DE3887292T2

DE3887292T2 - Antibiotische Verbindungen, genannt A/16686-Faktoren A'1,A'2 und A'3.

Info

Publication number: DE3887292T2
Application number: DE88116947T
Authority: DE
Inventors: Francesco Assi; Bruno Cavalleri; Romeo Ciabatti; Maurizio Denaro; Luciano Gastaldo
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1987-11-27
Filing date: 1988-10-13
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2008-10-14
Also published as: JPH01168700A; ATE100470T1; ES2061590T3; EP0318680B1; JPH0791315B2; DK612188D0; EP0318680A2; KR890008168A; EP0318680A3; DK612188A; IE883451L; GB8727807D0; DE3887292D1

Description

Die Erfindung betrifft Depsipeptidverbindungen der folgenden Strukturformel I
worin:
R für
-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub3;,
-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2; oder
-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2;
steht und R' alpha-D-Mannopyranosyl bedeutet und die Säureadditionsalze davon, das Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung als Antibiotika. Die vorstehend erwähnten Substanzen entsprechen dem Antibiotikum A/16686 und werden von demselben Mikroorganismums Actinoplanes sp. ATCC 33076, der das vorstehend erwähnte Antibiotikum erzeugt, erzeugt.
Das Antibiotikum A/16686 ist eine Substanz, die gegen Gram-positive Bakterien wirksam ist und wurde in dem U.S. Patent 4,303,646 zusammen mit seinem herstellungsverfahren und es enthaltenden pharmazeutischen Präparaten beschrieben. Es wurde dann gefunden, daß drei eng verwandte Komponenten aus dem Antibiotikum A/16686 isoliert werden konnten, die als Faktoren A1, A2 und A3 bezeichnet wurden. Der Faktor A2 (Ramoplanin) ist die Komponente, die in vorwiegenden Mengen erhalten wird und ist für die biologische Aktivität am wichtigsten, während die Faktoren A1 und A3 in Minormengen erhalten werden. Diese Substanzen, sowie ihre Herstellung und Verwendungen, sind in dem U.S. Patent 4,427,656 beschrieben.
Ein Verfahren zur selektiven Erhöhung der Erzeugung der Faktoren A2 und/oder A3 des Antibiotikums A/16686 durch Zugabe von geeigneten Vorläufern zu einer A/16686 erzeugenden Kultur ist in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0259780 beschrieben.
Die drei erfindungsgemäßen Verbindungen, die der Kürze halber als A/16686-Faktor A'1 (R = -CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub3;), Faktor A'2 (R = -CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2;) bzw. Faktor A'3 (R = -CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;- CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2;) bezeichnet werden, können durch Fermentation durch Actinoplanes sp. ATCC 33076, ein Stamm, der bei der permanenten Kultursammlung ATCC, wie in dem U.S. Patent Nr. 4,303,646 beschrieben, hinterlegt wurde und der nun frei verfügbar ist und gemäß dem Budapester Vertrag am 31. Januar 1981 angenommen wurde, oder einer erzeugenden Mutante davon (das heißt natürliche oder künstliche Mutante mit der Fähigkeit die gleichen Substanzen zu erzeugen), unter submersen aeroben Bedungungen in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, erzeugt werden. Um Arbeitsmengen (in diesem Fall soll der Ausdruck "Arbeitsmengen" bedeuten, daß die Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen, die in dem Rohisolat aus der Fermentationsbrühre enthalten ist, ausreichend ist, um ihre Isolierung mit üblichen Trenn- und Reinigungstechniken in einer Menge, die für Versuchszwecke und die praktische Verwendung geeignet ist, zu gestatten) der drei vorstehend erwähnten Verbindungen in dem rohen Fermentationsprodukt zu erzeugen, müssen die Fermentationsmedien geeignete Quellen der vorstehend erwähnten essentiellen Elemente enthalten.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Dextrose, Fructose, Maltose, Saccharose und dergleichen, Polyole, wie Glycerin und dergleichen, Stärke und modifizierte Stärken, wie Dextrin, wobei Saccharose, Glycerin und Dextrin am meisten bevorzugt sind. Es scheint jedoch, daß wenn die Konzentration an Dextrose in dem Nährkulturmedium mäßig oder niedrig ist, dies einen positiven Effekt auf die Bildung der Verbindungen der Formel I hat, wie aus ihrem größeren Anteil in dem Rohisolat aus der Fermentationsbrühre abgeleitet werden kann.
Bevorzugte Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Pepton, Trypton, Malzextrakt, Hefeextrakt, Aminosäuren und dergleichen, wobei Sojabohnenmehl und Malzextrakt am meisten bevorzugt sind.
Unter den anorganischen Salzen, die üblicherweise in die Kulturmedien eingearbeitet werden, sind übliche lösliche Salze mit der Fähigkeit, Natrium-, Kalium-, Eisen-, Zink-, Kobalt-, Mangan-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium,-, Chlorid-, Iodid-, Carbonat-, Sulfat-, Phosphat-, Nitrat-Ionen und dergleichen abzugeben.
Die Zugabe von geeigneten Vorläufern während der Fermentation gemäß dem in der europäischen Patentanmeldung Publikationsnummer 0259780 beschriebenen Verfahren können nützlich sein, um selektiv das Verhältnis eines der neuen Antibiotika der Formel I gegenüber den anderen zu erhöhen. Beispielsweise erhöht die Zugabe von 0,2 g/l bis 5 g/l Leucin (oder deren Salze) das Verhältnis des Faktors A'2 relativ zu den Faktoren A'1 und A'3, während die Zugabe von 0,2 g/l bis 5 g/l Valin (oder dessen Salz) selektiv das relative Verhältnis des Faktors A'3 erhöht. Isovaleriansäure besitzt die gleiche Wirkung wie Leucin, während Isobuttersäure die gleiche Wirkung wie Valin besitzt.
Üblicherweise wird der Antibiotika-erzeugende Stamm in einem Schüttelkolben vorgezüchtet, und dann wird die Kultur verwendet, um Fermenterbehältnisse zur Erzeugung beachtlicher Mengen der antibiotischen Substanzen zu inokulieren. Das für die Vorkultur verwendete Medium kann das gleiche sein, wie es für die größeren Fermentationen verwendet wird, aber andere Medien können auch verwendet werden. Der erzeugende Stamm kann bei Temperaturen zwischen 20 und 40ºC, bevorzugt zwischen 24 und 35ºC, am bevorzugtesten zwischen 28 und 32ºC für eine Zeitspanne (im allgemeinen variierend von 30 bis 180 Stunden), während derer ein Ansteigen der antibiotischen Aktivität beobachtet wird, gezüchtet werden.
Während der Fermentation kann die Antibiotikaproduktion durch Testen von Proben aus der Brühe oder dem Mycelextrakt auf antibiotische Aktivität, beispielsweise durch Bioassay oder TLC- oder HPLC-Verfahren überwacht werden.
Auf die erfindungsgemäßen Antibiotika empfindliche Organismen, wie Bacillus subtilis oder Bacillus pumilus können als Testorganismen verwendet werden. Der Bioassay wird zweckdienlicherweise nach dem Agar-Diffusionsverfahren auf Agarplatten durchgeführt.
Die maximale Produktion der Antibiotikaaktivität tritt im allgemeinen zwischen dem dritten und fünften Tag nach der Inokulation ein.
Die während der Fermentation des Stammes Actinoplanes sp. ATCC 33076 erzeugten Antibiotika befinden sich hauptsächlich in der Mycelmasse. Daher werden die erfindungsgemäßen Antibiotika geeigneterweise durch Abtrennen des Mycels von der Fermentationsbrühe, Extrahieren der Mycelmasse mit einem geeigneten Lösungsmittelsystem, Isolieren des Rohfermentationsprodukts aus dem Extrakt, Abtrennen und Reinigen der vorstehenden antibiotischen Substanzen aus dem isolierten Rohfermentationsprodukt isoliert. Ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung der Antibiotika A/16686-Faktoren A'1, A'2 und A'3 umfaßt die Extraktion des nassen Mycels nach der Abtrennung von der Fermentationsbrühe durch Filtration bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 5,5.
Die Extraktion der Mycelmasse wird am besten mit wassermischbaren organischen Lösungsmitteln, wie niedrigen Alkanolen, Aceton und ihren Gemischen bei einem pH-Wert zwischen 1,5 und 2,5 durchgeführt.
Ein rohes Fermentationsprodukt (das "Rohprodukt"), das ein Gemisch aus A/16686-Antibiotika, das heißt den Faktoren A1, A2 und A3 (U.S. Patent 4,427,656) im Gemisch mit den erfindungsgemäßen Verbindungen, d. h. den Faktoren A'1, A'2 und A'3 zusammen mit Verunreinigungen, Nebenprodukten, Salzen, Filterhilfsmitteln und Materialien, die sich von den Komponenten der Fermentationsprodukte ableiten, ist, wird aus dem Extraktionslösungsmittel, bzw. den Extraktionslösungsmitteln nach Routineverfahren gewonnen.
Die Isolierung der erfindungsgemäßen antibiotischen Substanzen aus dem rohen Fermentationsprodukt, ihre Abtrennung und Reinigung werden nach an sich bekannten Techniken durchgeführt, die die Extraktion mit Lösungsmitteln, die Fällung durch Zugabe von Nicht-Lösungsmitteln oder durch pH-Veränderung der Lösung, Verteilungschromatographie, Umkehrphasenverteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, HPLC- Techniken und dergleichen umfassen.
