JPH06261787A - 光学活性β−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 医薬品の重要な中間体である光学活性β−ア
ミノ酸類の安価で工業的な製造法を提供する。 【構成】 ６−置換ジヒドロウラシル類に、ジヒドロウ
ラシル環を立体選択的に開裂加水分解する能力を有する
微生物に由来するジヒドロピリミジナーゼをｐＨ７〜１
０の水性媒体中で作用させ、立体異性体に富むＮ−カル
バモイル−β−アミノ酸類に変換し、この立体異性体を
採取することを特徴とする光学活性Ｎ−カルバモイル−
β−アミノ酸類の製造法、および該光学活性Ｎ−カルバ
モイル−β−アミノ酸類を脱カルバモイル化してβ−ア
ミノ酸類とすることを特徴とする光学活性β−アミノ酸
類の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、光学活性β−アミノ酸
類およびその誘導体の製造法に関する。

【０００２】β−アミノ酸類は、医薬、たとえばβ−ラ
クタム誘導体の重要な中間体である。

【０００３】

【従来の技術】光学活性β−アミノ酸類の製造法として
は、ラセミ体のメチルエステルを酒石酸で分割する方法
（テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒｓ）２７、２７８９、（１９７２））、
ラセミ体のベンジルオキシカルボニル体をキニンで光学
分割する方法（ビュレタン オブ ザ ケミカル ソサ
エティー オブ ジャパン（Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ． Ｊａｐａｎ）５２、３３２６（１９７
９））、公知のいわゆるアルント−アイステルト（Ａｒ
ｎｄｔ−Ｅｉｓｔｅｒｔ）合成によって対応するα−ア
ミノ酸を一炭素増炭する方法（ケミストリー レターズ
（Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ）１５１（１９７
３））、アセチル酢酸誘導体のフェネチルアミンシッフ
塩基を水素添加する方法（特開昭６０−１３９６５５号
公報）、クロトン酸誘導体にフェネチルアミンを付加さ
せる方法（ジャーナル オブ オーガニック ケミスト
リー（Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．）５７、２３９６
（１９９２））、３−ヒドロキシ酪酸から誘導する方法
（ヘルベティカ キミカ アクタ（Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉ
ｍ． Ａｃｔａ）７０、１３２６（１９８７））、Ｌ−
アスパラギンから誘導する方法（テトラヘドロンレター
ズ ３１、５７１７（１９９０）、ジャーナル オブ
オーガニック ケミストリー ５６、１３５５（１９９
１））、３−アミノアクリル酸誘導体を不斉なルテニウ
ム錯体で不斉還元する方法（テトラヘドロン アシンメ
トリー（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒ
ｙ）２、４６４（１９９１））などが知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】酒石酸またはキニンを
用いる光学分割法では、β−アミノ酸類を一たん誘導体
としたのち、酒石酸またはキニンで光学分割し、さらに
加水分解するため工業的に煩雑であり、操作的難点を有
している。つぎに、アルント−アイステルト合成を用い
る方法では、有毒で爆発性のジアゾメタンを使用すると
いった欠点がある。また、フェネチルアミンを用いる方
法は、フェネチルアミンが高価であり、満足すべき方法
とはいいがたい。さらに、３−ヒドロキシ酪酸およびＬ
−アスパラギンから誘導する方法は、数ステップの化学
反応よりなるために、多くの製造工程と煩雑な操作を必
要とする。また、不斉なルテニウム錯体は高価でかつ取
扱いが困難であるという難点がある。

【０００５】本発明者らは、光学活性β−アミノ酸類の
安価で工業的な製造法を開発すべく鋭意検討を重ねた結
果、６−置換ジヒドロウラシル類を原料として使用しジ
ヒドロピリミジナーゼによって光学分割するというきわ
めて効果的な製造法を見出し、本発明を完成した。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の要点は、次式で
表される。

【０００７】

【化５】

【０００８】（式中、Ｘは炭素数１〜４のアルキル基、
式

【０００９】

【化６】

【００１０】（式中、Ｒは水素、ヒドロキシル基もしく
は炭素数１〜４の低級アルコキシ基を示す）で表わされ
るフェニルもしくは置換フェニル基、チエニル基、フリ
ル基、ピリジル基、ナフチル基またはインドリル基を示
す）すなわち本発明は、一般式（Ｉ）：

【００１１】

【化７】

【００１２】（式中、Ｘは炭素数１〜４のアルキル基、
式

【００１３】

【化８】

【００１４】（式中、Ｒは水素、ヒドロキシル基もしく
は炭素数１〜４の低級アルコキシ基を示す）で表わされ
るフェニルもしくは置換フェニル基、チエニル基、フリ
ル基、ピリジル基、ナフチル基またはインドリル基を示
す）で表わされる６−置換ジヒドロウラシル類に、ジヒ
ドロウラシル環を立体選択的に開裂加水分解する能力を
有する微生物に由来するジヒドロピリミジナーゼ（Ｅ．
Ｃ．３．５．２．２、別名ヒダントイナーゼ）をｐＨ７
〜１０の水性媒体中で作用させ、式（II）：

【００１５】

【化９】

【００１６】（式中、Ｘは前記と同じ）で表わされる立
体異性体に富むＮ−カルバモイル−β−アミノ酸類に変
換し、この立体異性体を採取することを特徴とする光学
活性Ｎ−カルバモイル−β−アミノ酸類の製造法およ
び、式（II）で表わされる光学活性Ｎ−カルバモイル−
β−アミノ酸類を脱カルバモイル化して式（III ）

