JPH01165963A - Cu,Zn−スーパーオキサイド・ディスムターゼの測定方法 - Google Patents
Cu,Zn−スーパーオキサイド・ディスムターゼの測定方法Info
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- JPH01165963A JPH01165963A JP32376387A JP32376387A JPH01165963A JP H01165963 A JPH01165963 A JP H01165963A JP 32376387 A JP32376387 A JP 32376387A JP 32376387 A JP32376387 A JP 32376387A JP H01165963 A JPH01165963 A JP H01165963A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、Cu、 Zn−スーパーオキサイド・ディス
ムターゼ(以下、Cu、 Zn−3ODと略記する)を
特異的に認識するモノクローナル抗体を利用した、試料
中のCu、 Zn−9ODの測定方法に関するものであ
る。
ムターゼ(以下、Cu、 Zn−3ODと略記する)を
特異的に認識するモノクローナル抗体を利用した、試料
中のCu、 Zn−9ODの測定方法に関するものであ
る。
[従来の技術]
Cu、 Zn−8ODは、スーパーオキサイド・ラジカ
ル(以下、02丁と略記する)の不均化反応の触媒作用
を有する酵素で、最近その測定が臨床的に注目されてお
り、肝臓や肺臓などの種々の組織におけるCu、 Zn
−3ODの微量測定が望まれている。またCu。
ル(以下、02丁と略記する)の不均化反応の触媒作用
を有する酵素で、最近その測定が臨床的に注目されてお
り、肝臓や肺臓などの種々の組織におけるCu、 Zn
−3ODの微量測定が望まれている。またCu。
Zn−8ODは、種々の治療薬としても用いられるよう
になり、その血中濃度の測定が望まれるようになった。
になり、その血中濃度の測定が望まれるようになった。
従来の測定に関しては、マコード(Me Cord
)らの方法(J、Biol、Chem、244巻604
9〜6055頁、 1989年)が知られている。この
方法は操作が繁雑で、また測定感度も充分なものではな
かった。さらにマコードらの方法は、02τを消去する
物質の量を測定する方法であり、Cu、 Zn−8OD
にのみ特異的なものではない。
)らの方法(J、Biol、Chem、244巻604
9〜6055頁、 1989年)が知られている。この
方法は操作が繁雑で、また測定感度も充分なものではな
かった。さらにマコードらの方法は、02τを消去する
物質の量を測定する方法であり、Cu、 Zn−8OD
にのみ特異的なものではない。
スーパーオキサイド・ディスムターゼ(SOD)は酵素
活性の発現に必要なキレート金属の種類により、Cu、
Zn型、Mn型およびPe型に分類される。
活性の発現に必要なキレート金属の種類により、Cu、
Zn型、Mn型およびPe型に分類される。
真核生物の細胞質にはCu、 Zn−8ODが含まれ、
ミトコンドリアにはMn−3ODが含まれる。さらに0
2TはチトクロームC,エピネフリン、アスコルビン酸
などの生体物質によっても消去される。従って、試料中
のCu、 Zn−3ODのみを特異的に定量することは
マコードらの方法によっては不可能である。
ミトコンドリアにはMn−3ODが含まれる。さらに0
2TはチトクロームC,エピネフリン、アスコルビン酸
などの生体物質によっても消去される。従って、試料中
のCu、 Zn−3ODのみを特異的に定量することは
マコードらの方法によっては不可能である。
一方従来から、体液中の微量成分を測定する方法として
、免疫学的測定、たとえば放射性免疫測定法、および酵
素免疫測定法が用いられている。
、免疫学的測定、たとえば放射性免疫測定法、および酵
素免疫測定法が用いられている。
Cu、 Zn−3ODの免疫学的測定法については、従
来からいくつかの特許が公開されている。例えば特開昭
5’l−1[)2195号公報には、酵素標識したSO
D含有液とSODと特異的結合を有する抗体含有液と、
SODを定量すべき被検液を混合し、免疫複合体を沈殿
物として水溶液から除き水溶液または沈殿物の標識酵素
の活性を測定することでSODの測定をしている。また
特開昭57−1.0219[i号公報や特開昭58−7
560号公報では酵素標識した抗SODポリクローナル
抗体と不溶性担体に結合させた抗SODポリクローナル
抗体を用いるサンドイツチ法によりSOD測定を行って
いる。
来からいくつかの特許が公開されている。例えば特開昭
5’l−1[)2195号公報には、酵素標識したSO
