JPH0669370B2 - モノクローナル抗ウシラクトフェリン抗体産生ハイブリドーマの製造法 - Google Patents
モノクローナル抗ウシラクトフェリン抗体産生ハイブリドーマの製造法Info
- Publication number
- JPH0669370B2 JPH0669370B2 JP59145667A JP14566784A JPH0669370B2 JP H0669370 B2 JPH0669370 B2 JP H0669370B2 JP 59145667 A JP59145667 A JP 59145667A JP 14566784 A JP14566784 A JP 14566784A JP H0669370 B2 JPH0669370 B2 JP H0669370B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bovine lactoferrin
- producing
- lactoferrin
- hybridoma
- bovine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、モノクローナル抗ウシラクトフエリン抗体を
産生するハイブリドーマの製造法に関する。
産生するハイブリドーマの製造法に関する。
ラクトフエリンは乳汁などの外分泌液中に存在する鉄結
合生蛋白質であつて、乳児の授乳において栄養的に著し
く有益であるばかりでなく、その鉄結合能の特性のため
腸管における鉄要求性の高い病原性細菌に対して強い静
菌作用を呈するという生理的効果を有するものである。
すなわち、ラクトフエリンは、乳汁に存在する免疫グロ
ブリンやリゾチームなどと共に感染防禦物質として栄養
学的のみならず、薬理学的にも重要な乳蛋白質といえ
る。
合生蛋白質であつて、乳児の授乳において栄養的に著し
く有益であるばかりでなく、その鉄結合能の特性のため
腸管における鉄要求性の高い病原性細菌に対して強い静
菌作用を呈するという生理的効果を有するものである。
すなわち、ラクトフエリンは、乳汁に存在する免疫グロ
ブリンやリゾチームなどと共に感染防禦物質として栄養
学的のみならず、薬理学的にも重要な乳蛋白質といえ
る。
従来技術 上述したようなラクトフエリンの特性に鑑み、従来より
乳からラクトフエリンを分離、精製するための方法が種
々提案されている。しかしながら、ラクトフエリンは非
常に反応性に富んだ分子構造を有する蛋白質であり、か
つ他の乳蛋白質とも相互作用を示すため、従来の方法で
は純度の高いラクトフエリンを簡易にかつ有効に分離精
製して採取することは困難であつた。
乳からラクトフエリンを分離、精製するための方法が種
々提案されている。しかしながら、ラクトフエリンは非
常に反応性に富んだ分子構造を有する蛋白質であり、か
つ他の乳蛋白質とも相互作用を示すため、従来の方法で
は純度の高いラクトフエリンを簡易にかつ有効に分離精
製して採取することは困難であつた。
例えば、従来、乳から脂肪を分離した脱脂乳よりpH4.6
でカゼインを等電沈澱させることにより除去し、ついで
得られる乳清画分を硫酸アンモニウムで塩析した画分を
純水に対して透析した後、イオン交換樹脂に数回通して
分離、精製する方法（Gordon et al.:「Biochim.Biophy
s.Acta,60,410〜411,1962」及びMerton L.Glove et a
l.:「Biochim.Biophys.Acta,100,154〜162,1965」また
はJohansson,B.G.et al.:「Acta Chem.Scand.23,683,19
69」）や上記方法においてイオン交換樹脂の代りにシリ
カ粒子を用いる方法（特開昭58-28233号）及び上述のよ
うにイオン交換樹脂を通した後に、更に銅アフイニテイ
−クロマトグラフイ−処理を行なう方法（河方則裕、吉
野芳夫等「生化学会講演予稿集、第1053頁、1983」）が
行なわれているが、これらの方法は、いずれも操作が煩
雑で、処理に要する時間も長いため実用性に乏しいとい
える。
でカゼインを等電沈澱させることにより除去し、ついで
得られる乳清画分を硫酸アンモニウムで塩析した画分を
純水に対して透析した後、イオン交換樹脂に数回通して
分離、精製する方法（Gordon et al.:「Biochim.Biophy
s.Acta,60,410〜411,1962」及びMerton L.Glove et a
l.:「Biochim.Biophys.Acta,100,154〜162,1965」また
はJohansson,B.G.et al.:「Acta Chem.Scand.23,683,19
69」）や上記方法においてイオン交換樹脂の代りにシリ
カ粒子を用いる方法（特開昭58-28233号）及び上述のよ
うにイオン交換樹脂を通した後に、更に銅アフイニテイ
−クロマトグラフイ−処理を行なう方法（河方則裕、吉
野芳夫等「生化学会講演予稿集、第1053頁、1983」）が
行なわれているが、これらの方法は、いずれも操作が煩
雑で、処理に要する時間も長いため実用性に乏しいとい
