JP2588274B2

JP2588274B2 - 定性酵素アッセイの視覚的識別

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Publication number: JP2588274B2
Application number: JP1146906A
Authority: JP
Inventors: エル．カーンナピヤー; エル．チョートグレンダ
Original assignee: Microgenics Corp
Current assignee: Microgenics Corp
Priority date: 1988-06-24
Filing date: 1989-06-12
Publication date: 1997-03-05
Anticipated expiration: 2012-03-05
Also published as: EP0348211A3; CA1336884C; EP0348211A2; AU620872B2; US5037735A; ATE101722T1; JPH02110374A; DE68913086D1; EP0348211B1; DE68913086T2; ES2063130T3; AU3598289A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、酵素イムノアッセイ、特にβ−ガラクトシ
ダーゼ相補的アッセイに関する。

〔背景〕

イムノアッセイは、広範囲の種類の分析物を検出する
ために多くの異なった方法論に基づいて開発されて来
た。アッセイ方法のほとんどは、熟練者及び実験装置を
必要とする。野外で行なうことができるアッセイの必要
性が存在するけれども、数種類のアッセイのみが好結果
をもって適合されて来た。たとえば、妊娠の徴候を示す
ホルモンのレベルを決定するための酵素結合免疫吸着ア
ッセイ（ELISA）が、市販されて来た。しかしながら、
他のタイプの適用、たとえば調節物質についての尿、汚
染物についての水又は抗生物質についてのミルクを試験
するためのアッセイの必要性が存在する。早く且つ容易
に行なうことができ、そして準備し、そして分析する装
置をほとんど又はまったく必要としない他に、このアッ
セイは感度が高く且つ正確であるべきである。

〔関連文献〕

変性されたβ−ガラクトシダーゼ酵素供与体及び酵素
受容体は、化学合成及び組換え方法により調製されて来
た。変性されたフラグメントは相補的に基づいてβ−ガ
ラクトシダーゼ活性を保持し、そしてフラグメントの生
成及びフラグメントへの分析物の結合を促進する。たと
えばアメリカ特許第4,708,929号及び本明細書に引用さ
れた文献を参照のこと。

〔発明の要約〕

サンプル中において特異的結合対（sbs）のメンバー
である分析物の存在を決定するためのβ−ガラクトシダ
ーゼ相補的アッセイが提供され、このアッセイはこれら
のサンプル間の視覚的識別を可能にし、ここで分析物は
予定された限界濃度以上で存在する。その方法は、sbp
複合体含有アッセイ媒体を形成するために、サンプルと
疎水性酵素供与体−（ED−）分析物接合体及びsbpの相
補的メンバーとを混合することを含んで成る。少量のア
ッセイ媒体が、吸収性固体支持体に付着された酵素受容
体（EA）上に滴下され、続いて酵素基質溶液による処理
を伴う。サンプル中の分析物濃度が限界値以下である場
合、限界値以上である分析物濃度に比べて実質的に大き
な部分が検出される。このアッセイは特に、野外試験用
途、たとえばミルク中の抗生物質の存在、水中の毒素の
存在又は血清又は尿中の薬物の存在を決定することにお
いて有用である。その方法を容易にするキットもまた提
供される。

〔特定の態様の記載〕

限界濃度の分析物〔該分析物は特異的結合対（sbp）
のメンバーである〕の存在を検出するためのβ−ガラク
トシダーゼ相補的アッセイ方法が提供される。その方法
は、EA紙を形成するために、吸収性固体支持体に付着さ
れたβ−ガラクトシダーゼ酵素受容体（EA）を使用す
る。サンプルは、sbpメンバー間の複合体を含むアッセ
イ媒体を形成するために、サンプル中に存在するいづれ
かの分析物及び接合体が前記相補的な特異的結合対メン
バーと競争的に反応するのに十分な時間、疎水性酵素供
与体−（ED−）分析物の接合体及び前記相補的な特異的
結合対メンバーと共に混合される。少量のアッセイ媒体
がEA紙上に滴下され、そしてその適用部位から放射状に
内側からはじきとばされた形に成る。次にそのEA紙を、
酵素基質溶液と組合せる。分析物が限界濃度以下である
場合、前記限界濃度以上である前記分析物に比べて実質
的に大きな部分が検出できる。

