DE3885735T2

DE3885735T2 - Von einem lebenden körper abgeleitetes protein.

Info

Publication number: DE3885735T2
Application number: DE3885735T
Authority: DE
Inventors: Akira Awaya; Hideo Fukui; Yoshihide Hashimoto; Hiroshi Inoue; Hisako Muramatsu; Takashi Muramatsu
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1987-08-22
Filing date: 1988-08-22
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2008-08-23
Also published as: EP0331743A1; WO1989001947A1; DE3885735D1; JP2690956B2; EP0331743A4; EP0331743B1; JPH03173899A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein (im folgenden als GP68 Protein bezeichnet), das zum Beispiel aus fötalen Mäusegehirnen isoliert wird und ein Molekulargewicht von etwa 68000 und einen isoelektrischen Punkt von 5,4 bis 5,6 aufweist, das für das Wachstum und die Differenzierung von Zellen in dem zerebralen und Nervensystem und das Wachstum und die Entwicklung von anderen Organen und Geweben wesentlich ist, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung oder Regelung von ihnen spielt und auf therapeutische, prophylaktische und diagnostische Mittel für Erkrankungen aufgrund von Anormalität in dem zerebralen und Nervensystem, Insuffizienz beim Wachstum oder Auswüchsen und Entwicklung von jeweiligen Organen oder Geweben und Krebs oder dergleichen anwendbar ist. Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen dieses GP68 Proteins, auf polyklonale Antikörper und monoklonale Antikörper gegen das GP68 Protein, auf Hybridomas, die in der Lage sind, diese monoklonalen Antikörper zu erzeugen, und auf ein Verfahren zum Herstellen dieser Antikörper.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als therapeutische Mittel, prophylaktische oder diagnostische Mittel für die vorgenannten verschiedenartigen Krankheiten anwendbar ist.

Stand der Technik

Bezüglich der Forschung, die die Proteine oder dergleichen betrifft, die in Geweben oder Zellen des zerebralen und Nervensystems vorhanden sind, waren die Fortschritte langsam im Vergleich zu denjenigen, die Proteine oder dergleichen betreffen, die in anderen Organen vorhanden sind: aber bis heute ist schon viel Wissen angesammelt worden.
Beispielsweise sind als die Proteine oder dergleichen, die in den Geweben oder Zellen des zerebralen und Nervensystems vorhanden sind, Tubulin, Mikrotubulin-assoziierte Proteine (MAPs), neurofilamentöses Triplett- und gliales fibrilläres saures Protein (GFA Protein) bekannt (Structure and Function of Cell Skeleton, in Experimental Methods in Biochemistry; eine zweite Reihe, No. 6, Parts 1 und 2 in Vol. 1 und Part 9 in Vol. 2, Japanese Society for Biochemistry).
Untersuchungen über verschiedene Substanzen, die in Zellen des zerebralen und Nervensystems enthalten sind, insbesondere über Proteine, die Funktionen bei der Differenzierung der Zellen des zerebralen und Nervensystems ausüben, und auch Analysen der Funktionen sind äußerst brauchbar, um Proteine oder dergleichen zu finden, die zum Beispiel bei der Entwicklung von neuen therapeutischen oder prophylaktischen Mitteln oder diagnostischen Mitteln für verschiedene Krankheiten in dem zerebralen und Nervensystem anwendbar sind.
Folglich bestand ein hoher Bedarf für Untersuchungen an den verschiedenen Substanzen, die in den Zellen des zerebralen und Nervensystems enthalten sind, und den Analysen ihrer Funktionen.
Unter diesen Umständen fanden die Erfinder der vorliegenden Anmeldung das Vorhandensein eines periodisch-spezifischen Proteins in fötalen Mäusegehirnen als eines der Proteine, die von den Zellen des zerebralen und Nervensystems abgeleitet sind (Japanische Patentoffenlegungsschrift Nr. 60-100597; Noguchi, S. et al., J. Biochem., 96, 881, 1984).
Außerdem wurde das Vorhandensein eines Proteins, das spezifisch in Tumorzellen des menschlichen zerebralen und Nervensystems gefunden wird, durch die Erfinder der vorliegenden Anmeldung in der Beschreibung der Japanischen Patentoffenlegungsschrift Nr. 61-233623 beschrieben.
Andererseits haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung das Vorhandensein eines Proteins beschrieben, das in Tumorzellen des zerebralen und Nervensystems von Mäusen und Ratten gefunden wird, jedoch nicht oder, wenn überhaupt, in einer sehr kleinen Menge in normalen Gehirnzellen von Mäusen oder Ratten gefunden wird (Japanische Patentoffenlegungsschrift 61-275221; Noguchi, S. et al., Cell Structure and Function, 12, 127, 1987).