える。
更に、ラクトフエリンは乳中に存在する他の蛋白質と相
互作用を有するという特性のため、イオン交換樹脂を用
いる上掲の方法では乳中の免疫グロブリン等の他の蛋白
質の混入が避けられず、したがつて、純度の高いラクト
フエリンを採取することが実際上困難であり、加うる
に、塩析及びイオン交換による処理を繰返して行なうた
めに、ラクトフエリンの回収率の著しい低下が避けられ
ないのみならず、ラクトフエリンを分離精製する過程で
得られる残留分に含まれる、ラクトフエリン以外の乳蛋
白質及びその他の乳成分を回収して再利用することが実
際上不可能であるという欠点がみられる。
互作用を有するという特性のため、イオン交換樹脂を用
いる上掲の方法では乳中の免疫グロブリン等の他の蛋白
質の混入が避けられず、したがつて、純度の高いラクト
フエリンを採取することが実際上困難であり、加うる
に、塩析及びイオン交換による処理を繰返して行なうた
めに、ラクトフエリンの回収率の著しい低下が避けられ
ないのみならず、ラクトフエリンを分離精製する過程で
得られる残留分に含まれる、ラクトフエリン以外の乳蛋
白質及びその他の乳成分を回収して再利用することが実
際上不可能であるという欠点がみられる。
発明の目的 本発明は、ラクトフエリンに関する従来技術の現状に鑑
みてなされたものであつて、牛乳からウシラクトフエリ
ンを高純度でかつ高収率で有利に分離、精製するのに用
い得るモノクローナル抗ウシラクトフエリン抗体を産生
するハイブリドーマの製造法を提供することを目的とす
る。以下本発明を詳しく説明する。
みてなされたものであつて、牛乳からウシラクトフエリ
ンを高純度でかつ高収率で有利に分離、精製するのに用
い得るモノクローナル抗ウシラクトフエリン抗体を産生
するハイブリドーマの製造法を提供することを目的とす
る。以下本発明を詳しく説明する。
発明の構成 本発明の特徴は、マウスの腹腔にウシラクトフェリンと
フロインドアジュバンドとのエマルジョンを投与して免
疫し、最終免疫終了後６〜７日目に脾臓を摘出し、その
リンパ球を採取し、IgGk鎖を分泌しない融合促進剤とし
て分子量4000のポリエチレングリコールを用いて融合さ
せ、ハイブリドーマを選択し、ソリッドフェイズ法に従
ってスクリーニングを行い、マウス胸腺細胞をフィーダ
ー細胞として用いて、限界希釈法を行ってモノクローナ
ル化されたハイブリドーマを得ることを特徴とするモノ
クローナル抗ウシラクトフェリン抗体産生ハイブリドー
マの製造法にある。
フロインドアジュバンドとのエマルジョンを投与して免
疫し、最終免疫終了後６〜７日目に脾臓を摘出し、その
リンパ球を採取し、IgGk鎖を分泌しない融合促進剤とし
て分子量4000のポリエチレングリコールを用いて融合さ
せ、ハイブリドーマを選択し、ソリッドフェイズ法に従
ってスクリーニングを行い、マウス胸腺細胞をフィーダ
ー細胞として用いて、限界希釈法を行ってモノクローナ
ル化されたハイブリドーマを得ることを特徴とするモノ
クローナル抗ウシラクトフェリン抗体産生ハイブリドー
マの製造法にある。
従来、免疫されたマウスの脾臓リンパ球とマウスの骨髄
腫細胞を融合させることによりモノクローナルな抗体産
生のハイブリドーマを得る手法は、G.Khler、C.Milst
ein等により発表（Nature,256,495〜497,1975）されて
以来、細胞融合によるハイブリドーマの形成および得ら
れたハイブリドーマ産生の抗体についての科学的研究及
びその利用に関する報告が多くなされている。
腫細胞を融合させることによりモノクローナルな抗体産
生のハイブリドーマを得る手法は、G.Khler、C.Milst
ein等により発表（Nature,256,495〜497,1975）されて
以来、細胞融合によるハイブリドーマの形成および得ら
れたハイブリドーマ産生の抗体についての科学的研究及
びその利用に関する報告が多くなされている。
しかしながら、このようなハイブリドーマを形成するた
めの一般的手法を特定なモノクローナル抗体産生の新規
なハイブリドーマの形成に適用する場合、操作上種々の
困難な問題がみられる。すなわち、ハイブリドーマの形
成に当つて抗原として用いる蛋白質の相違により、その
後の免疫、融合の操作上特別な工夫を要し、かつ、所望
のハイブリドーマを単離するためのスクリーニング技術
に影響を与えるからである。
めの一般的手法を特定なモノクローナル抗体産生の新規
なハイブリドーマの形成に適用する場合、操作上種々の
困難な問題がみられる。すなわち、ハイブリドーマの形
成に当つて抗原として用いる蛋白質の相違により、その
後の免疫、融合の操作上特別な工夫を要し、かつ、所望
のハイブリドーマを単離するためのスクリーニング技術
に影響を与えるからである。
因に、本発明者らはさきにヒトラクトフエリンに対する
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成させる発
明をしたが（特願昭59-22412）、同一の名前を持つラク
トフエリンであつても種によつてその一次構造は異な
る。従つて、ヒトラクトフエリンに対するモノクローナ