本発明のアッセイ方法は、従来技術のイムノアッセイ
又は相補的方法により決定されるいづれかの分析物を検
出するために使用され得る。そのアッセイ方法は、分析
物を含む水性媒体と共に使用され得る。分析物は、免疫
原、たとえば高分子量（MW＞1000）のペプチド、タンパ
ク質又は炭水化物であるが、しかし通常、ハプテン（MW
＜1000）、たとえば薬物又は毒素ではない。この方法
は、所望により野外で試験される分析物のために、たと
えば体液、たとえば尿、血清又は血漿中に存在する調節
された物質の検出のために特に適切である。その方法は
また、ミルク中の抗生物質又は水又は土壌サンプル中の
毒素、たとえば殺菌剤、ジオキシン、パラチオン又は同
様のものを検出するためにも使用される。水溶液にサン
プルを供給し、そして粒状物を除去する以外、サンプル
の前処理は通常、本発明のアッセイ方法のためには行な
われないであろう。

酵素供与体及び酵素受容体は、β−ガラクトシダーゼ
の部分配列である。いづれかの部分配列が、配列の生
成、分析物の結合又は同様のことを促進するために突然
変異され得る。酵素受容体及び酵素供与体−分析物接合
体は、一緒にされる場合、活性酵素複合体を形成するこ
とによって特徴づけられる。酵素供与体−分析物接合体
が相補的な特異的結合対メンバーに結合される場合、観
察される酵素活性は、その相補的な特異的結合対メンバ
ーの不在下で観察される活性と異なる。従って、酵素供
与体−分析物接合体と結合する特異的結合対の相補的メ
ンバーの有効性は、媒体中の分析物の量と共に変化する
であろう。

β−ガラクトシダーゼ酵素供与体及び受容体は、分析
物及び酵素供与体−分析物接合体であるものとして、ア
メリカ特許第4,708,929号に記載され、そしてこれを引
用により本明細書に組込む。欧州特許第0327312号は、
相補的アッセイのための反応条件及び試薬を記載する。
その出願に記載されるアッセイの条件は、本発明に適用
できる。

β−ガラクトシダーゼEAは、EA紙を形成するために吸
収性固体支持体に付着されるであろう。その支持体は十
分に堅くEAを結合する吸収性物質であるので、支持体が
水溶液中に含浸される場合、EAは支持体に付着され、そ
してこの結合は相補性を妨げないであろう。さらに、支
持体は十分に疎水性環境を付与し、その結果、支持体に
適用される疎水性ED−分析物接合体はその適用部分から
移動せず、又は短い距離移動するに過ぎないであろう。
本発明のイムノアッセイ方法に使用される多くの吸収性
固体支持体が文献中に報告され、そしてその支持体とし
て、変性されたセルロース性支持体、たとえば紙、ニト
ロセルロース及び所望により非セルロース性支持体、た
とえばナイロン膜、ポリエステル基材の膜及びポリアミ
ド基材の膜を列挙することができる。便利には、その固
体支持体は、化学的反応性膜、たとえば処理ナイロン膜
であり、これはその膜と共にインキュベートされるタン
パク質を共有結合又は非共有結合するであろう。タンパ
ク質のアミノ基との結合の形成を通してタンパク質を共
有結合することが報告されるナイロン膜は、Millipore
Corporation（“Immobilon"）及びPall Corporation
（“Immunodyne"）から入手できる。Immunodyne膜は、
膜上に付着されたEAがImmobilon膜よりもImmunodyne膜
による貯蔵に基づいて長期間安定するので好ましい。

酵素受容体は、支持物質にタンパク質を共有結合又は
非共有結合するために従来の手段により固体支持体に結
合されるであろう。Immobilon膜へのEAの結合のための
好ましい方法、実験部分に詳しく説明される。通常、酵
素受容体は、個体支持体の全表面を被覆するであろう。
しかしながら、EAは前記紙の選択された部分に適用され
る。所望により、EAは実質的に一定した濃度でその紙の
表面上に存在するであろう。酵素受容体の結合の後、そ
の紙を、所望により界面活性剤を含む水性緩衝溶液によ
り注意して洗浄し、その紙に堅く結合されないEAを除去
する。EAの結合の後、その紙をブロッキング剤、たとえ
ばウシ血清アルブミン（BSA）又はカゼインにより被覆
し、そのEA紙へのタンパク質性物質の非特異的結合を最
少にする。調製した後、そのEA紙を吸着乾燥せしめ、そ
して所望により真空デシケーター中に貯蔵する。乾燥条
件下でその紙を貯蔵することは、EAの安定性を増強する
ことが見出された。その紙は室温で貯蔵するか又は長期
安定性のためには冷蔵庫中に貯蔵することができる。