Beschreibung der Erfindung

Im Hinblick auf die vorstehend beschriebene Wichtigkeit der in den Geweben und Zellen des zerebralen und Nervensystems enthaltenen Proteine haben die Erfinder verschiedene Substanzen wie Proteine ständig untersucht. Die Untersuchung führte zu dem Auffinden eines Proteins (GP68 Protein) mit einem Molekulargewicht von etwa 68000 Daltons, abgeschätzt unter Verwendung von zweidimensionaler Elektrophorese, und einem isoelektrischen Punkt von 5,4 bis 5,6, welches das am stärksten vorherrschende Protein unter den in Gehirnen von Mäuse-Embryos (Föten) gefundenen Proteinen ist und von dem erwartet wird, daß es für therapeutische oder prophylaktische Mittel für Krankheiten aufgrund der Anormalität in dem zerebralen und Nervensystem, für Insuffizienz im Wachstum und der Entwicklung verschiedener Organe und Gewebe, Auswüchsen, Krebs oder dergleichen anwendbar ist.
Da jedoch die Menge des vorhandenen GP68 Proteins extrem gering ist und Verunreinigung mit verschiedenartigen vorhandenen Proteinen unvermeidbar ist, wenn es über ein herkömmliches Verfahren hergestellt wird, wurde es notwendig, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem eine ausreichende Menge hoch-gereinigtes GP68 Protein erhalten werden kann.
Unter diesen Umständen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung intensiv geforscht, um ein effektiveres Verfahren zum Isolieren und Reinigen des GP68 Proteins zu entwickeln, und haben gefunden, daß durch Einführen eines zusätzlichen Schrittes der Affinitätschromatographie mit Lectin, gebunden als ein Träger, die Kontamination von unerwünschten Proteinen effektiv so entfernt wird, daß eine ausreichende Menge hoch-reinen GP68 Proteins wirksam isoliert und gereinigt wird. Außerdem wird durch das Reinigungsverfahren auf der Basis dieses Ergebnisses zum Erhalten einer ausreichenden Menge des GP68 Proteins die Herstellung von Antikörpern zu dem GP68 Protein erfolgreich durchgeführt, und, es wird weiterhin ein wirksames Verfahren zur Isolierung und Reinigung des GP68 Proteins unter Verwendung der Antikörper bereitgestellt, um so die Erfindung zu vervollständigen.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen einer ausreichenden Menge hoch-reinen GP68 Proteins zu schaffen, die zum Untersuchen von Eigenschaften und Funktionen des GP68 Proteins notwendig ist, damit die Wirksamkeit des GP68 Proteins als pharmazeutische Zubereitung für menschliche und tierische Verwendung oder als ein diagnostisches Mittel bestätigt werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine Technologie zu schaffen, die notwendig ist, um verschiedenartige immunologische Messungen zu entwickeln, bei denen das GP68 Protein identifiziert wird, wobei polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen dieses Protein als ein Marker beim Diagnostizieren von Patienten mit z. B. Krankheiten in dem zerebralen und Nervensystem, Insuffizienz im Wachstum und in der Entwicklung verschiedener Organe oder von Geweben, Auswüchsen oder Krebs verwendet wird, und die Antikörper selbst zu liefern und ein Verfahren für ihre Herstellung zu schaffen oder eine pharmazeutische Zusammensetzung zu schaffen, die diese Antikörper als therapeutische und prophylaktische Mittel enthält.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, eine pharmazeutische Zusammensetzung zu schaffen, die das GP68 Protein zur Verhinderung oder für Therapie von Insuffizienz beim Wachstum und Entwicklung verschiedener Organe, einschließlich Organen in dem zerebralen und Nervensystem, enthält.
Die vorliegende Erfindung umfaßt zur Lösung der vorgenannten Aufgaben das GP68 Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 68000 und einem isoelektrischen Punkt von 5,4 bis 5,6, das von fötalen Mäusegehirnen oder dergleichen isoliert wird; ein Verfahren für die Reinigung des GP68 Proteins; polyklonale und monoklonale Antikörper gegen das GP68 Protein; ein Verfahren zur Herstellung von Hybridomas, die diese monoklonalen Antikörper erzeugen können, und ein Verfahren zum Herstellen dieser Antikörper; und eine brauchbare pharmazeutische Zusammensetzung, die das GP68 Protein oder diese Antikörper enthält, als therapeutische, prophylaktische oder diagnostische Mittel für die obengenannten verschiedenartigen Krankheiten.