ル抗体はウシラクトフエリンとは反対し得ない。このよ
うに類似の抗原蛋白質であつてもそれに対するモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを取得するためにはそれ
なりの工夫をこらす必要がある。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成させる発
明をしたが（特願昭59-22412）、同一の名前を持つラク
トフエリンであつても種によつてその一次構造は異な
る。従つて、ヒトラクトフエリンに対するモノクローナ
ル抗体はウシラクトフエリンとは反対し得ない。このよ
うに類似の抗原蛋白質であつてもそれに対するモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマを取得するためにはそれ
なりの工夫をこらす必要がある。
本発明に係るモノクローナル抗ウシラクトフエリン抗体
産生ハイブリドーマは、ウシラクトフエリンで免疫した
マウスから摘出した脾臓より採取した脾臓リンパ球とマ
ウスの骨髄種細胞を公知の手法で融合させることにより
形成し得る。次に上記ハイブリドーマの形成法について
説明する。
産生ハイブリドーマは、ウシラクトフエリンで免疫した
マウスから摘出した脾臓より採取した脾臓リンパ球とマ
ウスの骨髄種細胞を公知の手法で融合させることにより
形成し得る。次に上記ハイブリドーマの形成法について
説明する。
モノクローナル抗ウシラクトフエリン抗体産生ハイブリ
ドーマの形成 ヒトラクトフエリンはシグマ社から純度98％のものが市
販されているが、ウシラクトフエリンは市販されていな
い。そこで、まずウシ初乳より等電点沈澱によりカゼイ
ンを除き、残つたホエー画分から公知の方法（例えばJo
hansson,B.G.et al.:Acta Chem.Scand.23,683,1969）に
従つて純度約60％のウシラクトフエリンを得た。
ドーマの形成 ヒトラクトフエリンはシグマ社から純度98％のものが市
販されているが、ウシラクトフエリンは市販されていな
い。そこで、まずウシ初乳より等電点沈澱によりカゼイ
ンを除き、残つたホエー画分から公知の方法（例えばJo
hansson,B.G.et al.:Acta Chem.Scand.23,683,1969）に
従つて純度約60％のウシラクトフエリンを得た。
ついで、ウシラクトフエリンの溶液を調製し（一般に食
塩を含むリン酸緩衝液（PBS）pH7.2を用いる）、この溶
液とフロインド・アジユバント（Freund′s adjuvant）
を等量混合して得られるエマルジヨンを、マウス（一般
に６〜８週令）の腹腔内に２週間おきに３回免疫を行な
う。この際用いるウシラクトフエリンは純度の高いもの
を用いなければならない。
塩を含むリン酸緩衝液（PBS）pH7.2を用いる）、この溶
液とフロインド・アジユバント（Freund′s adjuvant）
を等量混合して得られるエマルジヨンを、マウス（一般
に６〜８週令）の腹腔内に２週間おきに３回免疫を行な
う。この際用いるウシラクトフエリンは純度の高いもの
を用いなければならない。
そのためには、ウシラクトフエリン画分に含まれる主た
る不純物であるウシ免疫グロブリンに対する抗血清を用
いて免疫グロブリンを吸収してウシラクトフエリンの純
度を高めることが望ましい。
る不純物であるウシ免疫グロブリンに対する抗血清を用
いて免疫グロブリンを吸収してウシラクトフエリンの純
度を高めることが望ましい。
ウシラクトフエリンの純度が低いと目的とするハイブリ
ドーマを得にくい。すなわち、ウシラクトフエリンとウ
シ免疫グロブリンではウシ免疫グロブリンの方がずつと
免疫され易く、ウシラクトフエリンの抗体価が上らない
ためである。
ドーマを得にくい。すなわち、ウシラクトフエリンとウ
シ免疫グロブリンではウシ免疫グロブリンの方がずつと
免疫され易く、ウシラクトフエリンの抗体価が上らない
ためである。
本発明に使用するマウスの種類は特に限定されないが、
一般にはBALB／ｃ系のマウスを用いるとよい。
一般にはBALB／ｃ系のマウスを用いるとよい。
従来、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの形成に
用いられる脾臓リンパ球は、特定の抗原による最終免疫
後３〜４日目に摘出した脾臓から採取するのが一般的で
あるが、本発明において対象とするウシラクトフエリン
の場合には、上記最終免疫後３〜４日目ではマウスにお
ける抗体価の上昇が最高値に達せず、また脾臓リンパ球
中の抗体産生細胞の活性化が不充分であり、したがつ
て、目的とするモノクローナル抗ウシラクトフエリン抗
体産生ハイブリドーマの形成率が低くなる。
用いられる脾臓リンパ球は、特定の抗原による最終免疫
後３〜４日目に摘出した脾臓から採取するのが一般的で
あるが、本発明において対象とするウシラクトフエリン
の場合には、上記最終免疫後３〜４日目ではマウスにお
ける抗体価の上昇が最高値に達せず、また脾臓リンパ球
中の抗体産生細胞の活性化が不充分であり、したがつ