その相補的な特異的結合対メンバーへの結合の不在下
でEA紙に適用される部分に存続するのに十分に疎水性で
あるED−分析物接合体が使用される。しかしながら、そ
の接合体が特異的結合対の相補的メンバーと組合される
場合、その接合体は適用部位から実質的に離れて放射状
に移動し、そしてこの距離は、酵素基質への暴露の後、
実質的に大きな検出可能部分を明瞭に示すであろう。所
望により、その接合体は、その特異的結合対メンバーと
複合体化される場合、その適用の部分から少なくとも２
倍、通常４倍、好ましくは溶媒前部まで放射状に内側か
ら移動するであろう。

EDに結合される分析物又は分析類似体は、陽性及び陰
性のアッセイ結果間に識別を付与するために十分に疎水
性の接合体を生成することができる。そうでない場合、
１又はそれ以上の疎水性置換基が疎水性接合体を付与す
るためにEDに結合され得る。所望により、疎水性原子、
たとえばC,H,S又はハロゲンは、ED上に合計置換基（分
析物を含む）の少なくとも約50重量％、通常少なくとも
約60重量％を含有するであろう。いづれか追加の置換基
が、分析物結合部位と同じ部位又は異なった部位でEDに
結合され得る。分析物と同じ部位で結合される場合、置
換基は分析物にのみ結合されるか、又はEDに分析物を結
合する、少なくとも約６個の炭素原子の結合基として作
用することもできる。その置換基は、１又は複数の疎水
性成分、たとえばコレステロール、脂肪酸、T3又はT4で
あり得る。

接合体が陽性及び陰性サンプル間を識別するために十
分に疎水性であるかどうかを決定するための典型的な機
能的方法は、実験部分に詳しく説明されている。これら
の方法は、相補的な特異的結合対メンバーを有する及び
それを有さないアッセイ媒体中でプレインキュベートし
た後、EA紙上にスポットされる場合に移動する接合体の
距離の差異の決定に基づかれている。

イムノアッセイに使用され得る多くの特異的結合対が
知られている。結合体への相補的メンバーの結合がEA紙
の表面上で補足する接合体の能力の差異を提供する場
合、前記特異的対のいづれかのメンバーが分析物として
作用することができる。通常、特異的結合対の少なくと
も１つのメンバーは、タンパク質又はタンパク質フラグ
メント、たとえば抗原−抗体、レクチン−糖、等であろ
う。通常、その対は、受容体−リガンド対（この際リガ
ンドは分析物として作用する）であろう。受容体とし
て、抗体（ポリクローナル又はモノクローナルのいづれ
か）が通常使用されるであろう。他方、他の受容体／リ
ガンド対、たとえばビタミンＢ−12−内因子及び葉酸−
フォレート結合タンパク質が使用され得る。

アッセイ媒体を形成するためにサンプルと組合した
後、酵素供与体−分析物接合体の濃度は通常、約1nM〜
約60nM、より普通には約1nM〜約10nMの範囲で存在する
であろう。酵素受容体は通常、EA紙上に実質的に過剰に
存在するであろう。酵素供与体−分析物接合体：酵素受
容体のモル比は通常、1:50〜1:10,000、普通1:100〜1:2
000であろう。酸素供与体−分析物接合体及び相補的な
特異的結合対メンバーの濃度は、予定された限界濃度の
分析物がサンプル中に存在する場合、分析物受容体に結
合されないED−分析物接合体を提供する。

ED−分析物接合体及びその相補的な特異的結合対メン
バーの最適比は、分析物の予定された限界濃度を決定
し、そしてまたバックグラウンド活性を最少にするため
にEAの存在下で決定されるであろう。バックグラウンド
レベルに関する応答は最適化される。濃度を最適化する
ための可能性ある１つの方法は、便利には２段階方法で
ある。第１に、ED−分析物接合体及び相補的な特異的結
合対メンバーの濃度の比は、所望する分析物の濃度範囲
において分析物濃度と共に変化する酵素比率の直線性を
維持しながら、アッセイ条件下で最少の酵素比率を実質
的に達成するような比である。この濃度は所望により、
反応の速度学を研究することによって溶液中において決
定される。たとえば、欧州特許第0327312号（これは、
接合体及び抗体濃度を最適化することを詳しく説明す
る）を参照のこと。普通、相補的な特異的結合対メンバ
ー及び接合体の濃度は、条件を最適化するのに必要な濃
度の少なくとも85％以内、より普通には少なくとも95％
以内であろう。さらに、相補的な特異的結合対メンバー
を抗体である場合、EA紙と接触する前、抗−分析物抗体
に対して特異的な第二抗体の添加がβ−ガラクトシダー
ゼ触媒反応速度を低めることができる。

