JP2632518B2 - ビリルビンオキシダーゼの化学修飾体 - Google Patents

ビリルビンオキシダーゼの化学修飾体

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はビリルビンオキシダーゼの化学修飾体に関す
る。
本発明により提供されるビリルビンオキシダーゼの化
学修飾体は黄疸時に血中に異常に増加するビリルビンを
特異的に分解消去する作用を有しており、しかも血中安
定性が極めて高いことから、黄疸の治療薬として有用で
ある。
従来の技術 血中ビリルビンが異常に増量するために皮膚、粘膜、
その他の組織が黄変する病態が黄疸である。各種肝疾患
に伴う黄疸では、ビリルビンの細胞毒性が強く発現し、
しばしば重篤な結果をもたらす。このため、ヒト新生児
黄疸では光線療法または交換輸血による療法が行われて
いる。また、各種のレジンを用いて血中のビリルビンを
吸着除去するか、またはセルロース、デキストリン、ア
ガロースなどの多糖類、ポリアクリルアミドゲル、多孔
性ガラス、ポリスチレンなどの担体に固定化したビリル
ビンオキシダーゼを用いて血中のビリルビンを分解除去
する体外療法も試みられている。
発明が解決しようとする問題点 上記の治療法はそれぞれ治療効率の不良、輸血製剤の
確保、吸着成分の非特異性、操作の煩雑性などの難点の
いくつかを有している。
黄疸患者から血中ビリルビンを除去するにはビリルビ
ンオキシダーゼを使用するのが反応特異性の点で優れて
いるが、ビリルビンオキシダーゼの生体内での不安定性
および抗原性に原因して該ビリルビンオキシダーゼを生
体内に投与できないのが現状である。
しかして、本発明の目的は、血中ビリルビンを特異的
に分解消去する作用を有し、かつ極めて長い血中半減期
を有するビリルビンオキシダーゼの化学修飾体を提供す
るにある。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、上記の目的は、水溶性高分子物質で
化学修飾されたビリルビンオキシダーゼ誘導体（以下、
これをビリルビンオキシダーゼ誘導体と略称する）を提
供することによつて達成される。
水溶性高分子質としてはポリエチレングリコール、ポ
リプロピレングリコール、エチレンオキサイド−プロピ
レンオキサイド共重合体などのポリアルキレングリコー
ル；ポリビニルアルコール；デキストラン、プルラン、
イヌリンなどの多糖類；部分加水分解されたスチレンと
無水マレイン酸との共重合体；部分半エステル化（メチ
ルエステル、プロピルエステル、ｎ−プチルエステル、
メトキシエチルエステル、エトキシエチルエステル、1,
3−ジメトキシ−２−プロピルエステル、2,3−ジメトキ
シ−１−プロピルエステル、1,3−ジエトキシ−２−プ
ロピルエステル、２−エトキシ−３−メトキシ−１−プ
ロピルエステルなど）されたスチレンと無水マレイン酸
との共重合体；部分加水分解されたジビニルエーテルと
無水マレイン酸との共重合体；部分半エステル化（メチ
ルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ｎ−
ブチルエステル、メトキシエチルエステル、エトキシエ
チルエステル、1,3−ジメトキシ−２−プロピルエステ
ル、2,3−ジメトキシ−１−プロピルエステル、1,3−ジ
エトキシ−２−ピロピルエステル、２−エトキシ−３−
メトキシ−１−プロピルエステルなど）されたジビニル
エーテルと無水マレイン酸との共重合体；部分加水分解
されたアクリル酸と無水マレイン酸との共重合体；部分
半エステル化（メチルエステル、エチルエステル、プロ
ピルエステル、ｎ−ブチルエステル、メトキシエチルエ
ステル、エトキシエチルエステル、1,3−ジメトキシ−
２−プロピルエステル、2,3−ジメトキシ−１−プロピ
ルエステル、1,3−ジエトキシ−２−プロピルエステ
ル、２−エトキシ−３−メトキシ−１−プロピルエステ
ルなど）されたアクリル酸と無水マレイン酸との共重合
体；フイコール；ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン
酸、ポリリジンなどのポリアミノ酸；およびアルブミン
などが挙げられる。これら水溶性高分子物質のうち、ポ
リアルキレングリコール、多糖類、または部分加水分解
もしくは部分半エステル化されたスチレンと無水マレイ
ン酸との共重合体をビリルビンオキシダーゼの化学修飾
剤として使用するのが好ましい。
ビリルビンオキシダーゼ誘導体としては、ポリアルキ
レングリコールで化学修飾されたビリルビンオキシダー
ゼ誘導体、多糖類で化学修飾されたビリルビンオキシダ
ーゼ誘導体、または部分加水分解もしくは部分半エステ
ル化されたスチレンと無水マレイン酸との共重合体で化
学修飾されたビリルビンオキシダーゼ誘導体が好まし
い。これら好ましいビリルビンオキシダーゼ誘導体につ
いて個々に以下に詳しく説明する。
ポリアルキレグリコールで化学修飾されたビリルビン
オキシダーゼ誘導体〔以下、これをビリルビンオキシダ
ーゼ誘導体（Ｉ）と略称する〕は下記の一般式（Ｉ）で
示される。
式中、〔BOase〕は求核性部位を有するアミノ酸残基
に換えて該求核性部位から１個もしくは２個の水素原子
を除いた形のアミノ酸残基を１ないし10個有するか、ま
たはカルボキシル基を有するアミノ酸残基に換えて該カ
ルボキシル基から水酸基を除いた形のアミノ残基を１な
いし98個有するビリルビンオキシダーゼを表わし;lおよ
びｍはそれぞれ〔BOase〕が求核性部位を有するアミノ
酸残基に換えて該求核性部位から１個もしくは２個の水
素原子を除いた形のアミノ酸残基を１ないし10個有する
ビリルビンオキシダーゼを表わす場合には０を表わし、
〔BOase〕がカルボキシル基を有するアミノ酸残基に換
えて該カルボキシル基から水酸基を除いた形のアミノ酸
残基を１ないし98個有するビリルビンオキシダーゼを表
わす場合にはそれらｌとｍの和がカルボキシル基から水
酸基を除いた形のアミノ酸残基の数に対応する１ないし
98の整数に相当し、かつｍが１以上の整数を表わし;R1
