JPH01104164A - ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ誘導体およびその製造法 - Google Patents
ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ誘導体およびその製造法Info
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、生体に有毒なスーパーオ中シトを分解するス
ーパーオキシドジスムターゼの酵素活性を概ね保持した
ままで該スーパーオキシドジスムターゼに比べて大幅に
延長された血中半減期を有する新規なスーパーオキシド
ジスムターゼ誘導体およびその製造法に関する。
ーパーオキシドジスムターゼの酵素活性を概ね保持した
ままで該スーパーオキシドジスムターゼに比べて大幅に
延長された血中半減期を有する新規なスーパーオキシド
ジスムターゼ誘導体およびその製造法に関する。
本発明、により提供されるスーパーオキシドジスムター
ゼ誘導体は活性酸素ラジカルが関与する種々の疾患に対
して有効であり、特に抗炎症剤、抗虚血障害剤、抗脳浮
腫剤、抗パラコート中毒剤として使用することができる
。また該スーパーオキシドジスムターゼ誘導体は虚血性
心疾患治療剤または活性酸素ラジカルに起因する制癌剤
の副作用を軽減するための医薬としても有用である。
ゼ誘導体は活性酸素ラジカルが関与する種々の疾患に対
して有効であり、特に抗炎症剤、抗虚血障害剤、抗脳浮
腫剤、抗パラコート中毒剤として使用することができる
。また該スーパーオキシドジスムターゼ誘導体は虚血性
心疾患治療剤または活性酸素ラジカルに起因する制癌剤
の副作用を軽減するための医薬としても有用である。
従来の技術
従来、スーパーオキシドジスムターゼ〔以下、これをS
ODと略記する〕は動物、植物、微生物などの生体内に
広く存在し、生体に有害なスーパーオ午シトを分解する
酵素として知られている。
ODと略記する〕は動物、植物、微生物などの生体内に
広く存在し、生体に有害なスーパーオ午シトを分解する
酵素として知られている。
最近、単離されたSODを抗炎症剤として用いようとす
る試みがなされている〔ファルマシア、17巻411頁
(1981年)およびカレント・セ2ポイテイツク・す
f −チ(Current TherapeuticR
esearch)、16巻706頁(1974年)参照
〕0SODを静脈内投与した場合、その血中半減期は僅
か4〜6分とされておfi、SODは速かに尿中に***
代謝される。SODの血中半減期を延長させるためにS
ODをフィコール、ポリエチレングリコールまたはジッ
トアルブミンで修飾し、巨大分子化することが試みられ
てきたが、フィコールまたはポリエチレングリコールで
修飾されたSODではSODの酵素活性が大幅に低下し
、またラットアルブミンで修飾されたSODには抗原性
があることが報告されているQまたイヌリンで修飾され
たSODではSODに比べて酵素活性の低下が認められ
るが、その血中半減期は大幅に延長されることが知られ
ている〔特開昭58−32826号公報参照〕0 発明が解決しようとする問題点 従来知られている種々の修飾SODはすでに報告されて
いる上記の理由、または巨大分子化に伴う組織内浸透性
の低下などの点でいずれも実用上問題がある0 しかして1本発明の1つの目的は、SODの酵素活性を
概ね保持したtまで該SODに比べて大幅に延長された
血中半減期を有する新規な非巨大分子化スーパーオ牛シ
トジスムターゼ誘導体を提供するにある。
る試みがなされている〔ファルマシア、17巻411頁
(1981年)およびカレント・セ2ポイテイツク・す
f −チ(Current TherapeuticR
esearch)、16巻706頁(1974年)参照
〕0SODを静脈内投与した場合、その血中半減期は僅
か4〜6分とされておfi、SODは速かに尿中に***
代謝される。SODの血中半減期を延長させるためにS
ODをフィコール、ポリエチレングリコールまたはジッ
トアルブミンで修飾し、巨大分子化することが試みられ
てきたが、フィコールまたはポリエチレングリコールで
修飾されたSODではSODの酵素活性が大幅に低下し
、またラットアルブミンで修飾されたSODには抗原性
があることが報告されているQまたイヌリンで修飾され
たSODではSODに比べて酵素活性の低下が認められ
るが、その血中半減期は大幅に延長されることが知られ
ている〔特開昭58−32826号公報参照〕0 発明が解決しようとする問題点 従来知られている種々の修飾SODはすでに報告されて
いる上記の理由、または巨大分子化に伴う組織内浸透性
の低下などの点でいずれも実用上問題がある0 しかして1本発明の1つの目的は、SODの酵素活性を
概ね保持したtまで該SODに比べて大幅に延長された
血中半減期を有する新規な非巨大分子化スーパーオ牛シ
トジスムターゼ誘導体を提供するにある。
本発明の他の1つの目的は、上記のスーパーオキシドジ
スムターゼ誘導体の製造法を提供するにある。
スムターゼ誘導体の製造法を提供するにある。
問題点を解決するための手段
本発明によれば、上記の1つの目的は1式%式%()
〔式中、(SOD)はアミン基に換えてアミノ基から1
個の水素原子を除いた基を1ないし6個有するスーパー
オキシドジスムターゼを表わし、〔z〕R″′ −CHz−C−(これらの式中、R1、R3およびR6
はそC0OR’ れぞれ水素原子またはメチル基を表わし R2は水素原
子、塩素原子、臭素原子またはメチル基を表わし R4
は水素原子または炭素数1ないし5のアルキル基を表わ
し R6はメチル基またはエチル基を表わす)で示され
る基からなる群から選ばれる基。
個の水素原子を除いた基を1ないし6個有するスーパー
オキシドジスムターゼを表わし、〔z〕R″′ −CHz−C−(これらの式中、R1、R3およびR6
はそC0OR’ れぞれ水素原子またはメチル基を表わし R2は水素原
子、塩素原子、臭素原子またはメチル基を表わし R4
は水素原子または炭素数1ないし5のアルキル基を表わ
し R6はメチル基またはエチル基を表わす)で示され
る基からなる群から選ばれる基。
すか、または炭素数1ないし4のアルカノール。
炭素数1ないし4のアルキル基部分を含むエチレングリ
コールモノアルキルエーテルもしくは炭素数1ないし4
のアルキル基部分を含むグリセリンシアル中ルエーテル
から水酸基を除いた残基を表わす)で示される基および 子の結合手は〔SOD〕と結合するものであることを意
味する)で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量
が800ないし20000である共重合体の一価の基を
表わし、Xは[SOD]が有するアミノ基から1個の水
素原子を除いた基の数に対応する工ないし6の整数を表
わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体(以下
、これをSOD誘導体と称す)を提供することによって
達成される。
コールモノアルキルエーテルもしくは炭素数1ないし4
のアルキル基部分を含むグリセリンシアル中ルエーテル
から水酸基を除いた残基を表わす)で示される基および 子の結合手は〔SOD〕と結合するものであることを意
味する)で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量
が800ないし20000である共重合体の一価の基を
表わし、Xは[SOD]が有するアミノ基から1個の水
素原子を除いた基の数に対応する工ないし6の整数を表
わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体(以下
、これをSOD誘導体と称す)を提供することによって
達成される。
また本発明によれば、上記の他の1つの目的は、SOD
と −CH2−C−(これらの式中、R1、R3およびR5
は〇〇〇R’ それぞれ水A11.子またはメチル基を表わLm R”
は水素原子、塩素原子、臭素原子またはメチル基を表わ
し R4は水素原子または炭素数1ないし5のアルキル
基を表わし%R6はメチル基またはエチル基を表わす)
で示される基から・なる群から選ばれる基、 すか、または炭素数1ないし4のアルカノール、炭素数
1ないし4のアル千ル基部分を含むエチレングリコール
モノアルキルエーテルもしくハ炭素数1ないし4のアル
キル基部分を含むグリセリンジアルキルエーテルから水
酸基を除いた残基を表わす)で示される基および で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量が800
ないし20000である共重合体(以下、これを共重合
体と略称する)とを州7〜11のアルカリ水溶液中で反
応させることを特徴とする上記のSOD誘導体の製造法
を提供することによって達成される。
と −CH2−C−(これらの式中、R1、R3およびR5
は〇〇〇R’ それぞれ水A11.子またはメチル基を表わLm R”
は水素原子、塩素原子、臭素原子またはメチル基を表わ
し R4は水素原子または炭素数1ないし5のアルキル
基を表わし%R6はメチル基またはエチル基を表わす)
で示される基から・なる群から選ばれる基、 すか、または炭素数1ないし4のアルカノール、炭素数
1ないし4のアル千ル基部分を含むエチレングリコール
モノアルキルエーテルもしくハ炭素数1ないし4のアル
キル基部分を含むグリセリンジアルキルエーテルから水
酸基を除いた残基を表わす)で示される基および で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量が800
ないし20000である共重合体(以下、これを共重合
体と略称する)とを州7〜11のアルカリ水溶液中で反
応させることを特徴とする上記のSOD誘導体の製造法
を提供することによって達成される。
SODと共重合体との反応は、通常炭酸ナトリウム、重
炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムな
どの塩の水溶液中にSODを溶解し、得られた溶液に粉
末状の共重合体またはジメチルスルホキシドなどの有I
f&溶媒に溶解した共重合体を添加することにより行わ
れる。反応中、溶液の州は7〜11に維持されているこ
とが必要であり、…が7よシ低い場合には、共重合体の
溶解性が低下して反応は進行しない。−また、…が11
より高い場合には、SODの酵素活性が失活して本発明
の有効成分化合物である5ODp導体を得ることはでき
ない。反応温度としては、約3〜50℃が好ましく、3
〜40℃がさらに好ましい。また、反応時間は反応温度
、共重合体の添加方法により異なるが、通常10分〜3
時間である。共重合体の使用量はSOD1モルに対して
約0.5〜30モルの範囲である。この使用量によって
SODに結合させる共重合体の分子数を調整することが
できる。
炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムな
どの塩の水溶液中にSODを溶解し、得られた溶液に粉
末状の共重合体またはジメチルスルホキシドなどの有I
f&溶媒に溶解した共重合体を添加することにより行わ
れる。反応中、溶液の州は7〜11に維持されているこ
とが必要であり、…が7よシ低い場合には、共重合体の
溶解性が低下して反応は進行しない。−また、…が11
より高い場合には、SODの酵素活性が失活して本発明
の有効成分化合物である5ODp導体を得ることはでき
ない。反応温度としては、約3〜50℃が好ましく、3
〜40℃がさらに好ましい。また、反応時間は反応温度
、共重合体の添加方法により異なるが、通常10分〜3
時間である。共重合体の使用量はSOD1モルに対して
約0.5〜30モルの範囲である。この使用量によって
SODに結合させる共重合体の分子数を調整することが
できる。
このようにして得られた反応液にはSOD誘導体と未反
応のSODおよび共重合体などが存在するが、かかる反
応液を濾過し、濾液をゲル濾過し、得られるSOD誘導
体を含む溶出液を必要に応じてハイドロフォービック・
クロマトグラフィーに付したのち限外濾過に付すること
により濃縮したのち、凍結乾燥することによりSOD誘
導体の固型物を取得することができる。
応のSODおよび共重合体などが存在するが、かかる反
応液を濾過し、濾液をゲル濾過し、得られるSOD誘導
体を含む溶出液を必要に応じてハイドロフォービック・
クロマトグラフィーに付したのち限外濾過に付すること
により濃縮したのち、凍結乾燥することによりSOD誘
導体の固型物を取得することができる。
上記の反応によシ%SODが有するアミノ基と共重合体
が有する無水マレイン酸環とが結合し、SOD誘導体が
生成する。例えば、ヒト型SOD ’には1分子当ジ
アミノ基が22個(ヒト赤血球型SODまたは酵母にて
遺伝子組換え操作により得られたヒト型5OD)または
24個(大腸菌にて遺伝子組換え操作により得られたヒ
ト型5OD)存在するが、上記の反応により、いずれか
の7ミノ基と共重合体が有する1個の無水マレイン酸環
とが反応し、SODの1分子当り共重合体が1〜6分子
結合したSOD誘導体が得られる。原料として用いる共
重合体には1分子中に通常無水マレイン酸環が平均0.
5〜2個存在するが、これらの無水マレイン酸環のなか
の1個がSODのアミノ基と結合した場合、残シの無水
マレイン酸環はさらに別のアミン基と反応することは少
なく、水とン酸由来の基となシ易い。したがって、SO
D9導体の構成単位には前記(ロ)の式においてR7が
水素原子である基も包含される。また原料として部分半
エステル化共重合体を用いる場合には、得られるSOD
誘導体の構造単位に前記(ロ)の基として上記のマレイ
ン酸由来の基が半エステル化されたものだけでなく、少
量の該マレイン酸由来の基が含まれる。共重合体の1分
子とSODの複数分子とが反応して該共重合体の複数個
の無水マレイン酸環と各SODのアミノ基とがそれぞれ
結合した化合物が副生する可能性があるが、かかる副生
物が少量混入したSOD誘導体を本発明の有効成分化合
物として用いることに不都合はない。しかしながら、医
薬の有効成分化合物は単一の化学構造を有する化合物で
あることが好ましい状況にあることを考慮すれば、上記
の副生物の混入量が多いSOD誘導体については、これ
をゲル濾過などの操作に付することにより該副生物を除
外して本発明の有効成分化合物として用いることが好ま
しい。
が有する無水マレイン酸環とが結合し、SOD誘導体が
生成する。例えば、ヒト型SOD ’には1分子当ジ
アミノ基が22個(ヒト赤血球型SODまたは酵母にて
遺伝子組換え操作により得られたヒト型5OD)または
24個(大腸菌にて遺伝子組換え操作により得られたヒ
ト型5OD)存在するが、上記の反応により、いずれか
の7ミノ基と共重合体が有する1個の無水マレイン酸環
とが反応し、SODの1分子当り共重合体が1〜6分子
結合したSOD誘導体が得られる。原料として用いる共
重合体には1分子中に通常無水マレイン酸環が平均0.