所望する分析物濃度範囲における最適な相補的特異的
結合対メンバー及び接合体の濃度が溶液アッセイにおい
て決定された後、これらの濃度は本発明のアッセイに使
用される。限界分析物濃度よりもわずかに高い濃度のサ
ンプルを用いる場合、接合体が適用部位部分に存続する
まで、種々の量の相補的な特異的結合体メンバーが添加
される。適用部位から接合体の移動は、限界濃度又はそ
れ以下の濃度の分析物を有するサンプルにより観察され
る。限界分析物濃度で接合体移動を提供する最少の相補
的特異的結合対メンバー濃度が、本発明のアッセイに使
用するために最適である。

アッセイ条件及びサンプル、ED−分析物接合体及び分
析物受容体が組合される緩衝液は、アッセイ媒体中にお
ける相補的な特異的結合対メンバー及びED−分析物接合
体又は分析物の間での複合体の形成を提供する。アッセ
イ媒体がEA紙上にスポットされる場合、緩衝液はまた、
固体支持体付着性β−ガラクトシダーゼを形成するため
に、酵素供与体と酵素受容体との間に相補性を提供す
る。その緩衝液配合は臨界ではない。一般的に、生理的
緩衝液、たとえばリン酸緩衝溶液、トリス緩衝液及び同
様の緩衝液が有用である。好ましい緩衝液は、約100mM
〜約300mMのNaPO₄、約5mM〜約10mMのEGTA及び約10mM〜2
0mMのNaN₃（pH6〜８）を含有する。温度は普通少なくと
も約20℃、好ましくは高温（但し60℃以下）であろう。
アッセイが野外で使用される場合、ほとんどのアッセイ
は、約20℃〜約30℃、より普通には約25℃で行なわれ
る。アッセイは大気圧で行なわれる。

サンプル中の分析物の存在を検出するための第１段階
として、サンプルは、相補的な特異的結合対メンバー及
びED−分析物接合体と共に、前記相補的な特異的結合対
メンバーが分析物と十分に反応する時間インキュベート
される。その時間は、インキュベーション温度及び特異
的結合対メンバーの親和性に依存して変化し、そして普
通、反応が平衡を達成するまでで十分であろう。普通、
インキュベーション時間は、約20℃〜約37℃で少なくと
も約15分間、より普通には約30〜60分間である。便利に
は、ED−分析物接合体及び相補的な特異的結合対メンバ
ーは、サンプルと接触する前、特異的結合対複合体を形
成するために組合される。その複合体は、EA紙上にスポ
ットする前、サンプル中の分析物が複合体中の相補的な
特異的結合対メンバーと反応するための十分な時間、サ
ンプルと共にインキュベーションされるであろう。予備
形成された複合体を用いる場合、ポリクローナル抗体を
用いる典型的なジゴキシンアッセイにおいて、サンプル
へのその複合体の添加の後、平衡は15〜約60分で達し
た。

アッセイ媒体を形成するために緩衝液中でED−分析物
接合体及び相補的な特異的結合対メンバーと共に混合さ
れる場合、種々の量のサンプルが使用され得、そしてそ
の量は、サンプル中における期待分析物濃度に依存す
る。普通、サンプルは、アッセイ媒体の体積の少なくと
も約１〜20％を占めるであろう。

少量のアッセイ媒体がEA紙に適用されるであろう。そ
のアッセイ媒体の量は、乾燥EA紙による適用装置から引
き出され、そしてウィッキングされるために十分に少量
であり、そしてその紙上で流れず、そして玉状にならな
い程度の量であろう。便利には、約10μ以下、普通約
３〜約５μが使用されるであろう。アッセイ媒体の体
積は便利には、EA紙に適用されるべき体積又はひじょう
に少量のサンプル体積を可能にし、そしてむだなアッセ
イ試薬を避けるいくぶん多量の体積であろう。しかしな
がら、測定の便利性又は同様のことを所望する場合、実
質的に多くのアッセイ媒体体積が使用され得る。

アッセイ媒体は便利には、媒体を含有する毛管とEA紙
の予定された部分とを接触せしめることによって適用さ
れ、そして適用部位から放射状にウィッキングするであ
ろう。EA紙は、インキュベーション温度に依存して、約
５〜約30分、より普通には約10〜30分間インキュベート
されるであろう。普通インキュベーションは、固体支持
体付着性β−ガラクトシダーゼを形成するためにEAがED
と反応するのに十分な時間行なわれるであろう。

