JPH01168700A - 新規な抗生物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は構造式Ｉ 式中、Ｒは−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨｘ−
ＣＨａ−ＣＨ５、−Ｃｏ−ＣＨ−Ｃｌ−Ｃｌ寥ＣＨ−Ｃ
Ｈ！−ＣＨ−（ＣＨ３）！または−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ−
ＣＨ−ＣＨ−ＣＪ−ＣＨａ−ＣＨ（ＣＨａ）＊であり、
そして Ｒ′はα−Ｄ−マンノピラノシルである、のデプシペブ
チド化合物及びその酸付加塩、その製造方法並びに抗生
物質としてのその用途に関する。上記の物質は抗生物質
Ａ／１６６８６と相互に関連し、上記抗生物質を産生ず
る同様なアクチノプラネス・ニス・ビー（Ａ　ｃｔｉｎ
ｏｐｌａｎｅｓ　　ｓｐ、）ＡＴＣＣ３３０７６によっ
て産生される。

抗生物質Ａ／１６６８６はその製造方法及び該物質を含
む製薬学的組成物と共に米国特許第４゜３０３．６４６
号に記載されたグラム陽性バクテリアに対して活性な物
質である。

因子Ａ１、Ａ２及びＡ３と称する３種の密接に関連した
成分を抗生物質Ａ／１６６８６から単離し得ることが見
い出された。因子Ａ２［ラモプラニン（ｒａｍｏｐｌａ
ｎｉｎ）　］は顕著な量で得られる成分であり、生物学
的活性に対して最も関連しており、一方、Ａ１及びＡ３
は少量で得られる。これらの物質並びにその製造及び用
途は米国特許第４．４２７．６５６号に記載されている
。

抗生物質Ａ／１６６８６産生培養物に適当な前駆物質を
加えることによってＡ／１６６８６の因子Ａ２及び／ま
たはＡ３の産生を選択的に高める方法がヨーロッパ特許
公告第０．２５９，７８０号に記載されている。

簡潔にするために、またそれぞれＡ／１６６８６因子Ａ
’ｌ（Ｒ嵩−Ｃｏ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ！　
−ＣＨｚ　　ＣＨ３）　、因子Ａ’２　（Ｒ−ＣＯ−Ｃ
Ｈ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨｚ　−ＣＨ（ＣＨｓ）ｚ）
及び因子Ａ’３　（Ｒ−−Ｃｏ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ−Ｃ
Ｈ−ＣＨ２−ＣＨａ−ＣＨ（ＣＨｘ）ｚ）として同一に
扱う本発明の３種の化合物をアクチノプラネス・ニス・
ビーＡＴＣＣ３３０７６の発酵によって産生させること
ができ、該菌株は米国特許第４．３０３．６４６号に記
載された如きパーマネント・カルチャー拳コレクション
（ｐｅｒｍａｎｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅ　　ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ）　Ａ　Ｔ　ＣＣによって寄託されており、現
在、自由に入手可能であり、１９８１年１３３１日のプ
ダベスト条約（Ｂ　ｕｄａｐｅｓｔＴ　ｒｅａｔｙ）下
で容認されているか、或いは同化可能な炭素及び窒素源
並びに無機塩を含む水性栄養媒質中にて浸水好気性条件
下で産生ずるその突然変異体（即ち、同様な物質を産生
じ得る天然または人工的突然変異体）である。粗製の発
酵産物中に上記３種の化合物の処理可能な量を産生させ
るために（この場合に、「処理可能な量」なる用語は、
発酵汁から粗製の単離物に含まれる本発明の化合物の量
が実験目的及び実験の利用に適する量で普通の分離及び
精製によってその単離を可能にするために十分であるこ
とを意味するものとする）、発酵媒質は上記の必須元素
の適当な源を含ませなければならない。

好ましい炭素源は糖、例えばデキストロース、フラクト
ース、マルトース、スクロース等、ポリオール、例えば
グリセリン、澱粉及び変性澱粉、例えばデキストリンで
あり、スクロース、グリセリン及びデキストリンが好ま
しい。しかしながら、栄養培養媒質中のデキストロース
の濃度が適度または低い場合、これは式Ｉの化合物の生
成において正の効果を有し、このことは発酵汁からの粗
製の単離物におけるその大きな割合から推測することが
できる。

好ましい窒素源は大豆ひきわり、ペプトン、トリプトン
、麦芽エキス、酵母エキス、アミノ酸等であり、大豆ひ
されり及び麦芽エキスが最も好ましい。

培養媒質に通常配合する無機塩の中で、ナトリウム、カ
リウム、鉄、亜鉛、マンガン、マグネシウム、カルシウ
ム、アンモニウム、クロライド、アイオダイド、カルボ
ネート、サルフェート、ホスフェート、ナイトレートイ
オン等を付与し得る普通の可溶性塩がある。

ヨーロッパ特許公告第０．２５９．７８０号に記載され
た方法に従って発酵中に適当な前駆物質の添加を、他の
ものよりも式■の新規抗生物質の一つの比を選択的に増
加させるために利用することができる。例えばロイシン
（またはその塩）０゜２ｇＩＱ乃至５／Ｑの添加は因子
Ａ’ｌ及びＡ’３に比較”して因子Ａ’２の比が増加し
、一方、バリン（またはその塩）０．２ｇ／Ｑ乃至５ｇ
／＜２の添加は因子Ａ’３の相対比を選択的に増加させ
る。イソ吉草酸はロイシンと同様の効果を有し、一方、
イソ酪酸はバリンと同一の効果を有する。

通例、抗生物質−産生菌株を振盪フラスコ中で予備培養
し、次に培養物を抗生物質の実質的な量を産生させるた
めのジャー発酵器に接種するために用いる。予備培養に
用いた媒質はより大きな発酵に対して用いるものと同一
であることができるが−１しかし、また他の媒質を用い
ることもできる。

産生−菌株を２０乃至４０℃間、好ましくは２４乃至３
５℃間、最も好ましくは２８乃至３２℃間の温度で、抗
生物質活性の増加が認められる期間（一般に３０乃至１
８０時間）増殖させることができる。

発酵期間中の抗生物質産生を、抗生物質活性に対して汁
または菌糸体抽出試料を例えばバイオアッセイ（ｂｉｏ
ａｓｓａｙ）　、Ｔ　Ｌ　ＣまたはＨＰＬＣ法によって
試験して監視することができる。

本発明の抗生物質に敏感な細菌、例えば枯草菌（Ｂ　ａ
ｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）またはバチルス・
プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｐｕｍｉｌｕｓ）を試
験細菌として用いることができる。バイオアッセイは寒
天プレート上で寒天希釈法によって有利に行われる。一
般に抗生物質活性の最大産生は接種後、第３日乃至第５
日間に生ずる。

菌株アクチノプラネス・ニス・ビーＡＴＣＣ３３０７６
の発酵中に産生ずる抗生物質は主として菌糸体塊に見い
出される。従って、本発明の抗生物質は、発酵汁から菌
糸体を分離し、菌糸体塊を適当な溶媒系で抽出し、該抽
出液から粗製の発酵産物を単離し、単離した粗製の発酵
産物から上記の抗生物質を分離し、そして精製すること
によって、適当に回収される。Ａ／１６６８６因子Ａ′
１、Ａ’２及びＡ’３抗生物質を回収する好ましい方法
は、１）Ｈ４−５乃至５．５で濾過によって発酵汁から
分離した後の湿った菌糸体を抽出することからなる。

菌糸体の抽出はｐＨ１，５乃至２．５間で水混和性有機
°溶媒、例えばアルカノーノ呟アセトン及びその混合物
によって最も有利に行われる。不純物、副生成物、塩、
濾過助剤及び発酵汁成分に由来する物質と共に、本発明
の化合物、即ち、因子Ａ′１、Ａ’２及びＡ’３との混
合物であるＡ／１６６８６抗生物質の混合物、即ち、因
子Ａ１１Ａ２及びＡ３（米国特許第４．４２７．６５６
号）である粗製の発酵産物（「粗製物」）は通常の方法
によって溶媒（複数種）抽出で回収される。