5〜2個存在するが、これらの無水マレイン酸環のなか
の1個がSODのアミノ基と結合した場合、残シの無水
マレイン酸環はさらに別のアミン基と反応することは少
なく、水とン酸由来の基となシ易い。したがって、SO
D9導体の構成単位には前記(ロ)の式においてR7が
水素原子である基も包含される。また原料として部分半
エステル化共重合体を用いる場合には、得られるSOD
誘導体の構造単位に前記(ロ)の基として上記のマレイ
ン酸由来の基が半エステル化されたものだけでなく、少
量の該マレイン酸由来の基が含まれる。共重合体の1分
子とSODの複数分子とが反応して該共重合体の複数個
の無水マレイン酸環と各SODのアミノ基とがそれぞれ
結合した化合物が副生する可能性があるが、かかる副生
物が少量混入したSOD誘導体を本発明の有効成分化合
物として用いることに不都合はない。しかしながら、医
薬の有効成分化合物は単一の化学構造を有する化合物で
あることが好ましい状況にあることを考慮すれば、上記
の副生物の混入量が多いSOD誘導体については、これ
をゲル濾過などの操作に付することにより該副生物を除
外して本発明の有効成分化合物として用いることが好ま
しい。
また、上記の反応によって得られるSOD誘導体は5O
DK種々の分子数の共重合体が結合して得られたものの
混合物であシ、それら個々のSOD誘導体のSODに結
合している共重合体の分子数は同一ではない。したがっ
て、本発明の有効成分化合物であるSOD誘導体を表わ
す前記式において、XはSOD1分子に結合する共重合
体分子数の平均値を表わすことを意味する。しかしなが
ら、有効成分化合物としてSODに結合する共重合体の
分子数が同数のSOD誘導体が所望される場合には、前
記の方法により得られるSOD誘導体をさらにゲル濾過
などの操作に付することにより所望のSOD誘導体を取
得することが可能である。
DK種々の分子数の共重合体が結合して得られたものの
混合物であシ、それら個々のSOD誘導体のSODに結
合している共重合体の分子数は同一ではない。したがっ
て、本発明の有効成分化合物であるSOD誘導体を表わ
す前記式において、XはSOD1分子に結合する共重合
体分子数の平均値を表わすことを意味する。しかしなが
ら、有効成分化合物としてSODに結合する共重合体の
分子数が同数のSOD誘導体が所望される場合には、前
記の方法により得られるSOD誘導体をさらにゲル濾過
などの操作に付することにより所望のSOD誘導体を取
得することが可能である。
なお、前記の反応および反応後の処理において、SOD
誘導体が有するカルボキシル基がアルカリ金属塩または
アンモニウム塩を形成する可能性があるが、かかる塩を
形成したカルボキシル基を有するSOD誘導体も本発明
の有効成分化合物に包含される。
誘導体が有するカルボキシル基がアルカリ金属塩または
アンモニウム塩を形成する可能性があるが、かかる塩を
形成したカルボキシル基を有するSOD誘導体も本発明
の有効成分化合物に包含される。
SOD誘導体の酵素活性はSODに結合する共重合体の
分子数が増加するに従って徐々に低下する傾向(ある。
分子数が増加するに従って徐々に低下する傾向(ある。
SODに7分子以上の共重合体が結合したSOD誘導体
の酵素活性は低くなりすぎ、かかる誘導体は本発明の有
効成分化合物としては不適当である。SODに1〜3分
子の共重合体が結合したSOD誘導体は酵素活性を高く
保持しており、かつ血中半減期が延長されるなどの特長
を有するので特に好ましい6 原料として用いられるSODは、#物(ヒト。
の酵素活性は低くなりすぎ、かかる誘導体は本発明の有
効成分化合物としては不適当である。SODに1〜3分
子の共重合体が結合したSOD誘導体は酵素活性を高く
保持しており、かつ血中半減期が延長されるなどの特長
を有するので特に好ましい6 原料として用いられるSODは、#物(ヒト。
ウシなど)、植物、微生物などの生物中に含まれている
ものを公知の方法によりそれぞれの生物体から抽出され
たもの、ま念は遺伝子工学の手法を用いて取得されたも
のなどである。SODの化学構造(配位金属、分子量、
アミノ酸配列など)はかなり解明されてきており、SO
DはFe配位SOD%Mn配位S OD、 Cu−Zn
配位SODの3ai類に分類され、存在している生体組
織によって異なるが3万〜8万の分子量を有している。
ものを公知の方法によりそれぞれの生物体から抽出され
たもの、ま念は遺伝子工学の手法を用いて取得されたも
のなどである。SODの化学構造(配位金属、分子量、
アミノ酸配列など)はかなり解明されてきており、SO
DはFe配位SOD%Mn配位S OD、 Cu−Zn
配位SODの3ai類に分類され、存在している生体組
織によって異なるが3万〜8万の分子量を有している。
SODのアミノ酸配列も存在している生体組織によって
若干相異しているが、その詳細はスーパーオキサイドと
医薬?4−90(大柳善彦著、共立出版刊、昭和56年
5月25日発行);ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー(Journal ofBiologi
cal Chemistry)、 2462875〜2
880(1971);同l互旦、6107〜6112(
1975); P N A SL旦、3725〜37
29(1973); ABBI’ひ、243〜256
(1977) などの文献の記載を参照されたい。原
料のSODとしてはヒト型のCu−Zn配位SODが好
ましい。このものは分子量3.3万を有し、また分子中
に22個または24個のアミン基を有する。ヒト型SO
Dは、例えば、ヒトの血液を順次熱処理、イオン交換、
ゲル濾過に付することにより、また遺伝子工学の手法を
用いることによって取得される。
若干相異しているが、その詳細はスーパーオキサイドと
医薬?4−90(大柳善彦著、共立出版刊、昭和56年
5月25日発行);ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー(Journal ofBiologi
cal Chemistry)、 2462875〜2
880(1971);同l互旦、6107〜6112(
1975); P N A SL旦、3725〜37
29(1973); ABBI’ひ、243〜256
(1977) などの文献の記載を参照されたい。原
料のSODとしてはヒト型のCu−Zn配位SODが好
ましい。このものは分子量3.3万を有し、また分子中
に22個または24個のアミン基を有する。ヒト型SO
Dは、例えば、ヒトの血液を順次熱処理、イオン交換、
ゲル濾過に付することにより、また遺伝子工学の手法を
用いることによって取得される。
また原料として用いる共重合体は、上記(イ)の構成単
位に対応する単量体と無水マレイン酸との共重合体を部
分加水分解〔少量(1分子当り平均0.5〜2個)の無
水マレイン酸環が残存し、他の無水マレイン酸環は加水
分解〕することにより、また上記(イ)の構成単位に対
応する単量体と無水マレイン酸との共重合体をアルコー
ルで部分半エステル化〔、少量(1分子当り平均0.5
〜2個)の無水マレイン酸環が残存し、他の無水マレイ
ン酸環は半エステル化〕することにより得られる。この
ようにして得られる共重合体として、例えば、部分加水
分解されたスチレン、p−クロロスチレン。
位に対応する単量体と無水マレイン酸との共重合体を部
分加水分解〔少量(1分子当り平均0.5〜2個)の無
水マレイン酸環が残存し、他の無水マレイン酸環は加水
分解〕することにより、また上記(イ)の構成単位に対
応する単量体と無水マレイン酸との共重合体をアルコー
ルで部分半エステル化〔、少量(1分子当り平均0.5
〜2個)の無水マレイン酸環が残存し、他の無水マレイ
ン酸環は半エステル化〕することにより得られる。この
ようにして得られる共重合体として、例えば、部分加水
分解されたスチレン、p−クロロスチレン。
p−ブロムスチレンまたはα−メチルスチレンと無水マ
レイン酸との共重合体; 部分半エステル化(メチルエステル、エチルエステル、
フロビルエステル、n−ブチルエステル、エトキシエチ
ルエステル、エトキシエチルエステル、フロボキシエチ
ルエステル、2−ブ)=?ジエチルエステル、1.3−
シメト牛シー2−プロピルエステル、2,3−ジメトキ
シ−1−プロピルエステル、1.3−ジェトキシ−2−
プロピルエステル、2−エトキシ−3−メトキシ−1−
プロピルエステル、1.3−ジプロポギシー2−プロピ
ルエステル、1,3−ジプト争シー2−プロピルエステ
ルなト)されたスチレン、p−クロロスチレン、p−ブ
ロムスチレンまたはα−メチルスチレンと無水マレイン
酸との共重合体; 部分加水分解されたエチレン、プロピレン、α−ブチレ
ン、インブチレン、1−ペンテン% 2−メチル−1−
ブテン、1−ヘキセンまたは1−ヘプテンと無水マレイ
ン酸との共重合体; 部分半エステル化(エステルの例示は上記と同様、以下
同じ)されたエチレン、プロピレン、α−ブチレン、イ
ンブチレン、1−ペンテン、2−メチル−1−ブテン、
1−ヘキセンまたは1−ヘプテンと無水マレイン酸との
共重合体; 部分加水分解された酢酸ビニルと無水マレイン酸との共
重合体; 部分半エステル化された酢酸ビニルと無水マレイン酸と
の共重合体; 部分加水分解された(メタ)アクリル酸メチルと無水マ
レイン酸との共重合体; 部分半エステル化された(メタ)アクリル酸メチルと無
水マレイン酸との共重合体; 部分加水分解され九(メタ)アクリル酸エチルと無水マ
レイン酸との共重合体; 部分半エステル化された(メタ)アクリル酸エチルと無
水マレイン酸との共重合体などが挙げられる0 これらの共重合体はいずれも疎水性基と親水性基の両者
を持つことによる適度な疎水性を有し、かつ他極の高い
カルボキシル基を有する。したがって、かかる共重合体
が結合しているSOD誘導体は血清蛋白および生体膜と
の可逆的な結合性を有しており、このととてより血中半
減期が延長され、また臓器への移行性が良好となる。な
かでも構成単位(づとしてスチレン由来の基を有するS
OD誘導体および構成単位(ロ)として半エステル化さ
れた基を有するSOD誘導体は疎水性がより高く、これ
らの効果を発現する点で好ましい。
レイン酸との共重合体; 部分半エステル化(メチルエステル、エチルエステル、
フロビルエステル、n−ブチルエステル、エトキシエチ
ルエステル、エトキシエチルエステル、フロボキシエチ
ルエステル、2−ブ)=?ジエチルエステル、1.3−
シメト牛シー2−プロピルエステル、2,3−ジメトキ
シ−1−プロピルエステル、1.3−ジェトキシ−2−
プロピルエステル、2−エトキシ−3−メトキシ−1−
プロピルエステル、1.3−ジプロポギシー2−プロピ
ルエステル、1,3−ジプト争シー2−プロピルエステ
ルなト)されたスチレン、p−クロロスチレン、p−ブ
ロムスチレンまたはα−メチルスチレンと無水マレイン
酸との共重合体; 部分加水分解されたエチレン、プロピレン、α−ブチレ
ン、インブチレン、1−ペンテン% 2−メチル−1−
ブテン、1−ヘキセンまたは1−ヘプテンと無水マレイ
ン酸との共重合体; 部分半エステル化(エステルの例示は上記と同様、以下
同じ)されたエチレン、プロピレン、α−ブチレン、イ
ンブチレン、1−ペンテン、2−メチル−1−ブテン、
1−ヘキセンまたは1−ヘプテンと無水マレイン酸との
共重合体; 部分加水分解された酢酸ビニルと無水マレイン酸との共
重合体; 部分半エステル化された酢酸ビニルと無水マレイン酸と
の共重合体; 部分加水分解された(メタ)アクリル酸メチルと無水マ
レイン酸との共重合体; 部分半エステル化された(メタ)アクリル酸メチルと無
水マレイン酸との共重合体; 部分加水分解され九(メタ)アクリル酸エチルと無水マ
レイン酸との共重合体; 部分半エステル化された(メタ)アクリル酸エチルと無
水マレイン酸との共重合体などが挙げられる0 これらの共重合体はいずれも疎水性基と親水性基の両者
を持つことによる適度な疎水性を有し、かつ他極の高い
カルボキシル基を有する。したがって、かかる共重合体
が結合しているSOD誘導体は血清蛋白および生体膜と
の可逆的な結合性を有しており、このととてより血中半
減期が延長され、また臓器への移行性が良好となる。な
かでも構成単位(づとしてスチレン由来の基を有するS
OD誘導体および構成単位(ロ)として半エステル化さ
れた基を有するSOD誘導体は疎水性がより高く、これ
らの効果を発現する点で好ましい。
共重合体において、構成単位(イ)と構成単位(ロ)お
よびC→の構成モル比「(イ)/(ロ)+(ハ)」は実
質的に約1〜1.3の範囲であることが好ましく、通常
は1である0構成モル比が1よシも小さいものは構成単
位(イ)に相当する単量体と無水マレイン酸との共重合
で得ることは困難である。また、構成モル比が1.3よ
りも大きいものは、構成単位(ロ)か半エステル化され
たものである場合、かかる共重合体を塩の水溶液中に溶
解させてSODと反応させる際に、共重合体の水溶液へ
の溶解性が不良となるので好ましくない。
よびC→の構成モル比「(イ)/(ロ)+(ハ)」は実
質的に約1〜1.3の範囲であることが好ましく、通常
は1である0構成モル比が1よシも小さいものは構成単
位(イ)に相当する単量体と無水マレイン酸との共重合
で得ることは困難である。また、構成モル比が1.3よ
りも大きいものは、構成単位(ロ)か半エステル化され
たものである場合、かかる共重合体を塩の水溶液中に溶
解させてSODと反応させる際に、共重合体の水溶液へ
の溶解性が不良となるので好ましくない。
上記の共重合体はいずれも公知のものであり、それらの
重量平均分子量は通常800〜20000 の範囲で
ある。これらの共重合体から得られるSOD誘導体の疾
患局所への移行性の点から、共重合体の重量平均分子量
は3000以下であることが好ましい。共重合体の分子
量分布については特に制限はない。上記の構成単位(イ
)に相当する単量体と無水マレイン酸とを2ジ力ル共重
合することにより得られる共重合体(重量平均分子量/
数平均分子量との比が約2.0またはそれ以上のもの)
を分別することなく、そのまま部分加水分解または部分
半エステル化したものを原料として用いることもできる
し、また分別して分子量分布を狭くしたものを部分加水
分解ま、たけ部分半エステル化して原料として用いても
よい。
重量平均分子量は通常800〜20000 の範囲で
ある。これらの共重合体から得られるSOD誘導体の疾
患局所への移行性の点から、共重合体の重量平均分子量
は3000以下であることが好ましい。共重合体の分子