て、目的とするモノクローナル抗ウシラクトフエリン抗
体産生ハイブリドーマの形成率が低くなる。
本発明者は、ウシラクトフエリンで最終免疫後６〜７日
目のマウスから摘出した脾臓から採取した脾臓リンパ球
を用いると上記ハイブリドーマの形成率が非常に高くな
ることを見出した。
目のマウスから摘出した脾臓から採取した脾臓リンパ球
を用いると上記ハイブリドーマの形成率が非常に高くな
ることを見出した。
上述のようにしてマウスの脾臓から採取した脾臓リンパ
球（以下脾細胞と称する）はマウス骨髄腫細胞（以下エ
ミローマ細胞と称する）と融合させる。
球（以下脾細胞と称する）はマウス骨髄腫細胞（以下エ
ミローマ細胞と称する）と融合させる。
ここで用いるミエローマ細胞は特に限定されないが、BA
LB／ｃ系マウスの脾細胞と融合させる場合には、IgGの
ｋ鎖を分泌しないSP2／0-Ag14を用いるのが好ましい。
融合方法は公知の手法に準じて行ない得るが、ミエロー
マ細胞として上記SP2／0-Ag14を用いる場合には、融合
促進剤（融合誘導剤）の添加、混合及び希釈の各操作か
ら成る融合時間を５〜15分、好ましくは９〜11分の範囲
内にすることが肝要である。
LB／ｃ系マウスの脾細胞と融合させる場合には、IgGの
ｋ鎖を分泌しないSP2／0-Ag14を用いるのが好ましい。
融合方法は公知の手法に準じて行ない得るが、ミエロー
マ細胞として上記SP2／0-Ag14を用いる場合には、融合
促進剤（融合誘導剤）の添加、混合及び希釈の各操作か
ら成る融合時間を５〜15分、好ましくは９〜11分の範囲
内にすることが肝要である。
この場合、融合時間が５分より短いと融合が不完全とな
り、一方15分を越えると融合促進剤として用いたポリエ
チレングリコールの被毒により細胞が死滅する。因に、
上記融合時間を９〜11分の範囲にするとほぼ100％に近
いコロニー形成率が得られる。また、ウシラクトフエリ
ンで免疫したBALB／ｃ系マウスの脾細胞とSP2／0-Ag14
を融合する場合には、融合促進剤としてメルク社製ガス
クロマトグラフイー用の分子量4000のポリエチレングリ
コールを濃度50％で用いると特に高いコロニー形成率
（融合率）が得られる。
り、一方15分を越えると融合促進剤として用いたポリエ
チレングリコールの被毒により細胞が死滅する。因に、
上記融合時間を９〜11分の範囲にするとほぼ100％に近
いコロニー形成率が得られる。また、ウシラクトフエリ
ンで免疫したBALB／ｃ系マウスの脾細胞とSP2／0-Ag14
を融合する場合には、融合促進剤としてメルク社製ガス
クロマトグラフイー用の分子量4000のポリエチレングリ
コールを濃度50％で用いると特に高いコロニー形成率
（融合率）が得られる。
融合終了後、融合細胞を従来法にしたがつて、HT培地
（ヒポキサンチン・チミジン・10％ウシ胎児血清を含む
ダルベツコ変法MEM培地）に分散させ、ついで96穴マイ
クロタイタープレート上に撤布し、37℃の温度で５％炭
酸ガス雰囲気下で培養し、その翌日よりHAT培地（ヒポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジン・10％ウシ胎児
血清を含むダルベツコ変法MEM培地）中でハイブリドー
マの選択を行なう。
（ヒポキサンチン・チミジン・10％ウシ胎児血清を含む
ダルベツコ変法MEM培地）に分散させ、ついで96穴マイ
クロタイタープレート上に撤布し、37℃の温度で５％炭
酸ガス雰囲気下で培養し、その翌日よりHAT培地（ヒポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジン・10％ウシ胎児
血清を含むダルベツコ変法MEM培地）中でハイブリドー
マの選択を行なう。
ついでハイブリドーマのコロニーが充分に大きくなつた
ところでソリツドフエイズ法（solid phase method）に
従つてスクリーニングを行ない、陽性反応を示したハイ
ブリドーマについて限界希釈法を用いてクローニングを
行なう。
ところでソリツドフエイズ法（solid phase method）に
従つてスクリーニングを行ない、陽性反応を示したハイ
ブリドーマについて限界希釈法を用いてクローニングを
行なう。
なお、ソリツドフエイズ法は、可溶性の抗原を96穴ソフ
トマイクロウエルに吸着させた後、ウシ血清アルブミン
（BSA）で上記ウエル中の非吸着部分をブロツクし、上
記の培養液上清を各ウエルに入れて抗原と反応させ、反
応後各ウエルを充分洗い、ついで二次抗体としてビオチ
ニル化させたマウス抗体に対する抗体を添加し、その後
アビジン及び螢光色素で標識したビオチンを反応させ
て、目的とする抗体を螢光で検出して行なつた。
トマイクロウエルに吸着させた後、ウシ血清アルブミン
（BSA）で上記ウエル中の非吸着部分をブロツクし、上
記の培養液上清を各ウエルに入れて抗原と反応させ、反
応後各ウエルを充分洗い、ついで二次抗体としてビオチ
ニル化させたマウス抗体に対する抗体を添加し、その後
アビジン及び螢光色素で標識したビオチンを反応させ
て、目的とする抗体を螢光で検出して行なつた。