D含有液とSODと特異的結合を有する抗体含有液と、
SODを定量すべき被検液を混合し、免疫複合体を沈殿
物として水溶液から除き水溶液または沈殿物の標識酵素
の活性を測定することでSODの測定をしている。また
特開昭57−1.0219[i号公報や特開昭58−7
560号公報では酵素標識した抗SODポリクローナル
抗体と不溶性担体に結合させた抗SODポリクローナル
抗体を用いるサンドイツチ法によりSOD測定を行って
いる。
又、特開昭62−167479号公報では、標識化した
抗Cu、 Zn−3ODモノクロ一ナル抗体と数種の抗
Cu、 Zn−8ODモノクロ一ナル抗体を結合させた
不溶性担体とを用い、2段階の抗原抗体反応を行う2ス
テツプサンドイツチ法によりSOD測定を行っている。
抗Cu、 Zn−3ODモノクロ一ナル抗体と数種の抗
Cu、 Zn−8ODモノクロ一ナル抗体を結合させた
不溶性担体とを用い、2段階の抗原抗体反応を行う2ス
テツプサンドイツチ法によりSOD測定を行っている。
[発明が解決しようとする問題点]
本発明はCu、 Zn−3ODの免疫学的測定において
、つねに同品質のものを得ることができるモノクローナ
ル抗体を用いて、再現性がよ(、かつ感度のすぐれた測
定方法を提供するものである。
、つねに同品質のものを得ることができるモノクローナ
ル抗体を用いて、再現性がよ(、かつ感度のすぐれた測
定方法を提供するものである。
[問題点を解決するための手段および作用コ本発明者ら
は、測定しようとするCu、 Zn=SODに特異的な
モノクローナル抗体を作製し、これを用いて免疫学的測
定法の検討を行った。その結果、本発明に関わるモノク
ローナル抗体はCu、 Zn−8OD測定用試薬として
極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。
は、測定しようとするCu、 Zn=SODに特異的な
モノクローナル抗体を作製し、これを用いて免疫学的測
定法の検討を行った。その結果、本発明に関わるモノク
ローナル抗体はCu、 Zn−8OD測定用試薬として
極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、Cu、 Zn−8ODを特異的に
認識するモノクロ−九ル抗体で、固相化されている抗体
と標識されている抗体が同一の抗体であり、かつそれら
を用いて同一容器内で同時に抗原抗体反応を行い、測定
感度が1 n g / ml−320ng/ m+であ
ることを特徴とするCu、 Zn−8ODの測定方法で
ある。
認識するモノクロ−九ル抗体で、固相化されている抗体
と標識されている抗体が同一の抗体であり、かつそれら
を用いて同一容器内で同時に抗原抗体反応を行い、測定
感度が1 n g / ml−320ng/ m+であ
ることを特徴とするCu、 Zn−8ODの測定方法で
ある。
本発明において使用されるモノクローナル抗体は、好ま
しくは、Cu、 Zn−3ODで免疫された動物の抗体
産生肺細胞とミエローマ細胞とを融合させることによっ
て、該Cu、 Zn−3ODを認識するモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマを得、ついで該ハイブリ
ドーマ及び/又はそれに由来する細胞株を培養し、その
培養物がら採取する。Cu、 Zn−3ODを認識する
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、手法
それ自体は公知である細胞融合法(G、ケーラー(Ko
hl、er)とC,ミルシュタイン(旧1stein)
、ネイチャー(Nature)258巻、495頁、1
975年)によって製造することができる。
しくは、Cu、 Zn−3ODで免疫された動物の抗体
産生肺細胞とミエローマ細胞とを融合させることによっ
て、該Cu、 Zn−3ODを認識するモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマを得、ついで該ハイブリ
ドーマ及び/又はそれに由来する細胞株を培養し、その
培養物がら採取する。Cu、 Zn−3ODを認識する
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマは、手法
それ自体は公知である細胞融合法(G、ケーラー(Ko
hl、er)とC,ミルシュタイン(旧1stein)
、ネイチャー(Nature)258巻、495頁、1
975年)によって製造することができる。
本発明においては、前述の如き方法によって、Cu、
Zn−8ODを認識するモノクローナル抗体を得た。
Zn−8ODを認識するモノクローナル抗体を得た。
Cu、 Zn−3ODは均等な2個のサブユニットより