およびR2はそれぞれ水素原子またはメチル基、エチル基
などの低級アルキル基を表わし;R3は水素原子またはメ
チル基、エチル基などの低級アルキル基または〔Z1〕と
の結合手を表わし;Aは窒素原子、酸素原子または硫黄原
子を有していてもよい２価の炭化水素基を表わし；
〔Z1〕はモノアルコキシポリアルキレングリコールから
誘導された基を表わし;nはｍが０を表わす場合〔BOas
e〕が有する求核部材から１個もしくは２個の水素原子
を除いた形のアミノ酸残基の数に対応する１ないし10の
整数を表わし、ｍが１ないし98の整数を表わす場合ｍに
対応する１ないし98の整数を表わし、好ましくは１ない
し30の整数であり、より好ましくは５ないし15の整数で
ある。
上記のＡが表わす窒素原子、酸素原子または硫黄原子
を有していてもよい２価の炭化水素基としては、例え
ば、CpH2p〔式中、ｐは１ないし10の整数を表わ
し、好ましくは４ないし６の整数を表わす〕、 −CH2OCH2-、 −CH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CH2-、 などが挙げられる。〔Z1〕が表わすモノアルコキシポリ
アルキレングリコールから誘導された基は一方の末端水
酸基がメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基などのア
ルコキシル基で置換された構造を有し、他方の末端にお
いて次のいずれかの構造を有する。
＝CH−（PAG−ｂ）または−CH2−（PAG−ｂ） 上記式中、（PAG−ａ）はモノアルコキシポリアルキ
レングリコールの末端から水酸基を除いた残基を表わ
し、（PAG−ｂ）はモノアルコキシポリアルキレングリ
コールの末端からヒドロキシメチル基を除いた残基を表
わし、R4は塩素原子または水酸基を表わす。
ビリルビンオキシダーゼ誘導体（Ｉ）は、（ｉ）ビリ
ルビンオキシダーゼと末端が活性化されたモノアルコキ
シポリアルキレングリコールとを反応させるか、または
（ii）ビリルビンオキシダーゼを予めジアミン化合物で
化学修飾後、その化学修飾体と末端が活性化されたモノ
アルコキシポリアルキレングリコールとを反応させ、必
要により得られたビリルビンオキシダーゼ誘導体を還元
することによつて製造することができる。
ビリルビンオキシダーゼのジアミン化合物による化修
飾体（以下、これをジアミン修飾体と称する）の製造
は、ビリルビンオキシダーゼと1,4−ジアミノブタン、
1,6−ジアミノヘキサン、1,8−ジアミノオクタン、1,4
−ジアミノベンゼン、ｐ−キシレンジアミン、N,N−ビ
ス（３−アミノプロピル）メチルアミン、ビス（アミノ
メチル）エーテル、ビス（３−アミノプロピル）エーテ
ル、エチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エ
ーテル、4,4′−ジアミノジフエニルエーテル、4,4′−
チオジアニリンなどのジアミン化合物とを例えば、ホウ
酸緩衝液、リン酸緩衝液などの緩衝液中で１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、
Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−1,2−ジヒド
ロキノリンなどの脱水剤の存在下に約０℃〜40℃の温度
で約１〜30時間反応させることにより行われる。反応終
了後、反応混合物を通常のゲル濾過、限外濾過などに付
し、生成したジアミン修飾体を分離する。。分離したジ
アミン修飾体を末端が活性化されたモノアルコキシポリ
アルキレングリコールとの反応に用いる。
ビリルビンオキシダーゼまたはそのジアミン修飾体と
末端が活性化されたモノアルコキシポリアルキレングリ
コールとの反応を次に説明する。
末端が活性化されたモノアルコキシポリアルキレング
リコールとして次の３種類の化合物が用いられる。な
お、（PAG−ａ）および（PAG−ｂ）は前記定義のとおり
である。
（１） 塩化シアヌル型 （２） イミドエステル型 （３） アルデヒド型 （PAG−ｂ）−CHO 塩化シアヌル型モノアルコキシポリアルキレングリコー
ルを原料として用いる場合 ビリルビンオキシダーゼまたはそのジアミン修飾体と
塩化シアヌル型モノアルコキシポリアルキレングリコー
ルとの反応は、例えば、ホウ酸緩衝液中、pH8〜10の下
に約０℃〜約40℃の温度で約１〜30時間で実施される。
反応混合物をゲル濾過、隅外濾過などに付し、未反応の
塩化シアヌル型モノアルコキシポリアルキレングリコー
ルを除去することにより、ビリルビンオキシダーゼ誘導
体（Ｉ）を得る。
イミドエステル型モノアルコキシポリアルキレングリコ
ールを原料として用いる場合 ビリルビンオキシダーゼまたはそのジアミン修飾体と
イミドエステル型モノアルコキシポリアルキレングリコ
ールとの反応は、例えば、リン酸緩衝液中、弱塩基性の
下に約０℃〜約40℃の温度で数分間で実施される。反応
混合物を例えば、限外濾過し、未反応のイミドエステル
型モノアルコキシポリアルキレングリコールまたはその
分解物を除去することにより、ビリルビンオキシダーゼ
誘導体（Ｉ）を得る。
アルデヒド型モノアルコキシポリアルキレングリコール
を原料として用いる場合 ビリルビンオキシダーゼまたはそのジアミン修飾体と
アルデヒド型モノアルコキシポリアルキレングリコール
との反応は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホ
ウ素ナトリウムなどのホウ素系還元剤の存在下または不
存在下に行われる。アルデヒド型モノアルコキシポリア
ルキレングリコールの使用量はビリルビンオキシダーゼ
またはそのジアミン修飾体に対して等モル量〜約１万倍
モル量である。この範囲内においてビリルビンオキシダ
ーゼまたはそのジアミン修飾体とアルデヒド型モノアル
コキシポリアルキレングリコールの使用量を調整するこ
とによつて、目的とするビリルビンオキシダーゼ誘導体
（Ｉ）のモノアルコキシポリアルキレングリコールによ