Beste Form zur Durchführung der Erfindung

Das erste Verfahren zum Isolieren und Reinigen des GP68 Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Verfahrensschritt, bei dem eine Affinitätschromatographie mit einem immobilisierten (gebundenen) Lectin als einem Affinitätsmittel auf einem Träger verwendet wird, in einen Schritt der Isolation des GP68 Proteins eingeführt wird.
Und zwar wird ein Gemisch aus dem GP68 Protein und zum Beispiel verschiedenen unerwünschten Proteinen in Kontakt mit einem Träger gebracht, der immobilisiert Lectin trägt, um das GP68 Protein an dem Träger adsorbieren zu lassen, und dann wird das GP68 Protein selektiv von dem Träger isoliert.
Beispiele für den Träger, der bei diesem Verfahrensschritt verwendet werden kann, umfassen Agarose, Acrylamidgel, verschiedene Toyopearl-Produkte (Tosoh Co., Ltd.) und Zellulose.
Weiterhin umfassen Beispiele für das Lectin, das auf den Träger immobilisiert werden soll, Rizinus-kommunes-Agglutinin (hier im folgenden als RCA bezeichnet), Weizenkeim- Agglutinin (hier im folgenden als WGA bezeichnet) und Concanavalin A. Hiervon wird vorzugsweise RCA verwendet.
Die Fixierung (Immobilisierung) des Lectins an dem Träger kann wahlweise durch ein übliches Verfahren durchgeführt werden, das für die Art des zu verwendenden Trägers und Lectins geeignet ist.
Eine Affinitätschromatographie mit der Anwendung der vorgenannten Materialien kann nach Bedarf durch ein geeignet ausgewähltes Verfahren durchgeführt werden, wie eine Säulenchromatographie, bei der ein Lectin tragender Träger in eine Säule mit einer geeigneten Größe und Form gefüllt ist, oder durch ein Chargen-Verfahren, bei dem ein Lectin tragender Träger mit einer zu behandelnden Lösung oder einer Lösung für Eluierung zusammengemischt wird.
Bei der Anwendung der vorgenannten Affinitätschromatographie mit Lectin ist es möglich, das GP68 Protein zu isolieren und zu reinigen, indem sowohl Lösungen, die das GP68 Protein enthalten, das in verschiedenen Schritten der Reinigung erhalten worden ist, als auch Extraktfluide von verschiedenen Geweben oder Zellen von fötalen Mäusegehirnen oder dergleichen behandelt werden.
Wenn das GP68 Protein von Mäusegeweben oder -zellen isoliert wird, wird die Extraktion durch Homogenisieren der Mäusegewebe oder -zellen über eine bestimmte Zeitperiode, zum Beispiel in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 2% Triton X-100 (Produkt von Rohm und Haas Co.), 0,005% Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 0,15 M NaCl enthält, und nachfolgendes Zentrifugieren des entstehenden Roh-Extrakts (zum Beispiel bei 40000 Umdrehungen pro Minute), um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten, durchgeführt.
Beispiele für die Mäusegewebe oder -zellen, die in dem vorgenannten Fall verwendet werden können, umfassen solche, die in der Periode von der Befruchtung bis zu einer Woche nach der Geburt, z. B. Embryos (Föten) bei 11-19 Tagen nach der Befruchtung, abgenommen werden, oder einzelne Organe und Gewebe von Mäusen bei einem Alter von einer Woche, wie Gehirn, Nervengewebe, Darmtrakt, weiches Muskelgewebe, Leber, Herz, Niere, Lunge oder Milz. Wenn die Isolierung durch Extraktion bei einer hohen Konzentration durchgeführt werden soll, werden fötale Mäusegehirne oder Gehirne von neugeborenen Mäusen mit einem Alter von bis zu etwa einer Woche bevorzugt verwendet.
Das auf dem Lectin tragenden Träger adsorbierte GP68 Protein wird eluiert, wobei eine Lösung zum Eluieren verwendet wird, die Bestandteile umfaßt, die in der Lage sind, GP68 Protein selektiv zu eluieren, um so das GP68 Protein von anderen Proteinen zu trennen.
Die Lösung zum Eluieren wird geeigneterweise gemäß der Art des zu verwendenden Lectins und des Trägers ausgewählt. Zum Beispiel sind Lösungen von 0,01 bis 0,2 M Lactose, N-Acetylglucosamin, alpha-Methylmannosid und Sialsäure anwendbar.
Das GP68 Protein in jeder eluierten Fraktion wird durch Messen eines Molekulargewichts und eines isoelektrischen Punktes bestimmt.