【００１７】

【化１０】

【００１８】（式中、Ｘは前記に同じ）で表わされるβ
−アミノ酸類とすることを特徴とする光学活性β−アミ
ノ酸類の製造法に関する。

【００１９】本発明の方法を用いることにより、安価な
微生物酵素を用いて６−置換ジヒドロウラシル類を基質
としてこれを変換して、光学活性なＮ−カルバモイル−
β−アミノ酸類をえることができる。さらに、Ｎ−カル
バモイル−β−アミノ酸類を鉱酸酸性水性媒体中、ジア
ゾ化処理して脱カルバモイル化することにより、高収率
で対応するβ−アミノ酸類に変換することができる。

【００２０】本反応で原料として用いられる６−置換ジ
ヒドロウラシル類は、通常は化学合成でえられるＤＬ体
を使用するのが適当である。たとえば、６−置換ジヒド
ロウラシルは、対応する６−置換ウラシルを還元する方
法（ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー
４９、５２５６（１９８４））や、アルデヒドとマロン
酸と尿素とを縮合する方法（イズベスティーアシビリス
オットデレニーアアカデミー ナウク （Ｉｚｕｖｅ
ｓｔ． Ｓｉｂｉｒ． Ｏｔｄｅｌ． Ａｋａｄ． Ｎ
ａｕｋ Ｓ．Ｓ．Ｓ．Ｒ）７、７２（１９６１））、尿
素と２−アルケン酸とを高温で縮合する方法（ジャーナ
ル オブ オーガニック ケミストリー ２６、１８７
７（１９６１））などによって、容易にかつ安価に合成
できる。

【００２１】ジヒドロピリミジナーゼ源となる微生物
は、６−置換ジヒドロウラシル類のジヒドロウラシル環
を立体選択的に開裂加水分解する能力を有するものであ
る。このような微生物は、自然界に存在する野生株、公
的な微生物保有機関に保存されている菌株、あるいはそ
れから人工的に変異誘導した微生物などから、前記能力
の有無を調べることによって選択されるものである。

【００２２】この能力の検出方法としては、たとえば次
のような方法が用いられる。まず微生物の培養液２ｍｌ
を遠心分離して菌体を集め、それを２ｍｌの０．９％
（重量％、以下同様）食塩水で洗浄後、再び遠心分離し
て菌体を集菌する。この分離した菌体（湿重量４０〜２
００ｍｇ）を濃度０．５％のＤＬ−６−メチル−ジヒド
ロウラシル水溶液２ｍｌに加えて、ｐＨ７〜１０、温度
４０〜８０℃に保って１０〜４０時間反応させる。反応
後、適宜希釈しｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドの
濃塩酸溶液を加えて発色させ、その液を遠心分離して菌
体などの不溶物を除き、ついで生成したＮ−カルバモイ
ル−β−アミノ酪酸をＨＰＬＣで測定して反応溶液中の
Ｎ−カルバモイル−β−アミノ酪酸生成量を求める。

【００２３】このようにして検出した結果、比較的高い
変換率を示した菌株については、実験規模を大きくし、
再度ＤＬ−６−メチル−ジヒドロウラシルの加水分解を
行ない、生成したＮ−カルバモイル−β−アミノ酪酸の
光学純度が高いと認められた菌体を本発明に使用する微
生物として採用する。

【００２４】本発明で使用する微生物は、細菌、放線
菌、かび、酵母および不完全菌の中から前記の検出法に
よって選ばれたものである。なかでも、光学収率および
６−置換ジヒドロウラシル類の変換率が高いことから、
バチルス属、シュードモナス属またはアルカリゲネス属
に由来する細菌が好適に使用できる。

【００２５】ここでいうジヒドロピリミジナーゼの立体
選択性は、６−置換ジヒドロウラシル類の６位の不斉炭
素における立体異性体（Ｒ体、Ｓ体）の一方に選択的に
作用することである。その選択性は、酵素源である微生
物によって、また基質の種類によって異なり、きわめて
選択性の厳密なものから、立体異性体により反応速度差
があるといった程度のものまで含んでいる。この点につ
いては、前記の能力検出法によって、いずれの立体異性
体に対してどの程度の選択性があるかを確め、目的に応
じて各々のＤ−β−アミノ酸に使用することができる。

【００２６】本発明の方法は、微生物の産生するジヒド
ロピリミナーゼの作用を利用するものであるが、この酵
素は天然栄養源を含有する通常の培地中で微生物を培養
することによって菌体内に生成蓄積させることができ
る。培養は、通常液体培地で行なわれるが、固体表面培
養によっても行なうことができる。培養は、通常資化し
うる炭素源、窒素源および各微生物の生育に必要な無機
塩ならびに栄養素とを含有させるが、さらに各種のピリ
ミジン系核酸塩基類またはそれらの誘導体、あるいは各
種ヒダトイン類を０．０５〜０．８％添加して所望のジ
ヒドロピリミジナーゼを適応的に増強させることが望ま
しい。ジヒドロピリミジナーゼ誘導効果の高いピリミジ
ン系核酸塩基類としては、ウラシル、シトシンおよびチ
ミンがあり、それらの誘導体としては、ジヒドロウラシ
ル、ジヒドロチミンなどがある。またヒダントイン類の
なかでは、ヒダントイン、ＤＬ−５−メチルヒダントイ
ンなどが望ましい。しかし多くの微生物に共通して、実
用的に好ましいのは、ウラシルである。培養条件は、使
用する微生物の至適生育条件に応じて温度２０〜６５
℃、ｐＨ４〜１１、培養時間数時間〜数日間の範囲が用
いられる。培養中には通気撹拌を行なって微生物の生育
を促進させることもできる。