Gemäß einem typischen Verfahren zur Isolierung des Rohprodukts wird der Mycelextrakt in einem Gemisch aus Wasser und wassermischbaren organischen Lösungsmitteln mit einem sauren pH-Wert, der die vorstehenden Antibiotika in Form von Säureadditionssalzen enthält, üblicherweise mit einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser schlecht mischbar ist und eine hohe Auflösungskraft für lipophile Verbindungen besitzt (z.B. Ethylacetat, Ethylether, n-Hexan), extrahiert, und dann wird die wäßrige Schicht unter Vakuum eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird dann auf pH 7 durch Zugabe von verdünntem Alkali oder Ammoniak gebracht und dann filtriert oder zentrifigiert, um den Feststoff zu gewinnen. Filterhilfsmittel können ebenfalls dem Gemisch zugesetzt werden, um die Isolierung des festen Produkts zu begünstigen.
Der erhaltene nasse "Rohproduktkuchen" kann weiter zur Isolierung und Reinigung der Verbindungen der vorstehenden Formel I bearbeitet werden. Wenn ein Filterhilfsmittel vor der Filtration zugesetzt wurde, kann es notwendig sein, den Rohproduktkuchen weiter mit einem Gemisch aus Wasser und einem wassermischbaren organishen Lösungsmittel bei einem sauren pH, wie dem, der zur Extraktion des Mycelkuchens verwendet wurde, zu extrahieren.
Die Repräzipitation des Rohprodukts aus diesem Extrakt wird durch Erniedrigen der Löslichkeit der Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Produkte in dem Extrakt durch Zugabe eines wassermischbaren organischen Lösungsmittels dazu, worin die Säureadditionssalze schlecht löslich sind, durchgeführt. Aceton und Isopropanol sind geeignete organische Lösungsmittel für diesen Zweck.
Das nasse Rohisolat wird dann weiter gereinigt, um davon das meiste der nicht-A/16686 Antibiotikaprodukte zu entfernen. Somit ist die Aufschlämmung des nassen Rohproduktkuchens mit einer verdünnten (5 bis 10% Gew./Vol.) Lösung einer starken Mineralsäure mit anschließender Zentrifugation nützlich, um einige der Verunreinigungen zu entfernen. Der so erhaltene nasse Kuchen kann weiter durch nochmaliges Auflösen in einem Gemisch aus Wasser und einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel des gleichen Typs, wie er zur Extraktion des Mycelkuchens verwendet wurde, bei einem pH-Wert zwischen 1,5 und 2,5 gereinigt werden. Während dieses Arbeitsschrittes können entfärbende Mittel der wäßrigen Lösung zugesetzt werden. Die Präzipitation des gereinigten Fermentationsprodukts, das die Verbindung der Formel I enthält, aus der sauren Lösung kann nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Ein solches gereinigtes Präparat des Fermentationsprodukts besteht im wesentlichen aus einem Gemisch der erfindungsgemäßen Verbindungen zusammen mit einem oder mehreren anderen ähnlichen Produkten, d. h. den Faktoren A1, A2 und A3 des Antibiotikums A/16686. Die Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindungen aus dem vorstehend beschriebenen Gemisch wird durch übliche Trenntechniken, wie vorstehend erwähnt, durchgeführt. Präparative HPLC ist besonders nützlich, sowohl zum Abtrennen als auch zum Reinigen, wenn die Fermentationsprodukte eine beträchtliche Menge der Faktoren A1, A2 und A3 des Antibiotikums A/16686 enthalten. Die Arbeitsschritte der präparativen HPLC werden üblicherweise unter Bedingungen durchgeführt, die der Trennung und Reinigung des Antibiotikums A/16686 entsprechen. Beispiele dieser Trenn- und Reinigungsschritte können beispielsweise in dem U.S. Patent 4,427,656 gefunden werden, worin eine C-18-Alkyl-silanisierte Silicagelsäule und ein Elutionsgemisch aus wäßrigem Ammoniumformiat und Acetonitril verwendet werden.
Während der präparativen HPLC werden die eluerten Flüssigkeiten aus jeder Injektion durch analytische HPLC geprüft und diejenigen Fraktionen, die an den A/16686-Faktoren A'1, A'2 bzw. A'3 angereichert sind, werden abgetrennt.
Die an jeder der vorstehenden Verbindungen angereicherten Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockene eingeengt. Die jeweiligen festen Rückstände werden erneut einer präparativen HPLC unter den gleichen Bedingungen wie zuvor unterworfen. Die aus der Einengung der eluierten Lösungen resultierenden festen Produkte werden in verdünnten Mineralsäuren aufgelöst und gefriergetrocknet, um die jeweiligen reinen Produkte in der Form von Mineralsäureadditionssalzen zu ergeben.
Ein alternatives Verfahren zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht darin, daß man eine Substanz, die den Faktor A1, A2 oder A3 des Antibiotikums A/16686 oder ein Gemisch davon enthält, mit dem Mycel von Actinoplanes sp. ATCC 33076 oder einer natürlichen oder künstlichen Mutante davon mit der Fähigkeit zur Erzeugung der Antibiotika A/16686 in Kontakt bringt, wodurch die Biotransformation in die Faktoren A'1, A'2 und A'3 gefördert wird. Gemäß diesem Verfahren werden die einzelnen Faktoren A1, A2 und A3 oder ein Gemisch davon, wie beispielsweise der Komplex, der sich aus der Fermentationsoperation ergibt, mit dem Mycel für eine Zeitspanne im Bereich von 50 bis 200 Stunden bei einer Temperatur zwischen 28 und 35ºC, bevorzugt zwischen 29 und 33ºC in Kontakt gelassen. Dieser Arbeitsschritt kann auf die Fermentation von Actinoplanes sp. ATCC 33076 (oder einer erzeugenden Mutante davon) zur Erzeugung der A/16686-Antibiotika folgen und daher aus einem verlängerten Kontakt des Fermentationsprodukts mit dem Mycel bestehen. Wenn die Fermentationsarbeitsschritte gemäß den vorstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt wurden, enthält das Fermentationsprodukt bereits einige Mengen der Faktoren A'1, A'2 und A'3, und daher führt ein verlängerter Kontakt mit dem Mycel tatsächlich zu einer Anreicherung der Verhältnisse der Verbindungen in der Fermentationscharge.
Gemäß einer praktischen Ausführungsform dieses Verfahrens wird nach Beendigung des Fermentationszyklus, d.h., wenn die analytischen Tests zeigen, daß die Antibiotikaaktivität in der Fermentationsbrühe nicht weiter zunimmt, bei Einstrom von Sauerstoff (oder Luft) in die Fermentoren gestoppt und die Fermentationsbrühe wird unter Rühren bein einer Temperatur zwischen 29 und 33ºC für eine weitere Zeitspanne, die zwischen 50 und 200 Stunden variiert, vor dem Ernten unter der Kontrolle analytischer HPLC gehalten.
Eine bevorzugte Form zur Durchführung der Biotransformation der Faktoren A1, A2 und A3 in die entsprechenden Faktoren A'1, A'2 und A'3 besteht darin, daß man die ersten drei vorstehend erwähnten Substanzen (oder ein Gemisch davon, einschließlich des A/16686-Komplexes als Ergebnis der Isolierungsarbeitsschritte aus der Fermentationscharge, wie beispielsweise in dem U.S. Patent 4,303,646 beschrieben ist) mit dem isolierten Mycel von Actinoplanes sp. ATCC 33076 oder einer erzeugenden natürlichen oder künstlichen Mutante davon in Kontakt bringt. Das Mycel, das in einem geeigneten Kulturmedium wächst, wird aus der Fermentationsbrühe (z.B. durch Zentrifugation) isoliert und dann zu einer Lösung des Faktors A1, A2 oder A3 oder eines Gemisches davon in Wasser oder in einem Gemisch aus Wasser und einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbar sind (z.B. niedrige Alkanole oder Aceton) unter Rühren gegeben. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wird innerhalb des vorstehend angegebenen Bereiches gehalten, wobei der pH-Wert um 7 durch Puffern der Lösung mit einem geeigneten Puffer (z.B. einem Phosphatpuffer) stabil gehalten werden kann. An die biologische Transformation schließt sich üblicherweise die analytische HPLC an. Experimentelle Tests zeigen, daß ein Rohgemisch des Antibiotikums A/16686, das üblicherweise je etwa 14% Faktor A1, etwa 64% Faktor A2 und etwa 12% Faktor A3 enthält, nach etwa 140-stündiger Kontaktzeit mit dem isolierten Mycel von Actinoplanes sp. ATCC 33076 unter den vorstehenden Bedingungen in ein Gemisch, das je etwa 10% Faktor A'1, etwa 38% Faktor A'2 und etwa 5% Faktor A'3 mit einer begleitenden Abnahme der Gehalte der Faktoren A1, A2 und A3 auf 10%, 28% bzw. 9% (HPLC-Flächen) überführt wird. Analog wird ein Substrat, das aus einer fast reinen Probe des Faktors A2 (HPLC-Titer: 89%) nach 180 Stunden in ein Gemisch, das etwa 60% des Faktors A'2 enthält, umgewandelt, wobei der Gehalt des Faktors A2 auf etwa 33% abnimmt (HPLC-Flächen).
