アミノ酸残基は少なくとも５つのアミノ酸残基のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列は、【配列があります】から成るアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列の範囲内に含まれるアミノ酸配列から選択され、前記ペプチドは担体分子に接合されている免疫抑制化合物。４．担体分子はキーホールリンベットのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）である請求の範囲２または３項記載の化合物。５．担体分子はペプチドにグルクルアルデヒドで接合されている請求の範囲２または３項記載の化合物。６．約４０より少ないアミノ酸残基を有するペプチドからなり、前記アミノ酸残基は少なくとも５つのアミノ酸残基のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列はアミノ酸配列ＱＲＥＫＲＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＧまたはＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩしの範囲内に含まれるアミノ酸配列から選択される免疫抑制ペプチド。７．アミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＤｌＬＦＬＱＥＧＧＬＣを有するペプチドの抗原決定基に対して相同の抗原決定基からなる免疫抑制ペプチド。８．少なくとも５つのアミノ酸残基の第１アミノ酸配列、前記第１アミノ酸配列はアミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱの範囲内に含まれるアミノ酸配列から選択される、および少なくとも５つのアミノ酸残基の少なくとも１つの他のアミノ酸配列、前記他のアミノ酸配列は、【配列があります】から成るアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列の範囲内に含まれるアミノ酸配列から選択される、からなる免疫抑制ペプチド。９．アミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱの範囲内に含まれるアミノ酸配列のアミノ末端は、【配列があります】から成るアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列の範囲内に含まれるアミノ酸配列のカルボキシ末端に結合されている請求の範囲８項記載の免疫抑制ペプチド。１０．アミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱの範囲内に含まれるアミノ酸配列のカルボキシ末端は、【配列があります】から成るアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列の範囲内に含まれるアミノ酸配列のアミノ末端に結合されている請求の範囲８項記載の免疫抑制ペプチド。１１．アミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱの範囲内に含まれるアミノ酸配列のカルボキシ末端およびアミノ末端の各々は、【配列があります】から成るアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列の範囲内に含まれるアミノ酸配列に結合されている請求の範囲８項記載の免疫制ペプチド。１２．アミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱの範囲内に合まれるアミノ酸配列のカルボキシ末端に結合しているアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱの範囲内に含まれるアミノ酸配列のアミノ末端に結合するアミノ酸配列と同一である請求の範囲１１項記載の免疫抑制ペプチド。１３．アミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱの範囲内に含まれるアミノ酸配列のカルボキシ末端に結合しているアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱの範囲内に含まれるアミノ酸配列のアミノ末端に結合するアミノ酸配列と異なる請求の範囲１１項記載の免疫抑制ペプチド。１４．環状である請求の範囲８項記載の免疫抑制ペプチド。１５．請求の範囲８項記載のペプチドの反復単位からなるポリマー。１６．請求の範囲８項記載のペプチドの反復単位からなるシマー。１７．アミノ酸配列ＡＫＬＲＥＲＬＫＱＲＱＱＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＱＥＧＧＬＣからなる免疫抑制ペプチド。１８．アミノ酸配列ＡＫＬＲＥＬＫＱＲＱＱＬＱＮＲＲＧＬＤｌＬＦＱＥＧＧＬＣからなる免疫抑制ペプチド。１９．アミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＤＩＬＦＬＱＥＧＧＬＣを有するペプチドに対して発生された抗体のたりの抗原決定基は親和性を有し、ポリペプチドは哺乳動物の癌細胞中で発現される、精製されたポリペプチド。２０．約１１０，０００ダルトンの見掛けの分子量を有する請求の範囲１９項記載の精製されたポリペプチド。２１．約３５，１０００ダルトンの見掛けの分子量を有する請求の範囲１９項記載の精製きれたポリペプチド。２２．請求の範囲１９項記載の精製されたポリペプチドをエンコードする精製された核酸配列。２３．請求の範囲２０項記載の精製されたポリペプチドをエンコードする精製された核酸配列。２４．請求の範囲２１項記載の精製されたポリペプチドをエンコードする精製された核酸配列。２５．請求の範囲１９、２０または２１項記載のポリペプチドに対する親和性を有する抗体。２６．請求の範囲２５項記載のポリクローナル抗体。２７．請求の範囲２５項記載のモノクローナル抗体。２８．請求の範囲１９項記載のポリペプチドに対する親和性を有し、そして血液生成細胞の表面上に存在する精製されたタンパク質。２９．請求の範囲２５項記載の抗体および製薬学的に許容されうる担体からなる治療用組成物。３０．被検者に請求の範囲２９項記載の治療用組成物の有効免疫抑制ブロツキング量を投与することからなる、免疫学的にまたは血液生成的に抑制された被検者を処置する方法。３１．請求の範囲１９、２０または２１項記載の精製されたポリペプチド、あるいは少なくとも５つのアミノ酸残基のアミノ酸配列を有するペプチド、前記アミノ酸配列は精製されたポリペプチド内に包含される、および製薬学的に許容されうる担体からなる治療用組成物。３２．被検者に請求の範囲３１項記載の治療用組成物の有効免疫抑制量を投与することからなる、被検者の免疫系を抑制する方法。３３．免疫抑制ペプチド結合活性を有する請求の範囲２８項記載の精製されたタンパク質の一部および製薬字的に許容されうる担体からなる治療用組成物。３４．被検者に請求の範囲３３項記載の治療用組成物の有効免疫抑制ブロッキング量を投与することからなる、免疫学的にまたは血液生成的に抑制された被検きを処置する方法。３５．アミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＤｌＬＦＬＱＥＧＧＬＣを有するペプチドに対してレイズされた（ｒａｉｓｅｄ　ｔｏ）抗体と反応する抗原決定基を有するポリペプチドを発現する試料からの細胞を検出することからなり、前記ポリペプチドは哺乳動物細胞中で発現される、試料中の癌細胞を検出する方法。３６．アミノ酸配列ＬＱＮＲＲＧＬＤｌＬＦＬＱＥＧＧＬＣを有するペプチドに対してレイズされた抗体と反応する抗原決定基を有するポリペプチド、前記ポリペプチドは哺乳動物細胞中で発現される、あるいは前記抗原決定基を含む前記ポリペプチドの部分、を、被検者から採取した体液中において検出することからなる被検者における癌を診断ずる方法。３７．請求の範囲１、６、７、８、１７または１８項記載のペプチドおよび製薬学的に許容されうる担体からなるワクチン。３８．被検者に有効免疫化量の請求の範囲３７項記載のワクチンを投与することからなる被検者をレトロウイルスに対して免疫化する方法。３９．請求の範囲２または３項記載の化合物および製薬学的に許容されうる担体からなるワクチン。４０、被検者に有効免疫化量の請求の範囲３９項記載のワクチンを投与することからなる被検者をレトロウイルスに対して免疫化する方法。４１．請求の範囲１、６、７、８、１７または１８項記載のペプチドおよび製薬学的に許容されうる担体からなる治療用組成物。４２．被検者に請求の範囲４１項記載の治療用組成物の有効免疫抑制量を投与することからなる、被検者の免疫系を抑制する方法。４３．請求の範囲２または３項記載のべブチドおよび製薬学的に許容されうる担体からなる治療用組成物。４４．被検者に請求の範囲４３項記載の治療用組成物の有効免疫抑制量を投与することからなる、被検者の免疫系を抑制する方法。