【００２７】６−置換ジヒドロウラシル類の加水分解に
用いられるジヒドロピリミジナーゼは、前記のようにし
て培養した微生物を培養物、菌体または菌体処理物の形
態で使用する。通常、微生物の培養物をそのまま反応に
使用することができるが、培養物中の成分が障害になる
ばあいには、培養物から分離した菌体を使用すればよ
い。菌体は、生菌体のままでも使用目的を達するが、貯
蔵あるいは取扱いの便宜から凍結乾燥菌体として用いる
こともできる。また菌体そのものでなく、菌体破砕物や
菌体抽出物のような菌体処理物の状態で使用することも
可能である。さらに、前記の菌体または菌体処理物を公
知の方法で固定化したものも使用することができる。ま
た、微生物に由来するジヒドロピリミジナーゼを通常用
いられる方法で精製しても使用することができるのはも
ちろんのことである。

【００２８】６−置換ジヒドロウラシル類に微生物の培
養物、菌体または菌体処理物などの形態でジヒドロピリ
ミジナーゼを作用させるには、通常水性媒体中で両者を
混合する方法が用いられる。ジヒドロピリミジナーゼ量
は、基質の種類により適宜選べばよく特に制限はない。

【００２９】６−置換ジヒドロウラシル類の水性媒体中
での濃度については、とくに制限はない。１〜３０％程
度の高濃度では、６−置換ジヒドロウラシル類は完全に
溶解しないものの、反応の進行にともなって６−置換ジ
ヒドロウラシル類が遂次溶解していくので支障にならな
い。

【００３０】水性媒体中で６−置換ジヒドロウラシル類
の立体選択的加水分解を行なう際に、実用上好ましいｐ
Ｈの範囲は、７〜１０であり、とくに好ましいのは８〜
９である。ジヒドロピリミジナーゼ活性の高い微生物を
使用して、このような条件で反応を行なえば、好収率で
目的物をえることができる。ｐＨ７未満では反応速度は
きわめて小さく、ｐＨ１０をこえると好ましくない副生
成物を生じるので、いずれも実用性には乏しい。ｐＨ７
〜１０が好ましい理由としては、本発明で利用される微
生物酵素であるジヒドロピリミジナーゼの至適ｐＨが８
〜９にあること、ならびにｐＨが増すにつれて基質の溶
解度が増すことによって、結果的に６−置換ジヒドロウ
ラシル類からＮ−カルバモイル−β−アミノ酸類への変
換速度が増大することにある。

【００３１】なお、反応の進行にともなって水性媒体の
ｐＨが低下するので、反応中、継続的に中和剤を添加し
て至適ｐＨに保持することが望ましい。中和剤として
は、アンモニア、苛性ソーダ、苛性カリ、炭酸ソーダな
どが適当である。その他、目的に応じて水性媒体に有機
溶媒や界面活性剤を添加して反応を行なわせることもで
きる。

【００３２】反応温度は、使用する微生物の酵素に適し
た温度が採用されるが、通常２０〜７０℃の範囲内にあ
る。反応時間は基質の種類、濃度、酵素の種類、濃度、
温度など反応条件により異なるので、目的とする立体異
性体に対応する基質が充分変換されるよう選ぶ。通常数
分〜数日間である。

【００３３】生成したＮ−カルバモイル−β−アミノ酸
類と未反応の６−置換ジヒドロウラシル類の分離は、容
易である。すなわち、６−置換ジヒドロウラシル類の水
に対する溶解度が低いため、反応溶液を冷却することに
より固体として析出してきた未反応の６−置換ジヒドロ
ウラシル類を濾別すればよい。さらに、必要に応じてイ
オン交換カラムや逆層のカラムを用いて精製してもよ
い。

【００３４】Ｎ−カルバモイル−β−アミノ酸類を立体
配置を保ちつつ脱カルバモイル化してβ−アミノ酸類に
変換するには、たとえば鉱酸酸性水性媒体中、亜硝酸塩
を作用させてジアゾ化処理する、いわゆるバンスライク
（ＶａｎＳｌｙｋｅ）法を基礎原理とする方法による。
この方法は、α−アミノ酸についてはたとえば特公昭５
８−４７０７号公報に記載されている。

【００３５】この脱カルバモイル化反応は、水性媒体中
で酸性下Ｎ−カルバモイル−β−アミノ酸類に亜硝酸塩
を反応させて達成することができる。これによると、Ｎ
−カルバモイル−β−アミノ酸類の光学活性は保持さ
れ、光学活性β−アミノ酸類をえることができる。

【００３６】鉱酸酸性水性媒体としては、０．４規定以
上の塩酸や硫酸などの強鉱酸、とくに副反応を避けるた
めに、硫酸が存在する水性媒体が望ましい。亜硝酸塩と
しては、安価に入手できることから、アルカリ金属また
はアルカリ土類金属の亜硝酸塩が好適に用いられる。亜
硝酸塩は、Ｎ−カルバモイル−β−アミノ酸類に対し
て、ほぼ当量作用させればよく、これによって高収率で
対応するβ−アミノ酸類に導くことができる。脱カルバ
モイル化反応は、多量の発熱をともなうため、亜硝酸塩
を徐々に添加するのが好ましく、温度は通常０〜４０℃
の範囲で行なわれる。反応は、チッ素ガスと炭酸ガスを
発生するが、亜硝酸塩の全量を加え終ったのち、１５分
〜数時間でガスの発生が終る。その後３０分〜１５時間
ほどのち反応させる。