る化学修飾の程度を変えることができる。ホウ素系還元
剤はアルデヒド型モノアルコキシポリアルキレングリコ
ールに対して等モル量〜約100倍モル量で使用される。
反応溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液などの緩衝液を使用するのが好ましい。また、ビリル
ビンオキシダーゼの酵素活性を失活させず、かつ反応の
支障とならないような有機溶媒、例えば、メタノール、
エタノール、イソプロパノールなどの低級アルカノー
ル、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドなどを反応
系に存在させることもできる。反応系のpHは８〜11の範
囲内で調整される。反応はビリルビンオキシダーゼが変
性しない温度下、例えば、約０℃〜約80℃の範囲、好ま
しくは約０℃〜約50℃の範囲の温度で実施される。反応
終了後、反応混合物をゲル濾過、限外濾過などに付し、
未反応のアルデヒド型モノアルコキシポリアルキレング
リコールを除去することにより、ビリルビンオキシダー
ゼ誘導体（Ｉ）を得ることができる。
モノアルコキシポリアルキレングリコールの代表剤と
しては、モノアルコキシポリエチレングリコール、モノ
アルコキシポリプロピレングリコール、モノアルコキシ
−エチレンオキサイド−プロピレンオキサイド共重合体
などが挙げられるが、モノアルコキシポリエチレングリ
コールが好ましく、特にモノメトキシポリエチレングリ
コールが好ましい。原料のポリエチレングリコールとし
ては平均分子量が400〜30,000の範囲のものが使用でき
るが、平均分子量が5,000〜20,000の範囲のポリエチレ
ングリコールを原料として使用する場合に、特に良好な
ビリルビンオキシダーゼ誘導体（Ｉ）を与える。
多糖類で化学修飾されたビリルビンオキシダーゼ誘導
体〔以下、これをビリルビンオキシダーゼ誘導体（II）
と略称する〕は下記の一般式（II）で示される。
式中、〔BOase〕、R1、R2、R3、Ａ、ｌ、ｍおよびｎ
は前記定義のとおりであり、〔Z2〕は多糖類から誘導さ
れた基を表わす。
上記の〔Z2〕が表わす多糖類から誘導された基は、結
合部位として次のいずれかの構造を有する。
＝CH−（Psac−ａ），−CH2−（Psac−ａ）または 上記式中、（Psac−ａ）は多糖類の構成単糖を部分的
に酸化して得られたアルデヒド型多糖類からホルミル基
を除いた残基を表わし、（Psac−ｂ）は多糖類から構成
単糖が有する水酸基を除いた残基を表わす。
ビリルビンオキシダーゼ誘導体（II）は、ビリルビン
オキシダーゼまたはそのジアミン修飾体と活性化された
多糖類とを反応させ、必要により得られたビリルビンオ
キシダーゼ誘導体（II）を還元することによつて製造す
ることができる。
活性化された多糖類としては、（１）多糖類の構成単
糖を常法により過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリ
ウムなどの酸化剤で部分的に酸化して得られるアルデヒ
ド型多糖類：（Psac−ａ）−CHOおよび（２）多糖類を
常法により臭化シアンにより部分的に活性化して得られ
る多糖類：例えば（Psac−ｂ）−Ｏ−CNが挙げられる。
なお、（Psac−ａ）および（Psac−ｂ）は前記定義のと
おりである。
アルデヒド型多糖類を原料として用いる場合 ビリルビンオキシダーゼまたはそのジアミン修飾体と
アルデヒド型多糖類とからのビリルビンオキシダーゼ誘
導体（II）の製造は、ビリルビンオキシダーゼまたはそ
のジアミン修飾体とアルデヒド型モノアルコキシポリア
ルキレングリコールとからビリルビンオキシダーゼ誘導
体（Ｉ）を製造する際に採用される方法と同様の方法に
より行われる。かかる方法により、ビリルビンオキシダ
ーゼ誘導体（II）〔結合部位の構造：−Ｎ＝CH−（Psac
−ａ）〕およびこれに対応する還元型のビリルビンオキ
シダーゼ誘導体（II）〔結合部位の構造：−NH−CH2−
（Psac−ａ）〕が得られる。
臭化シアン活性型多糖類を原料として用いる場合 ビリルビンオキシダーゼまたはそのジアミン修飾体と
臭化シアン活性型多糖類との反応は、例えば、弱塩基性
水溶液中で室温下に数時間〜ほぼ１日で実施される。反
応混合物を例えば、ゲル濾過し、未反応の臭化シアン活
性型多糖類を除去することにより、ビリルビンオキシダ
ーゼ誘導体（II）を得る。
原料の多糖類としては前述のとおり、デキストラン、
ブルラン、イヌリンなどが挙げられるが、デキストラン
が特に好ましい。デキストランとしては平均分子量が2,
000〜200,000の範囲のものが使用できるが、平均分子量
が5,000〜70,000の範囲のデキストランを使用する場合
に、特に良好なビリルビンオキシダーゼ誘導体（II）を
与える。
部分加水分解または部分半エステル化されたスチレン
と無水マレイン酸との共重合体で化学修飾されたビリル
ビンオキシダーゼ誘導体〔以下、これをビリルビンオキ
シダーゼ誘導体（III）と略称する〕は下記の一般式（I
II）で示される。
式中、〔BOase〕、R1、R2、R3、Ａ、ｌ、ｍおよびｎ
は前記定義のとおりであり、〔Z3〕は （イ） 式 で示される基、 （ロ） 式 （式中、R5は水素原子を表わすか、または炭素数が１な
いし４のアルカノール、炭素数が１もしくは２のアルキ
ル基部分を含むエチレングリコールモノアルキルエーテ
ルまたは炭素数が１もしくは２のアルキル基部分を含む
グリセリンジアルキルエーテルから水酸基を除いた残基
を表わす）で示される基および （ハ） 式 （式中、カルボニル基の炭素原子の結合手は と結合するものであることを意味する）で示される基 を構成単位とし、かつ平均分子量が800ないし20000であ
る共重合体の一価の基を表わす。
ビリルビンオキシダーゼ誘導体（III）は、ビリルビ
ンオキシダーゼまたはそのジアミン修飾体と特定の共重
合体、すなわち、 （イ） 式 で示される基、 （ロ） 式 （式中、R5は前記定義のとおりである）で示される基お
よび （ハ） 式 で示される基 を構成単位とし、かつ平均分子量が800ないし20000であ