ここで用いる可溶性の抗原は、なるべく高い純度のウシ
ラクトフエリンでなければならない。すなわち、ウシラ
クトフエリンの純度が低いと不純物抗原に対するハイブ
リドーマにも陽性を示し目的としているウシラクトフエ
リンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを
見つけ出すことが困難となるためである。
ラクトフエリンでなければならない。すなわち、ウシラ
クトフエリンの純度が低いと不純物抗原に対するハイブ
リドーマにも陽性を示し目的としているウシラクトフエ
リンに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを
見つけ出すことが困難となるためである。
また、限界希釈法は、マウスの胸腺細胞108個とハイブ
リドーマ50個を10mlのHT培地に分散したものを、96穴マ
イクロタイタープレート上にハイブリドーマが各ウエル
当り１個以下になるように散布してハイブリドーマの単
一コロニーを得るように行なつた。なお、ハイブリドー
マは細胞密度が低いと増殖できないので、マウスの胸腺
細胞をフイーダー細胞（feeder cel1）として添加し
た。
リドーマ50個を10mlのHT培地に分散したものを、96穴マ
イクロタイタープレート上にハイブリドーマが各ウエル
当り１個以下になるように散布してハイブリドーマの単
一コロニーを得るように行なつた。なお、ハイブリドー
マは細胞密度が低いと増殖できないので、マウスの胸腺
細胞をフイーダー細胞（feeder cel1）として添加し
た。
上述のようなクローニングを３回以上繰返し行なつてモ
ノクローン化されたハイブリドーマを得る。
ノクローン化されたハイブリドーマを得る。
次に、このようにして得られたモノクローナル抗ウシラ
クトフエリン抗体産生ハイブリドーマは、公知の手法に
従つて、マウス腹腔内に投与し、その腹水を回収する
か、或は培地中で培養してその上清液を回収し、硫安沈
澱、陰イオン交換樹脂を用いて精製することにより、モ
ノクローナル抗ウシラクトフエリン抗体を産生し得る。
クトフエリン抗体産生ハイブリドーマは、公知の手法に
従つて、マウス腹腔内に投与し、その腹水を回収する
か、或は培地中で培養してその上清液を回収し、硫安沈
澱、陰イオン交換樹脂を用いて精製することにより、モ
ノクローナル抗ウシラクトフエリン抗体を産生し得る。
因に、本発明に係るハイブリドーマ産生の上記モノクロ
ーナル抗ウシラクトフエリン抗体を用いて牛乳からウシ
ラクトフエリンを分離、精製するには、該抗体を不溶性
の担体に固定化したアフイニテイカラムを用いて行な
う。
ーナル抗ウシラクトフエリン抗体を用いて牛乳からウシ
ラクトフエリンを分離、精製するには、該抗体を不溶性
の担体に固定化したアフイニテイカラムを用いて行な
う。
以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。
実施例 ウシラクトフエリンは従来方法（Johansson,B.G.et a
l.:Acta Chem.Scand.23,683,1969）に従い、ウシ初乳よ
りイオン交換樹脂を用いて分離精製した。尚、ウシラク
トフエリンの純度は60％であつた。
l.:Acta Chem.Scand.23,683,1969）に従い、ウシ初乳よ
りイオン交換樹脂を用いて分離精製した。尚、ウシラク
トフエリンの純度は60％であつた。
このウシラクトフエリン画分にウシ免疫グロブリン抗血
清を添加し、主たる不純物であるウシ免疫グロブリンを
吸収してウシラクトフエリンの純度を約90％に上げた。
清を添加し、主たる不純物であるウシ免疫グロブリンを
吸収してウシラクトフエリンの純度を約90％に上げた。
このウシラクトフエリンを、食塩0.15Mを含むリン酸緩
衝液（PBS）pH7.2に0.3％濃度になるように溶解し、こ
の溶液にフロインド・アジユバント（デイフコ社製）を
等量混合してエマルジヨンを作り、得られたエマルジヨ
ンを６〜８週令のBALB／ｃ系マウス腹腔内に投与し、免
疫した。この免疫を２週間おきに３回行ない、最終免疫
後７日目にマウスより脾臓を摘出し、これから脾細胞を
採取した。この脾細胞をDMEM培地（ダルベツコ変法MEM
培地）に分散し、マウス骨髄腫細胞SP2／0-Ag14と2:1の
割合で混合した。この混合液に50％ポリエチレングリコ
ール（メルク社製、ガスクロマトグラフイー用、分子量
4000）溶液を融合促進剤として添加し、10分間で融合を
終了した。このようにして得られた融合細胞を、遠心分
離してポリエチレングリコールを除いた後、HT培地中に
１×107個／ml以下の細胞密度となるように分散し、つ
いで96穴マイクロタイタープレートにまき、37℃の温度
で５％炭酸ガス雰囲気下に培養を開始した。培養開始の
翌日（第１日目）よりHAT培地で半量交換を行ないつ
つ、17日目にソリツドフエイズ法でスクリーニングを行
なつた。ハイブリドーマのコロニー形成率は100％、ウ
シラクトフエリン陽性率は8.3％であつた。
衝液（PBS）pH7.2に0.3％濃度になるように溶解し、こ