【００３７】生成した光学活性β−アミノ酸類の単離
は、容易である。すなわち、反応溶液を濃縮し、冷却す
ることにより再結晶すればよい。さらに、必要に応じて
イオン交換カラムや逆層のカラムを用いて精製してもよ
い。

【００３８】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明をさらに詳しく
説明する。

【００３９】実施例１ ジャーナル オブ ファーメンテイション テクノロジ
ー（Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｔｅｃｈ．）５６、４９
２（１９７８）記載の方法にしたがってシュードモナス
・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）Ｉ
ＦＯ １２９９６（旧名 シュードモナス・ストリアー
タ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒｉａｔａ）ＩＦＯ
１２９９６）より精製したジヒドロピリミジナーゼ
（ヒダントイナーゼ）５０ｍｇにイオン交換水１００ｍ
ｌを加え、チッ素通気下、撹拌しながらＤＬ−６−メチ
ルジヒドロウラシル５００ｍｇを加え、３７℃で８時間
反応させた。反応中、１．０Ｎ−ＮａＯＨ溶液を用いて
反応液のｐＨを８．７に継続的に調節した。

【００４０】反応後、反応液を１０ｍｌに濃縮し、ＤＥ
ＡＥセファデクス Ａ−２５（ＨＣＯ₃ 型、３０×１０
０ｍｍ）（ファルマシア・バイオテク製）に吸着させ
た。蒸留水３００ｍｌで溶出して、溶出液を濃縮するこ
とにより未反応の６−メチルジヒドロウラシル３００ｍ
ｇをえたのち、さらに０．２Ｍの重炭酸アンモニウム溶
液５００ｍｌで溶出し、溶出液を濃縮することにより液
中の重炭酸アンモニウムを分解除去して２３４ｍｇのＮ
−カルバモイル−β−アミノ酪酸をえた。収率は４１％
であった。

【００４１】２３４ｍｇのＮ−カルバモイル−β−アミ
ノ酪酸に１Ｍの硫酸水溶液５ｍｌを加え、０℃に冷却し
た。この水溶液に、撹拌しながら１０７ｍｇの亜硝酸ナ
トリウムを加えて２時間脱カルバモイル化反応を行なっ
た。反応液をＤＯＷＥＸ ５０ＷＸ８（１０×１００ｍ
ｍ）（ザ・ダウケミカル・カンパニー製）に吸着させ、
蒸留水３０ｍｌで溶出して、溶出液のｐＨが中性になっ
ていることを確認したのち、さらに１．５Ｍの水酸化ア
ンモニウム溶液５０ｍｌで溶出し、溶出液を濃縮するこ
とにより（Ｓ）−β−アミノ酪酸の結晶１３０ｍｇをえ
た。Ｎ−カルバモイル−β−アミノ酪酸からの収率は８
０％であった。えられた（Ｓ）−β−アミノ酪酸は
［α］_D ²⁰＝＋１８．７゜（Ｈ₂ Ｏ、ｃ＝１．０）、５
３％ｅｅであった（文献値［α］_D ²⁰＝−３５．２゜
（（Ｒ）体）、ジャーナル オブ ケミカル ソサエテ
ィー （Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．）３３１６（１９
５２））。光学異性体分離カラムクロマトグラフィーに
より分析（カラム：ダイセル クラウンパックＣＲ
（＋）、４．０×１５０ｍｍ（ダイセル化学工業（株）
製）、移動相：ｐＨ１．５リン酸水溶液、検出波長：２
３０ｎｍ、温度：２．５℃、移動相流量：０．４ｍｌ／
ｍｉｎ、（Ｓ）体の保持時間５．８分、（Ｒ）体の保持
時間：６．８分）したところ、５６％ｅｅであった。

【００４２】実施例２ 下記の組成からなる液体培地を調製し、５００ｍｌ容肩
付振盪フラスコに１００ｍｌずつ分注し、１２０℃で２
０分間蒸気殺菌を行なった。

【００４３】培地組成： 肉エキス ０．５％ ペプトン １．０％ 酵母エキス ０．５％ ＮａＣｌ ０．１５ ウラシル ０．１％ ｐＨ ７．０ これに綿栓をした大型試験管にて同一組成培地１０ｍｌ
で３３℃にて２４時間培養したバチルス・スピーシーズ
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）ＫＮＫ１０８
（ＦＥＲＭ ＢＰ−８８７）を１．０ｍｌ接種し、３３
℃で２４時間振盪培養した。この培養液１００ｍｌを遠
心分離して集菌し、０．９％食塩水１００ｍｌで洗浄し
たのち再び遠心分離して集菌し、０．９％食塩水１００
ｍｌに懸濁した。この懸濁液に、アクリルアミド１．５
ｇとＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド８０ｍｇを
加えて溶解させ、チッ素ガスを通じて酸素を追い出した
のち、５％β−ジメチルアミノプロピオニトリル１ｍｌ
と０．００５％リボフラビン１ｍｌを加えて、室温で蛍
光灯下に放置した。１時間後、生成した菌体包有ゲルを
３ｍｍ角程度に切断し、０．９％生理食塩水で洗浄し、
ゲル固定化物を調製した。この固定化物５００ｍｇを２
００ｍｌスピナーフラスコに入れ、イオン交換水１００
ｍｌを加え、チッ素通気下、撹拌しながらＤＬ−６−メ
チルジヒドロウラシル５００ｍｇを加え、３７℃で４０
時間反応させた。反応中、１．０Ｎ−ＮａＯＨ溶液を用
いて反応液のｐＨを８．７に継続的に調製した。