る共重合体（以下、これを共重合体と略称する）とを反
応させることによつて製造することができる。
上記のビリルビンオキシダーゼまたはそのジアミン修
飾体と共重合体との反応は、通常炭酸ナトリウム、重炭
酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなど
の塩の水溶液中にビリルビンオキシダーゼまたはそのジ
アミン修飾体を溶解し、得られた溶液に粉末状の共重合
体またはジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に溶解し
た共重合体を添加することにより行われる。反応中、溶
液のpHは８〜11に維持されていることが必要であり、pH
が８より低い場合には、共重合体の溶解性が低下して反
応は進行しない。また、pHが11より高い場合には、ビリ
ルビンオキシダーゼの酵素活性が失活して有効なビリル
ビンオキシダーゼ誘導体（III）を得ることができな
い。反応温度としては、約３〜50℃が好ましく、３〜40
℃がさらに好ましい。また、反応時間は反応温度、共重
合体の添加方法により異なるが、通常10分〜３時間であ
る。共重合体の使用量はビリルビンオキシダーゼまたは
そのジアミン修飾体１モルに対して約0.5〜30モルの範
囲である。この使用量によつてビリルビンオキシダーゼ
またはそのジアミン修飾体に結合させる共重合体の分子
数を調整することができる。
このようにして得られた反応液にはビリルビンオキシ
ダーゼ誘導体（III）と未反応のビリルビンオキシダー
ゼまたはそのジアミン修飾体および共重合体などが存在
するが、かかる反応液を濾過し、濾液をゲル濾過し、得
られるビリルビンオキシダーゼ誘導体（III）を含む溶
出液を必要に応じてハイドロフオービツク・クロマトグ
ラフイーに付したのち限外濾過に付することにより濃縮
したのち、凍結乾燥することによりビリルビンオキシダ
ーゼ誘導体（III）の固型物を取得することができる。
上記の反応により、ビリルビンオキシダーゼまたはそ
のジアミン修飾体が有する求核性部位または導入された
アミノ基と共重合体が有する無水マレイン酸環とが結合
し、ビリルビンオキシダーゼ誘導体（III）が生成す
る。原料として用いる共重合体には１分子中に通常無水
マレイン酸環が平均0.5〜２個存在するが、これらの無
水マレイン酸環のなかの１個がビリルビンオキシダーゼ
またはそのジアミン修飾体が有する求核性部位または導
入されたアミノ基と結合した場合、残りの無水マレイン
酸環はさらに別のアミノ基と反応することは少なく、水
と反応して開環して で示されるマレイン酸由来の基となり易い。したがつ
て、ビリルビンオキシダーゼ誘導体（III）の構成単位
には前記（ロ）の式においてR5が水素原子である基も包
含される。また原料としては部分半エステル化共重合体
を用いる場合には、得られるビリルビンオキシダーゼ誘
導体（III）の構成単位に前記（ロ）の基として上記の
マレイン酸由来の基が半エステル化されたものだけでな
く、少量の該マレイン酸由来の基が含まれる。共重合体
の１分子とビリルビンオキシダーゼまたはそのジアミン
修飾体の複数分子とが反応して該重合体の複数個の無水
マレイン酸環と各ビリルビンオキシダーゼまたはそのジ
アミン修飾体が有する求核性部位または導入されたアミ
ノ基とがそれぞれ結合した化合物が副生する可能性があ
るが、かかる副生物が少量混入したビリルビンオキシダ
ーゼ誘導体（III）を本発明に含めることに不都合はな
い。しかしながら、医薬の有効成分化合物は単一の化学
構造を有する化合物であることが好ましい状況にあるこ
とを考慮すれば、上記の副生物の混入量が多いビリルビ
ンオキシダーゼ誘導体（III）については、これをゲル
濾過などの操作に付することにより該副生物を除外して
用いることが好ましい。また、上記反応によつて得られ
るビリルビンオキシダーゼ誘導体（III）はビリルビン
オキシダーゼまたはそのジアミン修飾体に種々の分子数
の共重合体が結合して得られたものの混合物であり、そ
れら個々のビリルビンオキシダーゼ誘導体（III）のビ
リルビンオキシダーゼまたはそのジアミン修飾体に結合
している共重合体の分子数は同一ではない。したがつ
て、ビリルビンオキシダーゼ誘導体（III）を表わす前
記式において、ｎはビリルビンオキシダーゼまたはその
ジアミン修飾体１分子に結合する共重合体分子数の平均
値を表わすことを意味する。しかしながら、ビリルビン
オキシダーゼまたはそのジアミン修飾体に結合する共重
合体の分子数が同数のビリルビンオキシダーゼ誘導体
（III）が所望される場合には、前記の方法により得ら
れるビリルビンオキシダーゼ誘導体（III）をさらにゲ
ル濾過などの操作に付することにより所望のビリルビン
オキシダーゼ誘導体（III）を取得することが可能であ
る。なお、前記の反応および反応後の処理において、ビ
リルビンオキシダーゼ誘導体（III）が有するカルボキ
シル基がアルカリ金属塩またはアンモニウム塩を形成す
る可能性があるが、かかる塩を形成したカルボキシル基
を有するビリルビンオキシダーゼ誘導体（III）も本発
明に含めることができる。
また原料として用いる共重合体は、上記（イ）の構成
単位に対応する単量体と無水マレイン酸との共重合体を
部分加水分解〔少量（１分子当り平均0.5〜２個）の無
水マレイン酸環が残存し、他の無水マレイン酸環は加水
分解〕することにより、また上記（イ）の構成単位に対
応する単量体と無水マレイン酸との共重合体をアルコー
ルで部分半エステル化〔少量（１分子当り平均0.5〜２
個）の無水マレイン酸環が残存し、他の無水マレイン酸
環は半エステル化〕することにより得られる。このよう
にして得られる共重合体として、例えば、部分加水分解
されたスチレンと無水マレイン酸との共重合体；部分半
エステル化（メチルエステル、エチルエステル、プロピ
ルエステル、ｎ−ブチルエステル、メトキシエチルエス
テル、エトキシエチルエステル、1,3−ジメトキシ−２
−プロピルエステル、2,3−ジメトキシ−１−プロピル