なる2ffi体であるので、同じモノクローナル抗体を
使ったサンドイツチ法による固相酵素免疫測定法(En
zyme−1inked 1mmuno 5orben
t As5ay )が可能となった。モノクローナル抗
体を数多く必要とせず、1種でよいこと、また、同一容
器内て固相化抗体及び標識化抗体を用いて同時に抗原抗
体反応を行えることなどから操作が非常に簡便となった
。
なる2ffi体であるので、同じモノクローナル抗体を
使ったサンドイツチ法による固相酵素免疫測定法(En
zyme−1inked 1mmuno 5orben
t As5ay )が可能となった。モノクローナル抗
体を数多く必要とせず、1種でよいこと、また、同一容
器内て固相化抗体及び標識化抗体を用いて同時に抗原抗
体反応を行えることなどから操作が非常に簡便となった
。
本発明は、固相化抗体としてCu、 Zn−8ODを特
異的に認識するモノクローナル抗体を固定化するが、固
定化の方法は、公知の方法を採用できる。
異的に認識するモノクローナル抗体を固定化するが、固
定化の方法は、公知の方法を採用できる。
抗体を固定化するものとしては、例えばガラス。
ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル。
ラテックス、アガロース、セルロース、メタアクリレー
ト等を用いたビーズやマイクロプレートが好ましく使用
される。
ト等を用いたビーズやマイクロプレートが好ましく使用
される。
また、標識化モノクローナル抗体を調製するためのモノ
クローナル抗体は固定化に用いたものと同一のモノクロ
ーナル抗体を用い、また標識化の方法や手段、それの検
出方法や手段は何ら限定されるものではなく、公知の方
法や手段により測定することができる。標識剤としては
、酵素を用いる方法(EIA )では、パーオキシダー
ゼ、β−り一ガラクトシダーゼ、又はアルカリ・ホスフ
ァターゼ等の酵素が、放射性物質を用いる方法(RIA
)では、 i、 3H等が、蛍光物質を用いる
方法(PIA )では、フルオレッセイン・イソチオシ
アネート等が通常使用されるが、その他のものであって
もよい。
クローナル抗体は固定化に用いたものと同一のモノクロ
ーナル抗体を用い、また標識化の方法や手段、それの検
出方法や手段は何ら限定されるものではなく、公知の方
法や手段により測定することができる。標識剤としては
、酵素を用いる方法(EIA )では、パーオキシダー
ゼ、β−り一ガラクトシダーゼ、又はアルカリ・ホスフ
ァターゼ等の酵素が、放射性物質を用いる方法(RIA
)では、 i、 3H等が、蛍光物質を用いる
方法(PIA )では、フルオレッセイン・イソチオシ
アネート等が通常使用されるが、その他のものであって
もよい。
標識剤が酵素である場合には、その活性を測定するため
に基質が用いられる。例えば、西洋ワサビパーオキシダ
ーゼの基質としては、2.2−−アジノジ−[3−エチ
ルベンズチアゾリンスルホン酸]ニアンモニウム塩(以
下ABTSとする) ′−H202,5−アミノサリチ
ル酸−H2O2,o フェニレンジアミン−H2O2
等を、β−D−ガラクトシダーゼの基質としては、0−
ニトロフェノール−β−D−ガラクトピラノシド等を、
アルカリ・ホスファターゼの基質として、p−ニトロフ
ェニルホスフェート等を挙げることができる。
に基質が用いられる。例えば、西洋ワサビパーオキシダ
ーゼの基質としては、2.2−−アジノジ−[3−エチ
ルベンズチアゾリンスルホン酸]ニアンモニウム塩(以
下ABTSとする) ′−H202,5−アミノサリチ
ル酸−H2O2,o フェニレンジアミン−H2O2
等を、β−D−ガラクトシダーゼの基質としては、0−
ニトロフェノール−β−D−ガラクトピラノシド等を、
アルカリ・ホスファターゼの基質として、p−ニトロフ
ェニルホスフェート等を挙げることができる。
測定のためには、これらの試薬以外にも溶解剤。
洗浄剤2反応停止剤等の公知の試薬が使用される。
このようにしてCu、 Zn−8ODに対する1種のモ
ノクローナル抗体を用いてサンドイツチ法における2種
類の抗原抗体反応を同一容器内で同時に進行させること
ができ、試薬の添加や不要物質の洗浄除去操作は1回の
みでよい1段階サンドイツチ法を行うことかできる。
ノクローナル抗体を用いてサンドイツチ法における2種
類の抗原抗体反応を同一容器内で同時に進行させること
ができ、試薬の添加や不要物質の洗浄除去操作は1回の
みでよい1段階サンドイツチ法を行うことかできる。
本発明方法では試料中のCu、 Zn−3ODは特に1
.00〜320 ng/ mlの範囲で測定する方法で
ある。この範囲を越えるものは、現在の検出法では測定
が難しくなるからである。
.00〜320 ng/ mlの範囲で測定する方法で
ある。この範囲を越えるものは、現在の検出法では測定