Die Produkte, die aus den vorstehend beschriebenen Biotransformationen hervorgehen, werden aus dem Reaktionsgemisch (oder aus der Fermentationsbrühe, in dem Falle, in dem die biologische Transformation direkt durch Verlängerung des Kontakts mit dem Mycel in der Fermentationscharge durchgeführt wird) durch Ansäuern der Mycelsuspension auf einen pH-Wert zwischen 1,5 und 2,5 und anschließende Zugabe eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels, wie eines niedrigen Alkanols oder Acetons, sofern dieses noch nicht in einer ausreichenden Menge vorhanden ist, isoliert, um die Extraktion der Reaktionsprodukte aus der Mycelmasse zu unterstützen. Nach abtrannung des Mycels durch Filtration oder Zentrifugation wird die Lösung wie vorstehend beschrieben zur Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen aufgearbeitet.
Wenn die biologische Transformation direkt in der Fermentationsbrühe, wie vorstehend erwähnt, durchgeführt wird, kann die Isolierung der Reaktionsprodukte exakt, wie vorstehend bezüglich der Isolierung der Fermentationsprodukte beschrieben, durchgeführt werden.
Die Faktoren A'1, A'2 und A'3 des Antibiotikums A/16686 werden einer Bestimmung des Zuckergehalts (saure Hydrolyse) einer Säure/Basen-Titration, einer Aminosäureanalyse (bezüglich der Menge und der Sequenz), der IR-, UV-. NMR-Spectroskopie, der Fast Atom Bombardment Massen Spectrometrie (FAB-MS) unterworfen. Die aus diesen analytischen Tests erhaltenen Daten bestätigen die zugeordneten Strukturen.
Wie in Formel I gezeigt, besitzen die erfindungsgemäßen antibiotischen Substanzen basische Funktionen, die Säureadditionssalze nach herkömmlichen Verfahren bilden können.
Repräsentative und geeignete Säureadditionssalze der Vrbindungen der Formel I umfassen diejenigen Salze, die durch Standardreaktionen sowohl mit organischen als auch anorganischen Säuren, die durch Standardreaktionen sowohl mit organischen als auch anorganischen Säuren, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Trichloressigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoasäure, Mucinsäure, Glutaminsäure, Camphersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure und dergleichen gebildet wurden.
Die Umwandlung der freien Amino- oder Nicht-Salzverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung in die entsprechenden Additionssalze und umgekehrt, d.h. die Umwandlung eines Additionssalzes einer erfindungsgemäßen Verbindung in die Nicht-Salzform, fallen unter das übliche technische Können und sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Beispielsweise kann eine erfindungsgemäße Verbindung in das entsprechende Säureadditionssalz durch Auflösen der Nicht-Salzform in einem wäßrigen Lösungsmittel und Zugabe eines geringfügigen molaren Überschusses der ausgewählten Säure überführt werden. Die so erhaltene Lösung oder Suspension wird dann gefriergetrocknet, um das gewünschte Salz zu gewinnen.
In dem Falle, in dem das abschließend erhaltene Salz in einem Lösungsmittel, in dem die Nicht-Salzform löslich ist, unlöslich ist, wird es durch Filtration aus der organischen Lösung der Nicht-Salzform nach Zugabe der stöchiometrischen Menge oder eines geringen molaren Überschusses der ausgewählten Säure isoliert.
Die Nicht-Salzform kann aus einem entsprechenden sauren Salz, das in einer wäßrigen Lösung aufgelöst ist, welche dann neutralisiert wird, wodurch die Nicht-Salzform freigesetzt wird, hergestellt werden.
Wenn nach der Neutralisation Entsalzen notwendig ist, kann ein übliches Entsalzungsverfahren verwendet werden.
Beispielsweise können Säulenchromatographie auf silanisiertem Silicagel, nicht-funktionalisiertem Polystyrol, Acrylharzen und Polydextranharzen mit kontrollierter Porengröße (wie Sephadex LH 20) oder Aktivkohle zweckmäßigerweise verwendet werden. Nach Eluieren der unerwünschten Salze mit einer wäßriger Lösung wird das gewünschte Produkt mittels eines linearen Gradienten oder eines Stufengradienten eines Gemisches aus Wasser und einem polaren oder apolaren organischen Lösungsmittels, wie Acetonitril:Wasser von 50:50 bis etwa 100% Acetonitril isoliert.
Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann die Salzbildung entweder mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren oder nicht-pharmazeutisch annehmbaren Säuren als geeignete Reinigungstechnik verwendet werden. Nach Bildung und Isolierung kann die Salzform eines Antibiotikums der vorstehenden Formel I in das entsprechende Nicht-Salz oder in ein pharmazeutisch annehmbares Salz überführt werden.
Die Faktoren A'1, A'2 und A'3 des Antibiotikums A/16686 sind besonders gegen Gram-positive Mikroorganismen wirksam. Das mikrobiologische Aktivitätsspektrum des Faktors A'2 des Antibiotikums A/16686 ist in der folgenden Tabelle dargestellt: TABELLE I In vitro-Aktivität des A/16686-Faktors A'2 Stamm MHC (mcg/ml) Staphylococcus aureus Tour Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Streptococcus faecalis Streptococcus mitis Clostridium perfringens Clostridium difficile Propioibacterium acnes a) Inoculum 10&sup6; cfu/ml b) 30% Rinderserum zugesetzt c) Klinische Isolate
Die minimale Hemmkonzentration (MHC) wird durch das schrittweise zweifache Verdünnungsverfahren entweder der Brühe oder des Agars bestimmt. Kulturmedien und Wachstumsbedingungen: Iso-Sensitest-Brühe (Oxoid) für Staphylococcen und Streptococcus faecalis; Todd-Hewitt-Brühe (Difco) für die anderen Streptococcenarten; Wilkins-Chalgren-Agar für anaerobe Bakterien (T.D. Wilkins, S. Chalgren: Antimicrob. Agents Chemother. 10, 926 (1976)); das Endinoculum beträgt etwa 10&sup4; Kolonie-bildende Einheiten/ml oder Fleck. MHC bedeutet die niedrigste Konzentration, die kein sichtbares Wachstum nach 18- 24-stündiger Inkubation bei 37ºC zeigt; für die Anaerobia betragen die Inkubationsbedingungen 37ºC für 48 Stunden in anaerober Atmosphäre (N&sub2;:CO&sub2;:H&sub2;, 80:10:10). Die akute Toxizität des Faktors A'2 wird an CD1 Mäusen (Charles River) beiderlei Geschlechts mit einem Gewicht von 18-22 g durch eine einzelne i.v.-Injektion des Produkts, das in steriler Kochsalzlösung solubilisiert wurde, bestimmt. Die Infusionsrate beträgt 0,15 ml/sec. Dosisspiegel betragen 75, 100, 125 und 150 mg/kg. Der berechnete LD&sub5;&sub0;-Wert beträgt 103 mg/kg.
Die anderen zwei Produkte zeigen biologische Aktivitäten, die der des Faktors A'2 des Antibiotikums A/16686 vergleichbar sind.
Die erfindungsgemäßen antibiotischen Erfindung sind zur Herstellung von Medikamenten gegen Infektionen in erster Linie als Folge Gram-positiver weitverstreuter Bakterien nützlich. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Verbindungen für die topische Behandlung von Wundinfektionen und Akne nützlich.
Zur Verwendung als Medikamente können die erfindungsgemäßen Verbindungen auf verschiedenen Wegen entweder in Form der freien Verbindungen oder in Form ihrer Additionssalze mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren verabreicht werden, wobei diese zuletzt genannte Form bevorzugt ist. Der topische Weg ist üblicherweise der geeignetste Weg, die erfindungsgemäßen Verbindungen zu verabreichen.
Für medizinische Zwecke werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in pharmazeutische Dosierungsformen, die für die orale, topische oder parenterale Verabreichung geeignet sind, eingearbeitet, wie beispielsweise Tabletten, Kapseln, Pastillen, Gelatinekapseln, Granulate, Pulver, Salben, Gele, flüssige Lösungen, Cremes, Lösungen zur Injektion, Suspensionen und dergleichen. Beispielsweise können die Formulierungen der Dosisformen nach der allgemeinen Lehre von Remington's Pharmaceutical Sciences 17. Auflage, 1985, Merck Publisching Company, Easton Pennsylvania durchgeführt werden.
Die Dosiseinheit kann von 0,01 bis 99 Prozent, bevorzugt von 0,5 bis 80 Prozent, Wirkstoff enthalten. Die tägliche Dosis kann von mehreren Faktoren, wie Körpergewicht, dem infizierenden Mikroorganismums, der Schwere der Infektion, dem Alter des Patienten, der Zeitspanne und der Art der Verabreichung abhängen. Im allgemeinen sind die erfindungsgemäßen Verbindungen wirksam in täglichen Dosierungen im Bereich von etwa 2 mg bis etwa 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht, gegebenenfalls aufgeteilt in eine oder mehrere Verabreichungen pro Tag. Es ist offensichtlich, daß diese Dosierungen nur richtungsweisend sind, und daß die geeignetste Dosis in den speziellen Fällen und den Anwendungen unter Bezug auf biologische Tests, die zur Bestimmung der Menge der wirksamen Verbindung, die zur Erzielung des gewünschten Effekts notwendig ist, eingestellt werden kann.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, aber nicht ihren Umfang beschränken.