エステル、1,3−ジエトキシ−２−プロピルエステル、
２−エトキシ−３−メトキシ−１−プロピルエステルな
ど）されたスチレンと無水マレイン酸との共重合体など
が挙げられる。
これらの共重合体はいずれも疎水性基と親水性基の両
者を持つことによる適度な疎水性を有し、かつ極性の高
いカルボキシル基を有する。したがつて、かかる共重合
体が結合しているビリルビンオキシダーゼ誘導体（II
I）は血清蛋白および生体膜との可逆的な結合性を有し
ており、このことにより血中半減期が延長され、また臓
器への移行性が良好となる。なかでも構成単位（イ）と
してスチレン由来の基を有するビリルビンオキシダーゼ
誘導体（III）および構成単位（ロ）として半エステル
化された基を有するビリルビンオキシダーゼ誘導体（II
I）は疎水性がより高くこれらの効果を発現する点で好
ましい。
共重合体において、構成単位（イ）と構成単位（ロ）
および（ハ）の構成モル比「（イ）／（ロ）＋（ハ）」
は実質的に約１〜1.3の範囲であることが好ましく、通
常は１である。構成モル比が１よりも小さいものは構成
単位（イ）に相当する単量体と無水マレイン酸との共重
合で得ることは困難である。また、構成モル比が1.3よ
りも大きいものは、構成単位（ロ）が半エステル化され
たものである場合、かかる共重合体を塩の水溶液中に溶
解させてビリルビンオキシダーゼまたはそのジアミン修
飾体と反応させる際に、共重合体の水溶液への溶解性が
不良となるので好ましくない。
上記の共重合体はいずれも公知のものであり、それら
の重量平均分子量は通常800〜20000の範囲である。これ
らの共重合体から得られるビリルビンオキシダーゼ誘導
体（III）の疾患局所への移行性の点から、共重合体の
重量平均分子量は8000以下であることが好ましい。共重
合体の分子量分布については特に制限はない。上記の構
成単位（イ）に相当する単量体と無水マレイン酸とをラ
ジカル共重合することにより得られる共重合体（重量平
均分子量／数平均分子量との比が約2.0またはそれ以上
のもの）を分別することなく、そのまま部分加水分解ま
たは部分半エステル化したものを原料として用いること
もできるし、また分別して分子量分布を狭くしたものを
部分加水分解または部分半エステル化して原料として用
いてもよい。
本発明において用いる酵素ビリルビンオキシダーゼと
してはいかなる起源のものでもよく、例えばミロセシウ
ム（Myrothecium）属またはコプリナス（Coprinus）属
に属する微生物由来のものを使用することができる。ミ
ロセシウム属菌としては、ミロセシウム・ベルカリア
（Myr.verrucaria）MT−1,FERM−BP653〔アグリカルチ
ュラル アンド バイオロジカル ケミストリー（Agri
cultural and Biological Chemistry）、第45巻、2383
−2384ページ（1981年）参照〕、ミロセシウム・ベルカ
リア IFO 6113、ミロセシウム・ベルカリア IFO 61
33、ミロセシウム・ベルカリア IFO 6351、ミロセシ
ウム・ベルカリア IFO 9056、ミロセシウム・チンク
タム（Myr.cinctem）IFO 9950、ミロセシウム・ロリダ
ム（Myr.roridum）IFO 9531などの保存菌株が挙げら
れ、またコプリナス属菌としては、コプリナス・シネレ
ウス（Coprinus cinereus）IFO 8371、コプリナス・ラ
ゴビデス（Ocp.lagopides）IFO 31020などの保存菌株
が挙げられる。これらの菌株を常法により液体培養また
は固体培養し、その培養物から抽出、塩析、イオン交
換、ゲル濾過などを行うことにより酵素ビリルビンオキ
シダーゼの精製標品を得ることができる。
このようにして得られたビリルビンオキシダーゼは、
ビリルビンに作用してビリベルジンを経てほぼ無色の生
成物に変化せしめる結果、ビリルビンの特異吸収（460n
m付近）が減少するとともに、その還元性がなくなる。
また、この酵素は過酸化水素を生成しない特徴を有す
る。ビリルビンオキシダーゼはその起源によつても異な
るが、約52,000〜約83,000の分子量を有している。
本発明によつて提供されるビリルビンオキシダーゼ誘
導体は、後述の試験例の結果から明らかなように、血中
半減期が極めて長く、しかも血中ビリルビン濃度を著明
に低下させる作用を有する。ビリルビンオキシダーゼ誘
導体のうち、特にポリエチレングリコールで化学修飾さ
れたビリルビンオキシダーゼ誘導体が血中安定性および
減黄作用において優れる。
また、ビリルビンオキシダーゼ誘導体は毒性試験にお
いて低毒性であることが確認されている。
以上のことより、ビリルビンオキシダーゼ誘導体は体
質性黄疸、小児核黄疸などの黄疸の治療薬として有効で
ある。また、ビリルビンオキシダーゼ誘導体は肝硬変、
肝炎特に劇症肝炎の治療・予防薬としても有用である。
ビリルビンオキシダーゼ誘導体の投与量は疾病、患者
の重篤度、薬物に対する忍容性などにより異なるが、通
常成人１日あたり0.1〜100mg、好ましくは0.5〜50mgの
量であり、これを１回または分割して投与するのがよ
い。投与に際しては投与ルートに適した任意の形態をと
ることができる。
ビリルビンオキシダーゼ誘導体は任意慣用の製剤方法
を用いて投与用に調製することができる。少なくとも１
種のビリルビンオキシダーゼ誘導体を含有する医薬組成
物は任意所要の製薬用担体、賦形剤などの医薬上許容さ
れる添加剤などを使用して慣用の手段によつて調製され
る。
この組成物が経口用製剤である場合には、該製剤は消
化管からの吸収に好適な形態で提供されるのが望まし
い。経口投与の錠剤およびカプセルは単位量投与形態で
あり、結合剤、例えばシロツプ、アラビアゴム、ゼラチ
ン、ソルビツト、トラガカント、ポリビニルピロリドン
など；賦形薬、例えば乳糖、とうもろこし澱粉、りん酸
カルシウム、ソルビツト、グリシンなど；潤滑剤、例え
ばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレング
リコール、シリカなど；崩壊剤、例えば馬鈴薯澱粉な
ど；または許容し得る潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナト
リウムなどのような慣用の賦形を含有していてもよい。
錠剤は当業界において周知の方法でコーテイングしても
よい。経口用液体製造は水性または油性懸濁剤、溶液、
シロツプ、エリキシル剤、その他であつてもよく、ある
いは使用する前に水または他の適当なビヒクルで再生溶
解させる乾燥生成物であつてもよい。このような液体製
剤は普通に用いられる添加剤、例えば懸濁化剤、例えば
ソルビツトシロツプ、メチルセルロース、グルコース／
糖シロツプ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、
カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウ
ムゲル、水素化食用脂など；乳化剤、例えばレシチン、
モノオレイン酸ソルビタン、アラビアゴムなど；非水性
ビヒクル、例えばアーモンド油、分別ココナツト油、油
性エステル、プロピレングリコール、エチルアルコール
など；防腐剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、
ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、ソルビン酸などを含
有してもよい。
また注射剤を調製する場合、ビリルビンオキシダーゼ
誘導体を生理食塩水、注射用ブドウ糖液などの溶剤に溶
解し、ビリルビンオキシダーゼ誘導体２〜20mg/溶剤２
〜10mlの濃度に調整し、常法により皮下、筋肉内、静脈
内注射剤とする。調製時に必要により水溶液にPH調整
剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤などを添加す
ることができる。
上記の医薬組成物はその形態等に依存してビリルビン
オキシダーゼ誘導体を一般に約0.01〜50重量％、好まし
くは約0.1〜20重量％の濃度で含有することができる。
実施例 以下に、本発明を実施例および試験例により具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例により限定される
ものではない。
実施例１ ポリエチレングリコールで化学修飾されたビリルビンオ
キシダーゼ誘導体の製造 5.2mgのビリルビンオキシダーゼ（Sigma社製、分子量
52,000）を含む1mlの0.2Mホウ酸緩衝液（pH9.0）に200m
gの2,4−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）
−６−クロロ−Ｓ−トリアジン〔生化学工業（株）製、
平均分子量w20,000〕を添加し、37℃で２時間、つい
で４℃で16時間インキユベートした。得られた反応混合
物をセフアデツクス（Sephadex ）Ｇ−100（Pharmacia
社製）を充填したカラム（２×80cm）に注入し、ゲル濾
過した。リン酸緩衝液（pH7.4）を溶出液とし、流出液
を280nmで検出し、未反応の2,4−ビス（Ｏ−メトキシポ
リエチレングリコール）−６−クロロ−Ｓ−トリアジン
を除いた吸収部分の流出液を分取した。ビリルビンオキ
シダーゼ誘導体を含む溶液を凍結乾燥することにより、
約9mgの粉末（蛋白質として約4mg）を得た。ビリルビン
オキシダーゼ誘導体の活性収率は90％であつた。
上記で得られたビリルビンオキシダーゼ誘導体をセフ
アデツクス（Sephadex ）Ｇ−150（Pharmacia社製）を
充填したカラム（1.6×40cm）に注入し、ゲル濾過によ
り分画した。分子量約110,000の画分にビリルビンオキ
シダーゼ誘導体を回収した。この分子量は未処理のビリ
ルビンオキシダーゼの分子量よりも約60,000大きい。こ
のことから、ビリルビンオキシダーゼ誘導体は１分子の
ビリルビンオキシダーゼに６分子のモノメトキシポリエ
チレングリコールが結合した標品であると判定した。ビ
リルビンオキシダーゼ誘導体および未処理のビリルビン
オキシダーゼの125Iラベル標品のゲルクロマトグラフを
第１図に示す。図中、黒丸はビリルビンオキシダーゼ誘
導体のゲルクロマトグラフを表わし、白丸は未処理のビ
リルビンオキシダーゼのゲルクロマトグラフを表わす。
ビリルビンオキシダーゼ誘導体、未処理のビリルビン
オキシダーゼおよび2,4−ビス（Ｏ−メトキシポリエチ
レングリコール）−６−クロロ−Ｓ−トリアジンのUVス
ペクトルを、0.15M塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩
衝液（pH7.4）を用いて測定した。それぞれのUVスペク
トルを第２図にPB、ＢおよびＰで示す。
実施例２ ポリエチレングリコールで化学修飾されたビリルビンオ
キシダーゼ誘導体の製造 ビリルビンオキシダーゼ〔天野製薬（株）製、分子量
52,000〕600mgを80mlの0.01Mリン酸緩衝液（pH8.0）に
溶解し、ついで1,4−ジアミノブタン1.86gを加えて完全
に溶解した。得られた溶液に１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド2.20gを加え
て、撹拌下に４℃で１晩放置した。反応混合物を0.01M
リン酸緩衝液で平衡化したセフアデツクス（Sephade
x ）Ｇ−25（Pharmacia社製）を充填したカラム（容量
600ml）に注入し、排除限界に溶出される高分子画分の
みを分取した。ここまでの反応物の活性収率は約35％で
あつた。反応物をポリアクリルアミド電気泳動（ゲル濃
度:7.5％、pH8.9）に付したところ、1,4−ジアミノブタ
ンを結合させたビリルビンオキシダーゼは未処理のビリ
ルビンオキシダーゼに対して等電点が塩基性側にずれて
いることが観察された。
上記の反応物（ビリルビンオキシダーゼとして25mg分
相当量）を25mlの0.02Mホウ酸緩衝液（pH10.0）に溶解