その後、EA紙は、酵素基質溶液と共にインキュベート
される。酵素により分解される場合、吸光度（光学濃
度）又はアッセイ媒体の発光の量の変化をもたらす酵素
基質が用いられる。すなわち、基質の分解は、着色又は
蛍光生成物の出現又は消出をもたらす。酵素基質は、沈
殿性又は非沈殿性生成物を生成することができる。所望
により、非沈殿性生成物を用いる場合、その生成物はEA
紙に非特異的に結合されるであろう。好ましい酵素基質
は、クロロフェノール、レッドガラクトシド（CPRG）で
ある。CPRG及び他の匹敵する酵素基質、たとえばオルト
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ONPG）は、
市販されている。酵素基質とのインキュベーションは便
利には、酵素基質溶液中にEA紙を含浸することによって
行なわれる。CPRGを用いる場合、EA紙は便利には、約0.
5〜2mMの間のCPRGの溶液中において室温で１〜10分間イ
ンキュベートされるであろう。所望により、EAが発色を
強めるために気質溶液に添加され得る。他方、その基質
は、別々の溶液としてよりもむしろ、EA紙中に組込まれ
又はアッセイ媒体中に存在することができる。この場
合、EA紙と共にアッセイ媒体をインキュベーションする
ことは、EA紙の進展を提供するであろう。

サンプルが予定された限界濃度以上の濃度の分析物を
含む場合、接合体は適用部位の近くに存続し、そして基
質による展開の後、検出できる小さな部分を生ぜしめ
る。CPRGを用いる場合、小さな黒い点がその適用部位で
形成される。分析物が予定された限界濃度以上の濃度で
存在しない場合、接合体は、より薄い色を有する実質的
に大きな検出できる部分を形成するために、適用部位か
ら実質的に離れて放射状にウィッキングする。

本発明を促進する試薬を含むキットがまた、考慮され
る。そのキットは、吸収性固体支持体に付着されたEA及
びβ−ガラクトシダーゼED−分析物接合体並びに特異的
結合対の相補的メンバーを含んで成る。ED−分析物接合
対及び相補的な特異的結合対メンバーは、同じか又は異
なった容器中に、便利には予備形成された複合体と同じ
容器中に供給され得る。酵素基質溶液は、キット中に含
まれるか又は別々に売られている。キットはさらに、陽
性及び陰性の分析物対照を含むことができる。EA紙は乾
燥形で供給されるであろう。追加の試薬は、液体又は乾
燥形で供給され得る。便利には、その追加の試薬は、１
回のアッセイのために十分な量の試薬を含む錠剤の形で
供給されるであろう。

次の例は例示的であって、限定するものではない。

実験例１ EA紙の調製膜にEAを結合するために、EA22の溶液〔50mMのPO₄ ^3-
緩衝液（pH7.4）中、約５〜10μＭの濃度で〕でおおわ
れた膜を、室温（RT）で30分間、振盪した。次にその膜
を、PBS中、１％カゼイン溶液によりブロックし（振
盪、60分、RT）、次いで0.05％のTween 20を含むPBSに
より２度すすいだ（振盪、15分、RT）。次にその膜を吸
収乾燥せしめ、そして真空デシケーター中に保存した。

存在するタンパク質の完全な結合のためには、膜上の
タンパク質結合部位と競争するチオールが存在しないこ
とが好ましい。従って、次の例のために使用されるEA
は、貯蔵チオールがSephadexカラムを通して除去されて
いる“交換された"EA22であった。

交換されたEAは、チオール保護のためにEGTAの添加を
伴って又はその添加を伴わないで７日間までの間、冷蔵
庫中に保存され、又は固定化後、匹敵する酵素活性を供
給するために７日又はそれ以上の間貯蔵するために10％
グリセロールと共に冷凍された。

例２抗体及びED−分析物接合体の濃度の最適化免疫複合体を、まず１〜8mMのEDTA及び6mMのMg（OA
c）_２を含む250mMのPO₄ ^3-緩衝液中、50nMのED4T3及び1:
200の希釈度のモノクローナル抗−T3抗体を37℃で45分
間インキュベートすることによって調製した。次にこの
免疫複合体を希釈し、5nMにし、そして放射状にウィッ
キングする形態により5nMのED4T3と比べた。この免疫複
合体は、適用部位で小さな点で残るED4T3に比べて溶媒
前部まで前進した。従って、抗体の存在又は不在間に卓
越した識別が存在した。