BEISPIELE

Beispiel 1 - Fermentierung von Actinoplanes sp. ATCC 33076 und Gewinnung des rohen Fermentationsprodukts

1.1 Fermentation von Actinoplanes sp. ATCC 33076

Ein lyophilisiertes Fläschchen einer Stammlösung wird verwendet, um zwei 18 cm-Hafermehl-Schrägagars zu inokulieren. Nach einwöchiger Inkubation bei 29ºC wird das Mycel eines Schrägagars in einem 500 ml-Kolben mit Schikanen, der 100 ml vegetatives Medium (1) enthält, inokuliert, welches bei 29ºC unter rotierender Bewegung (200 UpM) inkubiert wird.
Nach 48 Stunden wird die gewachsene Kultur eines Kolbens mit pH = 7,0 in ein 7-Liter-Gefäß mit 4 Litern vegetativem Medium (1) überführt (900 UpM; 28ºC; 0,5 Vol./Vol./M. Luft). Nach 48 Stunden werden 25 ml der Tankkultur mit einem pH von 7,1 in 50-ml-Ampullen abgefüllt. Die Ampullen werden dann in einer Aufschlämmung aus Aceton und Trockeneis gefroren und bei -74ºC gelagert.
Das gefrorene Mycel der 10 Ampullen wird in 10 Kolben mit Schikanen (2000/400 ml) mit vegetativem Medium (1) inokuliert. Nach 51-stündiger Inkubation bei 29ºC mit rotierender Bewegung (150 UpM) haben die Kolben einen durchschnittlichen pH-Wert von 6,8. Anschließend werden alle 10 Kolben in einen 10.500-l-Fermentor, der mit 4.000 l vegetativem Medium(1), welches chargenweise bei 120ºC 20 Minuten lang sterilisiert worden war, gefüllt ist, inokuliert.
Nach 68 Stunden bei 29ºC wird die Vorkultur, die einen pH-Wert von 6,8 besitzt, verwendet, um zwei 27.500-l-Fermentoren, die mit je 20.000 l-Fermentationsmedium(2), welches chargenweise bei 120ºC 20 Minuten lang sterilisiert worden war, gefüllt sind, zu inokulieren. Die Fermentationstemperatur wird bei 29ºC konstant gehalten, und der Fermentationsverlauf wird mittels analytischer HPLC verfolgt und nach 65 Stunden gestoppt.