量分布については特に制限はない。上記の構成単位(イ
)に相当する単量体と無水マレイン酸とを2ジ力ル共重
合することにより得られる共重合体(重量平均分子量/
数平均分子量との比が約2.0またはそれ以上のもの)
を分別することなく、そのまま部分加水分解または部分
半エステル化したものを原料として用いることもできる
し、また分別して分子量分布を狭くしたものを部分加水
分解ま、たけ部分半エステル化して原料として用いても
よい。
次に、5ODp導体の薬理学的特性についての試験例を
示す。
示す。
試験例1
局所用が低下した組織へのSOD誘導体の特異的集積作
用 マウス(20r)の左側大腿筋に0.15Mのヘベス(
HEPES ) バッフ7 (PH6,0)をo、2
11L11また右側大腿筋に生理食塩水を0.2−それ
ぞれ筋肉内投与した直後に1合成例2の記載の方法に準
じて調製した 125工標識SOD誘導体(14nmo
l)、まえは合成例2で用いたBu−8MA(部分中ブ
チルエステル化したスチレン−無水マレイン酸共重合体
を意味する。以下1、本明細書において同じ。)と同様
の3H標識Bu−8MA(0,22μmO1)を静脈内
投与し、経時的に左右の大腿筋に集積した放射活性を測
定した。結果を第13図に示す。右側大腿筋(コントロ
ール側)に比べて、左側大腿筋(酸性側)の放射活性は
有意に高い。このことから、合成例2で得られるSOD
誘導体はBu−8MAが結合していることによって酸性
組織(炎症局所の田は低下している)へ選択的に取りこ
まれることがわかる。
用 マウス(20r)の左側大腿筋に0.15Mのヘベス(
HEPES ) バッフ7 (PH6,0)をo、2
11L11また右側大腿筋に生理食塩水を0.2−それ
ぞれ筋肉内投与した直後に1合成例2の記載の方法に準
じて調製した 125工標識SOD誘導体(14nmo
l)、まえは合成例2で用いたBu−8MA(部分中ブ
チルエステル化したスチレン−無水マレイン酸共重合体
を意味する。以下1、本明細書において同じ。)と同様
の3H標識Bu−8MA(0,22μmO1)を静脈内
投与し、経時的に左右の大腿筋に集積した放射活性を測
定した。結果を第13図に示す。右側大腿筋(コントロ
ール側)に比べて、左側大腿筋(酸性側)の放射活性は
有意に高い。このことから、合成例2で得られるSOD
誘導体はBu−8MAが結合していることによって酸性
組織(炎症局所の田は低下している)へ選択的に取りこ
まれることがわかる。
試験例2
抗虚血障害作用および抗炎症作用
試験方法
SD系雄性ラット(体!200?)を−晩絶食させたの
ち、1群6匹としてストレスケージに入れて拘束し、ラ
ットの胸から下を22℃の水に浸漬し、ラットにストレ
スを負荷した。かかるストレス負荷により、ラットの胃
粘膜での血流量が減少し1局所的虚血が起こる結果、急
性炎症が房起され、潰瘍が発生する。上記のストレス負
荷の2時間後、4時間後および6時間後にラットを水か
ら引揚げて殺し、胃を摘出した。胃内腔に1oチホルマ
リンを注入して組織を固定した。固定後、粘膜面の線状
潰瘍の長さを測定し、その総和を潰瘍係数(Ulcer
Index)として表示した。
ち、1群6匹としてストレスケージに入れて拘束し、ラ
ットの胸から下を22℃の水に浸漬し、ラットにストレ
スを負荷した。かかるストレス負荷により、ラットの胃
粘膜での血流量が減少し1局所的虚血が起こる結果、急
性炎症が房起され、潰瘍が発生する。上記のストレス負
荷の2時間後、4時間後および6時間後にラットを水か
ら引揚げて殺し、胃を摘出した。胃内腔に1oチホルマ
リンを注入して組織を固定した。固定後、粘膜面の線状
潰瘍の長さを測定し、その総和を潰瘍係数(Ulcer
Index)として表示した。
なお、被検化合物はラットに水浸拘束直前に投与した。
コントロール群にはQ、 5 m/の生理食塩水を、ま
た試験群にはlny/ラットのSODまたは後述の合成
例2で得られたSOD訪導体をQ、 5 rxlの生理
食塩水溶液としてそれぞれ静脈内投与(l。
た試験群にはlny/ラットのSODまたは後述の合成
例2で得られたSOD訪導体をQ、 5 rxlの生理
食塩水溶液としてそれぞれ静脈内投与(l。
v、)シた。
試験結果
得られた潰瘍係数(mm/1issue)をストレス負
荷時間とともに第14図に示す。第14図において○印
およびΔ印はそれぞれコントロール群およびSOD誘導
体投与群の試験結果を表わす。なお、SOD投与群の試
験結果はコントロール群のものとほぼ同等であったため
図中に表示することを省略する。
荷時間とともに第14図に示す。第14図において○印
およびΔ印はそれぞれコントロール群およびSOD誘導
体投与群の試験結果を表わす。なお、SOD投与群の試
験結果はコントロール群のものとほぼ同等であったため
図中に表示することを省略する。
SOD投与群には潰瘍の発生を抑制する作用は全く認め
られなかったが5合成例2で得られたSOD誘導体の投
与群では潰瘍の発生が顕著に抑制されていることは第1
4図から明らかである。
られなかったが5合成例2で得られたSOD誘導体の投
与群では潰瘍の発生が顕著に抑制されていることは第1
4図から明らかである。
このようにSOD誘導体は局所組織の田が低下する疾患
における抗虚血障害剤、抗炎症剤として優れた特性を有
する。
における抗虚血障害剤、抗炎症剤として優れた特性を有
する。
試験例3
抗脳浮腫作用
ラット(20Or)の右大脳半球を頭骸骨外側から液体
窒素にて30秒間処理すると着側な右側性脳浮腫が起こ
る。このラットに0.2μmolの試験例1で用いたと
同じ3H標識Bu−8MAを静脈内投与すると、浮腫を
起こして2(が低下した病巣側に放射活性の特異的集積
が起こった〔第15図(2)参照〕。また、このラット
に27 nmolの試験例1で用いたと同じ126工標
識SOb誘導体を静脈内投与すると、障害側に放射活性
の特異的集積が見られた〔第15図(1)参照〕。この
ことにより 、Bu−8MAが結合した合成例2で得ら
れるSOD誘導体は脳障害局所へよく集積することがわ
かる。なお、SOD誘導体の集積によシ浮腫の発現は着
側に低下した。
窒素にて30秒間処理すると着側な右側性脳浮腫が起こ
る。このラットに0.2μmolの試験例1で用いたと
同じ3H標識Bu−8MAを静脈内投与すると、浮腫を
起こして2(が低下した病巣側に放射活性の特異的集積
が起こった〔第15図(2)参照〕。また、このラット
に27 nmolの試験例1で用いたと同じ126工標
識SOb誘導体を静脈内投与すると、障害側に放射活性
の特異的集積が見られた〔第15図(1)参照〕。この
ことにより 、Bu−8MAが結合した合成例2で得ら
れるSOD誘導体は脳障害局所へよく集積することがわ
かる。なお、SOD誘導体の集積によシ浮腫の発現は着
側に低下した。
試験例4
抗酸素毒性作用
マウス(20り)に200■/神のパラコートを腹腔内
投与すると、酸素ラジカルが発生し、肝細胞障害が起こ
り、血中のGOTレベルが着側に増加する。このパラコ
ート処理マウスに204/1#の前記と同じSOD誘導
体を静脈内投与すると血中GO’I’の増加が顕著に抑
えられた(第16図参照)。Bu −S MAが結合し
ていないSODを投与した場合には、この様な保護効果
が認められず、血中のGOTレベルはコントロール群の
それと差がなかった。
投与すると、酸素ラジカルが発生し、肝細胞障害が起こ
り、血中のGOTレベルが着側に増加する。このパラコ
ート処理マウスに204/1#の前記と同じSOD誘導
体を静脈内投与すると血中GO’I’の増加が顕著に抑
えられた(第16図参照)。Bu −S MAが結合し
ていないSODを投与した場合には、この様な保護効果
が認められず、血中のGOTレベルはコントロール群の
それと差がなかった。
また%SOD誘導体は毒性試験においても低毒性である
ことが確認されている。
ことが確認されている。
以上の結果より、SOD誘導体は活性酸素ラジカルが関
与する種々の疾患に対して有効であり。
与する種々の疾患に対して有効であり。
特に抗炎症剤、抗虚血障害剤、抗脳浮腫剤、抗パラコー
ト中毒剤として使用することができる。
ト中毒剤として使用することができる。
さらにSOD誘導体は虚血性心疾患治療剤または活性酸
素ラジカルに起因する制癌剤の副作用を軽減するための
医薬としても有用である。
素ラジカルに起因する制癌剤の副作用を軽減するための
医薬としても有用である。
SOD誘導体の投与量は疾病、患者の型温度、薬物に対
する忍容性などにより異なるが、通常成人1日あ九り0
.1〜500rq、好ましくは0.5〜1009の景で
あシ、これを1回または分割して投与するのがよい。投
与に際しては投与ルートに適した任意の形態をとること
ができる。
する忍容性などにより異なるが、通常成人1日あ九り0
.1〜500rq、好ましくは0.5〜1009の景で
あシ、これを1回または分割して投与するのがよい。投
与に際しては投与ルートに適した任意の形態をとること
ができる。
SOD誘導体は任意慣用の製剤方法を用いて投与用に調
製することができる。したがって、本発明は少なくとも
1種のSOD誘導体を含有する医薬組成物をも包含する
ものである。このような組成物は任意所要の製薬用担体
、賦形剤などの医薬上許容される添加剤などを使用して
慣用の手段によって調製される。
製することができる。したがって、本発明は少なくとも
1種のSOD誘導体を含有する医薬組成物をも包含する
ものである。このような組成物は任意所要の製薬用担体
、賦形剤などの医薬上許容される添加剤などを使用して
慣用の手段によって調製される。
この組成物が経口用製剤である場合には、該製剤は消化
管からの吸収に好適な形態で提供されるのが望ましい。
管からの吸収に好適な形態で提供されるのが望ましい。
経口投与の錠剤およびカプセルは単位量投与形態であシ
、結合剤、例えばシロップ。
、結合剤、例えばシロップ。
アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラカント、ポ
リビニルピロリ゛トンなど;賦形薬、例えば乳糖、とう
もろこし澱粉、りん酸カルシウム、ソルビット、グリシ
ンなど;潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タ
ルク、ポリエチレングリコール、シリカなど;崩壊剤、
例えば馬鈴薯澱粉など;または許容し得る湿潤剤1例え
ば5’)リル硫酸ナトリウムなどのような慣用の賦形剤
を含有していてもよい。錠剤は当朶界において周知の方
法でコーティングしてもよい。経口用液体製剤は水性ま
たは油性懸濁剤、溶液、シロップ、エリ午シル剤、その
他であってもよく、あるいは使用する前に水または他の
適当なビヒクルで再溶解させる乾燥生成物であってもよ
い。このような液体製剤は普通に用いられる添加剤、例
えば懸濁化剤、例1fソルビットシロップ、メチルセル
ロース、グルコース/糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキ
シエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース。
リビニルピロリ゛トンなど;賦形薬、例えば乳糖、とう
もろこし澱粉、りん酸カルシウム、ソルビット、グリシ
ンなど;潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タ
ルク、ポリエチレングリコール、シリカなど;崩壊剤、
例えば馬鈴薯澱粉など;または許容し得る湿潤剤1例え
ば5’)リル硫酸ナトリウムなどのような慣用の賦形剤
を含有していてもよい。錠剤は当朶界において周知の方
法でコーティングしてもよい。経口用液体製剤は水性ま
たは油性懸濁剤、溶液、シロップ、エリ午シル剤、その
他であってもよく、あるいは使用する前に水または他の
適当なビヒクルで再溶解させる乾燥生成物であってもよ
い。このような液体製剤は普通に用いられる添加剤、例
えば懸濁化剤、例1fソルビットシロップ、メチルセル
ロース、グルコース/糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキ
シエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース。
ステアリン酸アルミニウムゲル、水素化食用脂なト;
乳化剤、 例えばレシチン、モノオレイン酸ソルビタン
、アラビアゴムなト:非水性ビヒクル、例えばアーモン
ド油、分別ココナツト油、油性エステル、フロピレンゲ
リコール、エチルアルコールなど;防腐剤、例えばp−
ヒドロキシ安息香酸メチル、p−ヒドロキシ安息香酸プ
ロピル、ソルビン酸などを含有してもよい。
乳化剤、 例えばレシチン、モノオレイン酸ソルビタン
、アラビアゴムなト:非水性ビヒクル、例えばアーモン
ド油、分別ココナツト油、油性エステル、フロピレンゲ
リコール、エチルアルコールなど;防腐剤、例えばp−
ヒドロキシ安息香酸メチル、p−ヒドロキシ安息香酸プ
ロピル、ソルビン酸などを含有してもよい。
また注射剤を:A製する場合には、SOD誘導体を生理
食塩水、注射用ブドウ糖液などの溶剤に溶解し、SOD
誘導体2〜20キ/溶剤2〜1ONIの濃度にFA整し
、常法により皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。調製
時に必要によシ水溶液に田調整剤、緩衝剤、安定化剤、
保存剤、可溶化剤などを添加することができる。
食塩水、注射用ブドウ糖液などの溶剤に溶解し、SOD
誘導体2〜20キ/溶剤2〜1ONIの濃度にFA整し
、常法により皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。調製
時に必要によシ水溶液に田調整剤、緩衝剤、安定化剤、
保存剤、可溶化剤などを添加することができる。
上記の医薬組成物は、その形態等に依存して。
SOD誘導体を一般に約0.O1〜501i量係、好ま
しくは約0.1〜20重量−の濃度で含有することがで
きる。
しくは約0.1〜20重量−の濃度で含有することがで
きる。
以下余白
実施例
以下に、実施例によシ本発明を説明する。なお、本発8
1jはこれらの実施例により限定されるものではない。
1jはこれらの実施例により限定されるものではない。
参考例1
スチレン−無水マレイン酸共重合体の合成無水マレイン
酸383 t (3,9mole)をクメン3.7tに
加えてクメ7還流下に攪拌した。この溶液にジクミルパ
ーオキシド16.3 f (60mmole)およびス
チレy203 ? (1,95mole)をクメン1.
7tに溶解させて得られた溶液を約40分間を要して徐
々に滴下した。滴下終了後、1時間加熱攪拌を続けた。
酸383 t (3,9mole)をクメン3.7tに
加えてクメ7還流下に攪拌した。この溶液にジクミルパ
ーオキシド16.3 f (60mmole)およびス
チレy203 ? (1,95mole)をクメン1.
7tに溶解させて得られた溶液を約40分間を要して徐
々に滴下した。滴下終了後、1時間加熱攪拌を続けた。
得られた反応液を一夜静胃し、上澄液を除去したのち、
容器に付着した粘稠生成物をアセトンに溶解させて回収
した。得られた回収液からアセトンを減圧下に留去して
スチレン−無水マレイン酸共重合体(以下、これをSM
Aと略称する)を353f得た。
容器に付着した粘稠生成物をアセトンに溶解させて回収
した。得られた回収液からアセトンを減圧下に留去して
スチレン−無水マレイン酸共重合体(以下、これをSM
Aと略称する)を353f得た。
SMAの分別
上記の方法で得られた5MAl2O,OFをアセトン3
tに溶解し、この溶液にn−ヘキサン4.9tを攪拌下
に約1時間で滴下した。白濁したアセトンとn−ヘキサ
ンとの混合液を別の容器に移し、この混合液にn−ヘキ
サン9.741を攪拌下に約1.5時間で滴下した。容
器の器壁に付着したアメ状物をアセトンに溶解させて回
収した。得られた回収液からアセトンを減圧下に留去し
たのち、70〜80℃の温度で一夜真空乾燥を行い、S
MAの分別沈殿物を49.2f得た。
tに溶解し、この溶液にn−ヘキサン4.9tを攪拌下
に約1時間で滴下した。白濁したアセトンとn−ヘキサ
ンとの混合液を別の容器に移し、この混合液にn−ヘキ
サン9.741を攪拌下に約1.5時間で滴下した。容
器の器壁に付着したアメ状物をアセトンに溶解させて回
収した。得られた回収液からアセトンを減圧下に留去し
たのち、70〜80℃の温度で一夜真空乾燥を行い、S
MAの分別沈殿物を49.2f得た。
このようKして得られたSMAの分別沈殿物40、Of
をアセトン1tに溶解し、この溶液に表面シラン処理を
し九ガラスピーズ(平均粒径0.1wm ) 3.8−
を加えたのち、アセトンを蒸発させることによシガラス
ビーズ表面にSMAを付着させた0 内径80m、長さ80cWtのカラムに上記のSMAを
付着したガラスピーズおよびアセトンとn−ヘキサンと
の混合液(25℃における容積比が24ニア6であるも
の)1.4Aを充填したカラム系の温度を25℃に保ち
つつ2191の容積比のアセトンとn−へキサンとの混
合液〔アセトンとn−ヘキサンとの25℃における容積
比が(1)24ニアs。
をアセトン1tに溶解し、この溶液に表面シラン処理を
し九ガラスピーズ(平均粒径0.1wm ) 3.8−
を加えたのち、アセトンを蒸発させることによシガラス
ビーズ表面にSMAを付着させた0 内径80m、長さ80cWtのカラムに上記のSMAを
付着したガラスピーズおよびアセトンとn−ヘキサンと
の混合液(25℃における容積比が24ニア6であるも
の)1.4Aを充填したカラム系の温度を25℃に保ち
つつ2191の容積比のアセトンとn−へキサンとの混
合液〔アセトンとn−ヘキサンとの25℃における容積
比が(1)24ニアs。
混合液上、etおよび(1037: 63の混合液6.
0tの頭で〕、ついでアセトン3.OLの項でカラムの
上部よシ滴下供給した。上記のアセトンとn−ヘキサン
との容積比が37 + 63の混合液が溶出する流出分
を集めた。この流出分から減圧下に低沸点物を留去し、
ついで70〜80℃の温度で一夜真空乾燥することによ
シ目的とする分別8M人を31.8F得た。このものの
ゲルパーミェーションクロマトグラフィー(以下、これ
をGPCと略称する;テトラヒドロフラン溶出液、ポリ
スチレン標準)Kよる分析で重量平均分子量(Mw )
および蒸気圧浸透圧計による測定ではMnは1210で
あった。また得られた分別SMA中の無水マレイン酸含
有率を電位差滴定法によ〕求めたところ、47.3モル
チであった。
0tの頭で〕、ついでアセトン3.OLの項でカラムの
上部よシ滴下供給した。上記のアセトンとn−ヘキサン
との容積比が37 + 63の混合液が溶出する流出分
を集めた。この流出分から減圧下に低沸点物を留去し、
ついで70〜80℃の温度で一夜真空乾燥することによ
シ目的とする分別8M人を31.8F得た。このものの
ゲルパーミェーションクロマトグラフィー(以下、これ
をGPCと略称する;テトラヒドロフラン溶出液、ポリ
スチレン標準)Kよる分析で重量平均分子量(Mw )
および蒸気圧浸透圧計による測定ではMnは1210で
あった。また得られた分別SMA中の無水マレイン酸含
有率を電位差滴定法によ〕求めたところ、47.3モル
チであった。
上記の方法で分別された5MAl0.Of、n−ブチル
アルコール2.20f、無水酢酸リチウム0.10fお
よびジオキサン20 dを磁気攪拌子を備えた約40d
容のアンプルに仕込み封管した。
アルコール2.20f、無水酢酸リチウム0.10fお
よびジオキサン20 dを磁気攪拌子を備えた約40d
容のアンプルに仕込み封管した。
このアンプルの内容物を攪拌下に90℃の温度で20時
間加熱した。得られた反応液の一部を取シ、反応液中の
未反応n−ブチルアルコール量をエチルセロソルブを内
部標準としてガスクロマトグラフィーによシ定量し、仕
込みn−ブチルアルコールの反応率から共重合体中に存
在していた無水マレイン酸環の半ブチルエステル化度を
算出したところ62%であった。次に、反応液をジオキ
サン201+4で希釈し、この希釈液をn−ヘキサン4
00d中に滴下して再沈殿の操作を行い、得られた沈殿
を回収して約60℃の温度で一夜真空乾燥することによ
シ、目的とする部分半ブチルエステル化スチレンー無水
マレイン酸共重合体を11.5f得た。
間加熱した。得られた反応液の一部を取シ、反応液中の
未反応n−ブチルアルコール量をエチルセロソルブを内
部標準としてガスクロマトグラフィーによシ定量し、仕
込みn−ブチルアルコールの反応率から共重合体中に存
在していた無水マレイン酸環の半ブチルエステル化度を
算出したところ62%であった。次に、反応液をジオキ
サン201+4で希釈し、この希釈液をn−ヘキサン4
00d中に滴下して再沈殿の操作を行い、得られた沈殿
を回収して約60℃の温度で一夜真空乾燥することによ
シ、目的とする部分半ブチルエステル化スチレンー無水
マレイン酸共重合体を11.5f得た。
このものの赤外線吸収スペクトル(FT−IR。
KBrディスク法)の波数1780 cts−” オヨ
U 700cts−”における吸収強度を基にして、残
存無水マレイン酸環の含有率を求めたところ30.3モ
ルチ(Bu−8MAI分子中に含まれる無水マレイン酸
環は平均1.8個存在)であった。またGPCの測定か
ら、このもののMvは1530であル、Mnは1440
であった( My/Mn=1.06 )。
U 700cts−”における吸収強度を基にして、残
存無水マレイン酸環の含有率を求めたところ30.3モ
ルチ(Bu−8MAI分子中に含まれる無水マレイン酸
環は平均1.8個存在)であった。またGPCの測定か
ら、このもののMvは1530であル、Mnは1440
であった( My/Mn=1.06 )。
合成例1
ヒト赤血球型5OD(3,000単位/岬)50〜(1
,5X10 モル)を0.1M重炭酸ナトリウム水溶
液(田8.o)1oyに37℃で攪拌しながら溶解させ
た。溶解後、この溶液にスチレン−無水マレイン酸共重
合体〔ジクミルパーオキシドを開始剤としてクメン中で
溶液重合したもの、スチレンと無水マレイン酸との共重
合モル比1:1.MY=1280、分子量分布s My
/Mn = 1.20以下〕を部分半ブチルエステル化
したスチレン−無水マレイン酸共重合体(MY:160
0%エステル化度;60モルチ、無水マレイン酸環含有
量=25モルチ(1分子中に含まれゐ無水マレイン酸環
は平均1.6個存在))801119(5mM、反応液
中の最終Bu−8MA濃度を意味する。以下同様。)を
固体粉末のit徐々に添加し、−時間反応させた。
,5X10 モル)を0.1M重炭酸ナトリウム水溶
液(田8.o)1oyに37℃で攪拌しながら溶解させ
た。溶解後、この溶液にスチレン−無水マレイン酸共重
合体〔ジクミルパーオキシドを開始剤としてクメン中で
溶液重合したもの、スチレンと無水マレイン酸との共重
合モル比1:1.MY=1280、分子量分布s My
/Mn = 1.20以下〕を部分半ブチルエステル化
したスチレン−無水マレイン酸共重合体(MY:160
0%エステル化度;60モルチ、無水マレイン酸環含有
量=25モルチ(1分子中に含まれゐ無水マレイン酸環
は平均1.6個存在))801119(5mM、反応液
中の最終Bu−8MA濃度を意味する。以下同様。)を
固体粉末のit徐々に添加し、−時間反応させた。
ヒト赤血球型SODのアミノ基がBu−8MAと反応す
る経過を観察するためにトリニトロベンゼンスルホン酸
ナトリウム(TNBS)で残存アミノ基を定量した。用
いたヒト赤血球11sODには1分子当)22側のアミ
ノ基が存在しておシ、これらのアミノ基のうちでTNB
S法によシ定量可能なアミノ基は約10〜11個である
が、上記の反応条件下ではヒト赤血球W S ODoの
アミノ基の20モル%(定量可能なアミノ基の約44モ
ルチに相当)がBu−8MAと反応したことが確認され
た。反応液を濾過後、濾液をセファデックスG−100
(商品名、7ア一マシア社製、スエーデy国)を充填し
九に50/30カラム(商品名、ファーマシア社製、ス
エーデン国)に注入し、ゲル濾過した。20−0重炭酸
アンモニウムと炭酸アンモニウムとの混合液を溶出液と
し、流出液を2 g Q nmで検出し、吸収部分の溶
出液を分取し、限外濾過膜(ザルトリウス5M145−
39)Pcよシ濃縮し、これを凍結乾燥し、白色粉末5
2”Fを得意。得られ六粉末のUV吸収スペクトル〔第
2図においてSOD誘導体(1)として示す〕および原
料SODとBu−8MAのUV吸収スペクトルをリン酸
緩衝液を用いて47.1iで測定し、それぞれ第2図に
示した。また、同様にして作成した5μlの:、Crラ
ベル標品(反応生成物)を用いてアンフオラインによる
等電点分画(11,5〜6.0.700mV、12時間
通電、1WIl/フラクシヨンで分画)を行い、F!(
と放射活性を測定し、その結果を第8図に示した。得ら
れた粉末の等電点け2.0であった。さらに、得られ九
白色粉末の蛋白質含有量をローリ−法で測定したところ
5Otsであつ几。これらの結果に基づき、5ODI分
子当シ結合したBu−8MAの分子数を決定し九〇 以上のことよシ、得られた白色粉末は5ODIとのモル
比1:1.60%ブチルエステル化、My=1600
)が平均5分子結合(SODの7ミノ基とBu−8MA
の無水マレイン酸環との反応による結合)L、fI−8
oD誘導体であると同定し九。
る経過を観察するためにトリニトロベンゼンスルホン酸
ナトリウム(TNBS)で残存アミノ基を定量した。用
いたヒト赤血球11sODには1分子当)22側のアミ
ノ基が存在しておシ、これらのアミノ基のうちでTNB