が難しくなるからである。
[発明の効果コ
本発明方法はCu、 Zn−8ODに対して特異的な測
定方法であり、Cu、 Zn−3OD以外の027を消
去する物質か存在してもなんら影響を受けない。また、
本発明に使用されるモノクローナル抗体は大量に均質な
ものを得ることができ、反応の均一性が高いものである
。そして、これらは工業的に生産することも可能である
。また、モノクローナル抗体を1種しか必要とせず、固
相化抗体及び標識化抗体を用いて同一容器内で同時に抗
原抗体反応を行えることなどから操作が非常に簡便、迅
速となった。
定方法であり、Cu、 Zn−3OD以外の027を消
去する物質か存在してもなんら影響を受けない。また、
本発明に使用されるモノクローナル抗体は大量に均質な
ものを得ることができ、反応の均一性が高いものである
。そして、これらは工業的に生産することも可能である
。また、モノクローナル抗体を1種しか必要とせず、固
相化抗体及び標識化抗体を用いて同一容器内で同時に抗
原抗体反応を行えることなどから操作が非常に簡便、迅
速となった。
[実施例]
以下、実施例により本発明を詳述する。しかし、本発明
はこれら実施例のみに限定されるものではない。
はこれら実施例のみに限定されるものではない。
実施例1
イ)抗ヒトCu、 Zn−8ODモノクロ一ナル抗体の
調製抗ヒトCu、 Zn−3ODモノクロ一ナル抗体の
調製はG、ケーラーとC,ミルシュタインの方法に準じ
て行った。すなわちヒト赤血球由来のCu、 Zn−8
ODを溶解したPBS (リン酸緩衝生理食塩水)と
フロイントの完全アジュバントを混合した乳濁液を4週
間の間隔で2度BALB/ cマウス腹腔に投与した。
調製抗ヒトCu、 Zn−3ODモノクロ一ナル抗体の
調製はG、ケーラーとC,ミルシュタインの方法に準じ
て行った。すなわちヒト赤血球由来のCu、 Zn−8
ODを溶解したPBS (リン酸緩衝生理食塩水)と
フロイントの完全アジュバントを混合した乳濁液を4週
間の間隔で2度BALB/ cマウス腹腔に投与した。
血中抗体価の上昇を96ウエルプレートを用いる固相酵
素免疫測定法で確認した後、ヒト赤血球由来のCu、
Zn−3ODを溶解したPBSを該マウスの尾静脈に注
射した。4日後にマウスの肺細胞を取り出し、ポリエチ
レングリコールを用いて、8−アザグアニン耐性ミエロ
ーマ細胞5P210と細胞融合を行った。
素免疫測定法で確認した後、ヒト赤血球由来のCu、
Zn−3ODを溶解したPBSを該マウスの尾静脈に注
射した。4日後にマウスの肺細胞を取り出し、ポリエチ
レングリコールを用いて、8−アザグアニン耐性ミエロ
ーマ細胞5P210と細胞融合を行った。
細胞は96ウエルプレートで培養し、公知のHAT選択
を行った。ハイブリドーマのスクリーニングは96ウエ
ルプレートを用いる固相酵素免疫測定法を行い、抗ヒト
SOD抗体を産生ずるハイブリドーマについて限界希釈
法によりクローニングを行った。
を行った。ハイブリドーマのスクリーニングは96ウエ
ルプレートを用いる固相酵素免疫測定法を行い、抗ヒト
SOD抗体を産生ずるハイブリドーマについて限界希釈
法によりクローニングを行った。
以上のようにして得られたハイブリドーマをフラスコ培
養後、BALB/c系マウス腹系内ウス腹腔内培養し、
モノクローナル抗体を含む腹水を得た。
養後、BALB/c系マウス腹系内ウス腹腔内培養し、
モノクローナル抗体を含む腹水を得た。
これを硫安沈殿、イオン交換カラムクロマトグラフィー
によって抗ヒI・Cu、 Zn−3ODモノクロ一ナル
抗体を得た。これらは、ヒトCu、 Zn−8ODに特
異的であり、他動物例えばウシ、ブタ、ラットのCu。
によって抗ヒI・Cu、 Zn−3ODモノクロ一ナル
抗体を得た。これらは、ヒトCu、 Zn−8ODに特
異的であり、他動物例えばウシ、ブタ、ラットのCu。
Zn−8OD及びMn−3ODとは反応性を示さないこ
とを確認した。
とを確認した。
口)固相化モノクローナル抗体の調製
未処理96ウエルーマイクロタイタープレート(商品名
タンク・イムノプレート、インターメッド社製)の各ウ
ェルに0,1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,6)に
溶解した1Hg/mlのマウス抗ヒトCu、 Zn−3
ODモノクロ一ナル抗体(イ)で調整したモノクローナ
ル抗体、以下、5H2Bとする。 IgG1)250μ
mを加えて、4℃で一夜インキユベートした。次に、各
ウェルの溶液を除き、0.04%Tween−20を含
有するPBS溶液(以下、PBS−T溶液という)で、
3回洗浄した後、1%のBSA (ウシ血清アルブミ
ン)を含有するPBS−T溶液を300μ!加えて4℃