(1): Zusammensetzung des vegetativen Mediums

Sojabohnenmehl 13 g/l
Dextrose 12 g/l
Dextrin 13 g/l
Calciumcarbonat 4 g/l

(2). Zusammensetzung des Fermentationsmediums

Sojabohnenmehl 30 g/l
Glycerin 20 g/l
Dextrose 4 g/l
Dextrin 4 g/l
Roher Malzextrakt 20 g/l
Saccharose 20 g/l
Calciumcarbonat 6 g/l

1.2 Isolierung des rohen Fermentationsprodukts

Die geerntete Brühe aus den zwei Fermentoren wird auf 10ºC abgekühlt und auf einen pH-Wert von 5 mit 20%iger (Gew./Vol.) HCl gebracht und dann auf einem Drehfilter filtriert.
Das nasse Mycel wird abgetrennt und mit 12.500 l Aceton dreimal durch Rühren der Suspension bei pH 2 (mit 30% HCl) und Zentrifugieren extrahiert. Der wäßrige Acetonextrakt wird in vier Anteile aufgeteilt und mit einem Gesamtvolumen von 12.600 l Ethylacetat extrahiert. Die wäßrige Phase wird unter Vakuum bei 18ºC (Innentemperatur) auf 7.000 l eingeengt.
Die auf 4ºC abgekühlte konzentrierte Lösung wird langsam mit 150 l 15%igem Na&sub4;)H bis zu pH 7 in Gegenwart von 210 l CH&sub2;Cl&sub2; versetzt. Nach Zugabe von 55 kg Filterhilfsmittel wird die Suspension auf einem Drehfilter filtriert. Der nasse Kuchen wird nochmals dreimal extrahiert, wobei jedesmal ein Gemisch aus 230 l Aceton und 44 l Wasser bei pH 2 (20% HCl) mit einer Aufschlämmung bei Raumtemperatur verwendet wird.
Nach Waschen des Feststoffs mit einem weiteren Aliquot von 110 l eines Gemisches aus Aceton:Wasser 6:4 bei pH 2 werden die drei Lösungen und Waschlösungen vereinigt und mit 2 600 l Aceton unter Rühren bei Raumtemperatur versetzt. Nach Stehenlassen über Nacht wird das feste Präzipitat zentrifugiert, mit 240 l Aceton gewaschen und bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet, wodurch 54 kg Rohfermentationsprodukt mit einem HPLC-Titer an gesamtem A/16686-Antibiotikum von 28% erhalten werden.

Beispiel 2 - Isolierung und Reinigung der antibiotischen A/16686-Faktoren A'1, A'2 und A'3

2.1 Gereinigtes Gemisch der A/16686-Antibiotika

Ein Aliquot von 13 kg des gemäß Beispiel 1 erhaltenen rohen Fermentationsprodukts wird mit 80 l 5%iger HCl (Gew./Vol.) bei etwa 15ºC unter heftigem Rühren 3 Stunden lang aufgeschlämmt. Die Suspension wird zentrifugiert, und der Feststoff wird mit 24 l 5%iger HCl gewaschen. Der nasse Kuchen wird mit einem Gemisch aus 80 l Aceton und 33 l Wasser in Gegenwart von 10,5 kg entfärbender Diatominerde (Tonsil Optimum NFF, Süd-Chemie A.G., München) und 2,1 kg Holzkohle (Darco G 60) bei 15ºC extrahiert. Die Suspension wird zentrifugiert, und der Feststoff wird mit 30 l eines Gemisches aus Aceton:Wasser von 6:4 gewaschen. Die Extrakte werden vereinigt (insgesamt 140 l) und 350 l Aceton werden langsam unter Rühren zugegeben. Nach Stehenlassen über Nacht wird das Gemisch über eine Reihe von Buchner- Filtern filtriert. Der so erhaltene Kuchen wird mit 10 l eines Gemisches aus Aceton:Wasser von 9:1 und dann mit 4 l Aceton gewaschen. Das auf dem Filter verbleibende feste Produkt wird im Vakuum 72 Stunden lang bei Raumtemperatur getrocknet, wodurch 1,86 kg eines gereinigten Präparats (HPLC-Titer 89%) der A/16686-Antibiotika erhalten werden, die für weitere Arbeitsschritte zur Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden.

2.2 Isolierung und Reinigung der antibiotischen A/16686-Faktoren A'1, A'2 und A'3

27 Gramm des gemäß Paragraph 2.1 erhaltenen Präparats werden einer präparativen HPLC unter Verwendung der folgenden Apparatur und Bedingungen für jedes Aliquot von 300 mg, aufgelöst in 5 ml Wasser, welches 10% (Vol./Vol.) CH&sub3;CN enthält, unterworfen.
Instrument: Apparatur wird durch Zusammenbauen einer Waters mod. 590 Pumpe, eines Waters Lambda-Max mod. 481LC Detektors, der auf 285 nm eingestellt ist, und eines Rheodyne Injektors, der mit einer 5-ml-Schleife ausgestattet ist, zusammengestellt.
Säule: LiChrosorb RP-18, 10 micron, 250 mm × 50 mm (Merck)
Mobile Phase: 0,05 M HCOONH&sub4;:CH&sub3;CN (64:36)
Flußrate: 30 ml/min
Die Arbeitsschritte werden mittels analytischer HPLC (vergleiche Beispiel 5, Paragraph 5.1) überwacht. Die Gruppen der je an den Faktor A'1, Faktor A'2 und Faktor A'3 angereicherten Fraktionen werden getrennt, und jede Gruppe von Fraktionen wird unter Bildung von 3 Lösungen vereinigt, welche wie folge aufgearbeitet werden. Die Lösung wird zur Trockene im Vakuum eingeengt und der Rückstand wird erneut mittels präparativer HPLC gereinigt. Die Fraktionen, die die reine Komponente enthalten, werden vereinigt und unter Vakuum konzentriert. Der feste Rückstand wird zweimal mit Ethanol aufgenommen und durch Filtration gesammelt. Der trockene Feststoff wird in 0,1N HCl aufgeslöst und gefiregetrocknet, wodurch das Hydrochloridsalz der reinen Verbindung erhalten wird, welches einer Analyse und physikalisch-chemischer Charakterisierung unterworfen wird.
Aus der vorstehend erwähnten Probe werden die folgenden Mengen an reinen Hydrochloriden der Faktoren A'1, A'2 bzw. A'3 erhalten: 150 mg, 600 mg und 30 mg.

Beispiel 3 - Biologische Transformation des antibiotischen A/16686- Faktors A2 in den Faktor A'2