次の実験は、使用される濃度を最適化するための免疫
複合体中の抗−T3抗体の濃度の滴定であった。免疫複合
体を抗−T3抗体（1:1600〜1:200の範囲）により構成
し、そして次にPall−EA紙上にスポットした。1:200又
は1:400の希釈度の抗−T3が使用される場合、免疫複合
体は溶媒前部まで放射状にウィッキングした。しかしな
がら、1:1600の希釈度が使用される場合、中央が黒い点
がCPRGによる展開の後、現われ始めた。これは、抗体に
結合されていない接合体が存在することを指摘する。抗
体の存在又は不在の間の識別を示す条件が確立された
後、次の研究は、限界濃度の分析物の存在を識別する試
みであった。

より濃縮された免疫複合体を、この研究のために調製
した:500nMのED4T3及び1:100の抗−T3抗体。この複合体
を希釈し、2nMのED4T3にし、そして1:25,000の抗−T3に
し、そして50ng/mlのT3と共に37℃で15分間、検量器中
でインキュベートした。分析物を有するサンプルは、分
析物を有さないサンプルと比べて明らかに内部が黒い点
を示した。

例３予定された分析物濃度を検出するための抗体／接合体比溶媒前部までの距離と等しい直径の薄い点を生ぜしめ
る濃度よりも低い、分析物の一定の予定された限界濃度
がCPRG及び分析物を用いて内部が黒い点を生ぜしめるた
めに必要とされるアッセイが開発された。初めの研究
は、50nMのED4T3及び1:400の抗−T3により調製された免
疫複合体を用い、そして前記複合体は10倍に希釈され、
そして0,10,25,50又は90ng/mlのT3（システムの濃度）
と共に、インキュベートされた。内部が黒い点は、すべ
ての濃度のT3で見られた。しかしながら、その色は、検
量器中の高い割合の血清による相補性の阻害により50及
び90ng/mlで薄かった（溶液中において動的アッセイで
別々に示される場合）。０及び10ng/mlの間のサンプル
の溶液中でのその割合の差異は、無限の分析物用量（90
ng/mlのT3）の42％対61％を示した。従って、10ng/mlの
T3サンプルによるその溶液割合の約19％の正味差異が、
ウィッキングアッセイにおける内部点の識別を十分に可
能にした。

より高い限界濃度のT3（50ng/ml）へのアッセイを応
答せしめるためには、抗−T3の濃度を、免疫複合体の形
成のために1:100に高めた。50ng/mlのT3では、内部点は
見られなかった。溶液中でアッセイする場合の比較し得
る割合は、50ng/mlの用量が開放割合、すなわち無限分
析物用量に関する割合のたった44％に達したことを示し
た。閉鎖割合、すなわち限界分析物濃度に関する割合
は、開放割合の34％に達した。従って、これらの２種の
サンプル間の差異は、10％の正味増加率に過ぎなかっ
た。これらの２種の研究からのデータは、約10〜約19％
の正味差異がアッセイにおいて内部点を生ぜしめ、そし
て従って限界濃度以上及び以下の濃度のサンプル間の識
別を可能にしたことを示した。

最後の研究は、1:200の抗−T3抗体の存在下で調製さ
れた免疫複合体により行なわれた。酵素の割合は溶液中
でモニターされ、そして多量のアッセイ媒体は上記のよ
うに放射状にしみを作った。その割合は次のとおりであ
る：溶液ウィッキング 0 T3＝37％開放割合内部点は存在しない 10 T3 39％開放割合内部点は存在しない 20 T3 52％開放割合内部点は存在する 40 T3 63％開放割合内部点は存在する従って、内部点を生ぜしめるための最少量である20ng/m
lのサンプルは、閉鎖割合よりも15％の正味上昇率の結
果であった。限界アッセイは事実と、所望とする分析物
濃度に対して敏感である免疫複合体を得るために抗体を
定することによって他の分析物のために開発され得るこ
とがこれらの研究から明らかである。