でブロッキング処理(担体に存在する、抗原または抗体
との非特異的結合部位にBSAを吸着させる処理)をし
、そのまま4°Cで保存した。
タンク・イムノプレート、インターメッド社製)の各ウ
ェルに0,1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,6)に
溶解した1Hg/mlのマウス抗ヒトCu、 Zn−3
ODモノクロ一ナル抗体(イ)で調整したモノクローナ
ル抗体、以下、5H2Bとする。 IgG1)250μ
mを加えて、4℃で一夜インキユベートした。次に、各
ウェルの溶液を除き、0.04%Tween−20を含
有するPBS溶液(以下、PBS−T溶液という)で、
3回洗浄した後、1%のBSA (ウシ血清アルブミ
ン)を含有するPBS−T溶液を300μ!加えて4℃
でブロッキング処理(担体に存在する、抗原または抗体
との非特異的結合部位にBSAを吸着させる処理)をし
、そのまま4°Cで保存した。
ハ)標識化モノクローナル抗体の調製
0.3M重炭酸ナトリウム緩衝液(pH8,1>に溶解
した西洋ワサビパーオキシダーゼ(以下HRPOとする
)溶液(5[I1g/ ml) 1 mlに1%1−フ
ルオロ−2,4−ジニトロベンゼンのエタノール溶液0
.1mlを加え、室温で1時間反応させた。次に0.0
6M過ヨウ素酸ナトリウム1.Omlを加えて30分間
反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを0.1[
iMエチレングリコール1.Omlを加えて除去した後
、0.01M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,5)に対
して透析した。
した西洋ワサビパーオキシダーゼ(以下HRPOとする
)溶液(5[I1g/ ml) 1 mlに1%1−フ
ルオロ−2,4−ジニトロベンゼンのエタノール溶液0
.1mlを加え、室温で1時間反応させた。次に0.0
6M過ヨウ素酸ナトリウム1.Omlを加えて30分間
反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを0.1[
iMエチレングリコール1.Omlを加えて除去した後
、0.01M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9,5)に対
して透析した。
= 11 −
次に固相化抗体と同一のモノクローナル抗体(SH2B
)’G 5 mg加え5時間反応させた。水素化ホウ素
ナトリウム5 mgを加え、4°Cで一夜放置した。
)’G 5 mg加え5時間反応させた。水素化ホウ素
ナトリウム5 mgを加え、4°Cで一夜放置した。
上記のようにして得られた反応物をTSKゲルG−30
00SW (東ソー株式会社製、商標)を用いた高速液
体クロマトグラフィーにて精製し、HRP O標識化モ
ノクローナル抗体を得た。
00SW (東ソー株式会社製、商標)を用いた高速液
体クロマトグラフィーにて精製し、HRP O標識化モ
ノクローナル抗体を得た。
二)酵素免疫測定法によるヒ) C0,Zn−3ODの
定m。
定m。
本実施例の口)で抗体を固定化したマイクロタイタープ
レートを室温に戻し、PBS−T溶液で3回洗浄した。
レートを室温に戻し、PBS−T溶液で3回洗浄した。
その後、精製したヒト赤血球由来Cu。
Zn−3OD (ヒト赤血球よりSDS電気泳動的に均
一にまで生成した標品で、ウシ血清アルブミンを標準と
するロウソー法により決定した蛋白質濃度1 +ng当
り、3,500単位(1単位はマコードらの方法による
; J、Biol、Chem、244巻、 6049頁
、 1969年)の活性を示したもの)0〜320ng
/ mlを含有する正常ウサギ血清を、標準物質とし
て各ウェルに20μ!ずつ加えた。次いで、各ウェルに
ハ)でInしたH l? P O標識抗体4.5mg/
mlを1.5%正常ウサギ血清、01吋%ミオグロビン
、 0.075%精製白糖。
一にまで生成した標品で、ウシ血清アルブミンを標準と
するロウソー法により決定した蛋白質濃度1 +ng当
り、3,500単位(1単位はマコードらの方法による
; J、Biol、Chem、244巻、 6049頁
、 1969年)の活性を示したもの)0〜320ng
/ mlを含有する正常ウサギ血清を、標準物質とし
て各ウェルに20μ!ずつ加えた。次いで、各ウェルに
ハ)でInしたH l? P O標識抗体4.5mg/
mlを1.5%正常ウサギ血清、01吋%ミオグロビン
、 0.075%精製白糖。
0.05%卵白アルブミンを含むPBS−T溶液で10
00倍に希釈した溶液を各ウェルに300μβずつ添加
し、室温で3時間インキュベートした後、溶液を除去し
てからPBS−T溶液で3回洗浄した。さらに、■、2