Eine Probe (600 mg) des antibiotischen A/16686-Faktors A2 (HPLC-Titer 89%), hergestellt nach dem in dem U.S. Patent 4,427,656 beschriebenen Verfahren, wird in 200 ml Wasser (in einem 1000 ml-Kolben) aufgelöst. Diese Lösung wird mit dem Mycel von Actinoplanes sp. ATCC 33076, erhalten durch Zentrifugation von 400 ml einer in vegetativem Medium in einen 7 l-Gefäß gezüchteten Kultur (wie in Beispiel 1, Paragraph 1.1 zur Herstellung des Inokulationsmycels beschrieben), versetzt.
Das Gemisch wird be 200 UpM bei 32ºC gerührt, und die biologische Transformation wird mittels analytischer HPLC verfolgt (vergleiche unter Beispiel 5, Paragraph 5.1).
Die HPLC-Analyse der Mycelsuspension wird alle 2 Stunden durchgeführt. Das analytische Muster zeigt, daß die Mycelsuspension, die üblicherweise den Faktor A2 in einer Konzentration von 2053 Mikrogramm/ml nach 180 Stunden enthält, den Faktor A2 und den Faktor A'2 in Konzentrationen von 282 Mikrogramm/ml (33%) bzw. 513 Mikrogramm/ml (60%) enthält.
Die Suspension wird wie die Fermentationsbrühe in Beispiel 1, erster Teil von Paragraph 1.1, aufgearbeitet, wodurch ein wäßriger Acetonextrakt des Gemisches antibiotischer A/16686-Faktor A2 und Faktor A'2 erhalten wird, welcher dann von dem Extrakt durch Zugabe von Aceton in einem Verhältnis von etwa 3 Volumina für jedes Volumen wäßriger Acetonextrakt ausgefällt wird.
Das feste Präzipitat wird dann durch Filtration abgetrennt und, wie in dem letzten Teil von Beispiel 2, Paragraph 2.1 beschrieben, aufgearbeitet, wodurch ein gereinigtes Gemisch des antibiotischen A/16686-Faktors A2 und des Faktors A'2 mit einem HPLC-Titer von etwa 33% bzw. etwa 60% erhalten wird. Die Isolierung und Reinigung des Faktors A'2 aus dem Gemisch wird nach Paragraph 2.2 von Beispiel 2 durchgeführt, wodurch 55 mg reiner antibiotischer A/16686-Faktor A'2 als Hydrochlorid erhalten werden.

Beispiel 4 - Biologische Transformation eines Gemisches der antibiotischen A/16686-Faktoren A1, A2 und A3 in ein Gemisch, das die Faktoren A'1, A'2 und A'3 enthält

Eine Probe aus 600 mg antibiotischem A/16686-Komplex, enthaltend 13,9% Faktor A1, 64,3% Faktor A2, 12,3% Faktor A3 (analytische HPLC), wird dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 3 beschrieben, unterworfen. Die Reaktion wird nach 140 Stunden gestoppt, während denen die Reaktion mittels HPLC überwacht wurde. Das analytische Muster der Mycelsuspension zeigt, daß die Konzentrationen der Faktoren A1, A2 und A3, die ursprünglich 313 Mikrogramm/ml, 1434 Mikrogramm/ml bzw. 227 Mikrogramm/ml betrugen, nach 140 Stunden auf 96 Mikrogramm/ml (10%), 273 Mikrogramm/ml (29,4%) bzw. 85 Mikrogramm/ml (8,9%) abgenommen hatten, während die Konzentrationen der Faktoren A'1, A'2 und A'3 99 Mikrogramm/ml (10,3%), 364 Mikrogramm/ml (37,9%) bzw. 45 Mikrogramm/ml (4,7%) betrigen.
Die Suspension wird, wie in Beispiel 3 oben beschrieben, aufgearbeitet und ergibt ein gereinigtes Gemisch der A/16686-Antibiotika mit den folgenden HPLC-Titern: Faktor A1 (10%), Faktor A2 (28%), Faktor A3 (9%), Faktor A'1 (10%), Faktor A'2 (38%), Faktor A'3 (5%). Aus diesem Präparat werden die Faktoren A'1, A'2 und A'3 in Form der jeweiligen Hydrochloride nach im wesentlichen den gleichen Verfahren, wie unter Beispiel 2, Paragraph 2.2 beschrieben, isoliert.

Beispiel 5 - Analytische Assays und physikalisch-chemische Charakterisierung

5.1 Analytischer HPLC

Apparatur: Hewlett Packard Flüssigchromatograph, mod. 1084 B, ausgestattet mit einem UV-Detektor, der auf 254 nm eingestellt ist.
Säule: Erbasil C-18, 5 micron, 150 mm × 4,6 mm (Carlo Erba)
Mobile Phase: A) 0,5 M NaH&sub2; PO&sub4; pH4;
B) 0,05 M NaH&sub2;PO&sub4; pH4:CH&sub3;CN 73:23
Flußrate: 0,5 ml/min
Gradientenprofil: min 0 10 40
%B 45 45 65
Injektionsvolumen: 20 Mikroliter einer Lösung der zu untersuchenden Substanz zu etwa 0,5 mg/ml in Wasser
Unter diesen Bedingungen sind die jeweiligen Retentionszeiten (tR) wie folgt:
tR (Minuten)
Faktor A1 15,14
Faktor A'1 17,81
Faktor A2 20,30
Faktor A'2 22,70
Faktor A3 24,85
Faktor A'3 27,24
Wenn der Assay mit der Fermentationsbrühe durchgeführt wird, wird die zu analysierende Probe wie folgt hergestellt:
Zwei Milliliter der Fermentationsbrühe werden entnommen und mit 40 Mikrolitern 6N HCl versetzt, um den pH-Wert auf einen Wert zwischen 1,8 und 2,0 einzustellen. Zwei Milliliter Aceton werden dem Gemisch zugesetzt, welches 10 Minuten gerührt wird und dann 5 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert wird. Das Mycel wird abgetrennt, und ein Aliquot aus zwei Millilitern der Lösung wird mit einem gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert. Nach Trennung der zwei Phasen wird die wäßrige Schicht abgetrennt (etwa 1,2 ml) und für die HPLC-Bestimmung verwendet.

5.2 Zuckeranalyse

Die Zuckerbestimmung wird nach saurer Hydrolyse (2N H&sub2;SO&sub4;, 100ºC, 2 Stunden wie von B. Cavalleri et al. in The Journal of Antibiotics, Bd. 37, Nr. 4, Seiten 309-317, 1984, beschrieben, durchgeführt. Das Vorliegen einer D-Mannose-Einheit pro Molekül der drei Faktoren A'1, A'2 und A'3 wird beobachtet.