粗製の発酵産物から本発明の抗生物質の単離、その分離
及び精製はそれ自体公知の方法に従って行われ、該方法
には溶媒による抽出、非溶媒の添加による沈澱化または
溶液のｐＨ変化による沈澱化、分配クロマトグラフィー
、逆相分配クロマトグラフィー、ｂｌ　３イオン交換ク
ロマトグラフイー、アフイニテイクロマトグラフイー、
ＨＰＬＣ法等が含まれる。

「粗製物」を回収する典を的な方法によれば、酸付加塩
型において上記の抗生物質を含む水及び水混和性有機溶
媒の混合物中の酸性ｐＨでの菌糸体抽出液を通常水と難
溶性であり且つ肝脂性化合物に対して高度の溶解力を有
する有機溶媒（例えば酢酸エチル、エチルエーテル、ｎ
−ヘキサン）で抽出し、次に水層を真空下で濃縮する。

濃縮した溶液を希釈アルカリまたはアンモニアの添加に
よってｐＨ７にし、次に濾過または遠心分離して固体を
回収する。また固体精製物の回収を有利にするために、
混合物に濾過助剤を加えることもできる。

得られる湿った「粗製の」ケーキを更に上記式■の化合
物の単離及び精製に対してたんねんに仕上げることがで
きる。濾過前に濾過助剤を加える場合、菌糸体ケーキの
抽出に適用した如き酸性ｐＨで水及び水混和性有機溶媒
の混合物によって「粗製の」ケーキを更に抽出する必要
がある。

この抽出液から「粗製物」の再沈澱は、これに本発明の
精製物の酸付加塩が難溶性である水混和性有機溶媒を加
えることにより、該酸付加塩の溶解度を減少させること
によって行われる。この目的に対してアセトン及びイン
プロパツールが適当な有機溶媒である。次に湿った粗製
の単離物を、このものから非−Ａ／１６６８６抗生物質
産物の大部分を除去するために更に精製する。かくして
、ある不純物を除去するために、強無機酸の希釈溶液（
５〜ｌＯ％Ｗ／Ｖ）で粗製の湿ったケーキをスラッジに
し、次に遠心分離することが有用である。

かくして得られる湿ったケーキを菌糸体ケーキの抽出に
用いたものと同一タイプの水及び水溶性有機溶媒の混合
物に１．５乃至２．５間のｐＨで再溶解して更に精製す
ることができる。この操作中、水溶液に脱色剤を加える
ことができる。式Ｉの化合物を含む精製した発酵産物の
酸性溶液からの沈澱化は上記方法に従って行うことがで
きる。発酵産物のかかる精製した調製物は本質的に１種
またはそれ以上の他の同様な生成物、即ち、抗生物質Ａ
／１６６８６の因子Ａ１、Ａ２及びＡ３と共に、本発明
の化合物の混合物からなる。上記混合物から本発明の化
合物の単離は上記の如き通常の分離法によって行われる
。発酵産物がかなりの量の抗生物質Ａ／１６６８６因子
Ａｔ、Ａ２及びＡ３を含んでいる場合、分離及び精製目
的の双方に対して分取ＨＰＬＣが殊に有用である。分取
ＨＰＬＣ操作は通常、Ａ／１６６８６抗生物質の分離及
び精製に対する普通の条件下で行われる。該分離及び精
製操作の例は例えば米国特許第４，４２７．６５６号に
記載されており、ここではｃ−１８アルキルシラン化し
たシリカゲルカラム並びに水性ギ酸アンモニウム及びア
セトニトリルの溶離剤混合物を用いている。

分取ＨＰＬＣ操作中、各注入にょる溶離液を分析用ＨＰ
ＬＣでチエツクし、それぞれＡ／１６６８６因子Ａ’ｌ
、Ａ’２及びＡ’３に富んだフラクションを分離する。

上記化合物の各々に富んだフラクションを合液し、真空
下で濃縮乾固させる。それぞれの固体残渣を前と同一条
件下で分取ＨＰＬＣに再び付す。

溶離液の濃縮よって生ずる固体生成物を無機酸で希釈し
、凍結乾燥し、それぞれ純粋な生成物が無機酸付加塩型
で得られる。

本発明の化合物を製造する別法は、抗生物質Ａ／１６’
６８６因子Ａｔ、Ａ２及びＡ３またはその混合物を含む
基質をアクチノプラネス・ニス・ビーＡＴＣＣ３３０７
６或いはＡ／１６６８６抗生物質を産生し得るその天然
または人工的突然変異性の菌糸体と接触させ、かくして
、因子Ａ’ｌ。

Ａ’２及びＡ２Ｂへの生物転換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍａｔｉ。

ｎ）を促進させることからなる。この目的に従って、単
一因子Ａ１、Ａ２及びＡ３またはその混合物、例えば発
酵操作により生ずる複合体を２８乃至３５℃間、好まし
くは２９乃至３３℃間の温度で５０乃至２００時間の範
囲期間菌糸体に接触させる。この操作をＡ／１６６８６
抗生物質を産生させるためのアクチノプラネス・ニス嗜
ピーＡＴｃｃ３３０７６　（またはその産生突然変異体
）の発酵に引き続いて行うことができ、従って、発−産
物と菌糸体との長期間の接触からなる。発酵操作を上記
の条件に従って行った場合、発酵産物はすでにある量の
因子Ａ’ｌ、Ａ’２及びＡ’３を含有し、従って、菌糸
体との長期間の接触により、発酵汁中の該化合物の比率
の増加を実際にもたらす。

この方法の実際の具体例によれば、発酵循環が終了した
後、即ち、分析試験が発酵汁における抗生物質活性がも
はや増加しないことを示した際、発酵器への酸素（また
は空気）の導入を止め、−分析用ＨＰＬＣ調節下で収穫
前に、発酵汁を撹拌しなから２９乃至３３℃間の温度で
更に５０乃至２００時間の期間保持する。

因子Ａｔ、Ａ２及びＡ３の対応する因子Ａ’ｌ。

Ａ’２及びＡ’３への生物転換を行う好ましい方法は、
上記の採取の３種の物質（またはその混合物、例えば米
国特許筒４．３０３．６４６号に記載された如く、発酵
汁から回収操作により生じるようなＡ／１６６８６複合
体を含めて）をアクチノプラネス・エス・ピーＡＴＣＣ
３３０７６或いはその産生天然または人工的突然変異体
の単離した菌糸体と接触させることからなる。適当な培
養媒質中で増殖した菌糸体を発酵汁から（例えば遠心分
離よって）単離し、次に水または水と１種もしくはそれ
以上の水混和性有機溶媒（例えば低級アルカノールまた
はアセトン）中の因子Ａ１、Ａ２及びＡ３の溶液に撹拌
しながら加える。反応混合物の温度を上に示した範囲内
に保持し、一方、ｐＨを適当な緩衝剤（例えばリン酸塩
緩衝剤）で溶液を緩衝してほぼ７に安定に保持する。生
物学的転換を通常、分析用ＨＰＬＣで追跡する。実験的
試験により、それぞれ因子ＩＡ約１４％、因子２Ａ約６
４％及び因子３Ａ約１２％を最初に含んでいるＡ／１６
６８６抗生物質の粗製の混合物は、上記条件下でアクチ
ノプラネス・エス・ピーＡＴＣＣ３３０７６の単離した
菌糸体と約１４０時間接触させた後、それぞれ因子Ａｔ
、Ａ２及びＡ３含有量の１０％、２８％及び９％（ＨＰ
ＬＣ面積）の減少に伴って、それぞれ因子Ａ’ｌ約１０
％、因子Ａ’２約３８％及び因子Ａ’３約５％を含む混
合物に転換されたことがわかった。同様に、１８０時間
後に因子Ａ２　（ＨＰＬＣタイター：８９％）のほとん
ど純粋な試料からなる基質は、因子Ａ２含有量の約３３
％減少（ＨＰＬＣ面積）に伴って、因子Ａ’２約６０％
を含む混合物に転化された。