し、ついで塩化シアヌル活性化モノメトキシポリエチレ
ングリコール（ポリサイエンス社製、ポリエチレングリ
コールの平均分子量w5,000〕800mgを加えて完全に溶
解し、４℃で１晩インキユベートした。得られた反応混
合物を分画分子量13,000の限外濾過用ミニモジユールに
通し、過剰のポリエチレングリコールに由来する原料物
質を除いたのち、ビリルビンオキシダーゼ誘導体を含む
溶液を凍結乾燥した。ビリルビンオキシダーゼ誘導体の
活性収率は未処理のビリルビンオキシダーゼ基準で約29
％であつた。得られたビリルビンオキシダーゼ誘導体を
ドデシル硫黄ナトリウム−ポラアクリルアミド電気泳動
（ゲル濃度:10％、pH8.9）に付したところ、ビリルビン
オキシダーゼのバンドは全く認められず、ビリルビンオ
キシダーゼのバンドが認められるべき位置よりも高分子
側に幅広い染み（smear）状のバンドが検出された。
実施例３ デキストランで化学修飾されたビリルビンオキシダーゼ
基準誘導体の製造 デキストラン（Pharmacia社製、平均分子量w10,00
0〕2gを水18mlに溶解し、得られた溶液に10％（W/V）過
ヨウ素酸ナトリウム2mlを加えて、撹拌下に４℃で１晩
インキユベートした。反応混合物にヨウ素の褐色が消失
するまで５％亜硫酸水素ナトリウムを滴下した。反応混
合物から低分子化合物の塩を透析により除去したのち、
アルデヒド型の活性化デキストランを含む溶液を凍結乾
燥した。
実施例２におけると同様にして得られた1,4−ジアミ
ノブタンを掛合させたビリルビンオキシダーゼ15mgを15
mlの0.2Mホウ酸緩衝液（pH10.0）に溶解し、ついで上記
で得られたアルデヒド型の活性化デキストラン450mgを
加えて、４℃で１晩インキユベートした。得られた反応
混合物をドデシル硫黄ナトリウム−ポリアクリルアミド
電気泳動（ゲル濃度:10％、pH8.9）に付したところ、ビ
リルビンオキシダーゼのバンドは全く認められず、約7
0,000〜200,000の分子量に相当する位置に幅広い連続し
たバンドが検出された。得られたビリルビンオキシダー
ゼ誘導体の活性収率は1,4−ジアミノブタンを結合させ
たビリルビンオキシダーゼ基準で83.3％であつた。
実施例４ 部分半ブチルエステル化されたスチレンと無水マレイン
酸との共重合体で化学修飾されたビリルビンオキシダー
ゼ誘導体の製造 スチレン−無水マレイン酸共重合体の合成 無水マレイン酸383g（3.9mole）をクメン3.7に加え
て還流下に撹拌した。この溶液にジクミルパーオキシド
16.3g（60mmole）およびスチレン203g（1.95mole）をク
メン1.7に溶解させて得られた溶液を約40分間を要し
て徐々に滴下した。滴下終了後、１時間加熱撹拌を続け
た。得られた反応液を一夜静置し、上澄液を除去したの
ち、容器に付着した粘稠生成物をアセトンに溶解させて
回収した。得られた回収液からアセトンを減圧下に留去
してスチレン−無水マレイン酸共重合体（以下、これを
SMAと略称する）を353g得た。
SMAの分別 上記の方法で得られたSMA120.0gをアセトン３に溶
解し、この溶液にｎ−ヘキサン4.9を撹拌下に約１時
間で滴下した。白濁したアセトンとｎ−ヘキサンとの混
合液を別の容器に移し、この混合液にｎ−ヘキサン9.74
を撹拌下に約1.5時間で滴下した。容器の器壁に付着
したアメ状物をアセトンに溶解させて回収した。得られ
た回収液からアセトンを減圧下に留去したのち、70〜80
℃の温度で一夜真空乾燥を行い、SMAの分別沈殿物を49.
2g得た。
このようにして得られたSAMの分別沈殿物40.0gをアセ
トン１に溶解し、この溶解に表面シラン処理をしたガ
ラスビーズ（平均粒径0.1mm）3.8kgを加えたのち、アセ
トンを蒸発させることによりガラスビーズ表面にSMAを
付着させた。
内径80mm、長さ80cmのカラムに上記のSMAを付着した
ガラスビーズおよびアセトンとｎ−ヘキサンとの混合液
（25℃における容積比が24:76であるもの）1.4を充填
したカラム系の温度を25℃に保ちつつ２種の容積比のア
セトンとｎ−ヘキサンとの混合液〔アセトンとｎ−ヘキ
サンとの25℃における容積比が（ｉ）24:76の混合液1.6
および（ii）37:63の混合液6.0の順で〕、ついでア
セトン3.0の順でカラムの上部より滴下供給した。上
記のアセトンとｎ−ヘキサンとの容積比が37:63の混合
液が溶出する流出分を集めた。この流出分から減圧下に
低沸点物を留去し、ついで70〜80℃の温度で一夜真空乾
燥することにより目的とする分別SMAを31.8g得た。この
もののゲルパーミエーシヨンクロマトグラフイー（以
下、これをGPCと略称する；テトラヒドロフラン溶出
液、ポリスチレン標準）による分析で重量平均分子量
（ｗ）および数平均分子量（ｎ）を求めたところ、
ｗは1340であり、ｎは1220であつた（w/ｎ＝1.
10）。蒸気圧浸透圧計による測定ではｎは1210であつ
た。また得られた分別SMA中の無水マレイン酸含有率を
電位差滴定法により求めたところ、47.3モル％であつ
た。
分別SMAの部分半ブチルエステル化 上記の方法で分別されたSMA10.0g、ｎ−ブチルアルコ
ール2.20g、無水酢酸リチウム0.10gおよびジオキサン20
mlを磁気撹拌子を備えた約40ml容のアンプルに仕込み封
管した。このアンプルの内容物を撹拌下に90℃の温度で
20時間加熱した。得られた反応液の一部を取り、反応液
中の未反応ｎ−ブチルアルコール量をエチルセロソルブ
を内部標準としてガスクロマトグラフイーにより定量
し、仕込みｎ−ブチルアルコールの反応率から共重合体
中に存在していた無水マレイン酸環の半ブチルエステル
化度を算出したところ62％であつた。次に、反応液をジ
オキサン20mlで希釈し、この希釈液をｎ−ヘキサン400m
l中に滴下して再沈殿の操作を行い、得られた沈殿を回
収して約60℃の温度で一夜真空乾燥することにより、目
的とする部分半ブチルエステル化スチレン−無水マレイ
ン酸共重合体（以下、これをBu−SMAと略称する）を11.