5.3 Aminosäureanalyse und ¹H-NMR-Spektren

Die saure Hydrolyse wird an allen drei Verbindungen mit 6N HCl bei 105ºC 20 Stunden lang in einem versiegelten Reagenzglas durchgeführt. Das Aminosäurengemisch wird säulenchromatographisch auf einem stark sauren Sulfonsäuredivinylbenzolharz (Dowex 50 W) durch Elution mit wäßriger HCl mit ansteigenden Konzentrationen von 0,5N bis 2N getrennt.
Die Aminosäure werden durch Vergleich mit authentischen Proben auf der Grundlage von ¹H-NMR und GC-MS verglichen. Das Aminosäureverhältnis und ihre Sequenz in den intakten Molekülen werden mittels NMR-Versuchen bestimmt.
Alle drei Verbindungen zeigen die gleichen Aminosäurezusammensetzungen und die gleiche Sequenz.
Die folgende Tabelle II zeigt den Typ und die Anzahl der Aminosäurereste in jedem der drei Faktoren A'1, A'2 und A'3. Tabelle II Aminosäure Anzahl der Einheiten Threo-beta-hydroxyasparaginsäure Asparaginsäure Allothreonin Glycin Alanin 4-Hydroxyphenylglycin Leucin Phenylalanin 3-Chlor-4-hydroxyphenylglycin Ornithin
Zwei Äquivalente Ammoniak pro Mol jedes Faktors werden in dem jeweiligen sauren Hydrolysegemisch mittels eines automatischen Aminosäureanalysators bestimmt, was zwei primäre Amidgruppen nachweist.
Ferner ist die Gesamtanzahl der Amidstickstoffatome (19) als Ergebnis der ¹&sup5;N-NMR-Experimente um zwei größer als die Anzahl der Stickstoffatome, die an den Peptidbindungen gemäß der Anzahl der Aminosäuren in dem Molekül beteiligt sind Tabelle (II). Die Titration der Faktoren zeigt kein Vorliegen von freien Carboxylgruppen. Diese Überlegungen stützen die Tatsache, daß die zwei primären Amidgruppen an der Asparaginsäureeinheit bzw. der Threo-beta- hydroxyasparaginsäureeinheit sind.
Die NMR-Spektren werden im Temperaturbereich von 25 bis 60ºC auf einem Bruker AM 250 Spectrometer, ausgestattet mit einem Aspect 3000 Computer, aufgezeichnet.
Eine Standardpulssequenz und eine Standardsoftware werden für die 2D- NMR-Spektren mit geringfügigen Modifikationen, um den Wasserpeak während der Messung zu unterdrücken, verwendet.
Die folgenden 2D-Techniken werden verwendet: COSY, Relayed COSY, (W.J. Chazin, D.P. Goldenberg, T.E. Creighton, K. Wüthrich: Eur. J. Biochem., 152, 429-437 (1985)), COSY mit Verstärkung der Kupplungen im langen Bereich (A. Bax, R. Freeman: J. Magn. Reson., 44, 542-561 (1981)), NOESY (S. Macura, K. Wütrich, R.R. Ernst: J. Magn. Reson. 47; 351-357 (1982)) und COLOC (H. Kessler, C. Griesinger, J. Zarbock, H.R. Loosli: J. Magn. Reson. 57, 331-336 (1984)).
Die folgende Tabelle III zeigt die ¹H-NMR chemischen Verschiebungen (delta, ppm) der Aminosäuren des Aminosäurerests des antibiotischen A/16686- Faktors A'2 in H&sub2;O : DMSO, 4:1 bei einem pH-Wert von 4,6, Temperatur 40ºC, interner Standard TMS (delta = 0,00 ppm). TABELLE III Aminosäure HCalpha HCbeta Sonstige Asparaginsäure Beta-Hydroxyasparaginsäure 4-Hydroxyphenylglycin Ornithin Threonin Phenylalanin Phenyl HCgamma TABELLE III (Fortsetzung) Aminosäure HCalpha HCbeta Sonstige Ornithin 4-Hydroxyphenylglycin Threonin Glycin Leucin Alanin 3-Chloro-4-hydroxyphenyl-glycin HCgamma HCdelta Phenyl
Die Faktoren A'1 und A'3 zeigen das gleiche Muster.
Figur 1 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von Faktor A'2.
Die ¹H-NMR-Spektren der Faktoren A'1 und A'3 zeigen das gleiche Muster wie das von Faktor A'2, abgesehen von den Signalen, die den Fettsäureketten in Bindung an den Asparaginsäurerest zuzuschreiben sind.

5.4 Fettsäurereste

Die folgende Tabelle IV faßt die ¹H-NMR chemischen Verschiebungen (delta, ppm) in Zuordnung zu den Fettsäureresten von jeder der drei Verbindungen in H&sub2;O:DMSO, 4:1 bei pH 4,6, Temperatur 40ºC, interner Standard TMS (Delta = 0,00 ppm) zusammen. TABELLE IV Faktor Sonstige

5.5 Zucker

Die D-Mannose-Einheit ergibt die folgenden ¹H-NMR-Signale (delta, ppm) für jeden der drie Faktoren in H&sub2;O:DMSO, 4:1 bei pH 4,6, Temperatur 40ºC, interner Standard TMS (delta = 0,00 pm) : 5,40 (ein anomeres Proton); 4,01, 3,91-3,71, 3,60-3,51 (die anderen Protonen). Der Verknüpfungspunkt des Zukkers an dem Peptidrest wird mittels NMR-Experimenten bestimmt (Nuklearer Overhauser Effekt).

5.6 Lactonring

Das Vorliegen eines Lactonrings wird durch die Absorption bei 1760 cm&supmin;¹ in dem IR-Spektrum (vergleiche unter Beispiel 6, Paragraph 6.1) gestützt. Die Position der Lactonbindung wird ermittelt durch
a) Identifizierung der Aminosäure, die mit ihrer Carboxylgruppe zu der Lactonbindung beiträgt
b) Identifizierung der Hydroxyaminosäure, die mit ihrer Hydroxylgruppe zur Lactonbindung beiträgt
Gemäß Stufe a) wird fein vermahlenes CaCl&sub2; (2,5 g) zu einer gekühlten (0-5ºC) Lösung aus NaBH&sub4; (1,5 g) in absolutem EtOH (150 ml) unter Rühren mit einem Magnetrührer gegeben. Nach 1,5 Stunden wird Faktor A'2 (1 g) in trokkenem DMF (60 ml) aufgelöst und tropfenweise zugesetzt. Das gekühlte Reaktionsgemisch wird 24 Stunden lang gerührt, dann vorsichtig in Wasser (600 ml) gegossen. Der pH-Wert wird mit wäßriger HCl auf 5 eingestellt und dann wird die Lösung auf einer mit einem makroporösen vernetzten Polystyrolharz XAD-2 (Amberlite Rohm and Haas) gefüllten Säule entsalzt, indem zuerst mit H&sub2;O zur Entfernung der Salze und dann mit einem Gemisch aus 0,01N HCl:CH&sub3;CN 1:1 eluiert wird, um die reduzierten Peptide zu gewinnen. Die Fraktionen, die das Peptid enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockene eingeengt.
Der Rückstand wird mit 6N HCl bei 105ºC 20 Stunden lang hydrolysiert. Die saure Lösung wird nach Extraktion mit Ethylacetat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird auf einer Dowex 50Wx4-Säule durch Elution mit 0,5N HCl chromatographiert. Die Fraktionen, die die gewünschte Verbindung enthalten (überprüft mittels zweidimensionaler HPTLC: Cellulose, erster Lauf mit Butanol:Essigsäure:H&sub2;O 4:1:5, obere Schicht, zweiter Lauf Pyridin: H&sub2;O 4:1; die Aminosäureflecken werden durch Besprühen mit Ninhydrin und Erhitzen auf 120ºC für 5 Minuten lokalisiert), werden vereinigt und eingeengt. Der ölige Rückstand wird erneut durch präparative Schichtchromatographie (SiO&sub2;, 5 mm dick, Butanol: Essigsäure:H&sub2;) 4:1:5, obere Schicht) gereinigt, um den 2- Amino-2-(3-chlor-4-hydroxyphenyl)ethylalkohol zu erhalten: ¹H-NMR (250 MHz, DMSO-d&sub6;) delta, ppm: 3,45 (m,CH, teilweise von dem Wassersignal bedeckt), 3,38 (m,CH&sub2;), 6,92 (d,CH-5), 7,11 (dd, CH-6, ³J = 8,8 Hz), 7,32 (d, CH-2, &sup4;J = 2,5 Hz). Die Struktur wird weiter durch Vergleich mit einer authentischen Probe, die aus 3-Chlor-4-hydroxyphenylglycin (30 mg), welches in seinen Methylester (MeOH, HCl) umgewandelt wurde und dann mit Ca(BH&sub4;)&sub2; nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren reduziert wurde, hergestellt wurde, bestätigt. Stufe b) wird so durchgeführt, daß zuerst der Faktor A'2 mit Phenylisocyanat umgesetzt wird. Dieses zuletzt genannte Produkt reagiert mit allen freien Hydroxyl- und Aminogruppen des Peptids und ergibt Urethane bzw. Harnstoffe, die üblicherweise ziemlich resistent gegenüber der sauren Hydrolyse, die wie im Beispiel 5, Paragraph 3 beschrieben, durchgeführt wird, sind. Die Menge an Hydroxyasparaginsäure nimmt nicht ab, während die Mengen der anderen hydroxylierten Aminosäuren abnehmen, was anzeigt, daß es die Aminosäure ist, die an der Lactonbindung mit der Hydroxylgruppe beteiligt ist.
Folglich wird Faktor A'2 (100 mg) in DMF (2 ml) aufgelöst, und Phenylisocyanat (300 Mikroliter) wird zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 48 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen, durch Zugabe von H&sub2;O (20 ml) abgeschreckt und filtriert. Die feste Verbindung wird hydrolisiert und, wie im Beispiel 5, Paragraph 3 beschrieben, auf ihre Aminosäurezusammensetzung analysiert. Die gleichen Versuche wurden mit den Faktoren A'1 und A'3 ausgeführt und ergaben entsprechende Ergebnisse.

Beispiel 6 - IR-, UV- und FAB-MS-Spektren

6.1 Das IR-Spektrum von Faktor A'2, das als Nujolsuspension mit einem Perkin-Elmer mod. 580 Spektrophotometer zufgezeichnet wurde, ist in Figur 2 der beigefügten Zeichnungen gezeigt. Die folgenden Absorptionsmazima werden beobachtet: 3500-3100 (ny NH und ny OH), 3020-2800 (Nujol), 1760 (ny C=0 Lacton), 1630 (ny C=0, Amid I), 1510 (delta NH, Amid II), 1460 und 1375 (Nujol), 1225 (ny C=0, Lacton), 1065-980 (ny C=0, Zucker), 840 und 815 cm&supmin;¹ (gamma CH aromatisch).
Die Spektren der anderen zwei Faktoren zeigen keine wesentlichen Unterschiede.
6.2 Das Ultraviolettspektrum des Faktors A'2, das in Wasser mit einem Perkin Elmer mod. 320 Spektrophotometer aufgezeichnet wurde, ist in Figur 3 der beigefügten Zeichnungen gezeigt. Das Spektrum zeigt die folgenden Absorptionsmaxima: 232 nm (log epsilon 4,64), 270 nm (log epsilon 4,34). Die Spektren der anderen zwei Faktoren zeigen keine wesentlichen Unterschiede.
6.3 Die Fast Atom Bombardment Mass Spectra (FAB-MS) werden mit einem MS9/50TC-Gerät unter Verwendung eines Thioglycerin/Glyceringemisches im Verhältnis 1:1 als Matrix durchgeführt. Beschußgas Xe; kinetische Energie 6keV; Beschleunigungsspannung 4kV. Die isotopen Gruppen der kationisierten Molekülionen MH+ zeigen Molekulargewichte von 2375 (Faktor A'1), 2389 (Faktor A'2) bzw. 2403 (Faktor A'3) an (niedrigste Isotopenzusammensetzungen). Diese Daten und das Vorliegen von Fragment-Ionen entsprechend dem Verlust von 163 Einheiten von den jeweiligen MH+-Ionen in den Spektren entsprechen den beschriebenen Strukturen.

6.4 Elementaranalyse

Die Elementaranalyse nach vorherigem Trocknen der Probe bei etwa 140ºC unter einer inerten Atmosphäre ergeben die folgende annähernde prozentuale Zusammensetzung: Faktor Asche %
Die vorstehenden Werte entsprechen denen, die für die jeweiligen Dihydrochloridsalze der drei Verbindungen berechnet wurden.

Claims

1. Verbindung der Formel I

worin

R für -CO-CO=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub3;,

-CO-CO=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2; oder

-CO-CO=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2;

steht

und R' α-D-Mannopyranosyl bedeutet, und die Säureadditionsalze davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R für

-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub3;

steht.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R für

-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2;

steht.

4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R für

-CO-CH=CH-CH=CH-CH&sub2;-CH&sub2;-CH(CH&sub3;)&sub2;

steht.

5. Säureadditionssalz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es das Dihydrochlorid ist.

6. Verfahren zur Erzeugung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) der Mikroorganismus Actinoplanes sp. ATCC 33076 oder eine produktbildende Mutante davon unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Medium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und anorganische Salze enthält, fermentiert wird, (b) das Mycel von der Fermentationsbrühe abgetrennt wird, (c) die Mycelmasse mit einem geeigneten Lösungsmittelsystem extrahiert wird, (d) das rohe Fermentationsprodukt aus dem Extrakt isoliert wird, und (e) die vorstehenden antibiotischen Substanzen aus dem isolierten rohen Fermentationsprodukt abgetrennt und gereinigt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquellen aus Dextrose, Fructose, Maltose, Saccharose, Glycerin und Dextrin, die Stickstoffquellen aus Sojabohnenmehl und Malzextrakt ausgewählt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei einer Temperatur zwischen 24 und 35ºC, bevorzugt zwischen 28 und 32ºC, für eine Zeitspanne, währenddessen ein Ansteigen der antibiotischen Aktivität beobachtet wird, durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Mycel von der Fermentationsbrühe durch Filtration oder Zentrifugation bei einem pH-Wert zwischen 4,5 und 5,5 abgetrennt wird, die Mycelmasse mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, ausgewählt aus niedrigen Alkanolen, Aceton und Gemischen davon, bei einem pH-Wert zwischen 1,5 und 2,5 extrahiert wird und das rohe Fermentationsprodukt aus dem Extrakt der Mycelmasse durch Zusetzen eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, worin die Säureadditionssalze der antibiotischen Substanzen schlecht löslich sind, isoliert wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung und Reinigung der antibiotischen Substanzen von dem isolierten rohen Fermentationsprodukt mittels präparativer HPLC-Verfahren durchgeführt werden.

11. Verfahren zur Erzeugung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Substrat, das den antibiotischen A/16686-Faktor A1, A2 oder A3, oder ein Gemisch davon enthält, mit dem Mycel von Actinoplanes sp. ATCC 33076 oder einer natürlichen oder künstlichen Mutante davon mit der Fähigkeit zur Erzeugung der A/16686-Antibiotika in Kontakt gebracht wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat mit dem Mycel bei einem pH-Wert um 7 bei einer Temperatur zwischen 28 und 35ºC, bevorzugt zwischen 29 und 33ºC, für eine Zeitspanne, die von 50 bis 200 Stunden variiert, in Kontakt gebracht wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Mycel zuvor aus der Fermentationsbrühe isoliert wird und der Kontakt mit dem Substrat in einer Lösung aus Wasser oder einem Gemisch aus Wasser mit einem oder mehreren mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, bevorzugt ausgewählt aus niedrigen Alkanolen und Aceton, durchgeführt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsprodukte von dem Reaktionsmedium durch Ansäuern der Mycelsuspension bei einem pH-Wert zwischen 1,5 und 2,5, Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels oder eines Gemisches aus mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, sofern das Lösungsmittel bzw. die Lösungsmittel noch nicht in dem Reaktionsgemisch in einer Menge, die zur Extraktion des Reaktionsproduktes bzw. der Reaktionsprodukte von der Mycelmasse ausreichend ist, vorhanden ist bzw. sind, dazu, Abtrennen des Mycels durch Zentrifugation oder Filtration und anschließende Behandlung des Extrakts nach einem der Ansprüche 9 und 10, abgetrennt werden.

15. Verfahren nach Anspruch 1 zur Verwendung als antibakterielles Mittel.

16. Pharmazeutisches Präparat, enthaltend eine Verbindung der Formel I nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz davon.

17. Verwendung einer Verbidnung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung von infektiösen auf gram-positive Mikroorganismen zurückzuführende Erkrankungen.

18. Verbinding nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung von Wundinfektionen oder Akne.

19. Pharmazeutisches Präparat, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1 als Wirkstoff.

20. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 19, insbesondere zur Verwendung zur topischen Behandlung von Wundinfektionen oder Akne.