の溶液にフロインド・アジユバント（デイフコ社製）を
等量混合してエマルジヨンを作り、得られたエマルジヨ
ンを６〜８週令のBALB／ｃ系マウス腹腔内に投与し、免
疫した。この免疫を２週間おきに３回行ない、最終免疫
後７日目にマウスより脾臓を摘出し、これから脾細胞を
採取した。この脾細胞をDMEM培地（ダルベツコ変法MEM
培地）に分散し、マウス骨髄腫細胞SP2／0-Ag14と2:1の
割合で混合した。この混合液に50％ポリエチレングリコ
ール（メルク社製、ガスクロマトグラフイー用、分子量
4000）溶液を融合促進剤として添加し、10分間で融合を
終了した。このようにして得られた融合細胞を、遠心分
離してポリエチレングリコールを除いた後、HT培地中に
１×107個／ml以下の細胞密度となるように分散し、つ
いで96穴マイクロタイタープレートにまき、37℃の温度
で５％炭酸ガス雰囲気下に培養を開始した。培養開始の
翌日（第１日目）よりHAT培地で半量交換を行ないつ
つ、17日目にソリツドフエイズ法でスクリーニングを行
なつた。ハイブリドーマのコロニー形成率は100％、ウ
シラクトフエリン陽性率は8.3％であつた。
次に、陽性反応を示したハイブリドーマを24穴マイクロ
タイタープレートに移し、細胞密度が１×105個／mlに
増殖した時点でクローニングを行つた。その後２週間HT
培地中で培養し、単一コロニーを形成しているウエルを
選んで二次スクリーニングを行なつた。
タイタープレートに移し、細胞密度が１×105個／mlに
増殖した時点でクローニングを行つた。その後２週間HT
培地中で培養し、単一コロニーを形成しているウエルを
選んで二次スクリーニングを行なつた。
このようなクローニングとスクリーニング操作を計３回
行ない、抗ウシラクトフエリン抗体を産生するハイブリ
ドーマのモノクローンを得た。これに対し、フロイント
アジュバンドを使用せず、４日目に脾臓を摘出したもの
を用い、実施例と同様の処理を行なう（比較例）と次表
に示すようにバイブリドーマのコロニー形成率68％、ウ
シラクトフェリン陽性率4.8％であって、本願発明がハ
イブリドーマのコロニー形成率及びウシラクトフェリン
陽性率のいずれの点においても著しく高い値を示した。
行ない、抗ウシラクトフエリン抗体を産生するハイブリ
ドーマのモノクローンを得た。これに対し、フロイント
アジュバンドを使用せず、４日目に脾臓を摘出したもの
を用い、実施例と同様の処理を行なう（比較例）と次表
に示すようにバイブリドーマのコロニー形成率68％、ウ
シラクトフェリン陽性率4.8％であって、本願発明がハ
イブリドーマのコロニー形成率及びウシラクトフェリン
陽性率のいずれの点においても著しく高い値を示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，256，495−497（1975) Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐ ｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，446，214−225 （1976)
Claims (1)
- 【請求項１】マウスの腹腔にウシラクトフェリンとフロ
イントアジュバントとのエマルジョンを投与して免疫
し、最終免疫終了後６〜７日目に脾臓を摘出し、そのリ
ンパ球を採取し、IgGκ鎖を分泌しないマウス骨髄腫細
胞と、融合促進剤として分子量4000のポリエチレングリ
コールを用いて融合させ、ハイブリドーマを選択し、ソ
リットフェイズ法に従ってスクリーニングを行い、マウ
ス胸腺細胞をフィーダー細胞として用いて、限界希釈法
を行ってモノクローナル化されたハイブリドーマを得る
ことを特徴とするモノクローナル抗ウシラクトフェリン
抗体産生ハイブリドーマの製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59145667A JPH0669370B2 (ja) | 1984-07-13 | 1984-07-13 | モノクローナル抗ウシラクトフェリン抗体産生ハイブリドーマの製造法 |
| NZ212690A NZ212690A (en) | 1984-07-13 | 1985-07-09 | Hybridoma capable of producing monoclonal antibody against bovine lactoferrin |
| DE19853524585 DE3524585A1 (de) | 1984-07-13 | 1985-07-10 | Zur erzeugung eines monoklonalen antikoerpers gegen bovines lactoferrin faehiges hybridoma |
| BE0/215340A BE902877A (fr) | 1984-07-13 | 1985-07-12 | Hybridome capable de produire un anticorps monoclonal vis-a-vis de la lactoferrine bovine |