例４界面活性剤の効果これまでの例において使用されたすべての接合体は、
いづれの安定剤をも含まない250mMのリン酸緩衝液中で
調製された。接合体は所望により安定剤と共に貯蔵され
るので、ED4及びED4T3のウィッキングに対する２種の界
面活性剤の効果を試験した。ED4及びED4T3の溶液（5n
M）を、0.24％のラウロイルサルコシン又は0.9％のTwee
n20により又はそれらによらないで調製し、そしてこれ
までのようにPall−EA膜上にスポットした。界面活性剤
は、ED4のウィッキング又は色彩進行に対して効果を持
たなかった。Tween20の存在は、ED4T3サンプルの半径の
わずかな増加を単に引き起こした。それぞれの特異的接
合体及び界面活性剤の組合せが所望により試験されるだ
ろうけれども、この研究は、アッセイ試薬への界面活性
剤の添加はアッセイを妨害しないであろうことを示唆す
る。

例５接合体の疎水性度種々の濃度のED4T3（１〜100nM）をスポットし、そし
てEAと共にインキュベートされていないが、しかし１％
カゼインによりブロックされたPall膜上で放射状に内側
からの拡大を可能にした。その膜をEA及びCPRGにより進
行せしめた。すべての場合、色彩は中央の点に制限さ
れ、そしてこれは溶媒前部に達しなかった。従って、前
の研究においては、ED4は溶媒前部まで進行したけれど
も、前記ブロックされたPall膜は溶媒前部へのED4T3の
ウィッキングを可能にしなかった。接合体のこの非特異
的結合はED−T3接合体の疎水性性質に帰する。さらに一
連の他の接合体を研究し、陽性及び陰性サンプル間の識
別のために必要とされる疎水性度を決定した。

Pall膜と５μＭのEAとを反応せしめることによって調
製されたEA紙を、種々の接合体の溶液５μ〜10nMによ
りスポットした。初めの研究におけるように、ED4スポ
ットは溶媒前部に拡張し、ところがED4T3は小さな点と
して存続した。ED4T4は、ED4T3と同一の挙動を示した。
ED4−ジゴキシンは中央に存続し、ところがその半径はT
3及びT4の接合体のスポットよりも大きかった。

ED4−B12は溶媒前部に拡張した。ED4−KLH及びED4−B
SAの溶液は、不十分ではあるが、溶媒前部に拡張した。

これらの結果は、抗体の不在下での接合体移動の程度
は、結合体の疎水性度と反比例して相互関係することを
示す。すなわち、T3及びT4接合体が最っとも疎水性であ
り、続いてジゴキシン接合体であり、そしてこれらは溶
媒前部に拡張しなかった唯一の接合体である。

例６ ED4−B12アッセイ ED4T3に関する研究を、ED4T3よりも低い疎水性である
接合体によりくり返した。ED4−B12を、広範囲の濃度の
抗−B12（1:5000〜1:100）と共にインキュベートし、免
疫複合体を形成した。これらを溶液中においてアッセイ
し、相補性の阻害率を決定し、そしてPall−EA紙上にス
ポットした。最っとも低い抗−B12濃度で、その溶液は
たった22％阻害され、そしてその膜のスポットに関する
色の進行の低下は存在しなかった。膜上の色の進行の低
下は、より高い抗−B12濃度により形成された免疫複合
体により観察され、そしてそれは溶液アッセイにおける
相補性の阻害率（1:1000〜1:100の抗−B12濃度で55〜64
％の阻害率）の上昇と相互関係した。このアッセイを開
発するために、免疫複合体（1:2000の抗−B12）を、ア
ッセイ及びスポットする前、５〜100nMのB12と共にイン
キュベートした。その複合体を添加物なしに44％阻害
し、そして最っとも高いB12濃度で34％を阻害し、これ
はED−B12及び抗−B12の割合が、最適化を要することを
示した。しかしながら、色彩進行の領域は、分析物の存
在によりわずかに影響されたに過ぎなかった。溶媒前部
での色彩濃度は分析物を有さないサンプルの濃度と同一
であるが、ちょうど中心部で濃度のわずかな上昇が存在
した。このデータから、種々の成分の濃度が最適化され
れば、感度の高いアッセイがB12のために開発され得る
ことは明らかである。

例７ ED4−ジゴキシンアッセイウィッキングアッセイ型をまた、ED4のジゴキシン接
合体を用いて試験した。免疫複合体を、3nMのED4−ジゴ
キシン、1:500のポリクローナル抗−ジゴキシン及び1:6
のヤギ抗−ウサギ血清（GARS）により形成した。この複
合体を続いて分析物（０又は100ng/ml）のジゴキシン）
と共に37℃で30分間インキュベートし、溶液中において
アッセイし、そしてまたウィッキングアッセイのために
Pall−EA膜上にスポットした。抗体を有する100ng/mlの
サンプルの活性は、抗体を有さないサンプルの割合の51
％であった。0ng/mlのサンプルの割合は34％であり、こ
れは溶液中、100ng/mlのサンプルにおいて正味15％の差
異を与えた。0ng/mlのサンプルの色彩進行は、100ng/ml
のサンプルの色彩進行よりもひじょうに弱かった。これ
らの結果は、T3接合体の結果に類似する。すなわち、約
10％と約20％との間の正味動的差異は、限界濃度の分析
物を有するサンプルとその限界濃度以下の濃度のサンプ
ルと区別するために十分である。