【００４４】反応後、実施例１と同様に処理して、２２
８ｍｇのＮ−カルバモイル−β−アミノ酪酸をえた。収
率は４０％であった。

【００４５】さらに、実施例１と同様に脱カルバモイル
化反応を行ない、精製して（Ｒ）−β−アミノ酪酸１２
８ｍｇをえた。Ｎ−カルバモイル−β−アミノ酪酸から
の収率は８０％であった。えられた（Ｒ）−β−アミノ
酪酸は［α］_D ²⁰＝−３０．０゜（Ｈ₂ Ｏ、ｃ＝１．
０）、８５％ｅｅであった。実施例１と同様の光学異性
体分離カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによ
り分析したところ、８７％ｅｅであった。

【００４６】実施例３ 実施例２とまったく同様にして調製した、固定化物２０
０ｍｇを２００ｍｌスピナーフラスコに入れ、イオン交
換水５０ｍｌを加え、チッ素通気下、撹拌しながらＤＬ
−６−メチルジヒドロウラシル２００ｍｇを加え、３７
℃で８時間反応させた。反応中、１．０Ｎ−ＮａＯＨ溶
液を用いて反応液のｐＨを８．７に継続的に調節した。
反応後、実施例１と同様に処理して、２０ｍｇのＮ−カ
ルバモイル−β−アミノ酪酸をえた。収率は９％であっ
た。

【００４７】さらに、実施例１と同様に脱カルバモイル
化反応を行ない、精製して（Ｒ）−β−アミノ酪酸１３
ｍｇをえた。Ｎ−カルバモイル−β−アミノ酪酸からの
収率は９２％であった。えられた（Ｒ）−β−アミノ酪
酸は［α］_D ²⁰＝−３１．７゜（Ｈ₂ Ｏ、ｃ＝１．
０）、９０％ｅｅであった。実施例１と同様の光学異性
体分離カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによ
り分析したところ、９１％ｅｅであった。

【００４８】実施例４ 実施例２と全く同様にして調製した、固定化物２００ｍ
ｇを２００ｍｌスピナーフラスコに入れ、イオン交換水
１００ｍｌを加え、チッ素通気下、撹拌しながらＤＬ−
６−メチルジヒドロウラシル２００ｍｇを加え、５０℃
で２０時間反応させた。反応中、１．０Ｎ−ＮａＯＨ溶
液を用いて反応液のｐＨを８．７に継続的に調節した。
反応後、実施例１と同様に処理して、９０ｍｇのＮ−カ
ルバモイル−β−アミノ酪酸をえた。収率は３２％であ
った。

【００４９】さらに、実施例１と同様に脱カルバモイル
化反応を行ない、精製して（Ｒ）−β−アミノ酪酸５２
ｍｇをえた。Ｎ−カルバモイル−β−アミノ酪酸からの
収率は８２％であった。えられた（Ｒ）−β−アミノ酪
酸は［α］_D ²⁰＝−３０．０゜（Ｈ₂ Ｏ、ｃ＝１．
０）、８５％ｅｅであった。実施例１と同様の光学異性
体分離カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによ
り分析したところ、８６％ｅｅであった。

【００５０】実施例５ 下記の組成からなる液体培地を調製し、大型試験管に１
００ｍｌずつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を
行なった。

【００５１】培地組成： 肉エキス ２．０％ プロエキス ２．０％ ＮａＣｌ ０．３％ ＭｎＣｌ₂ ・４Ｈ₂ Ｏ ２０ ｐｐｍ ウラシル ０．２％ ｐＨ ７．５ これに綿栓をした大型試験管にて同一組成培地１０ｍｌ
で３７℃にて１８時間培養したアルカリゲネス・ファエ
カリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）
ＩＦＯ １３１１１を１．０ｍｌ接種し、３７℃で２４
時間振盪培養を行なった。

【００５２】この培養液を遠心分離して集菌し、０．９
％食塩水１００ｍｌで洗浄したのち再び遠心分離して集
菌し、５０ｍＭの燐酸カリウム緩衝液１５０ｍｌに懸濁
した。この懸濁液５０ｍｌを２００ｍｌ容四ツ口丸底フ
ラスコに入れ、チッ素通気下、撹拌しながらＤＬ−６−
メチルジヒドロウラシル３００ｍｇを加え、３７℃で２
０時間反応させた。反応中、１．０Ｎ−ＮａＯＨ溶液を
用いて反応液のｐＨを８．７に継続的に調製した。反応
後、ＩＮ ＨＣｌを用いて反応液のｐＨを７．０に調節
し、反応液を遠心分離して未反応の出発物質や菌体など
の不溶物を除去した。さらに、実施例１と同様に処理し
て、１６０ｍｇのＮ−カルバモイル−β−アミノ酪酸を
えた。収率は４７％であった。