| GB08517597A GB2162856B (en) | 1984-07-13 | 1985-07-12 | Hybridoma capable of producing a monoclonal antibody against bovine lactoferrin |
| FR8510745A FR2567539B1 (fr) | 1984-07-13 | 1985-07-12 | Hybridome capable de produire un anticorps monoclonal contre la lactoferrine bovine et procede pour sa preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59145667A JPH0669370B2 (ja) | 1984-07-13 | 1984-07-13 | モノクローナル抗ウシラクトフェリン抗体産生ハイブリドーマの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6125482A JPS6125482A (ja) | 1986-02-04 |
| JPH0669370B2 true JPH0669370B2 (ja) | 1994-09-07 |
Family
ID=15390298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59145667A Expired - Fee Related JPH0669370B2 (ja) | 1984-07-13 | 1984-07-13 | モノクローナル抗ウシラクトフェリン抗体産生ハイブリドーマの製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0669370B2 (ja) |
| BE (1) | BE902877A (ja) |
| DE (1) | DE3524585A1 (ja) |
| FR (1) | FR2567539B1 (ja) |
| GB (1) | GB2162856B (ja) |
| NZ (1) | NZ212690A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61145200A (ja) * | 1984-12-19 | 1986-07-02 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | ウシラクトフェリンの分離精製法 |
| JP4847406B2 (ja) * | 2007-07-11 | 2011-12-28 | 株式会社くろがね工作所 | 引戸枠の連結装置 |
| AU2014349666B2 (en) * | 2013-11-17 | 2018-03-01 | New Proteintech Inc. | Method of preparing chromatographic materials |
-
1984
- 1984-07-13 JP JP59145667A patent/JPH0669370B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1985
- 1985-07-09 NZ NZ212690A patent/NZ212690A/xx unknown
- 1985-07-10 DE DE19853524585 patent/DE3524585A1/de active Granted
- 1985-07-12 FR FR8510745A patent/FR2567539B1/fr not_active Expired
- 1985-07-12 BE BE0/215340A patent/BE902877A/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-07-12 GB GB08517597A patent/GB2162856B/en not_active Expired
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，４４６，２１４−２２５（１９７６） |
| Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ212690A (en) | 1989-01-27 |
| GB8517597D0 (en) | 1985-08-21 |
| GB2162856A (en) | 1986-02-12 |
| JPS6125482A (ja) | 1986-02-04 |
| BE902877A (fr) | 1985-11-04 |
| DE3524585C2 (ja) | 1987-09-03 |
| GB2162856B (en) | 1988-03-09 |
| FR2567539B1 (fr) | 1988-11-25 |
| DE3524585A1 (de) | 1986-01-16 |