5g得た。このものの赤外線吸収スペクトル（FT−IR,KBr
デイスク法）の波数1780cm-1および700cm-1における吸
収強度を基にして、残存無水マレイン酸環の含有率を求
めたところ30.3モル％（Bu−SMA1分子中に含まれる無水
マレイン酸環は平均1.8個存在）であつた。またGPCの測
定から、このもののｗは1530であり、ｎは1440であ
つた。（w/ｎ＝10.6）。
ビリルビンオキシダーゼ誘導体の合成 ビリルビンオキシダーゼ（Sigma社製、分子量52,00
0）50mgを0.1M重炭酸ナトリウム水溶液（pH8.0）1mlに3
7℃で撹拌しながら溶解させた。溶解後、この溶液にBu
−SMA16mg（5mM、反応液中の最終Bu−SMA濃度を意味す
る。以下同様。）を固体粉末のまま徐々に添加し、37℃
で１時間インキユベートした。反応混合物を濾過後、濾
液をセフアデツクス（Sephadex ）Ｇ−100（Pharmacia
社製）を充填したカラム（３×40cm）に注入し、ゲル濾
過した。20mMの重炭酸アンモニウムと炭酸アンモニウム
との混合液を溶出液とし、流出液を280nmで検出し、吸
収部分の溶出液を分取し、限外濾過膜（ザルトリウスSM
145−39）により濃縮し、これを凍結乾燥し、白色粉末4
0mgを得た。ビリルビンオキシダーゼ誘導体の活性収率
は90％であつた。
得られた白色粉末はビリルビンオキシダーゼ１分子当
りBu−SMA（ とのモル比1:1、60％ブチルエステル化、ｗ＝1600）
が平均３〜４分子結合（ビリルビンオキシダーゼのアミ
ノ基とBu−SMAの無水マレイン酸環との反応による結
合）したビリルビンオキシダーゼ誘導体であると判定し
た。
試験例１ ビリルビンオキシダーゼ誘導体の血中半減期 実施例１に記載の方法に準じて調製したビリルビンオ
キシダーゼ誘導体を125Iで放射性標識したビリルビンオ
キシダーゼ誘導体および実施例１で用いたビリルビンオ
キシダーゼと同様の125Iで放射性標識したビリルビンオ
キシダーゼをそれぞれラツト（体重約200g）に500,000c
pm/ラツト量静脈内投与し、それらの血中濃度を血漿中
の放射活性を測定することにより経時的に調べた。それ
らの結果を片対数プロツトしたものを第３図に示す。図
中、黒丸はビリルピルオキシダーゼ誘導体について測定
した結果を示し、白丸はビリルビンオキシダーゼについ
て測定した結果を示す。これらの結果より、ビリルビン
オキシダーゼおよびビリルビンオキシダーゼ誘導体の血
中半減期はそれぞれ2.5分および190分であると判定し
た。
実施例４に記載の方法に準じて調製したビリルビンオ
キシダーゼ誘導体を125Iで放射性標識したビリルビンオ
キシダーゼ誘導体について同様にして血中半減期を求め
た。このビリルビンオキシダーゼ誘導体の血中半減期は
83分であると判定した。
試験例２ ビリルビンオキシダーゼ誘導体の減黄作用 SD系ラツト（雄性、体重約200g）を１群３匹として用
いた。ラツトをエーテル麻酔下に開腹し、胆管結紮切離
術を施行したのち、閉腹した。術後３日の黄疸モデルラ
ツトにビリルビンオキシダーゼ（5mg/ラツト）または実
施例１で得られたビリルビンオキシダーゼ誘導体（5mg/
ラツト）を静脈内投与したのち、経時的に尾静脈より採
血した。得られた血液を遠心分離（15,000rpm、12秒
間）に付して上清を得、その血漿中のビリルビンを測定
した。結果を第４図に示す。図中、黒丸はビリルビンオ
キシダーゼ誘導体投与群についての測定結果を、白丸は
ビリルビンオキシダーゼ投与群についての測定結果をそ
れぞれ示す。
試験例３ ビリルビンオキシダーゼ誘導体の減黄作用 ウイスター系ラツト（雄性、体重約170g）を１群４匹
として用いた。ラツトをエーテル麻酔下に開腹し、胆管
結紮切離術を施工したのち、閉腹した。術後３日の黄疸
モデルラツトにビリルビンオキシダーゼ（0.5mg/ラツ
ト）または実施例２で得られたビリルビンオキシダーゼ
誘導体（0.5mg/ラツト）を静脈内投与したのち、経時的
に心臓または尾静脈より採血した。得られた血液を遠心
分離（3,000rpm、５分間）に付して上清を得、その血漿
中のビリルビンを測定した。結果を第５図に示す。図
中、白丸はビリルビンオキシダーゼ誘導体投与群につい
ての測定結果を、黒丸はビリルビンオキシダーゼ投与群
についての測定結果をそれぞれ示す。
試験例２および試験例３の結果より明らかなとおり、
ポリエチレングリコールで化学修飾されたビリルビンオ
キシダーゼ誘導体は黄疸モデルラツトの血中ビリルビン
濃度を著明に低下させることができ、しかもその状態を
長時間持続させることができる。その反面、ビリルビン
オキシダーゼの減黄効果の程度は僅かであり、しかもそ
の効果は速やかに消失する。
発明の効果 本発明によれば、血中ビリルビンを特異的に分解消去
する作用を有し、かつ極めて長い血中半減期を有するビ
リルビンオキシダーゼ誘導体が提供される。該ビリルビ
ンオキシダーゼ誘導体は黄疸の治療薬として有効であ
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例１で得られたビリルビンオキシダーゼ誘
導体および使用したビリルビンオキシダーゼのゲルクロ
マトグラフである。第２図は実施例１で得られたビリル
ビンオキシダーゼ誘導体ならびに使用したビリルビンオ
キシダーゼおよび2,4−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレ
ングリコール）−６−クロロ−Ｓ−トリアジンンのUVス
ペクトルを示した図である。第３図は試験例１に示す実
施例１で得られたビリルビンオキシダーゼ誘導体および
使用したビリルビンオキシダーゼについて血中濃度を経
時的に測定した結果を片対数プロツトした図である。第
４図は試験例２に示す実施例１で得られたビリルビンオ
キシダーゼ誘導体およびビリルビンオキシダーゼのそれ
ぞれの黄疸モデルラツト投与群における血漿中のビリル
ビン濃度を経時的に測定した値をプロツトした図であ
り、また第５図は試験例３に示す実施例２で得られたビ
リルビンオキシダーゼ誘導体およびビリルビンオキシダ
ーゼのそれぞれの黄疸モデルラツト投与群における血漿
中のビリルビン濃度を経時的に測定した値をプロツトし
た図である。

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ポリエチレングリコールで化学修飾された
    ビリルビンオキシダーゼ誘導体。
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