上記の生物転換により生ずる生成物を反応混合物から（
または生物学的転換を発酵汁中で菌糸体と長期間接触さ
せて直接操作した場合には、発酵汁から）、菌糸体懸濁
液をｐＨ１，５乃至２．５間の酸性にし、次いでこれに
菌子体塊から反応生成物の抽出を助けるために、水溶性
有機溶媒、例えば低級アルカノールまたはアセトンを、
該溶媒が十分な量で既存せぬならば、加えることによっ
て回収する。濾過または遠心分離によって菌糸体を分離
した後、この溶液を本発明の化合物の単離及び精製に対
して上に述べた方法と同様にしてたんねんに処理する。

生物学的転換を上記の如く発酵汁において直接操作する
場合、反応生成物の回収を、発酵産物の回収に対して、
前に正確に述べた如（して行うことができる。

抗生物質Ａ／１６６８６因子Ａ’ｌ、Ａ’２及びＡ’３
を糖含有量測定（酸加水分解）、酸／塩基滴定、アミノ
酸分析（量及び配列に対して）、！Ｒ，ＵＶ、ＮＭＲ分
光分析及び高速原子衝撃法（ＦＡＢ−ＭＳ）に付した。

これらの分析試験から得られたデータは示した構造式を
確証するものであった。

式■に示した如く、本発明の抗生物質は普通の方法に従
って酸付加塩を生成し得る塩基性官能基を有している。

式Ｉの化合物の代表的なそして適当な酸付加塩には有機
酸及び無機酸の双方、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、
硫酸、リン酸、酢酸、トルフルオロ酢酸、トリクロロ酢
酸、コハク酸、クエン酸、アスコルビン酸、乳酸、マレ
イン酸、フマル酸、パルミチン酸、コール酸、パモイン
酸、粘液酸、グルタミン酸、ショウノウ酸、グルタル酸
、ゲルコール酸、７タル酸、酒石酸、ラウリン酸、ステ
アリン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンス
ルホン酸、ソルビン酸、ピクリン酸、安息香酸、ケイ皮
酸等との標準反応によって生成した塩が含まれる。

本発明の遊離アミノまたは非−塩化合物の対応する付加
塩への転換及びその逆、即ち、本発明の付加塩の非−塩
型への転換は通常の技術範囲内であり、本発明に包含さ
れる。

例えば本発明の化合物は、非−塩をを水性溶媒に溶解し
、選んだ酸のややモル過剰量を加えることによって、対
応する酸付加塩に転換することができる。次に生じた溶
液または懸濁液を凍結して、所望の塩を回収する。

非−塩型が可溶性である溶媒に最終塩が不溶性である場
合、選んだ酸の化学量論的量またはややモル過剰量の添
加後、このものを非−塩型の有機溶液から濾過によって
回収する。

非−塩をは水性溶媒に溶解した対応する酸塩から製造す
ることができ、次に中和して非−塩型を遊離状態にする
。

中和に続いて脱塩を必要とする場合、普通の脱塩法を用
いることができる。

例えばシラン化したシリカゲル、非官能化したポリスチ
レン、アクリル及び調節された細孔径のポリデキストラ
ン樹脂［例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　
Ｌ　Ｈ２０］または活性化された炭素におけるクロマト
グラフィーを有利に用いることができる。望ましくない
塩を水溶液で溶離した後、所望の生成物を水及び有極性
または非極性有機溶媒の混合物の直線勾配溶離法または
段階勾配溶離法を用いて、例えばアセトニトリル：水の
５０＝５０からアセトニトリル約１００％までを用いて
溶離することができる。

当該分野において公知の如く、有利な精製法として製薬
学的に許容し得る酸または製薬学的に許容し得ぬ酸によ
る塩生成法を用いることができる。

生成及び単離後、上記式■の抗生物質の塩型を対応する
非塩または製薬学的に許容し得る塩に転化することがで
きる。

抗生物質Ａ／１６６８６因子Ａ’１１Ａ’２及びＡ’３
は殊にグラム陽性微生物に対して活性である。抗生物質
Ａ／１６６８６因子Ａ’２の微生物学的活性スペクトル
を次の第１表に示す。

第１表 Ａ／１６６８６因子Ａ’２の試験管内活性菌株　　　　
　　　　　　　　　　　Ｍ　ＩＣ（ｍｃｇ／ｍＱ）黄色
ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅ
ｕｓ）Ｔｏｕｒ　　　　　　　１黄色−ｊ　ＦつＩＵＩ
（Ｓｔ任投と仝４阻１祖岬四）Ｔｏｕｒ’　　　　　　
２黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａ
ｕｒｅｕｓ）Ｔｏｕｒ”　　　　　　１表皮ブドウ球菌
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓ）ＡＴＣＣ１２２２８０，２５化膿連鎖球菌　（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃ２０
３０，００８大便連鎖球菌　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ｆａｅｃａｌ　１ｓ）ＡＴＣＣ７０８００，５緑
色連鎖球菌　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍ１ｔｉ
ｓ）Ｌ７９６’　　　　　　　０．０３２ウニチル菌　
　（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ
）ＩＳＳ３０５４３　　　２ａ）接種物１０’ｃｆｕ／
ｍＱ ｂ）３０％ウシ血清添加 Ｃ）臨床的単離物 最少抑制濃度（ＭＩＣ）を肉汁または寒天の一連の２倍
希釈法によって測定した。培養媒質及び増殖条件ニブド
ウ球菌及び大便連鎖球菌に対して、等感作試験（Ｉ　ｓ
ｏ−Ｓ　ａｎｓｉｔｅｓｔ）肉汁［オキソイド（Ｏｘｏ
ｉｄ）　］　　；他の連鎖球菌に対して、トッド−ヒユ
ーイト（Ｔｏｄｄ−ＨｅｗｉｔＬ）肉汁［デイフコ（［
）ｉｆｃｏ）　］　　；嫌気性バクテリアに対して、ウ
イルキンスーチャＪＬ／グレア　（Ｗ　１ｌｋｉｎｓ　
−Ｃｈａｌｇｒｅｎ）寒天［Ｔ、Ｄ、　Ｗｉｌｋｉｎｓ
、　Ｓ、　Ｃｈａｌｇｒｅｎ：アンチミクロビアル・エ
ージエンツ・アンド番ケモセラビイ　　（Ａｎｔｉｍｉ
ｃｒｏｂ、　　Ａｇｅｎｔｓ　　　　Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒ、）　　　ｌ　　Ｏ，９２６（１９７６）］　　；最
終接種物は約ｔｏ’集落形成単位／ｍＱまたはスポット
である。ＭＩＧは３７℃で１８〜２４時間培養後、明白
な増殖を示さぬ最少濃度とみなす；嫌気性バクテリアに
対して、培養は嫌気性雰囲気下（Ｎ　！　：　ＣＯ！　
：　Ｈ２，８０：１０：１０）にて３７℃で４８時間で
あつた。因子Ａ’２の急性毒性を体重１８〜２２ｇの両
性のＣＤＬマウス１チャーレスハ因子リバー（Ｃｈａｒ
ｌｅｓ　　Ｒ１ｖｅｒ）　］において、無菌の塩水に溶
解した生成物の１回の静脈内注射によって測定した。

注入速度は０−１５ｍ（２７秒である。投薬レベルは−
７５、ｌＯ゛０．１２５及び１５０　ｍｇ／ｋｇである
。

計算したＬＤＳ６値はＩ　Ｏ３ｍｇ／　ｋｇである。他
の２種の生成物は抗生物質Ａ／１６６８６因子Ａ’２に
匹敵する生物学的活性を示した。

本発明の抗生物質化合物は主にダラム陽性の広範囲に生
存するバクテリアによる感染に対する薬剤を製造する際
に有用である。殊に、本発明の化合物は創傷感染及び痙
厘の局部的処置に対して有用である。

薬剤として用いる際に、本発明の化合物を遊離化合物の
形態または製薬学的に許容し得る酸によるその付加塩の
形態で異なる経路によって投与することができ、酸付加
塩型が好ましい。通常、局部的投与が本発明の化合物を
投与する最も適当な方法である。