【００５３】さらに、実施例１と同様に脱カルバモイル
化反応を行ない、精製して（Ｓ）−β−アミノ酪酸１１
０ｍｇをえた。Ｎ−カルバモイル−β−アミノ酪酸から
の収率は９７％であった。えられた（Ｓ）−β−アミノ
酪酸は［α］_D ²⁰＝＋２２．８゜（Ｈ₂ Ｏ、ｃ＝１．
０）、６５％ｅｅであった。実施例１と同様の光学異性
体分離カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによ
り分析したところ、６７％ｅｅであった。

【００５４】実施例６ 下記の組成からなる液体培地を調製し、大型試験管に１
０００ｍｌずつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌
を行なった。

【００５５】培地組成： 肉エキス ３．０％ グルコース １．０％ ＭｎＣｌ₂ ・４Ｈ₂ Ｏ ２０ ｐｐｍ ウラシル ０．２％ ｐＨ ７．５ これに綿栓をした大型試験管にて同一組成培地１０ｍｌ
で３０℃にて１８時間培養したシュードモナス・プチダ
ＩＦＯ １２９９６を１．０ｍｌ接種し、３０℃で２
４時間振盪培養を行なった。

【００５６】この培養液を遠心分離して集菌し、０．９
％食塩水１００ｍｌで洗浄したのち再び遠心分離して集
菌し、５０ｍＭの燐酸カリウム緩衝液１５０ｍｌに懸濁
した。この懸濁液５０ｍｌを２００ｍｌ容四ツ口丸底フ
ラスコに入れ、チッ素通気下、撹拌しながらＤＬ−６−
メチルジヒドロウラシル３００ｍｇを加え、３７℃で２
０時間反応させた。反応中、１．０Ｎ−ＮａＯＨ溶液を
用いて反応液のｐＨを８．７に継続的に調製した。反応
後、ＩＮ ＨＣｌを用いて反応液のｐＨを７．０に調節
し、反応液を遠心分離して未反応の出発物質や菌体など
の不溶物を除去した。さらに、実施例１と同様に処理し
て、１５０ｍｇのＮ−カルバモイル−β−アミノ酪酸を
えた。収率は４５％であった。

【００５７】さらに、実施例１と同様に脱カルバモイル
化反応を行ない、精製して（Ｓ）−β−アミノ酪酸１０
５ｍｇをえた。Ｎ−カルバモイル−β−アミノ酪酸から
の収率は９９％であった。えられた（Ｓ）−β−アミノ
酪酸は［α］_D ²⁰＝＋１８．０゜（Ｈ₂ Ｏ、ｃ＝１．
０）、５１％ｅｅであった。実施例１と同様の光学異性
体分離カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによ
り分析したところ、５４％ｅｅであった。

【００５８】実施例７ 実施例２とまったく同様にして調製した、固定化物３０
０ｍｇを２００ｍｌスピナーフラスコに入れ、イオン交
換水１００ｍｌを加え、チッ素通気下、撹拌しながらＤ
Ｌ−６−フェニルジヒドロウラシル３００ｍｇを加え、
３７℃で１５０時間反応させた。反応中、１．０Ｎ−Ｎ
ａＯＨ溶液を用いて反応液のｐＨを８．７に継続的に調
節した。反応後、実施例１と同様に処理して、４０ｍｇ
のＮ−カルバモイル−３−アミノ−３−フェニルプロピ
オン酸をえた。収率は１２％であった。

【００５９】さらに実施例１と同様に脱カルバモイル化
反応を行ない、精製して（Ｓ）−３−アミノ−３−フェ
ニルプロピオン酸３０ｍｇをえた。Ｎ−カルバモイル−
３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸からの収率は９
５％であった。えられた（Ｓ）−３−アミノ−３−フェ
ニルプロピオン酸は［α］_D ²⁵＝−３．３６゜（Ｈ
_２Ｏ、ｃ＝０．２）、４８％ｅｅであった（文献値
［α］_Ｄ ^２５＝＋７．０゜（（Ｒ）体）、ジャーナル
オブ ケミカル ソサエティー ４０４７（１９６
１））。光学異性体分離カラムを用いた高速液体クロマ
トグラフィーにより分析（カラム：ダイセル キラルセ
ルＷＨ、４．６×２５０ｍｍ（ダイセル化学工業（株）
製）、移動相：０．２５ｍＭ 硫酸銅水溶液、検出波
長：２３０ｎｍ、温度：３０℃、移動相流量：１．５ｍ
ｌ／ｍｉｎ、（Ｓ）体の保持時間２１分、（Ｒ）体の保
持時間：３２分）したところ、５１％ｅｅであった。

【００６０】実施例８ 実施例６とまったく同様の方法でシュードモナス・プチ
ダ ＩＦＯ １２９９６を培養することによってえた懸
濁液４０ｍｌをフラスコに入れ、チッ素通気下、撹拌し
ながらＤＬ−６−フェニルジヒドロウラシル２００ｍｇ
を加え、３７℃で１５０時間反応させた。反応中、１．
０Ｎ−ＮａＯＨ溶液を用いて反応液のｐＨを８．７に継
続的に調節した。反応後、実施例１と同様に処理して、
４８ｍｇのＮ−カルバモイル−３−アミノ−３−フェニ
ルプロピオン酸をえた。収率は２２％であった。

【００６１】さらに、実施例１と同様に脱カルバモイル
化反応を行ない、精製して（Ｓ）−３−アミノ−３−フ
ェニルプロピオン酸３５ｍｇをえた。Ｎ−カルバモイル
−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸からの収率は
９１％であった。えられた（Ｓ）−３−アミノ−３−フ
ェニルプロピオン酸は［α］_D ²⁰＝−３．０゜（Ｈ
₂Ｏ、ｃ＝０．２）、４３％ｅｅであった。実施例７と
同様の光学異性体分離カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィーにより分析したところ、４４％ｅｅであっ
た。

【００６２】参考例 ６−（ｐ−メトキシフェニル）ジヒドロウラシルの合成 氷酢酸１０ｍｌにｐ−アニスアルデヒド６．４ｇ、マロ
ン酸７．４ｇ、尿素７．１ｇを溶解し、撹拌しながら１
２０℃で７時間反応した。反応溶液に、２００ｍｌの蒸
留水を加え激しく撹拌し、生成した白色固体を濾取し、
水洗後乾燥した。さらに、エタノール：水＝９：１であ
る混合溶媒３００ｍｌより再結晶することにより６−
（ｐ−メトキシフェニル）ジヒドロウラシル２．９ｇを
えた。

【００６３】収率は３１％、ｍｐは２２８〜２２９℃で
あった。

【００６４】¹ＨＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ₆ δ） １
０．１（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．９（ｂｒｓ、１Ｈ）、
７．２（ｄ、２Ｈ）、６．９（ｄ、２Ｈ）、４．６
（ｍ、１Ｈ）、３．８（ｓ、３Ｈ）、２．８（ｄｄ、１
Ｈ）、２．６（ｄｄ、１Ｈ） 実施例９ 実施例２とまったく同様にして調製した、固定化物３０
０ｍｇを２００ｍｌスピナーフラスコに入れ、イオン交
換水１００ｍｌを加え、チッ素通気下、撹拌しながらＤ
Ｌ−６−（ｐ−メトキシフェニル）ジヒドロウラシル３
００ｍｇを加え、３７℃で１５０時間反応させた。反応
中、１．０Ｎ−ＮａＯＨ溶液を用いて反応液のｐＨを
８．７に継続的に調節した。反応後、実施例１と同様に
処理して、４０ｍｇのＮ−カルバモイル−３−アミノ−
３−（ｐ−メトキシフェニル）プロピオン酸をえた。収
率は１２％であった。

【００６５】さらに、実施例１と同様に脱カルバモイル
化反応を行ない、精製して（Ｓ）−３−アミノ−３−
（ｐ−メトキシフェニル）プロピオン酸３０ｍｇをえ
た。Ｎ−カルバモイル−３−アミノ−３−（ｐ−メトキ
シフェニル）プロピオン酸からの収率は９５％であっ
た。えられた（Ｓ）−３−アミノ−３−（ｐ−メトキシ
フェニル）プロピオン酸のＮ−ＣＨＯ体は［α］_D ²⁰＝
＋６４．８゜（ＭｅＯＨ、Ｃ＝０．２）、４８％ｅｅで
あった（文献値［α］_D ²⁰＝−１３５．０゜（（Ｒ）
体）ジャーナル オブ オーガニック ケミストリー
５６、１３５５（１９９１）。光学異性体分離カラムを
用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析（カラ
ム：ダイセル キラルセルＷＨ、４．６×２５０ｍｍ、
移動相：０．２５ｍＭ 硫酸銅水溶液、検出波長：２３
０ｎｍ、温度：３０℃、移動相流量：１．５ｍｌ／ｍｉ
ｎ、（Ｓ）体の保持時間１１分、（Ｒ）体の保持時間：
１７分）したところ、５０％ｅｅであった。

【００６６】実施例１０ 実施例２とまったく同様にして調製した、固定化物２０
０ｍｇを２００ｍｌスピナーフラスコに入れ、イオン交
換水１００ｍｌを加え、チッ素通気下、撹拌しながらＤ
Ｌ−６−（２−チエニル）ジヒドロウラシル２００ｍｇ
を加え、４５℃で４８時間反応させた。反応中、１．０
Ｎ−ＮａＯＨ溶液を用いて反応液のｐＨを８．７に継続
的に調節した。反応後、実施例１と同様に処理して、１
００ｍｇのＮ−カルバモイル−３−アミノ−３−（２−
チエニル）プロピオン酸をえた。収率は２４％であっ
た。

【００６７】さらに、実施例１と同様に脱カルバモイル
化反応を行ない、精製して（Ｓ）−３−アミノ−３−
（２−チエニル）プロピオン酸３０ｍｇをえた。Ｎ−カ
ルバモイル−３−アミノ−３−（２−チエニル）プロピ
オン酸からの収率は１００％であった。えられた（Ｓ）
−３−アミノ−３−（２−チエニル）プロピオン酸は
［α］_D ²⁰＝＋１３．２゜（Ｈ₂ Ｏ、ｃ＝１．０）、８
６％ｅｅであった（文献値［α］_D ²⁰＝＋１５．３゜
（（Ｓ）体）、ビュレタン オブ ケミカル ソサエテ
ィー オブ ジャパン ５２、３３２６（１９７
９））。光学異性体分離カラムを用いた高速クロマトグ
ラフィーにより分析（カラム：ダイセル キラルセルＷ
Ｈ、４．６×２５０ｍｍ、移動相：０．２５ｍＭ 硫酸
銅水溶液、検出波長：２３０ｎｍ、温度：２０℃、移動
相流量：１．５ｍｌ／ｍｉｎ、（Ｓ）体の保持時間：１
２分、（Ｒ）体の保持時間：２６分）したところ、８７
％ｅｅであった。

【００６８】実施例１１ 実施例２とまったく同様にして調製した、固定化物３０
０ｍｇを２００ｍｌスピナーフラスコに入れ、イオン交
換水１００ｍｌを加え、チッ素通気下、撹拌しながらＤ
Ｌ−６−エチルジヒドロウラシル３００ｍｇを加え、４
５℃で４８時間反応させた。反応中、１．０Ｎ−ＮａＯ
Ｈ溶液を用いて反応液のｐＨを８．７に継続的に調節し
た。反応後、実施例１と同様に処理して、１１７ｍｇの
Ｎ−カルバモイル−３−アミノ吉草酸をえた。収率は３
５％であった。

【００６９】さらに、実施例１と同様に脱カルバモイル
化反応を行ない、精製して（Ｒ）−３−アミノ吉草酸３
０ｍｇをえた。Ｎ−カルバモイル−３−アミノ吉草酸か
らの収率は９０％であった。えられた（Ｒ）−３−アミ
ノ吉草酸は［α］_D ²⁰＝−３５．０゜（Ｈ₂ Ｏ、ｃ＝
１．０）、９１％ｅｅであった（文献値［α］_D ²⁰＝＋
３８．５゜（（Ｓ）体）、ガゼッタ キミカ イタリア
ーナ（Ｇａｚｚ． Ｃｈｉｍ． Ｉｔａｌ．）９６、１
３８０（１９６６））。光学異性体分離カラムクロマト
グラフィーにより分析（カラム：ダイセル クラウンパ
ックＣＲ（＋）、４．０×１５０ｍｍ、移動相：ｐＨ
１．５リン酸水溶液、検出波長：２３０ｎｍ、温度：
２．５℃、移動相流量：０．４ｍｌ／ｍｉｎ、（Ｒ）体
の保持時間：３．７分、（Ｓ）体の保持時間：４．９
分）したところ、９３％ｅｅであった。

【００７０】

【発明の効果】本発明によれば、一般式（Ｉ）

【００７１】

【化１１】

【００７２】（式中、Ｘは炭素数１〜４のアルキル基、
式

【００７３】

【化１２】

【００７４】（式中、Ｒは水素、ヒドロキシル基もしく
は炭素数１〜４の低級アルコキシ基を示す）で表わされ
るフェニルもしくは置換フェニル基、チエニル基、フリ
ル基、ピリジル基、ナフチル基またはインドリル基を示
す）で表わされる６−置換ジヒドロウラシル類に、ジヒ
ドロウラシル環を立体選択的に開裂加水分解する能力を
有する微生物に由来するジヒドロピリミジナーゼを作用
させ加水分解することによって分割して光学活性なＮ−
カルバモイル−β−アミノ酸類に変換し、さらにこの光
学活性なＮ−カルバモイル−β−アミノ酸類を脱カルバ
モイル化して式（III ）

【００７５】

【化１３】

【００７６】（式中、Ｘは前記と同じ）で表わされる光
学活性なβ−アミノ酸類を製造する、立体選択的な方法
を提供することができる。したがって、本発明は、医薬
品の重要な中間体であるβ−アミノ酸類の製造にきわめ
て有効な方法を提供するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:05） (72)発明者 長谷川 淳三 兵庫県明石市大久保町高丘２丁目13−４

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｘは炭素数１〜４のアルキル基、式 【化２】 （式中、Ｒは水素、ヒドロキシル基もしくは炭素数１〜
   ４の低級アルコキシ基を示す）で表わされるフェニルも
   しくは置換フェニル基、チエニル基、フリル基、ピリジ
   ル基、ナフチル基またはインドリル基を示す）で表わさ
   れる６−置換ジヒドロウラシル類に、ジヒドロウラシル
   環を立体選択的に開裂加水分解する能力を有する微生物
   に由来するジヒドロピリミジナーゼをｐＨ７〜１０の水
   性媒体中で作用させ、式（II）： 【化３】 （式中、Ｘは前記と同じ）で表わされる立体異性体に富
   むＮ−カルバモイル−β−アミノ酸類に変換し、この立
   体異性体を採取することを特徴とする光学活性Ｎ−カル
   バモイル−β−アミノ酸類の製造法。
2. 【請求項２】 微生物に由来するジヒドロピリミジナー
   ゼとして、微生物の培養物、菌体または菌体処理物を使
   用する請求項１記載の製造法。
3. 【請求項３】 微生物として、バチルス属、シュードモ
   ナス属またはアルカリゲネス属の細菌を使用する請求項
   １または２記載の製造法。
4. 【請求項４】 ｐＨを８〜９に保ちながら作用させる請
   求項１、２または３記載の製造法。
5. 【請求項５】 請求項１でえた光学活性Ｎ−カルバモイ
   ル−β−アミノ酸類を立体配置を保持しつつ脱カルバモ
   イル化して式（III ） 【化４】 （式中、Ｘは前記に同じ）で表わされるβ−アミノ酸類
   とすることを特徴とする光学活性β−アミノ酸類の製造
   法。
6. 【請求項６】 鉱酸酸性水性媒体中、亜硝酸塩を使用す
   ることによってジアゾ化処理し、脱カルバモイル化する
   請求項５記載の製造法。