%ABTS、 0.01%H2O2を含有する0、1M
クエン酸緩衝液(pH4,1) 200μmを各ウェル
に添加し、室温で30分間反応させたあと、1Mクエン
酸溶液を100μm加えて反応を停止した。反応停止後
、各ウェルについて波長415nm、対照波長492n
mの吸収強度を自動マイクロタイタープレート・リーダ
ー(東ソー株式会社製MPR−A4.商標)で測定し標
準物質の濃度及び吸収強度をプロットして表1の如き結
果を得て、検量線を作成した。この検量線を用いて、各
試料中のヒトCu、 Zn−3OD濃度を求めることが
できる。
00倍に希釈した溶液を各ウェルに300μβずつ添加
し、室温で3時間インキュベートした後、溶液を除去し
てからPBS−T溶液で3回洗浄した。さらに、■、2
%ABTS、 0.01%H2O2を含有する0、1M
クエン酸緩衝液(pH4,1) 200μmを各ウェル
に添加し、室温で30分間反応させたあと、1Mクエン
酸溶液を100μm加えて反応を停止した。反応停止後
、各ウェルについて波長415nm、対照波長492n
mの吸収強度を自動マイクロタイタープレート・リーダ
ー(東ソー株式会社製MPR−A4.商標)で測定し標
準物質の濃度及び吸収強度をプロットして表1の如き結
果を得て、検量線を作成した。この検量線を用いて、各
試料中のヒトCu、 Zn−3OD濃度を求めることが
できる。
−13=
” 表1
ホ) 5H2Bの交差反応性の検討
本実雄側二)と同様の方法において、標準物質として用
いたヒトCu、 Zn−8ODのかわりにウシ、ブタ、
ラットの赤血球由来のCu、 Zn−8OD又はミトコ
ンドリア由来Mn−8ODを320ng/ml含有する
正常ウサギ血清を用いてマウス抗ヒトCu、 Zn−3
ODモノクロ一ナル抗体S H2Bの交差反応の有無を
検討した。その結果、415nmでの吸光度はいずれも
0.01未浅であった。このことから本実施例で用いた
固相免疫測定用の試薬、即ぢ、固相化抗体と標識化抗体
の組は、ヒトCu、 Zn−8ODに特異的であること
が示された。
いたヒトCu、 Zn−8ODのかわりにウシ、ブタ、
ラットの赤血球由来のCu、 Zn−8OD又はミトコ
ンドリア由来Mn−8ODを320ng/ml含有する
正常ウサギ血清を用いてマウス抗ヒトCu、 Zn−3
ODモノクロ一ナル抗体S H2Bの交差反応の有無を
検討した。その結果、415nmでの吸光度はいずれも
0.01未浅であった。このことから本実施例で用いた
固相免疫測定用の試薬、即ぢ、固相化抗体と標識化抗体
の組は、ヒトCu、 Zn−8ODに特異的であること
が示された。
実施例2
イ)抗ウシCu、 Zn−3ODモノクロ一ナル抗体の
調製実施例1イ)において、抗原として用いたヒトCu
、 Zn−8ODのかわりに、ウシ赤血球由来のCu、
Zn−3ODを用いた以外は、全く同様の操作により
、マウスの抗ウシCu、 Zn−3ODモノクロ一ナル
抗体を調製した。これらは、ウシCu、 Zn−3OD
に特異的であり、他動物例えはヒト、ブタ、ラットのC
u、 Zn−3OD及びMn−3ODとは反応性を示さ
ないことを確認した。
調製実施例1イ)において、抗原として用いたヒトCu
、 Zn−8ODのかわりに、ウシ赤血球由来のCu、
Zn−3ODを用いた以外は、全く同様の操作により
、マウスの抗ウシCu、 Zn−3ODモノクロ一ナル
抗体を調製した。これらは、ウシCu、 Zn−3OD
に特異的であり、他動物例えはヒト、ブタ、ラットのC
u、 Zn−3OD及びMn−3ODとは反応性を示さ
ないことを確認した。
口)固相化モノクローナル抗体の調製
水実施例イ)で調製したマウスの抗ウシCu、 Zn−
3ODモノクローナル抗体(名称SH3にとする。
3ODモノクローナル抗体(名称SH3にとする。
IgGl)を用いて実施例10)と同じ方法にて固相化
モノクローナル抗体を調製した。
モノクローナル抗体を調製した。
ハ)標識化モノクローナル抗体の調製
水実施例イ)で調製し、かつ口)の固相化モノクローナ
ル抗体の調製に用いたものと同じモノクローナル抗体(
SO3M)を用いて、実施例1ハ)と同様の方法で標識
化モノクローナル抗体を調製した。
ル抗体の調製に用いたものと同じモノクローナル抗体(
SO3M)を用いて、実施例1ハ)と同様の方法で標識
化モノクローナル抗体を調製した。
二)酵素免疫測定法によるウシCu、zn−3ODの定
量本実施例の口)とハ)で調製した固相化モノクローナ
ル抗体および標識化モノクローナル抗体を用いて、実施
例に)で記述した方法により、ウシCu、 Zn−3O
D O〜320ng / ml含有する正常ウサギ血清
を、標準物質として測定した。ウシCu、 Zn−3O
Dはウシ赤血球よりSDS電気泳動的に均一にまで精製