| FR2567539A1 (fr) | 1986-01-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4668771A (en) | Method for separating bovine lactoferrin from cow's milk and purifying same | |
| Bazin et al. | Rat monoclonal antibodies. I. Rapid purification from in vitro culture supernatants | |
| Neoh et al. | The purification of mouse monoclonal antibodies from ascitic fluid | |
| US4468346A (en) | Monoclonal antibodies to porcine immunoglobulins | |
| JPH034781A (ja) | 肝炎ウイルス抗体を産生する細胞系 | |
| EP0038642B1 (en) | A monoclonal antibody against hepatitis b and its production, a hybridoma producing the monoclonal antibody and compositions containing it, the propagation of the hybridoma and the monoclonal antibody for use as an antiviral agent against hepatitus b and in isolating hepatitus b surface antigen from a sample | |
| JPH0669370B2 (ja) | モノクローナル抗ウシラクトフェリン抗体産生ハイブリドーマの製造法 | |
| JPS63123395A (ja) | 抗ｐｃｉモノクローナル抗体、これを用いた抗ｐｃｉの精製法及び免疫学的測定法 | |
| US5192684A (en) | Human IgG1 monoclonal antibody specific for the nicotinic acetylcholine receptor and hybridoma producing the antibody | |
| JPH0661263B2 (ja) | モノクローナル抗ヒトラクトフェリン抗体産生ハイブリドーマの製造法 | |
| CA1235078A (en) | Monoclonal antibodies, to bovine serum albumin and their use in bsa isolation | |
| EP0119859A2 (en) | Monoclonal antibodies, processes for their preparation and methods for their use | |
| JP3113302B2 (ja) | ヒト型単クローン性抗肺ガン細胞抗体及びそれを産生するハイブリドーマ | |
| JPS62210984A (ja) | 犬のｃ−反応性蛋白に対するモノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マとその抗体を用いた犬ｃ−反応性蛋白の分離精製法 | |
| JPS6236399A (ja) | ヒトｃｒｐの回収、精製法 | |
| JP3255640B2 (ja) | 抗体の分離法 | |
| JP2639684B2 (ja) | 抗ｃｐｂ▲ｉｉ▼モノクローナル抗体 | |
| JP2560069B2 (ja) | エリスロポエチンの製造方法 | |
| JP2759466B2 (ja) | ブタ・ヒト卵透明帯共通抗原に対するモノクローナル抗体及びその作製方法 | |
| JPS63253098A (ja) | ヒト抗体に対するモノクロ−ナル抗体、その製法及び用途 | |
| Chitarra-Guillon et al. | Crystallization and preliminary x-ray diffraction studies of antigen-antibody complexes | |
| JP2593865B2 (ja) | ヒトファクターｉに対する単クローン性抗体 | |
| JPS60166619A (ja) | 人乳からヒトラクトフエリンを分離、精製する方法 | |
| JP2613188B2 (ja) | 抗ｐｃｉモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ | |
| JPH066068B2 (ja) | ヒトＩｇＧサブクラスに対するモノクロ−ナル抗体とその製造法および該モノクロ−ナル抗体産生細胞系 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |