JPH0195799A - モノクローナル抗体および免疫化学的測定方法 - Google Patents

モノクローナル抗体および免疫化学的測定方法

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JPH0195799A
JPH0195799A JP62253729A JP25372987A JPH0195799A JP H0195799 A JPH0195799 A JP H0195799A JP 62253729 A JP62253729 A JP 62253729A JP 25372987 A JP25372987 A JP 25372987A JP H0195799 A JPH0195799 A JP H0195799A
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arginase
human
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antibody
human arginase
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Atsushi Isoai
礒合　敦
Hidematsu Hirai
平井　秀松
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AGC Inc
Original Assignee
KISO SHIYUYOUGAKU KENKYUKAI
Asahi Glass Co Ltd
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    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、抗アルギナーゼモノクローナル抗体とそれを
利用した免疫化学的測定法に関するものである。
［従来の技術とその問題点コ アルギナーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，３，１，Ｌ−アルギニ
ン・アミジノヒドロラーゼ）は、Ｌ−アルギニンをＬ−
オルニチンと尿素に分解する酵素であり、特に肝臓に大
量に存在する。アルギナーゼの測定は、肝疾患や高アン
モニア血症等の診断に有用である。従来、アルギナーゼ
の測定はＬ−アルギニンとアルギナーゼの反応生成物の
１つである尿素を測定する［クリニカルケミストリ　（
Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　）第１３巻、９００頁、１９
６７年］、同じくもう１つの反応生成物であるし一オル
ニチンを測定する方法［ジャーナルオブバイオロジカル
　ケミストリ　（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、　）第１９９巻、９１頁、１９５２年］、１
４ｃラベルしたグリニジノーし一アルギニンを基質とし
て用いる方法［アナリティ力ル　バイオケミストリ（Ａ
ｎｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）第　１０２巻、２０
６頁、　　１９８０年〕、などが知られている。しかし
、これら酵素活性を測定する方法は多量の試料を必要す
ること、除蛋白のため遠心分離操作を必要とすること、
血液中に存在する尿素やオルニチンなどを除く操作を必
要とすること、などの理由により、多数験体の処理には
多大の労力、時間、および試薬を要するものであった。
［問題点を解決する手段］ 本発明者らは、肝疾患や小児の遺伝的代謝異常などの診
断のためのマススクリーニングに利用できるアルギナー
ゼの免疫化学的測定法の開発を試み、その結果新規なモ
ノクローナル抗体とそれを利用した上記アルギナーゼの
免疫化学的測定法を見い出すに至った。即ち、本発明は
、ヒト以外の哺乳動物のアルギナーゼを抗原として用い
て得られた抗アルギナーゼモノクローナル抗体であって
、かつヒトアルギナーゼモノクローナル抗体、およびこ
の抗アルギナーゼモノクローナル抗体を用いて、ヒト血
清中あるいは他のヒト体液中のヒトアルギナーゼ濃度を
免疫化学的に測定することを特徴とする免疫化学的測定
法、である。
ヒト以外の哺乳動物のアルギナーゼは、ヒトアルギナー
ゼと同様の酵素活性を有するものの、そのアミノ酸配列
や立体構造などの相違による抗原性は全く同一とはいえ
ないものであると考えられる。しかし、両アルギナーゼ
間には抗体によって認識される抗原決定部位が共通する
部分もあると考えられ、従ってヒト以外の哺乳動物のア
ルギナーゼに対する抗体の内には、ヒトアルギナーゼと
共通の抗原決定部位を認識する抗体が存在すると考えら
れる。従って、本発明の抗アルギナーゼモノクローナル
抗体は、ヒト以外の哺乳動物のアルギナーゼを用いて得
られるハイブリドーマ（融合細胞）群からヒトアルギナ
ーゼと結合しつる抗体を産生ずるハイブリドーマを選択
し、この選択したバイプリドーマより得られるモノクロ
ーナル抗体である。なお、このハイブリドーマの選択に
あたっては、通常精製されたヒトアルギナーゼが必要と
される。ヒト以外の哺乳動物のアルギナーゼとしては、
たとえば、ラケット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウ
マ、ヒツジ、サルなどの臓器、特に肝臓から得られるア
ルギナーゼが適当であるが、哺乳動物の種類などはこれ
らに限られるものではない。アルギナーゼは粗製アルギ
ナーゼであってもよいが、好ましくは精製アルギナーゼ
が用いられる。アルギナーゼの精製は公知の方法（例え
ば、後述のＳｃｈｉｍｋｅの方法）を用いて行なうこと
ができる。モノクローナル抗体は通例のＩｇＧクラスは
勿論、ＩｇＭや他のクラスの抗体であってもよい。
モノクローナル抗体は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎらの方法［ネ
イシュア（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５６巻、第４９５頁。
１９７５年］と同様の方法で得ることができる。例えば
、前記アルギナーゼを抗原として免疫して得られたマウ
ス牌細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合させ、ヒト
アルギナーゼ結合性のモノクローナル抗体を分泌するハ
イブリドーマを選択し、そのハイブリドーマよりモノク
ローナル抗体を得る。より具体的には、以下のようにし
てモノクローナル抗体を得る、精製あるいは粗製アルギ
ナーゼで免疫したマウス（例：　ＢＡＬＢＺＣ系など）
から得られた肺細胞と、同系マウスのミエローマ細胞（
例：Ｎ５−１．　Ｐ３Ｕｌなど）とを細胞融合剤（例：
ポリエチレングリコール、センダイウィルスなど）の存
在下で混合し、融合させて培養する。ハイブリドーマは
、ピポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地［Ｈ
ＡＴ培地；ネイシュア（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５６巻、
第４９５頁、１９７５年コなどを用いて選択的に増殖さ
せ、次いで抗アルギナーゼ抗体産生細胞を選択する。培
養液中に目的とするヒトアルギナーゼに結合しつる抗体
が含まれているか否かは、公知の酸素免疫測定法を用い
て検定できる。ヒトアルギナーゼに対、して特異性の高
い抗体を産生ずるハイブリドーマは、さらに限界希釈法
によりモノクローン化される。得られた目的とするハイ
ブリドーマは、通常の液体培地や哺乳動物の腹腔内で増
殖させる。ハイブリドーマが産生ずるモノクローナル抗
体は公知の方法（たとえば、硫酸アンモニウムによる塩
析、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー、プロティ
ンＡカラムクロマトグラフィーなどによる）により濃縮
精製される。
本発明は、また上記抗アルギナーゼモノクローナル抗体
を用いてヒトアルギナーゼを免疫化学的に測定する方法
である。上記モノクローナル抗体は、そのまま使用する
ことは勿論、Ｆａｂ’フラグメントやＦ（ａｂ′）２フ
ラグメントなどのフラグメントや他の修飾物であっても
よい。
上記のような抗アルギナーゼモノクローナル抗体を用い
てヒトアルギ、ナーゼを免疫化学的に測定する方法にお
いて測定の対象となる被験試料としては、ヒト血清や他
の体液がある。具体的には、尿、血清、血漿などがあり
、特に血清が繁用される。
免疫化学的測定方法としては、競合法、サンドイツチ法
、凝集法などを用いることができる。これら方法の概要
を以下に示す。
■競合法：未知量のアルギナーゼを含む被験液と標識剤
で標識したアルギナーゼの一定量とを対応する抗アルギ
ナーゼ抗体の一定量に対して競合反応させ、抗体と結合
した標識剤または抗体と結合しなかった標識剤の量を測
定し、その測定値より前記被験液中のアルギナーゼの量
を決定する。
■サンドイッチ法：担体上に保持された過剰量の抗アル
ギナーゼ抗体に未知量のアルギナーゼを含む被験液を加
えて反応させ（第１反応）、次に第１反応に用いた抗体
とは抗原認識部の異る抗体を標識したものを一定量加え
て反応させ、（第２反応）、担体上に保持された標識剤
または担体上に保持されなかった標識剤の量を測定して
、その値より前記被験液中のアルギナーゼの量を決定す
る。なお、第１反応と第２反応は同時に行ってもよく、
時間をおいて順次行ってもよい。
■凝集法：赤血球やラテックス粒子などの担体表面に抗
アルギナーゼ抗体を結合さ せ、この抗体感作粒子と未知量のアルギナーゼを含む被
験液とを接触させて、抗体感作粒子をアルギナーゼを介
して結合させ凝集を起させる。被験液中のアルギナーゼ
の量に応じて凝集が起るので、その凝集の程度をスライ
ド法、マイクロタイマー法、比色法などで測定し、その
結果より前記被験液中のアルギナーゼの量を決定する。
上記方法に用いる標識剤としては、例えば、放射性同位
元素、酵素、蛍光物質、発光物質などがある。具体的に
は、例えば、＋２ｓＪ、　＋３１１゜３１、１４ｃなど
の放射性同位元素がある。酵素としては、安定で比活性
の大きなものが好ましく、■カルボキシヒドラーゼ［例
：グリコシダーゼ、アミラーゼコ、■アミダーゼ［例：
ウレアーゼ、アスパラギナーゼ］、◎エステラーゼ［例
：コリンエステラーゼ、ホスファターゼ、スルファター
ゼ、リパーゼコ、■ヌクレアーゼ［例：デオキシリボヌ
クレアーゼ、リボヌクレアーゼＪ、■鉄・ポルフィリン
酵素［例：カラターゼ、ベルオキシターゼコ、■銅酵素
［例：チロシナーゼ、アスコルビン酸オキシターゼ］、
■脱水素酵素［例：アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱
水素酵素、乳酸脱水素酵素、インクエン酸脱水素酵素］
、などが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレサミ
ン、フルオレセインイソチオシアネートなどが、発光物
質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェ
リン、ルシゲニンなどが挙げられる。これら標識剤と抗
体あるいはヒトアルギナーゼとを結合させる方法として
は、公知のクロラミンＴ法［ネイシュア（Ｎａｔｕｒｅ
）　。
第１９４巻、第４９５頁、１９６２年］、過ヨウ素酸法
［ジャーナル　オブ　ヒストケミストリ　マンド　サイ
トケミストリ、第２２巻、第１０８４頁、１９７４年］
、マレイミド法［ジャーナル　オブバイオケミストリ、
第７９巻、第　２３３頁、１９７６年コなどの方法を用
いることができる。
前記担体としては、ゲル粒子（例：アガロースグル）、
デキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、セルロー
ス粒子、イオン交換セルロース（例ニジエチルアミノエ
チルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、物理
的吸着剤（例ニガラス球、アミノアルキル化ガラス球）
、シリコン片、ポリスチレン系樹脂（例：ポリスチレン
球、ポリスチレン粒子）、イムノアッセ用プレート、イ
オン交換樹脂（例：弱酸性陽イオン交換樹脂、弱塩基性
陰イオン交換樹脂）などが挙げられる。担体に抗体を保
持させる方法としては、公知の方法を用いることができ
、例えば、ブロムシアン法、グルタルアルデヒド法（゛
代謝°゛、第８巻、第６９６頁、　１９７１年）などの
方法を用いることができる。また、より簡便な方法とし
て、物理的に担体表面に吸着させてもよい。　　　゛ 以下に本発明を参考例、および実施例により具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１　（ヒトアルギナーゼの精製）Ｓｃｈｊｍｋｅ
の方法［イソラド　インエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏ
ｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１７巻。
第３１４頁］に準じてヒトアルギナーゼを採取精製した
。即ち、ヒト肝臓４００ｇを細断し、これに１２００ｍ
（！の０．　ＩＭｋｃｌおよび０．０５Ｍの塩化マンガ
ンを含む０．０１Ｍ　トリス緩衝液を加え、水冷下ホモ
ジナイザーで１時間破砕して懸濁液を調整した。次に、
遠心分離し、その上清に最終濃度３５ｗｔ％になるよう
に硫酸アンモニウムを加え、水冷下１時間攪拌した。さ
らに遠心分離し、その上清に最終濃度６０ｗｔ％となる
ようにさらに硫酸アンモニウムを加え、水冷下１時間攪
拌した。次いで、遠心分離を行い沈殿を得、その沈殿に
０．０１Ｍ　トリス緩衝液を加えて溶解し、同じ緩衝液
に対して透析した後、６０℃で２０分間熱処理を行い、
水冷後に遠心分離を行って上清を得た。
次に、上記と同じ緩衝液を用いてＤＥＡＥセルロースの
カラム（２，６ｃｍＸ　５０ｃｍ）にかけてクロマトグ
ラフィ精製を行った。未吸着分画をさらにＣＭ−セファ
ロースＣＬ−６Ｂ　［ファルマシア社（スウェーデン）
製］のカラム（２，６ｃｍＸ５０ｃｍ）にかけた。吸着
分画を０から０．５ＭのＮａＣ１の直線濃度勾配により
溶出し、ヒトアルギナーゼを含むフラクションを得た。
このフラクションを０．０１Ｍ　トリス緩衝液に対して
透析後、再度ＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂカラムに吸
着させた。
０．１Ｍアルギニン溶液で溶出させ、ヒトアルギナーゼ
を含むフラクションを濃縮し、さらに七フアクリル５２
００　（ファルマシア社製）カラム（２，６ｃｍ　Ｘ９
０ｃｍ）でゲルクロマトグラフィを行い、精製したヒト
アルギナーゼを４３ｍｇ得た。
参考例２（標識抗体の調整） （ａ）　ｅ前例１で得た精製ヒトアルギナーゼ０．３ｍ
ｇを生理食塩水１ｍ（２に溶解し、これに）０イドの完
全アジュバント１ｍＱを加えてよく混和して乳剤を製造
し、これをヤギの両大腿部筋肉内、および背部皮下数ケ
所に注射した。
この操作を２週毎に５回行い（合計抗原量１．５ｍｇ　
）　、最終免疫後１週間で採血し、抗血清２℃を得た。
５０ｃｃの抗血清を硫酸アンモニウム法で塩析してグロ
ブリン分画を調整したのち、ＤＥＡＥセルロースのカラ
ム（２，６ｃｍＸ　５０ｃｍ）を用いて精製し、１ｇの
抗ヒトアルギナーゼ抗体を得た。
（ｂ）アルカリホスファターゼ標識抗ヒトアルギナーゼ
抗体複合体の調整 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）Ｉ　６．８）に希釈したア
ルカリホスファターゼ（０，５ｍｇ）の溶液１ｍＱに上
記（ａ）で得た抗ヒトアルギナーゼ抗体２ｍｇを溶解し
た。次に、この溶液に３％グルタルアルデヒド溶液０．
１ｍＱを加えて室温で６０分間反応させ、０．５Ｍ　Ｎ
ａＣ１を含むトリス緩衝液（ｐＨ７，８）に対し１夜透
析した。さらに、セフアクリル５２００のカラムで分画
してアルカリホスファターゼ標識抗ヒトアルギナーゼ抗
体複合体を得た。
参考例３（ラットアルギナーゼの精製）ラットの肝臓１
３５ｇから参考例１と同じ方法によりラットアルギナー
ゼを採取精製し、１３ｍｇの精製ラットアルギナーゼを
得た。
実施例１ （１）抗アルギナーゼモノクローナル抗体の作製参考例
３で得た精製ラットアルギナーゼ１００μＱを生理食塩
水５００μＱに溶解し、これにフロイントの完全アジュ
バント５００μＱを加えてよく混和し乳剤を調整し、こ
れをＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した。さらに
、２週間毎に２回同じ量の上記抗原含有乳剤で免疫し、
最終免疫後４日目に肺臓を取り出した。次にＲＰＭＩ　
１６４０培地でよく洗浄したのち、当該肺細胞１×１０
８個とマウスミエローマ（Ｐ２Ｏ３）　５Ｘ１０’個と
を混合し、１２０叶ｐｍで１５分間遠心してペレットを
作った。次にポリエチレングリコール４０００をＲＰＭ
Ｉ　１６４０に５０％溶解した溶液１ｍＱを加えて、さ
らにＲＰＭ１１６４０８ｍＱを徐々に加えて希釈した後
、１１０００ｒｐで５分間遠心分離し、細胞なＨＡＴ培
地培地４０ｍ分散させた。次に９０ウエルの借地プレー
ト［ヌンク社（デンマーク）製］に上記細胞分散液を１
００ｍＱづつ注入し、さらに４日目および６日目にＨＡ
Ｔ培地５０μＱづつ注入した、１４日後における培養上
清について、ラットアルギナーゼに対する抗体価を測定
したところ、計２８８ウェル中１６ウエルに陽性を認め
た。
次に、これら陽性バイプリドーマのクローニングを限界
希釈法を繰り返して行い、最終的に抗ラットアルギナー
ゼモノクローナル抗体を産生ずる１１種のハイブリドー
マを得た。
これらを鉱油で処理されたＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔
内に注入して、２〜３週間後に腹水を採取し、これより
抗体含有液を得た。この液を硫酸アンモニウムで塩析し
、それぞれグロブリン分画を得た。
（２）ヒトアルギナーゼ結合性抗アルギナーゼモノクロ
ーナル抗体の選択 下記試薬を用意し、前項で得られた１１種の抗アルギナ
ーゼモノクローナル抗体の中からヒトアルギナーゼに結
合性を有する抗体を選択した。
ＨＲＰ標識抗体：西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
）標識抗マウスイムノグロブリン抗体［カッベル社（米
国）製］ 緩衝液Ａ　：　０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含むｐ）Ｉ　７
．４の０、０２Ｍリン酸緩衝液。
緩衝液Ｂ：１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）　、および
０．１５　ＮａＣ１を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液。
）ＩＲＰ活性測定試薬：０．０２％過酸化水素と０．１