した標品である。本標品は、ウシ血清アルブミンを標準
とするロウソー法により決定した蛋白質濃度1 mg当
り、L800単位(1単位はマコードらの方法による;
J、Biol、Chem、244巻、 6049頁。
量本実施例の口)とハ)で調製した固相化モノクローナ
ル抗体および標識化モノクローナル抗体を用いて、実施
例に)で記述した方法により、ウシCu、 Zn−3O
D O〜320ng / ml含有する正常ウサギ血清
を、標準物質として測定した。ウシCu、 Zn−3O
Dはウシ赤血球よりSDS電気泳動的に均一にまで精製
した標品である。本標品は、ウシ血清アルブミンを標準
とするロウソー法により決定した蛋白質濃度1 mg当
り、L800単位(1単位はマコードらの方法による;
J、Biol、Chem、244巻、 6049頁。
1969年)の活性を示した。ウシCu 、 Z n
−S OD a度及び吸収強度をプロットして表2の如
き結果を得て、検量線を作成した。この検量線を用いて
各試料中のウシCu、 Zn−8OD濃度を求めること
ができる。
−S OD a度及び吸収強度をプロットして表2の如
き結果を得て、検量線を作成した。この検量線を用いて
各試料中のウシCu、 Zn−8OD濃度を求めること
ができる。
表2
ホ) SO2にの交差反応性の検討
−17=
本実雄側二)と同様の方法において、標準物質として用
いたウシCu、 Zn−8ODのかわりにヒト、ブタ、
ラットの赤血球由来のCu、 Zn−3OD又はミトコ
ンドリア由来Mn−3ODを320ng/ml含有する
正常ウサギ血清を用いてモノクローナル抗体S H3K
の交差反応の有無を検討した。その結果、415nmで
の吸光度はいずれも01吋未満であった。従って本実施
例での測定用キットはウシCu、 Zn−8ODに特異
的であることが示された。
いたウシCu、 Zn−8ODのかわりにヒト、ブタ、
ラットの赤血球由来のCu、 Zn−3OD又はミトコ
ンドリア由来Mn−3ODを320ng/ml含有する
正常ウサギ血清を用いてモノクローナル抗体S H3K
の交差反応の有無を検討した。その結果、415nmで
の吸光度はいずれも01吋未満であった。従って本実施
例での測定用キットはウシCu、 Zn−8ODに特異
的であることが示された。
以上の結果から、本発明は種々の試料中におけるCu、
Zn−8ODを測定するのに優れた方法であることか
わかる。
Zn−8ODを測定するのに優れた方法であることか
わかる。
Claims (1)
- Cu、Zn−スーパーオキサイド・ディスムターゼを特
異的に認識するモノクローナル抗体で、固相化されてい
る抗体と標識されている抗体が同一の抗体であり、かつ
それらを用いて同一容器内で同時に抗原抗体反応を行い
、測定感度が1ng/ml〜320ng/mlであるこ
とを特徴とするCu、Zn−スーパーオキサイド・ディ
スムターゼの測定方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP32376387A JPH01165963A (ja) | 1987-12-23 | 1987-12-23 | Cu,Zn−スーパーオキサイド・ディスムターゼの測定方法 |
EP88121530A EP0325782A3 (en) | 1987-12-23 | 1988-12-22 | Method of measurement of cu,zn-superoxide dismutase |
AU27419/88A AU630339B2 (en) | 1987-12-23 | 1988-12-23 | Measurement of cu,zn-superoxide dismutase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP32376387A JPH01165963A (ja) | 1987-12-23 | 1987-12-23 | Cu,Zn−スーパーオキサイド・ディスムターゼの測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01165963A true JPH01165963A (ja) | 1989-06-29 |
Family
ID=18158350
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP32376387A Pending JPH01165963A (ja) | 1987-12-23 | 1987-12-23 | Cu,Zn−スーパーオキサイド・ディスムターゼの測定方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