医薬用途に対して、本発明の化合物を経口、局部的また
は非経口投与に適する製薬学的投与形態、例えば錠剤、
カプセル−剤、ロゼンジ、ゲルール（ｇｅｌｕｌｅ）、
粒剤、粉剤、軟膏、ゲル、溶液、クリーム、注射溶液、
懸濁液等中に配合することができる。例えば該投与形態
の調製物化は、レミントン・ファーマシューテイカル・
サイエンシイズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍ
ａｃａｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）、第１７版、
１９８５、メルク出版社（Ｍｅｒｃｋ　　Ｐｕｂｌｉｓ
ｈ　ｉｎｇ　　Ｃｏｍｐａｎｙ）、イーストン・ペンシ
ルベニア（Ｅａｓｔｏｎ　　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ
）、に記載された一般的な指示に従って行うことができ
る。

投与単位には活性成分０．０１〜９９％、好ましくは０
．５〜８０％を含ませることができる。

１日当りの投薬量は種々な因子、例えば体重、感染する
微生物、感染の重さ、患者の年令、投与の期間及び方法
に依存する。一般に、本発明の化合物は、１日当り１回
または随時それ以上に分けた投与として、約２　ｍｇ／
　ｋｇ体重範囲の１日当りの投薬量で有効である。明ら
かに、これらの投薬量は単なる表示であり、最も適当な
投薬量を、所望の効果を得るために必要な活性化合物の
量を決定するために有用な生物学的試験によって、特定
の場合及び用途に調節することができる。

以下の実施例は本発明を説明するものであり、その範囲
を限定するものと解釈するべきでない。

実施例 実施例１−アクチノプラネス・エス・ピーＡＴＣＣ３３
０７６の発酵及び粗製の発酵産 物の回収 １、　１　　アクチノプラネス・エス・ピーＡＴＣＣ３
３０７６の発酵 ２本の１８ｃｍオート・ミール寒天傾斜培地に接種する
ために、１株の凍結乾燥した小びんを用いた。２９°Ｃ
で一週間培養した後、一つの傾斜培地の菌糸体を、回転
かきまぜ（２００ｒ、ｐ、ｍ、）によって２９°Ｃで培
養した増殖媒質（１）１００−を含む容量５００ｍＡの
遮断したフラスコに接種した。

４８時間後、ｐＨ＝７．０を有する一つのフラスコノ増
殖した培養物を増殖媒質（１）（９００ｒ、ｐ、ｍ、；
２８℃：空気０．５　ｖ／ｖ、　ｍ）４１と共に７１容
器に移した。４８時間後、ｐＨ−７，１を有するタンク
培養物２５−を容量５０ｍｊ２のアンプルに分配した。

アンプルをドライアイス及びアセトンのスラリ中で凍結
させ、−７４℃で保存した。

１０本のアンプルの凍結した菌糸体を増殖媒質（１）の
１０個の遮断したフラスコ（２０００／４００ｒｎｌ　
）に接種した。回転かきまぜ（１５０ｒ、ｐ、ｍ、）に
よって２９℃で５１時間培養した後、フラスコは平均ｐ
Ｈ６，８を有していた。次に、１０個の全てのフラスコ
を、１２０℃で２０分間バッチ中で滅菌した増殖媒質４
０００１を充填した容量１０゜０００１の発酵器に接種
した。２９℃で６８時間後、ｐＨ６，８を有する予備培
養を、１２０℃で２０分間バッチ中で滅菌した発酵媒質
（２）各２０゜０００１を充填した容量２７．５００１
の２債の発酵器に接種した。発酵温度を２９℃で一定に
保持し、発酵過程を分析用ＨＰＬＣで追跡し、６５時間
後に止めた。

（１）：増殖媒質の組成 大豆ひきわり　　　　　　　　　　Ｌ３ｇ／ｌデキスト
ロース　　　　　　　　　１２ｇ／Ｊ！デキストリン　
　　　　　　　　　１３ｇ／ｌ炭酸カルシウム　　　　
　　　　　４ｇ／！（２）；発酵媒質の組成 大豆ひされり　　　　　　　　　３０ｇ／ｌグリセリン
　　　　　　　　　２０ｇ／ｌデキストロース　　　　
　　　　　　４ｇ／ｌデキストリン　　　　　　　　　
　　４ｇ／２粗製の麦芽エキス　　　　　　　２０ｇ／
ｌスクロース　　　　　　　　　　２０ｇ／ｌ炭酸カル
シウム　　　　　　　　　６ｇ／１１．２　　粗製の発
酵産物の回収 ２個の発酵器からの収穫汁を１０℃に冷却し、２０％（
Ｗ／Ｖ）ＨＣＩでｐＨ５にし、回転−過機で濾過した。

湿った菌糸体を分離し、アセトン１２．５００１で３回
、ｐＨ２（３０％ＭＣＩによる）で懸濁液を撹拌して抽
出し、そして遠心分離した。水アセトン性抽出液を４部
に分け、合計容量１２，６００！の酢酸エチルで抽出し
た。水相を真空下にて１８℃（内部温度）で７．０００
１に濃縮した。４℃に冷却した濃縮溶液に、ＣＨｓＣ１
＊２１０１の存在下において、１５％Ｎ）１４０Ｈｌ　
５０ＲをｐＨ７になるまで徐々に加えた。濾過助剤５５
ｋｇを加えた後、懸濁液を回転濾過機で濾過した。湿っ
たケーキを、各々アセトン２３ＯＮ及び水４４１の混合
物を用いて、ｐＨ２（２０％ＨＣｌ）で室温にてスラリ
にして再抽出した。ｐＨ２でアセトン：水６部４混合物
１１０１で固体を洗浄した後、３種の溶液及び洗液を合
液し、これに室温で撹拌しなからアセトン２．６００１
を加えた。−夜放置後、固体沈殿物を遠心分離し、アセ
トン２４０１で洗浄し、真空下にて室温で乾燥し、２８
％総Ａ／１６６８６抗生物質１（ＰＬＯタイターを有す
る粗製の発酵産物５４ｋｇを得た。

実施例２−抗生物質Ａ／１６ｆ１６因子Ａ’ｌ。

Ａ’２及びＡ’３の単離及び精製 ２．１　　Ａ／１６６８６抗生物買の精製した混合物 実施例１に従って得られた粗製の発酵産物１３ｋｇを約
１５℃で５％（ｗ／　ｖ）ＨＣｌ　８０Ｒによって、３
時間はげしく撹拌してスラッジにした。この懸濁液を遠
心分離し、固体分を５％ＨＣｌ２４１で洗浄した。湿っ
たケーキを脱色用ケイソウ土［トンシル・オプテイマム
（Ｔｏｎｓｉｌ　　Ｏｐｔｉｍｕｍ）Ｎ　ＦＦ　、ＳＬ
Ｉｄ−Ｃｈｅｍｉｅ　Ａ、Ｇ、Ｍｕｎｃｈｅｎｌ　１０
−５ｋｇ及び木炭［ダルコ（Ｄａｒｃｏ）Ｇ６０］２．
１ｋｇの存在下において、アセトン８０１及び水３３１
の混合物によって１５℃で抽出した。懸濁液を遠心分離
し、固体分をアセトン：水６：４混金物３０１で洗浄し
た。抽出液を合液しく合計１４０１）、これに撹拌しな
がらアセトン３５０１を徐々に加えた。−夜装置した後
、混合物を一連のバンカー濾過器で濾過した。生じたケ
ーキをアセトン：水９：ｌ混合物１ＯＮ、次にアセトン
４１で洗浄した。フィルター上に残った固体生成物を真
空下にて室温で７２時間乾燥し、Ａ／１６６８６抗生物
質の精製した調製物（８９％ＨＰＬＣタイター）１．８
６ｋｇが得られ、このものを本発明の化合物を単離する
ための精製に用いた。

２．２　抗生物質Ａ／１６６８６因子Ａ’　１　。

Ａ’２及びＡ’３の単離及び精製 上記節２．１に従って得られた調製物２７ｇを、１０％
（ｖ／　ｖ）　ＣＨｓ　ＣＮを含む水５ｍＪ２に溶解し
た各３００ｍｇに対して下記の装置及び条件を用いて、
分取ＨＰＬＣにかけた。

装置：装置をウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）モデル５９
０ポンプ、２８５ｎｎ＋に固定したウォーターズ・ラム
ダ−マックス（Ｗａｔｅｒｓ　　Ｌ　ａｍｂｄａ　−Ｍ
ａｘ）モデル４８１ＬＣ検出器及び５−ループを備えた
レオダイン（Ｒｈｅｏｄｙｎｅ）注入器を組み合わせて
つくった。

カラム：リクロソルブ（Ｌ　ｉＣｈｒｏｓｏｒｂ）ＲＰ
　−１８，１０、ｕ、２５０　＋ｎｍＸ　５０　ＩＩＩ
ｍ（Ｍｅｒｃｋ）移動相二ｏ、ｏ５Ｍ　　ＨＣＯＯＮＨ
，：ＣＨＩＣＮ（６４：３６） 流速：３０ｄ／分 操作を分析用ＨＰＬＣによって監視した（実施例５、節
５．１参照）。それぞれ因子Ａ’ｌ、因子Ａ’２及び因
子Ａ’３に富んだフラクションの群を分離し、フラクシ
ョンの各群を合液し、３種の溶液にし、このものを同様
の方法で次の如くして処理した。溶液を真空下で濃縮乾
固させ、残渣を分取ＨＰＬＣによって再び精製した。純
粋な成分を含むフラクションをプールし、真空下で濃縮
した。

固体残渣をエタノールに２回採り入れ、そして濾過によ
って捕集した。乾燥固体を０．１Ｎ　　ＭＣＩに溶解し
、凍結乾燥し、純粋な成分の塩酸塩が得られ、このもの
を分析及び物理化学的同定に付した。

上記の試料から、それぞれ次の量の因子Ａ’ｌ。

Ａ’２及びＡ’３の純粋な塩酸塩が得られた：１５０ｍ
ｇ、６００ｍｇ及び３０ｍｇ。

実施例３−抗生物質Ａ／１６６８６因子Ａ２の因子Ａ’
２への生物学的転換 米国特許第４．４２７．６５６に記載された方法に従っ
て製造した抗生物質Ａ／、１６６８６因子Ａ２（ＨＰＬ
Ｃタイター８９％）の試料（６００ｍｇ）を水２００ｍ
ｊ！（容量１０１００Ｏのフラスコ中）に溶解した。こ
の溶液に容量７１の容器の増殖媒質中の培養増殖物４０
０ｍｊ！を遠心分離して得られたアクチノプラネス・ニ
ス・ビーＡＴＣＣ３３０７６の菌糸体（接種菌糸体を製
造するために実施例１、節１．１に述べたとおり）を加
えた。現金物を３２℃にて２００　ｒ、ｐ、ｍ、で撹拌
し、生物学的転換を分析用ＨＰＬＣによって追跡した（
実施例５、節５．１参照）。

菌糸体懸濁液のＨＰＬＣ分析を２時間毎に行った。分析
パターンは、最初に２０５３μｇ／ｌｌ１ｌの濃度で因
子Ａ２を含んでいた菌糸体懸濁液は１８０時間後、それ
ぞれ２８２μｇ／ｍ１（３３％）及び５１３　ｐｇ／ｍ
ｌ　（６０％）の濃度で因子Ａ２及び因子Ａ’２を含ん
でいることを示した。

懸濁液を実施例１、節１．１の最初の部分における発酵
汁と同様の方法で処理し、抗生物質Ａ／１６６８６因子
Ａ２及びＡ’２の混合物の水アセトン性抽出液が得られ
、次にこのものを、各水アセトン抽出液の容量の約３倍
容量の割合でアセトンを加えて、該抽出液から沈殿させ
た。

次に固体沈殿物を濾過によって分離し、実施例２、節２
．１の最後の部分に述べた如くして処理し、それぞれ約
３３％及び約６０％のＨＰＬＣタイターを有する抗生物
質Ａ／１６６８６因子Ａ２及び因子Ａ’２の精製された
混合物を得た。該混合物から因子Ａ’２の単離及び精製
を実施例２の節２．２に従って行い、純粋な抗生物質Ａ
／１６６８６因子Ａ’２塩酸塩５５ｍｇを得た。

実施例４−抗生物質Ａ／１６６８６因子Ａ１、Ａ２及び
Ａ３の混合物の因子Ａ’ｌ。

Ａ’２及びＡ’３を含む混合物への生物学的転換 因子Ａｌ１３．９％、因子Ａ２　６４．３％、因子Ａ３
１２．３％（分析用ＨＰＬＣ）を含む抗生物質Ａ／１６
６８６複合体６００ｍｇの試料を実施例３に述べた如き
同一方法に付した。叉応を１４０時間後に止め、この間
、反応をＨＰＬＣによって監視した。菌糸体懸濁液の分
析パターンは、最初にそれぞれ３１３　ｐ　ｇ／ｍＡ、
１４３４　ｐｇ／ｍＡ及び２２７　ｐ　ｇ／ｍｌであっ
た因子Ａ１、Ａ２及びＡ３の濃度が１４０時間後、それ
ぞれ９６μｇ／ａｌ（１０％）、２７３　μｇ／ｍ１　
（２９，４％）及び８５μｇ／ｍ１（８，９％）に減少
し、一方、因子Ａ’ｌ。

Ａ’２及びＡ’３の濃度はそれぞれ９９　ｐ　ｇ／　ｒ
ｎｆｌ（１０，３％）、３６４　ｐｇ／ｍｌ　（３７，
９％）及び４５μｇ／ｍｊ！（４，７％）であることが
わかった。

懸濁液を実施例３に述べた如くして処理し、次のＨＰＬ
Ｃタイターを有するＡ／１６６８６抗生物質の精製され
た混合物を得た：因子ＡＩ（１０％）、因子Ａ２（２８
％）、因子Ａ３（９％）、因子Ａ’１（１０％）、因子
Ａ’２（３８％）、因子Ａ’　３　（５％）。この調製
物から因子Ａ’１　、Ａ’２及びＡ’３を、実施例２、
節２．２で述べた同様な方法によって、それぞれの塩酸
塩をで単離した。

実施例５−評価分析及び物理化学的特徴同定５、１　　
分析ＨＰＬＣ 装置：２５４ｒｏ＋＋に固定したＵＶ検出器を備えたヒ
ユーレット・パラカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ　−Ｐ　ａｃ
ｋａｒｄ）液体クロマトグラフ、モデル１０８４Ｂ カラム；エルパシル（Ｅ　ｒｂａｓｉｌ）Ｃ−１８，５
μ、１５０　ｍｍＸ　４　、６　ｃｍ（Ｃａｒｌｏ　　
Ｅ　ｒｂａ）移動相：Ａ）０．０５Ｍ　　ＮａＨ，Ｐｏ
ｔ　　ｐＨ４；Ｂ）　　０．０５Ｍ　　ＮａＨ２ＰＯ２
ｐＨ４：ＣＨ３ＣＮ７３：２３ 流速：０．５ｍｌ／分 勾配溶離プロフィール二分　　０　１０　４０％Ｂ　　
４５　４５　６５ 注入容量：水中の約０−５ｍｇ／ｍｊ！で試験する物質
の溶液２０μ！ これらの条件下で、それぞれの保持時間は次のとおりで
あった： ｔＲ（分） 因子Ａｌ　　　　　　　　　　１５．１４因子Ａ’１　
　　　　　　　１７．８１因子Ａ２　　　　　　　　２
０．３０ 因子Ａ’２　　　　　　　　２２．７０因子Ａ３　　　
　　　　　２４．８５ 因子Ａ’３　　　　　　　　２７．２４評価分析を発酵
汁について行う場合、分析試料を次の如くして調製した
： 発酵汁２ｍｌを取り出し、これに６Ｎ　　ＭＣＩ４０μ
ｌを加えてｐＨ＠ｉ１．８乃至２．０間にした。

混合物にアセトン２ｍｌを加え、１０分間撹拌し、次に
３００　Ｏｒ、ｐ、ｍ、で遠心分離した。菌糸体を分離
し、溶液の２ｍｌを等容量の酢酸エチルで抽出した。２
相を分離した後、水層を分離しく約１．２ｍｌ　）、Ｈ
ＰＬＣ測定に用イタ。

５．２　糖分析 カバレリイ（Ｂ　、　Ｃａｖａｌｌｅｒｉ）等により、
ザ・ジャーナル・イブ・アンティビオティクス（Ｔ　ｈ
ｅＪｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ
）、第３７巻、第４号、３０９〜３１７（１９８４）に
記載された如くして、精測定を酸加水分解（２Ｎ　　Ｈ
，Ｓｏい　１００℃、２時間）後に行った。３種の因子
Ａ’　！　。

Ａ’２及びＡ’３の各分子に対して１個のＤ−マンノー
スの存在が認められた。

５．３　アミノ酸分析及び”Ｈ−ＮＭＲ酸加水分解を密
封管中にて全ての３種の化合物について、６Ｎ　ＭＣＩ
を用いて１０５°Ｃで２０時間行った。アミノ酸の混合
物を強酸性スルホン性ジビニルベンゼン樹脂［ダウエッ
クス（Ｄ　ｏｗｅｘ）　５ＯＷＩ上で、０．５Ｎから２
Ｎへ増加する濃度の水性ＨＣＩで溶離してカラムクロマ
トグラフィーによって分離した。

アミノ酸を’Ｈ−ＮＭＲ及びＧＣ−ＭＳに基ずき、確実
な試料と比較して同定した。完全な分子におけるアミノ
酸比及びその配列をＮＭＲ実験によって測定した。

全ての３種の化合物は同様なアミノ酸組成及び配列を示
した。次の第■表は３種の因子Ａ’ｌ。

Ａ’２及びＡ’３の各々におけるアミノ酸残基のタイプ
及び数を示す。

第■表 スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸　　ｌアスパラ
ギン酸　　　　　　　　　　　　　ｌアロースレオニン
　　　　　　　　　　　　３グリシン　　　　　　　　
　　　　　　　　　ｌアラニン　　　　　　　　　　　
　　　　　　１４−ヒドロキシフェニルグリシン　　　
　　５０イシン　　　　　　　　　　　　　　　　　ｌ
フェニルアラニン　　　　　　　　　　　　　１３−ク
ロロ−４−ヒドロキシフェニルグリシン　ｌオルニチン
　　　　　　　　　　　　　　　２各因子の１モル当り
アンモニア２当量をそれぞれの酸加水分解混合物につい
て、アミノ酸自動分析器を用いて滴定し、２個の第一ア
ミド基の証拠を得た。

更に、”Ｎ−ＮＭＲにより得られるアミド性窒素原子（
１９）の総数は分子内のアミノ酸の数によるペプチド結
合に含まれる窒素原子の数を２個上回った（第■表）。

因子の滴定は遊離カルボン酸の存在を示さなかった。こ
の考えは２個の第一アミド基がそれぞれアスパラギン酸
及びスレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸にあること
を支持するものである。

ＮＭＲスペクトルを２５〜６０℃の温度範囲において、
アスペクト（Ａｓｐｅｃｔ）３０００コンピユーターを
備えたブルーカー（Ｂ　ｒｕｋｅｒ）Ａ　Ｍ　２５０分
光計で記録した。

測定中、水のピークを抑制するためにいくぶん改変して
、標準パルス続発及び標準ソフトウェアを２Ｄ−ＮＭＲ
スペクトルに対して用いた。

次の２Ｄ法を用いた：Ｃ０５Ｙ、　　Ｒｅ１ａｙｅｄ　
　Ｃｏ５ｙ、　　［チャジン（Ｗ　、　Ｊ　、　Ｃｈａ
ｚｉｎ）、ゴールデンベルグ（Ｄ　、　Ｐ　、　Ｇｏｌ
ｄｅｎｂｅｒｇ）、クレイトン（Ｔ。

Ｅ　、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、ビットリツヒ（Ｋ　、
　Ｗｕｔｈｒｉｃｈ）：ユーロピアン・ジャーナル・イ
ブ・ケミストリイ（Ｅｕｒ、　　Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　）、１５２．４２９〜４３７（１９８５）］、長
い範囲のカップリングの増進によるＣ０５Ｙ［パックス
（Ａ、Ｂａｘ）、フリーマン（Ｒ、Ｆ　ｒｅｅｍａｎ）
：ジャーナル・イブやマグネティク・レゾナンス（Ｊ　
、　Ｍａｇｎ、　Ｒｅ５ｏｎ、　）、土１．５４２−５
６１（１９８１）］、Ｎ０ＥＳＹ［マフラ（Ｓ　、　Ｍ
ａｃｕｒａ）、Ｋ、　Ｗｕｔｈｒｉｃｈ、　Ｌルンスト
（Ｒ。

Ｒ，Ｅｒｎ５ｔ）：Ｊ　、　Ｍａｇｎ、　Ｒｅ５ｏｎ、
　４７　；３５１−３５７（１９８２月及びＣ０ＬＯＧ
［ケスラー（Ｈ。

Ｋ　ｅｓｓｌｅｒ）、グリーシンガー（Ｃ、Ｇ　ｒｉｅ
ｓｉｎｇｅｒ）、ザルポック（Ｊ　、　Ｚ　ａｒｂｏｃ
ｋ）、ルースリイ（Ｈ，Ｒ。

Ｌｏｏｓｌｉ）：Ｊ　、　Ｍａｇｎ、　Ｒｅ５ｏｎ、　
５ユ、３３１−３３６（１９８４）１゜ 次の第■表に、ｐＨ４，６、温度４０℃、内部基準ＴＭ
Ｓ（δ−０，ＯＯｐｐｍ）でＨ２Ｏ：ＤＭＳＯ１４：ｌ
中の抗生物質Ａ／１６６８６因子Ａ’２のアミノ酸部分
のアミノ酸の’Ｈ−ＮＭＲ化学シフト（δ、ｐｐａ＋）
を示す。

因子Ａ’ｌ及びＡ’３は同一パターンを示した。

第１図は因子Ａ’２の’Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

因子Ａ’ｌ及びＡ’３の’Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ア
スパラギン酸部分に結合した脂肪酸鋼に起因するシグナ
ルは別として、因子Ａ’２と同一パターンを示した。

５．４　脂肪酸部分 第■表に、ｐＨ４，６、温度４０°Ｃ１内部基準ＴＭＳ
（δ＝０．ＯＯｐｐｍ）でＨ，Ｏ：ＤＭＳＯ１４：ｌ中
の３種の化合物の各々の脂肪酸部分の’Ｈ−ＮＭＲ化学
シフト（δ、ｐｐｍ）指示を集約した。

５．５糖 Ｄ−マンノース単位は、ｐＨ４，６、温度４０℃、内部
基準ＴＭ　Ｓ　（＆　＝　０．００ｐｐｍ）テＨ！Ｏ：
ＤＭ　ＳＯ，４：１にて３種の因子の各々に対して次の
鳳Ｈ−ＮＭＲシグナル（δ、ｐｐｍ）を示した：５．４
０（１個の芳香族プロトン）；４．０１，３．９１−３
゜７１．３．６０−３．５１（他のプロトン）。ペプチ
ド部分に対する糖の結合点をＮＭＲ実験［核オーバーハ
ウゼル効果（Ｎ　ｕｃｌｅａｒ　　Ｏｖｅｒｈａｕｓｅ
ｒ　　Ｅ　ｆｆｅａｔ）］によって測定した。

５．６　ラクトン環 ラクトン環の存在はＩＲスペクトルにおいて１７６０ｃ
ｍ″″Ｉでの吸収によって支持される。ラクトン結合の
位置は、 ａ）そのカルボン酸基によるラクトン結合に起因するア
ミノ酸の同定、 ｂ）そのヒドロキシル基によるラクトン結合に起因する
ヒドロキシ−アミノ酸の同定 によって立証される。

工程ａ）に従い、細かく粉砕したＣａＣ１ｘ（２，５ｇ
）を磁気的に撹拌しながら、無水ＥｔＯＨ（１５０ｒｓ
ｌ　）中のＮａＢ　Ｈ４（１−５ｇ）の冷却された（０
〜５℃）溶液に加えた。１．５時間後、乾燥ＤＭＦ（５
０ｍｌ）に溶解した因子Ａ’２（Ｉｇ）を滴下した。冷
却した反応混合物を２４時間撹拌し、次に注意して水（
６００ｍｌ）に注いだ。ｐＨを水性ＨＣＩで５に調節し
、この溶液を、大孔性の交叉結合したポリスチレン樹脂
ＸＡＤ−２［アムバーライト・ローム・アンド・ハース
（Ａ　ｎ＋ｂｅｒｌｉｔｅ　　Ｒｏｈ＋ｉ　　ａｎｄＨ
ａａｓ）］を充填したカラムで、まず塩を除去するため
にＨ，Ｏで溶離して脱塩し、０．０１Ｎ　　ＨＣｌ：Ｃ
ＨｓＣＮｌ：１混合物で溶離して還元ペプチドを回収し
た。ペプチドを含むフラクションを合液し、真空下で濃
縮乾固させた。

樹脂を１０５℃にて６Ｎ　　ＭＣＩで２０時間加水分解
した。酢酸エチルで抽出後の酸性溶液を真空下で濃縮し
た。残渣をダウエックス５０ＷＸ４カラムで、溶離剤と
して０．５Ｎ　　ＭＣＩを用いてクロマトグラフィーに
かけた。必要とする化合物を含むフラクション（二次元
ＨＰＴＬＣによってチエツク：セルロース、初流ブタノ
ール：酢酸：Ｈ２Ｏ４：ｌ：５、上部層、第二流ピリジ
７：Ｈ，０４：ｌニアミノ酸のスポットを、ニンヒドリ
ンで噴霧し、１２０℃に５分間加熱して突きとめた）を
合液し、そして濃縮した。油状残渣を分取層クロマトグ
ラフィー（Ｓｉｎ、、５ｍｍ厚さ、ブタノール：酢酸：
Ｈ２Ｏ４：ｌ：５、上部層）に再びかけ、２−アミノ−
２−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）エチルア
ルコールを得た：’Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＤＭＳ
Ｏ−ｄａ）δ、ｐｐｍ３−４５　（＋＋＋。

ＣＨ，水のシグナルで一部おおわれた）、３．３８（ｍ
、ＣＨ２）、６．９２（ｄ、ＣＨ−５）、７．１１（ｄ
ｄ、ＣＨ−６、”Ｊ　−８，８Ｈｚ）、７．３２（ｄｄ
。

ＣＨ−２，’Ｊ−２，５Ｈｚ）。更に、構造式を、３−
クロロ−４−ヒドロキシフェニルグリシン（３０ｍｇ）
から、上記の方法に従ってこのものをそのメチルエステ
ルに転化しくＭｅＯＨ、ＨＣｌ）、次にＣａ（Ｂ　Ｈ４
）！で還元して製造した確実な試料と比較して確認した
。工程ｂ）をまず因子Ａ’２と７エニルイソシアネート
とを反応させて行った。後者はペプチドの全ての遊離ヒ
ドロキシル及びアミノ基と反応して、それぞれウレタン
及びウレアを生じ、これらのものは実施例５、節３に述
べた如く、行う酸加水分解に対して通常より耐性である
。ヒドロキシアスパラギン酸の量は減少しないが、他の
ヒドロキシル化されたアミノ酸の量が減少し、かくして
、そのヒドロキシル基とラクトン結合に含まれるアミノ
酸であることを示している。従って、因子Ａ’２（ｌ　
ＯＯｍｇ）をＤＭＦ（２＋１Ｉｔ）に溶解し、フェニル
イソシアネート（３００μｍ）を加えた。反応混合物を
室温で４８時間放置し、Ｈ，０（２０ｍｊりを加えて反
応を止め、そして濾過した。

固体化合物を加水分解し、実施例５、節３に述べた如く
して、そのアミノ酸組成を分析した。

Ａ’ｌ及びＡ’３を用いて行った同様な実験は対応する
結果を示した。

実施例６−ＩＲ，ＵＶ及びＦＡＢ−ＭＳ７．ベクトル ６．１　パーキン−エルマー（Ｐ　ｅｒｋｉｎ　−Ｅ　
１ｍｅｒ）モデル５８０分光光度計によりヌジョール・
マルとして記録した因子Ａ’２の！Ｒスペクトルを添付
の第２図に示した。次の吸収極大が認められた：３５０
０−３１００（ｎｙ　　ＮＨ及びｎｙＯＨ）、３０２０
−２８００（ヌジョール）、ｌ　７６０　（ｎｙＣ−０
，ラクトン）、１６３０（ｎｙ　　Ｃ−０，アミドＩ）
、１５１０（δＮＨ，アミドＵ）、１４６０及び１３７
５（ヌジョール）、１２２５（ｎｙ　　Ｃ−０゜ラクト
ン）、１０６５−９８０（ｎｙ　　Ｃ−０，糖）、８４
０及び８１５ｃｍ−”（γＣＨ芳香族）。

他の２種の因子のスペクトルは実質的な差異を示さなか
った。

６．２　パーキン−エルマー・モデル３２０分光光度計
により水中で記録した因子Ａ’２の紫外線スペクトルを
添付の第３図に示した。このスペクトルは次の吸収極大
を示した：　２３２　ｎｍ（ｌｏｇｇ４゜６４）、２７
０Ｈｍ（ｌｏｇｇ　４．３４）。他の２種の因子のスペ
クトルは実質的な差異を示さなかった。

６．３　高速原子衝撃質量スペクトル（Ｆ　Ａ　Ｂ　−
ＭＳ）を、マトリックスとしてチオグリコール／グリセ
リンｌ：１混合物を用いて、ＭＳ９１５０ＴＣ装置で記
録した。衝撃ガスＸｅ；運動エネルギー５ＫｅＶ；加速
電圧４ＫＶ、カチオン化された分子イオンＭＨ＋の同位
体クラスターはそれぞれ２３７５（因子Ａ’　ｌ　）、
２３８９（因子Ａ′２）及び２４０３（因子Ａ′３）の
分子量を示した。これらのデータ、及びそれぞれのＭＨ
＋イオンから１６３Ｕの損失に対応するフラグメント・
イオンのスペクトルの存在は指示した構造式と一致した
。

６．４　元素分析 試料を不活性雰囲気下にて約１４０℃で前もって乾燥し
た後の元素分析はほぼ次の百分率組成を示した： 因子Ａ’ｌ　　因子Ａ’２　　因子Ａ’３Ｃ％　　　　
５４．２　　５５．２　　５５．８Ｈ％　　　　　５．
８　　　５．４　　、　６．２Ｎ％　　　　１１．８　
　１２．６　　１１．４Ｃ１％　　　　　１９　　　４
．２　　　１０灰分％　　　　０．９　　　１．３　　
　０．７上記の値はそれぞれ３種の化合物の二塩酸塩に
対して計算しＩ；値と一致した。

本発明の主なる特徴及び態様は以下のとおりである。

１、式Ｉ υに 式中、Ｒは一〇〇−ＣＭ　−Ｃｌ−ＣＨ端ＣＨ−ＣＨ！
−ＣＨ□−ＣＨ，、−ＣＯ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ−
ＣＨｔ−ＣＨ−（ＣＨｓ）　！または−Ｃｏ−ＣＨ雪Ｃ
Ｈ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨｓ　−ＣＨ！　−ＣＨ（ＣＨ３）
　ｘであり、そして Ｒ′はα−Ｄ−マンノピラノシルである、の化合物及び
その酸付加塩。

２、Ｒが−Ｃｏ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ■ＣＨ−ＣＨ！　−
ＣＨ！　−ＣＨｓである上記ｌに記載の化合物。

３、Ｒが−Ｃｏ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ諺ＣＨ−ＣＨ！−Ｃ
Ｈ（ＣＨｓ）＊である上記ｌに記載の化合物。

４、Ｒが−Ｇｏ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ−ＣＨ！　　
ＣＨ！　−ＣＨ（ＣＨｓ）ｔである上記ｌに記載の化合
物。

５、二塩酸塩である上記ｌに記載の酸付加塩。

６、（ａ）微生物アクチノプラネス・ニス・ビー（Ａｃ
ｔｔｎｏｐｌａｎｅｓ　　ｓｐ、）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３３
０７６またはその産生突然変異体を同化可能な炭素及び
窒素源並びに無機塩を含む水性媒質中にて、浸水好気性
条件下で発酵させ、（ｂ）菌糸体を発酵汁から分離し、
（Ｃ）菌糸体塊を適当な溶媒系で抽出し、（ｄ）粗製の
発酵産物を該抽出液から単離し、そして（ｅ）単離した
粗製の発酵産物から上記の抗生物質を分離し、そして精
製することからなる上記ｌに記載の化合物の製造方法。

７、炭素源をデキストロース、フラクトース、マルトー
ス、スクロース、グリセリン及びデキストリンから選び
、窒素源を大豆ひきわり及び麦芽エキスから選ぶ上記６
に記載の如き方法。

８、発酵を２４乃至３５℃間、好ましくは２８乃至３２
℃間の温度で、抗生物質活性の増加が認められる期間行
う上記６及び７のいずれかに記載の如き方法。

９、菌糸体を発酵汁からｐＨ４，５乃至５．５間で濾過
または遠心分離によって分離する上記６〜８のいずれか
に記載の方法。

１０、菌糸体塊をｐＨ１，５乃至２．５間で、低級アル
カノール、アセトン及びその混合物から選ばれる水混和
性有機溶媒で抽出する上記６〜９のいずれかに記載の如
き方法。

１１、粗製の発酵産物を菌糸体塊の抽出液から、これに
抗生物質の酸付加塩が難溶性である水混和性有機溶媒を
加えることによって単離する上記６〜１０のいずれかに
記載の如き方法。

１２、水混和性有機溶媒をアセトン及びイソプロパツー
ルから選ぶ上記１１に記載の如き方法。

１３、単離した粗製の発酵産物から抗生物質の分離及び
精製を分取ＨＰＬＣ方によって行う上記６〜１２のいず
れかに記載の如き方法。

１４、分離及び精製法をＣ−１８アルキルシラン化され
たシリカゲルカラム並びに水性ギ酸アンモニウム及びア
セトニリトルの溶離剤混合物を用いて行う上記１３に記
載の如き方法。

１５、発酵工程中、式Ｉの抗生物質の一つの比が他のも
のよりも選択的に増加させるために、適当な前駆物質を
加える上記６〜１４のいずれかに記載の如き方法。　。

１６、前駆物質をロイシン、バリン、イソ吉草酸、イソ
酪酸またはその塩から選ぶ上記１５に記載の如き方法。

１７、抗生物質Ａ／１６６８６因子Ａ１、Ａ２及びＡ３
またはその混合物を含む基質をＡ／１６６８６抗生物質
を産生し得るアクチノプラネス・エス・ピーＡＴＣＣ３
３０７６或いはその天然または人工的突然変異体の菌糸
体と接触させることからなる上記ｌに記載の化合物の製
造方法。

１８、基質をｐＨはぼ７及び２８乃至３５℃間、好まし
くは２９乃至３３℃間の温度で、５０乃至２００時間の
期間、菌糸体と接触させる上記１７に記載の如き方法。

１９、菌糸体を前もって発酵汁から単離し、基質との接
触を水溶液或いは水と、好ましくは低級アルカノール及
びアセトンから選ばれる１種またはそれ以上の水混和性
有機溶媒との混合物中で行う上記１７及び１８のいずれ
かに記載の如き方法。

２０、菌糸体懸濁液をｐＨ１，５乃至２．１間の酸性に
し、これに水混和性有機溶媒または水混和性有機溶媒の
混合物を加え、いかなる場合にも、該溶媒（複数種）は
菌糸体塊から反応産物（複数種）の抽出に対して十分な
量で反応混合物中に既存しておらず、菌糸体を遠心分離
または濾過によって分離し、そして次に抽出液を上記１
１−１４のいずれかに従って処理することにより、反応
産物を反応媒質から分離する上記１７〜１９のいずれか
に記載の方法。

２１、基質及び菌糸体間の接触を、発酵産物と菌糸体と
の接触を延長して発酵汁中で直接行い、そして反応産物
の回収を上記９〜１４にいずれかに従って行う上記１７
に記載の如き方法。

２２、抗バクテリア剤として使用するための上記ｌに記
載の化合物。

２３、上記ｌに記載の式Ｉの化合物またはその製薬学的
に許容し得る酸付加塩を含んでなる製薬学的組成物。

２４、グラム陽性微生物による感染病を防除するための
薬剤の製造における上記１に記載の化合物の使用。

２５、創傷感染または！［の処置において使用するため
の上記１に記載の化合物。

２６、必要とする哺乳動物に上記ｌに記載の化金物の抗
バクテリア的有効量を投与することを特徴とする哺乳動
物における感染病の処置方法。

２７、感染病が創傷感染または痙癒である上記２６に記
載の方法。

２８、活性成分として上記ｌに記載の化合物を含んでな
る製薬学的組成物。

２９、創傷感染またはＩＥｆｆｉの局部的処置に対して
殊に有用な上記２８に記載の製薬学的組成物。

【図面の簡単な説明】 第１図は因子Ａ’２の’Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。 第２図は因子Ａ’２のＩＲスペクトルを示す。 第３図は因子Ａ’２のＵＶスペクトルを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 I ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒは−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＿２
   −ＣＨ＿２−ＣＨ＿３、−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ
   Ｈ−ＣＨ＿２−ＣＨ−（ＣＨ＿３）＿２または−ＣＯ−
   ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＿２−ＣＨ＿２−ＣＨ（
   ＣＨ＿３）＿２であり、そして Ｒ′はα−Ｄ−マンノピラノシルである、 の化合物及びその酸付加塩。 ２、（ａ）微生物アクチノプラネス・エス・ピー（Ａｃ
   ｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ　ｓｐ．）ＡＴＣＣ３３０７６ま
   たはその産生突然変異体を同化可能な炭素及び窒素源並
   びに無機塩を含む水性媒質中にて、浸水好気性条件下で
   発酵させ、 （ｂ）菌糸体を発酵汁から分離し、 （ｃ）菌糸体塊を適当な溶媒系で抽出し、 （ｄ）粗製の発酵産物を該抽出液から単離し、そして （ｅ）単離した粗製の発酵産物から上記の抗生物質を分
   離し、そして精製することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の化合物の製造方法。 ３、抗生物質Ａ／１６６８６因子Ａ１、Ａ２及びＡ３ま
   たはその混合物を含む基質をＡ／１６６８６抗生物質を
   産生し得るアクチノプラネス・エス・ピーＡＴＣＣ３３
   ０７６或いはその天然または人工的突然変異体の菌糸体
   と接触させることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の化合物の製造方法。 ４、特許請求の範囲第１項記載の式 I の化合物または
   その製薬学的に許容し得る酸付加塩を含んでなる製薬学
   的組成物。 ５、グラム陽性微生物による感染病を防除するための薬
   剤の製造における特許請求の範囲第１項記載の化合物の
   使用。 ６、創傷感染または■瘡の処置において使用するための
   特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ７、必要とする哺乳動物に特許請求の範囲第１項記載の
   化合物の抗バクテリア的有効量を投与することを特徴と
   する哺乳動物における感染病の処置方法。 ８、感染病が創傷感染または■瘡である特許請求の範囲
   第７項記載の方法。