この研究をくり返し、0ng/ml及び100ng/mlのサンプル
間の差異を最適化した。免疫複合体の形成時間を60分に
高めることによって、溶液中におけるサンプル間の正味
動的差異を33％に高めた。しかしながら、膜の色彩進行
の差異はさらに高められなかった。GARSを省くことによ
って、すべてのサンプルの色彩進行が高められ、そして
ひじょうに良好な色彩の差異がその膜により得られた。

上記例により例示されるように、本発明は、予定され
た濃度以上でのサンプル中の分析物の存在及び不在間の
視覚的識別を付与する単純なアッセイ方法を提供する。
このアッセイ方法は、野外で容易に行なわれるように、
最少の操作及び少数の試薬を必要とする。

本明細書に言及されたすべての出版物及び特許出願
は、本発明が関与する当業者の熟練のレベルの表示であ
る。すべての出版物及び特許出願を、引用により本明細
書に組込む。

この発明の好ましい態様を詳細に示し、そして記載し
たが、これによってこの発明の範囲を限定するものでは
ない。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプル中の分析物であって、該分析物を
含んで成る特異的結合対メンバー及び相補的な特異的結
合対メンバーである該分析物の存在を決定するための方
法であって：（ａ）疎水性β−ガラクトシダーゼ酵素供与体−分析物
の接合体及び前記相補的な特異的結合対メンバーを含有
する溶液と前記サンプルとを、前記サンプル中に存在す
るいづれかの分析物及び前記接合体が前記相補的な特異
的結合対メンバーと反応するのに十分な時間、混合する
ことによってアッセイ媒体を調製し；（ｂ）固体支持体付着性β−ガラクトシダーゼ酵素受容
体を含んで成る吸収性固体支持体の予定された部分に前
記アッセイ媒体の少量を適用し、そして前記アッセイ媒
体が前記予定された部分を囲む部分に放射状に内側から
はじきとばされた形になり；そして（ｃ）前記固体支持体を、β−ガラクトシダーゼとの反
応に基づいて視覚的に検出可能な生成物を形成する酵素
基質と共にインキュベートし、それによって、前記固体
支持体上に視覚的に検出可能な部分であって、前記サン
プル中の分析物の量に比例する該部分を形成することを
含んで成る方法。
【請求項２】前記視覚的に検出可能な部分が、前記分析
物濃度が限界値以下である場合、前記限界値以上である
前記分析物濃度に比べて実質的に大きい請求項１記載の
方法。
【請求項３】前記酵素基質が前記アッセイ媒体中に存在
するか又は前記吸収性固体支持体に付着されているかの
いづれかである請求項１記載の方法。
【請求項４】前記吸収性固体支持体がナイロン膜である
請求項１記載の方法。
【請求項５】前記接合体及び前記相補的な特異的結合対
メンバーが、前記サンプルが前記アッセイ媒体を形成す
るために前記溶液と混合される場合、予備形成複合体と
して存在する請求項１記載の方法。
【請求項６】前記特異的結合体が抗原−抗体の対である
請求項１記載の方法。
【請求項７】前記接合体が、前記相補的な特異的結合対
メンバーへの結合の不在下で前記予定された部分に存続
するのに十分な疎水性である請求項１記載の方法。
【請求項８】前記接合体が、前記接合体に結合される少
なくとも１種の疎水性成分を含有する請求項１記載の方
法。
【請求項９】疎水性吸着性固体支持体に付着されたβ−
ガラクトシダーゼ酵素受容体及び疎水性β−ガラクトシ
ダーゼ酵素供与体−分析物接合体並びに特異的結合対の
相補的な特異的結合対メンバーを含んで成るキットであ
って、前記特異的結合対が分析物及び前記相補的な特異
的メンバーを含んで成るキット。
【請求項１０】前記β−ガラクトシダーゼ酵素供与体−
分析物接合体及び前記相補的な特異的結合対メンバー
が、予備形成複合体として単一の容器中に存在する請求
項９記載のキット。