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EP (1) | EP0325782A3 (ja) |
JP (1) | JPH01165963A (ja) |
AU (1) | AU630339B2 (ja) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61234358A (ja) * | 1985-04-10 | 1986-10-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ヒト肺癌抗原の定量方法 |
JPS62167479A (ja) * | 1985-08-29 | 1987-07-23 | Ube Ind Ltd | ヒト銅・亜鉛−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼのモノクロ−ナル抗体からなるヒト銅・亜鉛−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ測定用試薬およびそれを用いる胃癌の診断方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4486530A (en) * | 1980-08-04 | 1984-12-04 | Hybritech Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
JPS57102196A (en) * | 1980-12-19 | 1982-06-25 | Toyo Jozo Co Ltd | Measuring method of superoxide dismutase (sod) |
GB8326508D0 (en) * | 1983-10-04 | 1983-11-02 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Monoclonal anti-superoxide dismutase antibody |
JPS61212600A (ja) * | 1985-03-19 | 1986-09-20 | Ube Ind Ltd | ヒト銅,亜鉛ス−パ−オキシドジスムタ−ゼに対するモノクロ−ナル抗体及びその製造方法 |
US4940659A (en) * | 1987-02-20 | 1990-07-10 | Monoclonetics International, Inc. | Screening extra-cellular body fluids for superoxide dismutase (SOD-1) for determining fetal trisomy 21 down syndrome |
-
1987
- 1987-12-23 JP JP32376387A patent/JPH01165963A/ja active Pending
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1988
- 1988-12-22 EP EP88121530A patent/EP0325782A3/en not_active Withdrawn
- 1988-12-23 AU AU27419/88A patent/AU630339B2/en not_active Ceased
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61234358A (ja) * | 1985-04-10 | 1986-10-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ヒト肺癌抗原の定量方法 |
JPS62167479A (ja) * | 1985-08-29 | 1987-07-23 | Ube Ind Ltd | ヒト銅・亜鉛−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼのモノクロ−ナル抗体からなるヒト銅・亜鉛−ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ測定用試薬およびそれを用いる胃癌の診断方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0325782A3 (en) | 1990-08-01 |
EP0325782A2 (en) | 1989-08-02 |
AU630339B2 (en) | 1992-10-29 |
AU2741988A (en) | 1989-06-29 |
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