５％フェニレンジアミンを含むｐＨ４，８の０．１Ｍク
エン酸−リン酸緩衝液。
まず、ＥＩＡ用イムノマイクロプレートＩ［ヌンク社製
］の各ウェルに緩衝液Ａで希釈して調整した参考例１で
得た精製ヒトアルギナーゼ液（２５μｇ／ｍ１））を５
μρづつ注入し、室温で１時間放置した。次に緩衝液Ａ
で洗浄したのち、緩衝液Ｂを１００μＱ加え、用時まで
冷所で保存し、抗原結合マイクロプレートを調整した。
前項（１）で得たモノクローナル抗体を緩衝液Ｂで希釈
して（１μｓ／ｍ１２）得た抗体溶液５０μＱを各ウェ
ルに注入し、３７℃で１時間反応させた。各ウェルな生
理食塩水で洗浄後、ＨＲＰ標識抗体を緩衝液Ｂで４００
倍に希釈した溶液５０μＱ注入し、３７℃で１時間反応
させた。生理食塩水で洗浄した後、ＨＲＰ活性測定試薬
１００μＱを加えて室温１０分間反応させ、ｌＮ−ＨＣ
ｌ１００μＱづつを加えて反応を停止させてから、マイ
クロプレート用自動比色計により、ブランクを対照にし
て４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を第１表
に示す。
上記測定の結果、前記（１）で得た１１種のモノクロー
ナル抗体の内、２種のモノクローナル抗体（ＲＩＤ８１
とＲ２Ｇ１１）がヒトアルギナーゼに対して結合性を有
することが確認された。
第　　１　　表 ＲＩＤ８１１ｇＧ１　十 ＲＩＧＩＩ　　ＩｇＧ１　　− Ｒ２ＤＩ９　１ｇＧ２ａ　　− Ｒ２Ｈ１０１ｇＧ１　　− Ｒ２Ｇ５１　１ｇＧ１　　− ＲＩＣ２１ｇＭ　　　− Ｒ２Ｂ６　　１ｇＭ　　　− Ｒ２Ｇ１１　１ｇＭ　　　＋ Ｒ３Ａ３　　１ｇＭ　　　− Ｒ３Ｆ２　　１ｇＭ　　　− Ｒ３Ｈ６１ｇＭ　　　− （３）測定 ＥＩＡ用イムノプレートの各ウェルにヒトアルギナーゼ
結合性のモノクローナル抗体（ＲＩＤ８１　、またはＲ
２Ｇ１１　）を前記緩衝液Ａで希釈した溶液（２５μｇ
／ｍｆ２）を５０μＱづつ加え、室温で１時間放置した
。次に、緩衝液Ａで洗浄した後前記緩衝液Ｂを１００μ
Ｑ加え、用時まで冷所保存した。
一方、参考例１で得た精製ヒトアルギナーゼを前記緩衝
液Ｂで希釈して、種々の濃度のヒトアルギナーゼ標準液
を用意した。この標準液を上記モノクローナル抗体を結
合させたイムノプレートの各ウェルに１００μＱづつ加
え、３７０℃で２時間反応させた。次に、各ウェルな生
理食塩水で洗浄した後、参考例２で作成したアルカリフ
ォスターゼ標識抗ヒトアルギナーゼ抗体複合体１００μ
Ｑを加えて、３７℃で２時間反応させ、その後、生理食
塩水で洗浄した。次いで、各ウェルに酵素基質液（［１
ｍＭ　ＭｇＣ１ｇを含む０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐ）１
９．８）に溶解した２ｍｇ／ｍＱのｐ−ニトロフェニル
リン酸液］１００μＱ加え、室温で３０分間反応させ、
反応停止剤［３ＮＮａ叶］１００μＱ加えて反応させた
。ブランクを対照として４０５ｎｍにおける吸光度を測
定した。ＲＩＤ８１モノクローナルを使用して得られた
標準曲線を第１図に示す。
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例１で得たヒトアルギナーゼ濃度と吸光度
との関係を示すグラフである。 第　１　図

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト以外の哺乳動物のアルギナーゼを抗原として用
    いて得られた抗アルギナーゼモノクローナル抗体であっ
    て、かつヒトアルギナーゼに結合しうる抗アルギナーゼ
    モノクローナル抗体 ２、ヒト以外の哺乳動物のアルギナーゼを抗原として用
    いて得られた抗アルギナーゼモノクローナル抗体であっ
    て、かつヒトアルギナーゼに結合しうる抗アルギナーゼ
    モノクローナル抗体を用いて、ヒト血清中あるいは他の
    ヒト体液中のヒトアルギナーゼ濃度を免疫化学的に測定
    することを特徴とする免疫化学的測定方法。
JP62253729A 1987-10-09 1987-10-09 モノクローナル抗体および免疫化学的測定方法 Pending JPH0195799A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996028733A1 (fr) * 1995-03-16 1996-09-19 Yamasa Corporation Anticorps specifique pour une arginase d'origine hepatique et application

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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