S法によシ定量可能なアミノ基は約10〜11個である
が、上記の反応条件下ではヒト赤血球W S ODoの
アミノ基の20モル%(定量可能なアミノ基の約44モ
ルチに相当)がBu−8MAと反応したことが確認され
た。反応液を濾過後、濾液をセファデックスG−100
(商品名、7ア一マシア社製、スエーデy国)を充填し
九に50/30カラム(商品名、ファーマシア社製、ス
エーデン国)に注入し、ゲル濾過した。20−0重炭酸
アンモニウムと炭酸アンモニウムとの混合液を溶出液と
し、流出液を2 g Q nmで検出し、吸収部分の溶
出液を分取し、限外濾過膜(ザルトリウス5M145−
39)Pcよシ濃縮し、これを凍結乾燥し、白色粉末5
2”Fを得意。得られ六粉末のUV吸収スペクトル〔第
2図においてSOD誘導体(1)として示す〕および原
料SODとBu−8MAのUV吸収スペクトルをリン酸
緩衝液を用いて47.1iで測定し、それぞれ第2図に
示した。また、同様にして作成した5μlの:、Crラ
ベル標品(反応生成物)を用いてアンフオラインによる
等電点分画(11,5〜6.0.700mV、12時間
通電、1WIl/フラクシヨンで分画)を行い、F!(
と放射活性を測定し、その結果を第8図に示した。得ら
れた粉末の等電点け2.0であった。さらに、得られ九
白色粉末の蛋白質含有量をローリ−法で測定したところ
5Otsであつ几。これらの結果に基づき、5ODI分
子当シ結合したBu−8MAの分子数を決定し九〇 以上のことよシ、得られた白色粉末は5ODIとのモル
比1:1.60%ブチルエステル化、My=1600
)が平均5分子結合(SODの7ミノ基とBu−8MA
の無水マレイン酸環との反応による結合)L、fI−8
oD誘導体であると同定し九。
合成例2
ヒト赤泊球型5OD(3,000単位/IIF ) 5
0叩を0.1M重炭酸ナトリウム水溶液(PH8,0)
10dに37℃で攪拌しながら溶解させ念o得られ念溶
液に合成例1で用いたBu−8MAと同じもの30η(
1,9mM)を徐々に添加し1合成例1と同様に上記ヒ
ト由来SODと反応させ、得られた反応液を合成例1と
同様に処理し、白色粉末45Qを得意〇得られた白色粉
末について合成例1と同様に測定したUV吸収スペクト
ルを第2図〔SOD誘導体(II)として示す〕に示し
1等電点分画を行い%田と放射活性を測定した結果を第
9図に示した。得られ九粉末の等電点け4.4であった
0ま之。
0叩を0.1M重炭酸ナトリウム水溶液(PH8,0)
10dに37℃で攪拌しながら溶解させ念o得られ念溶
液に合成例1で用いたBu−8MAと同じもの30η(
1,9mM)を徐々に添加し1合成例1と同様に上記ヒ
ト由来SODと反応させ、得られた反応液を合成例1と
同様に処理し、白色粉末45Qを得意〇得られた白色粉
末について合成例1と同様に測定したUV吸収スペクト
ルを第2図〔SOD誘導体(II)として示す〕に示し
1等電点分画を行い%田と放射活性を測定した結果を第
9図に示した。得られ九粉末の等電点け4.4であった
0ま之。
残存アミノ基′f:TNBS法で定量し念結果、原料S
ODのアミノ基の約9−eルー(定量可能なアミノ基の
約20モル11に相当)がBu−8MAと反応したこと
が確認された。
ODのアミノ基の約9−eルー(定量可能なアミノ基の
約20モル11に相当)がBu−8MAと反応したこと
が確認された。
以上のことよシ、得られた白色粉末は、5OD1分子当
り平均2分子のBu−8MAが結合し九S0D誘導体で
あると同定し±0 合成例3 ヒト赤血球型5OD(3,000単位/冨g)5言q(
1,5長10−7モル)を0.1M重炭酸ナトリウム水
溶液(…8.0 ) 1 ratに溶解したのち、得ら
れた溶液に合成例1で用いたBu−8MAと同じもの4
139(2,smM)を加えて37℃で反応させ、反応
時間の経過とSODが有するアミノ基量との関係を第5
図に示した0なお、アミン基の定量はTNB S法によ
シ行つ九。用いたヒト赤血球型5ODKは1分子当92
2個のアミン基が存在しており、これらのアミノ基のう
ちでTNBS法により定量可能なアミノ基は約10〜1
1個であるが、上記の反応条件下では1時間に定量可能
なアミノ基の約38モルチがBu−8MAと反応し几こ
とが確認され、5ODI分子に約4分子(D Bu −
S MA f)x結合し九SOD誘導体を得ることがで
き九02時間反応させたのち1反応液にさらに同量のB
u−8MAを添加した場合、第1図に示すように(・・
・・・・・・・・・・・)アミノ基量けさらに減少した
。これより明らかなように1反応させるBu−3MAの
量を変えることによp、SOD分子に結合するBu−8
MAの量をコントロールすることが可能であることがわ
かる。
り平均2分子のBu−8MAが結合し九S0D誘導体で
あると同定し±0 合成例3 ヒト赤血球型5OD(3,000単位/冨g)5言q(
1,5長10−7モル)を0.1M重炭酸ナトリウム水
溶液(…8.0 ) 1 ratに溶解したのち、得ら
れた溶液に合成例1で用いたBu−8MAと同じもの4
139(2,smM)を加えて37℃で反応させ、反応
時間の経過とSODが有するアミノ基量との関係を第5
図に示した0なお、アミン基の定量はTNB S法によ
シ行つ九。用いたヒト赤血球型5ODKは1分子当92
2個のアミン基が存在しており、これらのアミノ基のう
ちでTNBS法により定量可能なアミノ基は約10〜1
1個であるが、上記の反応条件下では1時間に定量可能
なアミノ基の約38モルチがBu−8MAと反応し几こ
とが確認され、5ODI分子に約4分子(D Bu −
S MA f)x結合し九SOD誘導体を得ることがで
き九02時間反応させたのち1反応液にさらに同量のB
u−8MAを添加した場合、第1図に示すように(・・
・・・・・・・・・・・)アミノ基量けさらに減少した
。これより明らかなように1反応させるBu−3MAの
量を変えることによp、SOD分子に結合するBu−8
MAの量をコントロールすることが可能であることがわ
かる。
合成例4
ヒト赤血球型5OD(3,000単位/■)10富9(
3,0X10−7モル)を0.1M重炭酸ナトリウム水
溶液(pH8,0)1mlに溶解し、得られた溶液に第
1表に示す種々の部分加水分解されたスチレン−無水マ
レイン酸共重合体または部分半エステル化され念スチレ
ンー無水マレイン酸共重合体を反応液における最終濃度
が2.5 mMになるように加え。
3,0X10−7モル)を0.1M重炭酸ナトリウム水
溶液(pH8,0)1mlに溶解し、得られた溶液に第
1表に示す種々の部分加水分解されたスチレン−無水マ
レイン酸共重合体または部分半エステル化され念スチレ
ンー無水マレイン酸共重合体を反応液における最終濃度
が2.5 mMになるように加え。
37℃で1時間反応させ九〇反応後、SOD中の残存ア
ミノ基をTNBS法で定量した結果、いずれの場合も定
量可能なアミン基の15〜25モルチのアミン基が減少
していることが確認された。
ミノ基をTNBS法で定量した結果、いずれの場合も定
量可能なアミン基の15〜25モルチのアミン基が減少
していることが確認された。
いずれの場合も5ODI分子に平均1.7〜2.8個の
ヌチレンーマレイン酸共重合体が結合したS。
ヌチレンーマレイン酸共重合体が結合したS。
D誘導体が得られた。
第1表
4−1 有(ブチルエステル) 60
1.3 12004−2 有(p )
40 2.0 16004−3
有(# ) 70 1.5
16004−4 有(1) 60 1
.9 20004−5 有(メチルエステル)
60 1.3 16004−6 有
(エチルエステル) 60 1.7
1600メトキシエチル 4−7 有(−’) 60 1.3
1600ニスアル 2−7ト“′ジ 60 1.7
16004−8 有(,1エユテ。
1.3 12004−2 有(p )
40 2.0 16004−3
有(# ) 70 1.5
16004−4 有(1) 60 1
.9 20004−5 有(メチルエステル)
60 1.3 16004−6 有
(エチルエステル) 60 1.7
1600メトキシエチル 4−7 有(−’) 60 1.3
1600ニスアル 2−7ト“′ジ 60 1.7
16004−8 有(,1エユテ。
1゛3−ジ””’−2) 6 0
1.4 16004−9 有(−プ。ヒλエ
ユア。
1.4 16004−9 有(−プ。ヒλエ
ユア。
1°3−ガト”−2) 6 0
1.3 16004−10 有(−プ。う
7エテヤ 合成例5 合成例4においてスチレン−無水マレイン酸共重合体の
代りに部分加水分解されたインブテン−無水マレイン酸
共重合体(MW=2500.無水マレイン鎖環含量=3
.0個/1分子)を用いる以外は合成例4と同様に反応
および分離操作を行や。
1.3 16004−10 有(−プ。う
7エテヤ 合成例5 合成例4においてスチレン−無水マレイン酸共重合体の
代りに部分加水分解されたインブテン−無水マレイン酸
共重合体(MW=2500.無水マレイン鎖環含量=3
.0個/1分子)を用いる以外は合成例4と同様に反応
および分離操作を行や。
5ODI分子に約4個のイソブチン−マレイン酸共重合
体が結合したSOD誘導体を得た。
体が結合したSOD誘導体を得た。
合成例6
合成例4においてスチレン−無水マレイン酸共重合体の
代りに第2表に示す種々の共重合体を用いる以外は合成
例1と同様に反応および分離操作を行い、それぞれ対応
するSOD誘導体を得た。
代りに第2表に示す種々の共重合体を用いる以外は合成
例1と同様に反応および分離操作を行い、それぞれ対応
するSOD誘導体を得た。
以下余白
合成例7
所定量のヒト赤血球型5OD(シグマ社製、3200単
位/1q)を0.1M重炭酸ナトリウム水溶液(田8.
0)に581/Idの濃度となるように溶解させた。こ
の溶液に部分加水分解されたスチレンと無水マレイン酸
との共重合体(分子量約1400.1分子あたりの無水
マレイン鎖環含量約1.0個)、部分加水分解されたp
−ブロムスチレンと無水マレイン酸との共重合体(分子
量約1600.1分子あたシの無水マレイン鎖環含量約
1.5個)、部分加水分解され九α−メチルスチレンと
無水!レイン酸との共重合体(分子量約16001分子
あたシの無水マレイン鎖環含量約3.3個)または部分
加水分解されたイソブチレンと無水マレイン酸との共重
合体(分子量2500,1分子あたシの無水!レイン鎖
環含量約3.5個)の所定量を各々加え、25℃の温度
で1時間反応させた。得られた反応液をセファデックス
G−75スーパーフアイン(商品名、ファーマシア社製
、スエーデン国)を充填し九に26/40カラム(商品
名、ファー嗜シア社製、スエーデン国)に注入し、ゲル
濾過した。10mMの重炭酸アンモニウムと炭酸アンモ
ニウムとの混合液を溶出液とし、流出液を280nm、
254nmで検出し、未反応の共重合体を除いた吸収部
分の溶出液を分取し、これを凍結乾燥し、白色粉末状の
5ODi9導体を各々得た。結果を第3表に示りには1
分子当#)22個のアミノ基が存在しておシ、これらの
アミノ基のうちでTNB S法により定量可能なアミノ
基は約10〜11個である。
位/1q)を0.1M重炭酸ナトリウム水溶液(田8.
0)に581/Idの濃度となるように溶解させた。こ
の溶液に部分加水分解されたスチレンと無水マレイン酸
との共重合体(分子量約1400.1分子あたりの無水
マレイン鎖環含量約1.0個)、部分加水分解されたp
−ブロムスチレンと無水マレイン酸との共重合体(分子
量約1600.1分子あたシの無水マレイン鎖環含量約
1.5個)、部分加水分解され九α−メチルスチレンと
無水!レイン酸との共重合体(分子量約16001分子
あたシの無水マレイン鎖環含量約3.3個)または部分
加水分解されたイソブチレンと無水マレイン酸との共重
合体(分子量2500,1分子あたシの無水!レイン鎖
環含量約3.5個)の所定量を各々加え、25℃の温度
で1時間反応させた。得られた反応液をセファデックス
G−75スーパーフアイン(商品名、ファーマシア社製
、スエーデン国)を充填し九に26/40カラム(商品
名、ファー嗜シア社製、スエーデン国)に注入し、ゲル
濾過した。10mMの重炭酸アンモニウムと炭酸アンモ
ニウムとの混合液を溶出液とし、流出液を280nm、
254nmで検出し、未反応の共重合体を除いた吸収部
分の溶出液を分取し、これを凍結乾燥し、白色粉末状の
5ODi9導体を各々得た。結果を第3表に示りには1
分子当#)22個のアミノ基が存在しておシ、これらの
アミノ基のうちでTNB S法により定量可能なアミノ
基は約10〜11個である。
ヒト赤血球型SODおよびウシ赤血球型SODのIR吸
収スペクトル(FT−IR%KBrディスク法)を各々
第4図(1)および第4図(2)に示し、第3表中の1
67−1、A7’−2および47−3のSOD誘導体の
IR吸収スペクトル(FT−IR。
収スペクトル(FT−IR%KBrディスク法)を各々
第4図(1)および第4図(2)に示し、第3表中の1
67−1、A7’−2および47−3のSOD誘導体の
IR吸収スペクトル(FT−IR。
KBrディスク法)を各々第5〜7図に示す。
第5〜7図には第4図(1)に示されるヒト赤血球型S
ODの吸収スペクトルに加えて各共重合体由来の吸収ス
ペクトル(矢印で示す部分)が認められ、これらの図に
示される吸収スペクトルからSODに各共重合体が結合
していることがわかる。
ODの吸収スペクトルに加えて各共重合体由来の吸収ス
ペクトル(矢印で示す部分)が認められ、これらの図に
示される吸収スペクトルからSODに各共重合体が結合
していることがわかる。
また上記の方法においてヒト赤血球型SODの代シにウ
シ赤面゛録型SODを用いる以外は同様の反応および分
離操作を行うことによシ、対応する同様のIR吸収スペ
クトルを有するSOD誘導体を得た。
シ赤面゛録型SODを用いる以外は同様の反応および分
離操作を行うことによシ、対応する同様のIR吸収スペ
クトルを有するSOD誘導体を得た。
試験例5
ヒト赤血球WISOD5可/dを37℃、田8.0で種
々の濃度(0,14,0,37,0,75,1,5,3
,6および12rl1M)のBu−8MAと1時間反応
させ、Bu−8MAの結合量の変化した種々のSOD誘
導体を調製し、得られたSOD誘導体のBu−8MAの
結合量と酵素活性との関係を調べた。なお、酵素活性の
測定はジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー
(Journal of BiologicalChe
mistr7 ) 、 244 、6049〜6055
(1965)に記載されている方法に従った。反応液中
のBu−8MA濃度と得られたSOD誘導体が有する残
存アミン基量(TNBS法で測定)および酵素活性との
関係を第3図に示した。第3図によればBu−8MA濃
度が6mMの場合、得られ九SOD誘導体中のTNBS
反応性アミノ基の残存量は約50チであるが(前述のよ
うに原料5ODI分子中のアミノ基22個のうちでTN
BS反応性アミノ基は約10〜11個であるので、この
場合5個のアミノ基が反応し、17個のアミノ基が未反
応で残っていることKなる)、酵素活性が50チ維持さ
れていること、またそれ以上Bu−S M Aの結合量
が増加すると酵素活性が50チ以下に低下することがわ
かる。したがって、SODへの極度の化学修飾は酵素活
性の維持に好ましくな(、SODの酵素活性を維持させ
るためには5ODI分子に結合される共重合体の数は約
6分子までに抑える必要がある。なお、第3図に示され
るように、SOD1分子に2分子のBu−8MAが結合
したSOD誘導体の場合にはSODそのものの酵素活性
に対して80チの酵素活性が維持されている。
々の濃度(0,14,0,37,0,75,1,5,3
,6および12rl1M)のBu−8MAと1時間反応
させ、Bu−8MAの結合量の変化した種々のSOD誘
導体を調製し、得られたSOD誘導体のBu−8MAの
結合量と酵素活性との関係を調べた。なお、酵素活性の
測定はジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー
(Journal of BiologicalChe
mistr7 ) 、 244 、6049〜6055
(1965)に記載されている方法に従った。反応液中
のBu−8MA濃度と得られたSOD誘導体が有する残
存アミン基量(TNBS法で測定)および酵素活性との
関係を第3図に示した。第3図によればBu−8MA濃
度が6mMの場合、得られ九SOD誘導体中のTNBS
反応性アミノ基の残存量は約50チであるが(前述のよ
うに原料5ODI分子中のアミノ基22個のうちでTN
BS反応性アミノ基は約10〜11個であるので、この
場合5個のアミノ基が反応し、17個のアミノ基が未反
応で残っていることKなる)、酵素活性が50チ維持さ
れていること、またそれ以上Bu−S M Aの結合量
が増加すると酵素活性が50チ以下に低下することがわ
かる。したがって、SODへの極度の化学修飾は酵素活
性の維持に好ましくな(、SODの酵素活性を維持させ
るためには5ODI分子に結合される共重合体の数は約
6分子までに抑える必要がある。なお、第3図に示され
るように、SOD1分子に2分子のBu−8MAが結合
したSOD誘導体の場合にはSODそのものの酵素活性
に対して80チの酵素活性が維持されている。
合成例2で得られたSOD誘導体と原料SODのプロテ
アーゼ感受性を比較検討した。反応は田7.4.37℃
で行った。SOD誘導体およびSODを1d当り15ユ
ニツト(5μg/ml)で各々Q、11Ni/Jのトリ
プシン、キモトリプシンおよびパパインと反応させ九。
アーゼ感受性を比較検討した。反応は田7.4.37℃
で行った。SOD誘導体およびSODを1d当り15ユ
ニツト(5μg/ml)で各々Q、11Ni/Jのトリ
プシン、キモトリプシンおよびパパインと反応させ九。
それらの結果を第11図に示した。両者ともパパインで
僅かく酵素活性が低下するが、他のプロテアーゼでは失
活することなく、両者とも安定であった。したがって、
SODを共重合体が修飾してもその酵素化学的安定性は
変化しないと結論される。
僅かく酵素活性が低下するが、他のプロテアーゼでは失
活することなく、両者とも安定であった。したがって、
SODを共重合体が修飾してもその酵素化学的安定性は
変化しないと結論される。
試験例6
合成例2で得られたSOD誘導体と原料のS0Dのそれ
ぞれをクシ血清アルブミン−セファo −ヌカ2ムによ
るアフイニテイクロマトグラフイーに付した。それらの
結果を第10図に示した。原料の80Dはアルブミンに
結合せず、ナベてカラムを素通りした。SOD誘導体は
95q6以上がアルブミンカラムに結合した。SOD@
導体のかなシの部分が0.1%のドデシル硫酸ナトリウ
ム(SDS)処理によシカラムから溶出されたが、この
条件下では依然として約30%のSOD誘導体がカラム
に結合しておシ、次にカラムを塩酸グアニジンで変性処
理することによってSOD誘導体のすべてが溶出された
。また、0.5%のSDS処理ではほぼ全景のSOD誘
導体がアルブミンカラムから溶出された。このことはB
u−8MAが結合し九SOD誘導体は原料SODとは異
なシ、アルブミンと強く結合することを示す。
ぞれをクシ血清アルブミン−セファo −ヌカ2ムによ
るアフイニテイクロマトグラフイーに付した。それらの
結果を第10図に示した。原料の80Dはアルブミンに
結合せず、ナベてカラムを素通りした。SOD誘導体は
95q6以上がアルブミンカラムに結合した。SOD@
導体のかなシの部分が0.1%のドデシル硫酸ナトリウ
ム(SDS)処理によシカラムから溶出されたが、この
条件下では依然として約30%のSOD誘導体がカラム
に結合しておシ、次にカラムを塩酸グアニジンで変性処
理することによってSOD誘導体のすべてが溶出された
。また、0.5%のSDS処理ではほぼ全景のSOD誘
導体がアルブミンカラムから溶出された。このことはB
u−8MAが結合し九SOD誘導体は原料SODとは異
なシ、アルブミンと強く結合することを示す。
次に、合成例2で得られたSOD誘導体ま之は原料のS
ODのそれぞれをラットに静脈内投与し、血中での濃度
変化を測定した。それらの結果を第12図に示す。第1
2図から明らかなように、原料SODは血中濃度が短時
間で低下する(半減期5分)のに比し、SOD誘導体の
血中濃度は極めて長時間高いレベルに保たれる(半減期
6時間)。
ODのそれぞれをラットに静脈内投与し、血中での濃度
変化を測定した。それらの結果を第12図に示す。第1
2図から明らかなように、原料SODは血中濃度が短時
間で低下する(半減期5分)のに比し、SOD誘導体の
血中濃度は極めて長時間高いレベルに保たれる(半減期
6時間)。
このことはSOD誘導体がBu−SMAの存在によって
血中のアルブミンと強く結合することによるものと推察
される。
血中のアルブミンと強く結合することによるものと推察
される。
合成例4.5および6で得られたSOD紡導体について
も、上記と同様にウシ血清アルブミン−セファロースカ
ラムによるアフイニテイクロマトグラフイーを行った。
も、上記と同様にウシ血清アルブミン−セファロースカ
ラムによるアフイニテイクロマトグラフイーを行った。
いずれのSOD誘導体についても、その90ヂ以上がア
ルブミンカラムに結合し、カラムからの溶出にはドデシ
ル硫酸ナトリウム(SDS)処理を必要とした。このこ
とはいずれの;OD誘導体もアルブミンと強く結合する
ことを示すものであJ’% SODと結合している共重
合体中の疎水性基およびカルボキシル基の存在によるも
−のと推察される。
ルブミンカラムに結合し、カラムからの溶出にはドデシ
ル硫酸ナトリウム(SDS)処理を必要とした。このこ
とはいずれの;OD誘導体もアルブミンと強く結合する
ことを示すものであJ’% SODと結合している共重
合体中の疎水性基およびカルボキシル基の存在によるも
−のと推察される。
また、合成例2においてヒト赤血球型SODの代りにウ
シ赤血球型SODを用いる以外は合成例2と同様の反応
および分離操作を行うことKよシ、ウシ赤血球型5OD
I分子にBu−SMAが2分子結合した5OJI導体が
得られた。この801)誘導体についても上記の試験結
果と同様の結果が得られ、ヒト赤血球型SODとウシ赤
血球型SODとでは差はみられなかった。
シ赤血球型SODを用いる以外は合成例2と同様の反応
および分離操作を行うことKよシ、ウシ赤血球型5OD
I分子にBu−SMAが2分子結合した5OJI導体が
得られた。この801)誘導体についても上記の試験結
果と同様の結果が得られ、ヒト赤血球型SODとウシ赤
血球型SODとでは差はみられなかった。
試験例7
合成例2で得られたSOD誘導体をラット血清と混和し
、混和物をゲル濾過の操作(セファクリルS−200、
SDラット血清Q、 2#Ill、サンプル0、2 W
’)に付した場合、5oDs導体はアルブミンを主体
とする血清蛋白質に結合して溶出することが認められた
。一方、原料SODをラット血清と混和し、混和物につ
いて同様のゲル濾過を行ったところ、SODは血清蛋白
質と相互作用することなく、それ自身の分子量33,0
00の位置に溶出された。
、混和物をゲル濾過の操作(セファクリルS−200、
SDラット血清Q、 2#Ill、サンプル0、2 W
’)に付した場合、5oDs導体はアルブミンを主体
とする血清蛋白質に結合して溶出することが認められた
。一方、原料SODをラット血清と混和し、混和物につ
いて同様のゲル濾過を行ったところ、SODは血清蛋白
質と相互作用することなく、それ自身の分子量33,0
00の位置に溶出された。
また、アルブミンを欠損する無アルブミンラットの血清
と上記のSOD誘導体を混和し、混和物について同様に
ゲル濾過を行った場合、かなシの量のSOD誘導体が非
アルブミン画分の血清蛋白質に結合して溶出された。し
たがって、血中のアルブミン濃度が低い場合には、SO
D誘導体は他の血清蛋白質に結合して挙動すると考えら
れる。
と上記のSOD誘導体を混和し、混和物について同様に
ゲル濾過を行った場合、かなシの量のSOD誘導体が非
アルブミン画分の血清蛋白質に結合して溶出された。し
たがって、血中のアルブミン濃度が低い場合には、SO
D誘導体は他の血清蛋白質に結合して挙動すると考えら
れる。
このことは血清アルブミン濃度が低下する疾患に対して
もSOD誘導体が有効に作用できることを示す。′ 試験例8 合成例2に記載の方法に準じて調製した510r標識し
1psooiyl導体、合成例2で用いたBu−SMA
と同様の3H標識したSMAおよびSODをそれぞれラ
ット(体重200 t ) K 200,000 cp
m/rat量静脈内投与し、1時間後の臓器中の放射活
性を測定した。それらの結果を第4表に示す。第4表か
ら明らかなとおり、SOD誘導体の尿中***は着側に抑
制されており、血中半減期が延長し、SOD誘導体は各
臓器に高濃度に移行することがわかる。
もSOD誘導体が有効に作用できることを示す。′ 試験例8 合成例2に記載の方法に準じて調製した510r標識し
1psooiyl導体、合成例2で用いたBu−SMA
と同様の3H標識したSMAおよびSODをそれぞれラ
ット(体重200 t ) K 200,000 cp
m/rat量静脈内投与し、1時間後の臓器中の放射活
性を測定した。それらの結果を第4表に示す。第4表か
ら明らかなとおり、SOD誘導体の尿中***は着側に抑
制されており、血中半減期が延長し、SOD誘導体は各
臓器に高濃度に移行することがわかる。
以下余白
第 4 表
放射性SODの臓器分布
血液(cpm/s#) 47 4400
7045脳 27
262 230肺臓 190 84
9 454心臓 127 262 383
肝臓 261 11667 832腎@
16200 33720 434尿
89725 67 248牌臓
80 496 385胃
120 271
363小腸(cpm/2f) 160
1300 159以上の試験例の結果から明ら
かなように、5ODll導体は、SODそのものに近い
酵素活性を有し、かつSODそのものに比べ大幅に延長
された血中半減期を有する。また、SOD誘導体は血清
蛋白質との可逆的な相互作用を有してお6、s。
7045脳 27
262 230肺臓 190 84
9 454心臓 127 262 383
肝臓 261 11667 832腎@
16200 33720 434尿
89725 67 248牌臓
80 496 385胃
120 271
363小腸(cpm/2f) 160
1300 159以上の試験例の結果から明ら
かなように、5ODll導体は、SODそのものに近い
酵素活性を有し、かつSODそのものに比べ大幅に延長
された血中半減期を有する。また、SOD誘導体は血清
蛋白質との可逆的な相互作用を有してお6、s。
Dを疾患局所へ移行させるうえで非常に有利である。一
般に、炎症局所および虚血性疾患局所の田は低下してお
シ、このような局所にはプロトン化されたカルボキシル
基含有化合物が集積分布すると言われている。SOD誘
導体はカルボキシル基を有していることから、このカル
ボキシル基がプロトン化されることKよシ、炎症局所お
よび虚血性疾患局所に効率よく集積分布されることが期
待される。
般に、炎症局所および虚血性疾患局所の田は低下してお
シ、このような局所にはプロトン化されたカルボキシル
基含有化合物が集積分布すると言われている。SOD誘
導体はカルボキシル基を有していることから、このカル
ボキシル基がプロトン化されることKよシ、炎症局所お
よび虚血性疾患局所に効率よく集積分布されることが期
待される。
次に、本発明の5OJI導体のうち合成例2で得られた
SOD誘導体を有効成分として含有する製剤例を示す。
SOD誘導体を有効成分として含有する製剤例を示す。
製剤例1
下記の成分を用いて常法によシ腸溶性カプセル剤を調製
した。
した。
合成例2で得られた5ODiI!導体 20岬乳糖
469 コーンスターチ 16wg結晶性セ
ルロース 1211Pグリコール酸
セル四−ス 5q(1カプセル当夛)
10919上記の腸溶性カプセル剤は、通
常大人に1回2カプセルを食後に1日3回投与する。
469 コーンスターチ 16wg結晶性セ
ルロース 1211Pグリコール酸
セル四−ス 5q(1カプセル当夛)
10919上記の腸溶性カプセル剤は、通
常大人に1回2カプセルを食後に1日3回投与する。
製剤例2
下記の成分を用いて常法によシ腸溶錠剤を調製し九。
合成例2で得られたSOD誘導体 20 11I
乳糖 79 Tlv コーンスターチ 45.51
v(1錠当シ) 145
my上記の腸溶錠剤は、通常大人に1回2錠を食後に
1日3回投与する。
乳糖 79 Tlv コーンスターチ 45.51
v(1錠当シ) 145
my上記の腸溶錠剤は、通常大人に1回2錠を食後に
1日3回投与する。
製剤例3
次の方法によシ注射用製剤を調製した。
合成例2で得られたSOD誘導体10岬を生理食塩水に
溶解して容積を5−とし滅菌ミクロボア・フィルターで
濾過した。濾液を滅菌こはく色ガラスびん(1型、37
)に封入した。
溶解して容積を5−とし滅菌ミクロボア・フィルターで
濾過した。濾液を滅菌こはく色ガラスびん(1型、37
)に封入した。
発明の効果
本発明によれば、SODの酵素活性を概ね保持し九まま
で該SODに比べて大@に延長された血中半減期を有す
る新規な非巨大分子化SOD誘導体が提供される。SO
D誘導体は血清蛋白質との可逆的な相互作用を有してお
j)、SODを疾患局所へ移行させるうえで非常に有利
である。またSOD誘導体は抗炎症作用、抗虚血障害作
用、抗脳浮腫作用、抗バラコート中毒作用を併わせ有す
る。
で該SODに比べて大@に延長された血中半減期を有す
る新規な非巨大分子化SOD誘導体が提供される。SO
D誘導体は血清蛋白質との可逆的な相互作用を有してお
j)、SODを疾患局所へ移行させるうえで非常に有利
である。またSOD誘導体は抗炎症作用、抗虚血障害作
用、抗脳浮腫作用、抗バラコート中毒作用を併わせ有す
る。
第1図は、合成例3に示すSODとBu −S M人と
の反応において、反応時間とSOD中のTNBS反応性
アミノ基減少率との関係を示した図である。第2図は合
成例1および合成例2で得られたSOD誘導体ならびに
原料である80D>よびBu−8MAのUVスペクトル
を示した図である。 第3図は試験例5に示す反応液中のBu −8M人濃度
と得られたSOD誘導体が有するTNBS反応性アミノ
基量および80D活性との関係を示した図である。第4
図(1)はヒト赤血球型SODのIRスペクトルを示し
た図であシ、第4図(2)はウシ赤血球型SODのIR
スペクトルを示した図である。 第5図、第6図および第7図は各々合成例7のA7−1
、l67−2および屋7−3で得られた各々のSOD誘
導体のIRスペクトルを示した図である。第8図は合成
例1で得られたSOD誘導体を51Crでラベルし、等
電点分画を行い、田と放射活性を測定した結果を示した
図である。第9図は合成−2で得られたSOD!!lI
導体を51Crでラベルし、等電点分画を行い、田と放
射活性を測定した結果を示した図である。第10図は合
成例2で得られたSOD誘導体および原料SODのウシ
血清アルブミン−セファロースカラムによるアフイニテ
ィクロマトグツフィーの結果を示した図である。第11
図は合成例2で得られたSOD誘導体および原料SOD
の各種グロテアーゼに対する抵抗性を比較した図である
。第12図は合成例2で得られたSOD誘導体または原
料SODのそれぞれをラットに静脈内投与したときの経
過時間による血中濃度の変化を示し意図である。第13
図は左側大腿筋K O,2adのへペスバツファ−(F
4(6,0)を、また右側大腿筋に0.2 dの生理食
塩水をそれぞれ筋肉内投与したマウスにSOD誘導体ま
たは部分半フチルエステル化シタスチレン−無水マレイ
ン酸共重合体(以下、これをBu−8MAと略記する)
を静脈内投与し、左側(酸性側)と右側(コントロール
側)におけるSOD誘導体またはBu−8MAの経時的
組織集積量を示した図である。第14図は水浸拘束によ
シ誘起されるラットの急性胃粘膜障害に対するSOD誘
導体の抗消化性潰瘍作用に関し、潰瘍係数(mm/ t
issue)とストレス負荷時間との関係を示した図で
ある。第15図(1)はラットの脳浮腫を起こした右大
脳半球(病側)、左大脳半球(体側)または血液中にお
けるSOD誘導体の組織集積量を示した図であシ、第1
5図(2)は同じラットの病側、体側または血液中にお
けるBu−8MAの組織集積量を示した図である。第1
6図は、パラコート処理マウスにSOD誘導体を投与し
た場合と、投与しない場合(コントロール)とについて
、パラコート投与後の時間と血漿中のGOTレベルとの
関係を示した図である。 幡 ′L 図 父人時間(時開〕 箒 2 図 う皮表(nm) 第3 区 日u−5MA J 11 (mM)吸光度 吸光度 圃し老膚 σ δ −舊 第 10 図 第11図 反応持藺0痺聞) 第12 ffi 経通錆聞扮) 第13 口 注X後の時間 (弁) 第14 図 ストレス夛U野涛聞 (時間) 第15 図 壌16 図 手続補正S (自発) 昭和62年7月2日 昭和62年特許願第75253号 2、発明の名称 スーパーオキシドジスムターゼ誘導体 およびその製造法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 熊本重態本市池田3丁目49−3 井上正康 倉敷1rlfi津16211jlk 4、代理人 倉敷市酒津冑江山2045の1 株式会社 り ラ し 内 電話 東京 03(277)3182 5、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄、発明の詳細な説明の欄お
よび図面の簡単な説明の欄な6、補正の内容 (1)明細書の特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する
。 (2)明細書第8頁第10行の1’−(SOD)−(Z
″lx Jをr(SOD)(Z)xJに訂正する。 (3)°明細書第12頁第8行の「有効成分化合物であ
る」を「目的とする」に訂正する。 (4)明細書第14頁第6行の「構造単位」を「構成単
位」に訂正する。 (5) 明細書第14頁第13〜14行の「有効成分
化合物として」を「SOD誘導体の医薬用途Klに訂正
する。 (6)明細書第14頁最下行および第16頁第5行の「
本発明」を「医薬」K訂正する。 (γ) 明細書第15頁第6〜7行の「有効成分化合物
である」を削除する。 (8)明細書第15頁第10行および第19行の「有効
成分化合物」を「5ODl!導体」に訂正する。 (9)明細書第17頁第6行の[PNAsJを[プロシ
ーデイングズ・オプ・ザ・ナショナル・アカテミイ・オ
フ−サイエンシス(PrOCeedlng80fthe
National Academy of 5cien
ces ) Jに訂正する。 (3)明細書第17頁第7行の1’−ABBJを「アル
カビンス・オプ・バイオケミストリー・アンド・(ロ)
明細書第27頁第4〜7行の「したがって、本発明−中
略−このような組成物Jを[SOD誘導体を少なくとも
1種含有する医薬組成物]K訂正する。 (2)明細書第27頁第14〜15行の「トラカント」
を[トラガカントー]に訂正する。 α鴫 明細書第34頁第12行の「溶液重合」を「ラジ
カル重合」に訂正する。 に)明細書第37頁第8行の「ヒト由来SOD Jを[
ヒト赤血球型5ODJに訂正する。 (ロ)明細書第41頁第6行の「合成例1」を「合成例
4」に訂正する。 (ロ)明細書第43頁第2〜3行の「シグマ社製、32
00単位/岬」を「シグマ社製」に訂正する0(ロ)明
細書第50頁第15行のr33,000」を「約33,
0OOJに訂正する。 (ホ)明細書第51頁第10行の「SMA」を[Bu−
8MAjに訂正する。 (2)明細書第54頁下から第5行のl’−5ggとし
」を「5ゴとし、」に訂正する。 −明細書第57頁第1〜3行の「部分半ブチルエステル
化したスチレン−無水マレイン酸共重合体(以下、これ
をBu−SMAと略記する)」をrBu−8MAJに訂
正する。 緯)第4図(1)、第4図(2)、第5図、第6図およ
び第7図を別紙のとおシ訂正する。 (別 紙) 「2、特許請求の範囲 1、式 %式%(: 〔式中、〔SOD〕はアミン基に換えてアミノ基から′
1個の水素原子を除いた基を1ないし6個有するスーパ
ーオキシドジスムターゼを表わし、〔z〕は およびR5はそれぞれ水素原子またはメチル基を表わし
、R2は水素原子、塩素原子、臭素原子またはメチル基
を表わし H4は水素原子または炭素数1ないし5のア
ルキル基を表わし、R6はメチル基またはエチル基を表
わす)で示される基からなる群から選ばれる基、 すか、または炭素数1ないし4のアルカノール、炭素数
1ないし4のアルキル基部分を含むエチレングリコール
モノアルキルエーテルもしくは炭素数1ないし4のアル
キル基部分を含むグリセリンジアルキルエーテルから水
酸基を除いた残基を表わす)で示される基および。 子の結合手は(SOD)と結合するものであ、ることを
意味する)で示される基を構成単位とし、かつ平均分子
量が800ないし20000である共重合体の一価の基
を表わし、Xは[SOD]が有するアミノ基から1個の
水素原子を除いた基の数に対応する工ないし6の整数を
表わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ防導体。 2、スーパーオキシドジスムターゼと RI R3 はそれぞれ水素原子またはメチル基を表わし R2は水
素原子、塩素原子、臭素原子またはメチル基を表わし、
R4は水素原子または炭素数1ないし5のアルキル基を
表わし R8はメチル基またはエチル基を表わす〕で示
される基からなる群から選ばれる基、 すか、または炭素数1ないし4のアルカノール、炭素数
1ないし4のアルキル基部分を含むエチレンクIJコー
ルモノアルキルエーテルもしくa炭素数1ないし4のア
ルキル基部分を含むグリセリンジアルキルエーテルから
水酸基を除いた残基を表わす)で示される基および で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量が800
ないし20000である共重合体とを…7〜11のアル
カリ水溶液中で反応させることを特徴とする式 (S
OD)CZ)x 〔式中、〔SOD〕はアミン基に換えてアミノ基から1
個の水素原子を除いた基を1ないし6個有するスーパー
オキシドジスムターゼヲ表わし、〔2〕よびR6は前記
定義のとおシである〕で示される基からなる群から選ば
れる基、 シである)で示される基および 子の結合手は(SOD)と結合するものであることを意
味する)で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量
が800ないし2000Gである共重合体の一価の基を
表わし、Xは(SOD)が有するアミノ基から1個の水
素原子を除いた基の数に対応する工ないし6の整数を表
わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体の製造
法。 」鏝光度 吸光度 吸光度 吸光座
の反応において、反応時間とSOD中のTNBS反応性
アミノ基減少率との関係を示した図である。第2図は合
成例1および合成例2で得られたSOD誘導体ならびに
原料である80D>よびBu−8MAのUVスペクトル
を示した図である。 第3図は試験例5に示す反応液中のBu −8M人濃度
と得られたSOD誘導体が有するTNBS反応性アミノ
基量および80D活性との関係を示した図である。第4
図(1)はヒト赤血球型SODのIRスペクトルを示し
た図であシ、第4図(2)はウシ赤血球型SODのIR
スペクトルを示した図である。 第5図、第6図および第7図は各々合成例7のA7−1
、l67−2および屋7−3で得られた各々のSOD誘
導体のIRスペクトルを示した図である。第8図は合成
例1で得られたSOD誘導体を51Crでラベルし、等
電点分画を行い、田と放射活性を測定した結果を示した
図である。第9図は合成−2で得られたSOD!!lI
導体を51Crでラベルし、等電点分画を行い、田と放
射活性を測定した結果を示した図である。第10図は合
成例2で得られたSOD誘導体および原料SODのウシ
血清アルブミン−セファロースカラムによるアフイニテ
ィクロマトグツフィーの結果を示した図である。第11
図は合成例2で得られたSOD誘導体および原料SOD
の各種グロテアーゼに対する抵抗性を比較した図である
。第12図は合成例2で得られたSOD誘導体または原
料SODのそれぞれをラットに静脈内投与したときの経
過時間による血中濃度の変化を示し意図である。第13
図は左側大腿筋K O,2adのへペスバツファ−(F
4(6,0)を、また右側大腿筋に0.2 dの生理食
塩水をそれぞれ筋肉内投与したマウスにSOD誘導体ま
たは部分半フチルエステル化シタスチレン−無水マレイ
ン酸共重合体(以下、これをBu−8MAと略記する)
を静脈内投与し、左側(酸性側)と右側(コントロール
側)におけるSOD誘導体またはBu−8MAの経時的
組織集積量を示した図である。第14図は水浸拘束によ
シ誘起されるラットの急性胃粘膜障害に対するSOD誘
導体の抗消化性潰瘍作用に関し、潰瘍係数(mm/ t
issue)とストレス負荷時間との関係を示した図で
ある。第15図(1)はラットの脳浮腫を起こした右大
脳半球(病側)、左大脳半球(体側)または血液中にお
けるSOD誘導体の組織集積量を示した図であシ、第1
5図(2)は同じラットの病側、体側または血液中にお
けるBu−8MAの組織集積量を示した図である。第1
6図は、パラコート処理マウスにSOD誘導体を投与し
た場合と、投与しない場合(コントロール)とについて
、パラコート投与後の時間と血漿中のGOTレベルとの
関係を示した図である。 幡 ′L 図 父人時間(時開〕 箒 2 図 う皮表(nm) 第3 区 日u−5MA J 11 (mM)吸光度 吸光度 圃し老膚 σ δ −舊 第 10 図 第11図 反応持藺0痺聞) 第12 ffi 経通錆聞扮) 第13 口 注X後の時間 (弁) 第14 図 ストレス夛U野涛聞 (時間) 第15 図 壌16 図 手続補正S (自発) 昭和62年7月2日 昭和62年特許願第75253号 2、発明の名称 スーパーオキシドジスムターゼ誘導体 およびその製造法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 熊本重態本市池田3丁目49−3 井上正康 倉敷1rlfi津16211jlk 4、代理人 倉敷市酒津冑江山2045の1 株式会社 り ラ し 内 電話 東京 03(277)3182 5、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄、発明の詳細な説明の欄お
よび図面の簡単な説明の欄な6、補正の内容 (1)明細書の特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する
。 (2)明細書第8頁第10行の1’−(SOD)−(Z
″lx Jをr(SOD)(Z)xJに訂正する。 (3)°明細書第12頁第8行の「有効成分化合物であ
る」を「目的とする」に訂正する。 (4)明細書第14頁第6行の「構造単位」を「構成単
位」に訂正する。 (5) 明細書第14頁第13〜14行の「有効成分
化合物として」を「SOD誘導体の医薬用途Klに訂正
する。 (6)明細書第14頁最下行および第16頁第5行の「
本発明」を「医薬」K訂正する。 (γ) 明細書第15頁第6〜7行の「有効成分化合物
である」を削除する。 (8)明細書第15頁第10行および第19行の「有効
成分化合物」を「5ODl!導体」に訂正する。 (9)明細書第17頁第6行の[PNAsJを[プロシ
ーデイングズ・オプ・ザ・ナショナル・アカテミイ・オ
フ−サイエンシス(PrOCeedlng80fthe
National Academy of 5cien
ces ) Jに訂正する。 (3)明細書第17頁第7行の1’−ABBJを「アル
カビンス・オプ・バイオケミストリー・アンド・(ロ)
明細書第27頁第4〜7行の「したがって、本発明−中
略−このような組成物Jを[SOD誘導体を少なくとも
1種含有する医薬組成物]K訂正する。 (2)明細書第27頁第14〜15行の「トラカント」
を[トラガカントー]に訂正する。 α鴫 明細書第34頁第12行の「溶液重合」を「ラジ
カル重合」に訂正する。 に)明細書第37頁第8行の「ヒト由来SOD Jを[
ヒト赤血球型5ODJに訂正する。 (ロ)明細書第41頁第6行の「合成例1」を「合成例
4」に訂正する。 (ロ)明細書第43頁第2〜3行の「シグマ社製、32
00単位/岬」を「シグマ社製」に訂正する0(ロ)明
細書第50頁第15行のr33,000」を「約33,
0OOJに訂正する。 (ホ)明細書第51頁第10行の「SMA」を[Bu−
8MAjに訂正する。 (2)明細書第54頁下から第5行のl’−5ggとし
」を「5ゴとし、」に訂正する。 −明細書第57頁第1〜3行の「部分半ブチルエステル
化したスチレン−無水マレイン酸共重合体(以下、これ
をBu−SMAと略記する)」をrBu−8MAJに訂
正する。 緯)第4図(1)、第4図(2)、第5図、第6図およ
び第7図を別紙のとおシ訂正する。 (別 紙) 「2、特許請求の範囲 1、式 %式%(: 〔式中、〔SOD〕はアミン基に換えてアミノ基から′
1個の水素原子を除いた基を1ないし6個有するスーパ
ーオキシドジスムターゼを表わし、〔z〕は およびR5はそれぞれ水素原子またはメチル基を表わし
、R2は水素原子、塩素原子、臭素原子またはメチル基
を表わし H4は水素原子または炭素数1ないし5のア
ルキル基を表わし、R6はメチル基またはエチル基を表
わす)で示される基からなる群から選ばれる基、 すか、または炭素数1ないし4のアルカノール、炭素数
1ないし4のアルキル基部分を含むエチレングリコール
モノアルキルエーテルもしくは炭素数1ないし4のアル
キル基部分を含むグリセリンジアルキルエーテルから水
酸基を除いた残基を表わす)で示される基および。 子の結合手は(SOD)と結合するものであ、ることを
意味する)で示される基を構成単位とし、かつ平均分子
量が800ないし20000である共重合体の一価の基
を表わし、Xは[SOD]が有するアミノ基から1個の
水素原子を除いた基の数に対応する工ないし6の整数を
表わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ防導体。 2、スーパーオキシドジスムターゼと RI R3 はそれぞれ水素原子またはメチル基を表わし R2は水
素原子、塩素原子、臭素原子またはメチル基を表わし、
R4は水素原子または炭素数1ないし5のアルキル基を
表わし R8はメチル基またはエチル基を表わす〕で示
される基からなる群から選ばれる基、 すか、または炭素数1ないし4のアルカノール、炭素数
1ないし4のアルキル基部分を含むエチレンクIJコー
ルモノアルキルエーテルもしくa炭素数1ないし4のア
ルキル基部分を含むグリセリンジアルキルエーテルから
水酸基を除いた残基を表わす)で示される基および で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量が800
ないし20000である共重合体とを…7〜11のアル
カリ水溶液中で反応させることを特徴とする式 (S
OD)CZ)x 〔式中、〔SOD〕はアミン基に換えてアミノ基から1
個の水素原子を除いた基を1ないし6個有するスーパー
オキシドジスムターゼヲ表わし、〔2〕よびR6は前記
定義のとおシである〕で示される基からなる群から選ば
れる基、 シである)で示される基および 子の結合手は(SOD)と結合するものであることを意
味する)で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量
が800ないし2000Gである共重合体の一価の基を
表わし、Xは(SOD)が有するアミノ基から1個の水
素原子を除いた基の数に対応する工ないし6の整数を表
わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体の製造
法。 」鏝光度 吸光度 吸光度 吸光座
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、式 〔SOD〕−〔Z〕_x 〔式中、〔SOD〕はアミノ基に換えてアミノ基から1
個の水素原子を除いた基を1ないし6個有するスーパー
オキシドジムターゼを表わし、〔Z〕は (イ)▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化
学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があり
ます▼ または▲数式、化学式、表等があります▼(これらの式
中、R^1、R^3およびR^5はそれぞれ水素原子ま
たはメチル基を表わし、R^2は水素原子、塩素原子、
臭素原子またはメチル基を表わし、R^4は水素原子ま
たは炭素数1ないし5のアルキル基を表わし、R^6は
メチル基またはエテル基を表わす)で示される基からな
る群から選ばれる基、 (ロ)▲数式、化学式、表等があります▼(式中、R^
7は水素原子を表わすか、または炭素数1ないし4のア
ルカノール、炭素数1ないし4のアルキル基部分を含む
エチレングリコールモノアルキルエーテルもしくは炭素
数1ないし4のアルキル基部分を含むグリセリンジアル
キルエーテルから水酸基を除いた残基を表わす)で示さ
れる基および (ハ)▲数式、化学式、表等があります▼(式中、カル
ボニル基の炭素原子の結合手は〔SOD〕と結合するも
のであることを意味する)で示される基を構成単位とし
、かつ平均分子量が800ないし20000である共重
合体の一価の基を表わし、Xは〔SOD〕が有するアミ
ノ基から1個の水素原子を除いた基の数に対応する1な
いし6の整数を表わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体。 2、スーパーオキシドジスムターゼと (イ)▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化
学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があり
ます▼ または▲数式、化学式、表等があります▼(これらの式
中、R^1、R^3およびR^5はそれぞれ水素原子ま
たはメチル基を表わし、R^2は水素原子、塩素原子、
臭素原子またはメチル基を表わし、R^4は水素原子ま
たは炭素数1ないし5のアルキル基を表わし、R^6は
メチル基またはエチル基を表わす)で示される基からな
る群から選ばれる基、 (ロ)▲数式、化学式、表等があります▼(式中、R^
7は水素原子を表わすか、または炭素数1ないし4のア
ルカノール、炭素数1ないし4のアルキル基部分を含む
エチレングリコールモノアルキルエーテルもしくは炭素
数1ないし4のアルキル基部分を含むグリセリンジアル
キルエーテルから水酸基を除いた残基を表わす)で示さ
れる基および (ハ)▲数式、化学式、表等があります▼ で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量が800
ないし20000である共重合体とをpH7〜11のア
ルカリ水溶液中で反応させることを特徴とする式〔SO
D〕−〔Z〕_x 〔式中、〔SOD〕はアミノ基に換えてアミノ基から1
個の水素原子を除いた基を1ないし6個有するスーパー
オキシドジスムターゼを表わし、〔Z〕は (イ)▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化
学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があり
ます▼または ▲数式、化学式、表等があります▼(これらの式中、R
^1、R^2、R^3、R^4、R^5およびR^6は
前記定義のとおりである)で示される基からなる群から
選ばれる基、 (ロ)▲数式、化学式、表等があります▼(式中、R^
7は前記定義のとおりである)で示される基および (ハ)▲数式、化学式、表等があります▼(式中、カル
ボニル基の炭素原子の結合手は〔SOD〕と結合するも
のであることを意味する)で示される基を構成単位とし
、かつ平均分子量が800ないし20000である共重
合体の一価の基を表わし、Xは〔SOD〕が有するアミ
ノ基から1個の水素原子を除いた基の数に対応する1な
いし6の整数を表わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体の製造
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62075253A JPH0824569B2 (ja) | 1986-05-16 | 1987-03-28 | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ誘導体およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11309586 | 1986-05-16 | ||
JP61-113095 | 1986-05-16 | ||
JP62075253A JPH0824569B2 (ja) | 1986-05-16 | 1987-03-28 | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ誘導体およびその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01104164A true JPH01104164A (ja) | 1989-04-21 |
JPH0824569B2 JPH0824569B2 (ja) | 1996-03-13 |
Family
ID=26416403
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62075253A Expired - Lifetime JPH0824569B2 (ja) | 1986-05-16 | 1987-03-28 | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ誘導体およびその製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0824569B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0412879U (ja) * | 1990-05-19 | 1992-01-31 |
-
1987
- 1987-03-28 JP JP62075253A patent/JPH0824569B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0412879U (ja) * | 1990-05-19 | 1992-01-31 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0824569B2 (ja) | 1996-03-13 |
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