Das GP68 Protein bei der vorliegenden Erfindung hat ein Molekulargewicht von etwa 68000 (68000 ± 2000), abgeschätzt durch die zweite Elektrophorese, wie es noch in Beispiel 1 beschrieben wird, und einen isoelektrischen Punkt von 5,4 bis 5,6.
Die das GP68 Protein enthaltende Fraktion, die durch das obenbeschriebene Verfahren fraktioniert worden ist, wird durch verschiedene Mittel wie Gel-Filtrierung behandelt, wie sie in verschiedenartigen anderen Reinigungsverfahren angewendet werden, so daß hoch-gereinigtes GP68 Protein mit gutem Wirkungsgrad erhalten werden kann.
Bei der Gel-Filtrierung kann irgendein Verfahren, das üblicherweise bei Protein-Reinigungen angewendet wird, angewendet werden.
Das so erhaltene hoch-gereinigte GP68 Protein hat eine Aminosäure-Zusammensetzung und eine Zucker-Zusammensetzung, wie es nachfolgend in Beispiel 1 beschrieben wird, und die Aminosäure-Sequenz des Oligopeptids in der Amino- Endregion ist fast identisch mit der von Mäuse-alpha- Fötoprotein in der gleichen Region (Michael B. Gorin et al., J. Biol. Chem. , 256, 1954, 1981). Weiterhin war der Zuckergehalt 12,7 Gew.-%.
Das GP68 Protein ist brauchbar als ein wirksamer Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammensetzung als ein Medikament zur Verhinderung oder zur Behandlung von Insuffizienz bei Wachstum und Entwicklung von verschiedenen Organen, einschließlich denjenigen in dem zerebralen und Nervensystem.
Weiterhin kann das vorgenannte GP68 Protein zur Immunisierung von Tieren verwendet werden, um Antikörper gegen das GP68 Protein herzustellen.
Spezieller gesagt, Tiere wie Ratten, Kaninchen, Ziegen, Pferde oder Rindvieh werden immunisiert mit dem GP68 Protein, und polyklonale Antikörper gegen das GP68 Protein werden in den Seren der immunisierten Tiere erhalten.
Immunisierung wird auf eine Weise durchgeführt, die an sich bekannt ist, wie durch Injektion des GP68 Proteins in einer geeigneten Menge mit einem geeigneten Adjuvans in den Rücken, in die Fußpfoten, intraperitoneal oder intravaskulär. Antiseren werden von den Tieren 7-200 Tage nach der Immunisierung aufgesammelt, um gewünschte polyklonale Antikörper zu erhalten.
Es ist außerdem möglich, den Antikörper-Titer durch zusätzliche Immunisierungen in geeigneten Intervallen nach der ersten Immunisierung zu erhöhen.
Andererseits werden Milzzellen von Tieren, die auf die vorstehend beschriebene Art immunisiert worden sind, oder von Balb/c Mäusen mit Myelom-Zellen verschmolzen, um so Hybridomas zu erhalten, die in der Lage sind, monoklonale Antikörper gegen das GP68 Protein zu erzeugen.
Beispiele für die Myelom-Zellinien, die verwendet werden können, umfassen Myelom-Zellinien vom Mäuse-Ursprung wie Maus NS-1, X 63-Ag8, MPC-11 und SP-2/0 und Ratten 210.RCY.Ag1.2.3 Zellinie.
Seren von Tieren nach 10-80 Tagen nach der ersten Immunisierung mit dem GP68 Protein werden am stärksten bevorzugt verwendet.
Weiterhin kann die Verschmelzung (Fusion) auf eine Weise durchgeführt werden, die per se bekannt ist. Erhaltene Hybridomas werden gezüchtet, zum Beispiel in einer RPMI- Medium Lösung (Nissui Pharmaceutical Co. Ltd., Code 05911), die 5-20% fötales Kalbsserum und HAT enthält, dann in einer RPMI-Medium Lösung, die HT enthält, und schließlich in einem Medium wie einem RPMI Medium für Zellkultur, so daß gewünschte monoklonale Antikörper gegen das GP68 Protein ausgeschieden und in dem Medium angesammelt werden. Die monoklonalen Antikörper werden auf diese Weise erzeugt.
Alternativ dazu werden die Hybridomas in die Bauchhöhle von nackten Ratten oder immununterdrückten Ratten transplantiert, um Aszites-Tumor auszulösen, so daß die monoklonalen Antikörper in dem Aszites erzeugt und aufgesammelt werden, und auf diese Weise werden die monoklonalen Antikörper hergestellt.
Die so erhaltenen polyklonalen und monoklonalen Antikörper sind brauchbar, wie vorstehend erwähnt, als ein Bestandteil eines Reaktionsmittels, um das GP68 Protein als ein Marker beim Diagnostizieren von Patienten mit Krankheiten wie Insuffizienz im Wachstum oder in der Entwicklung von entsprechenden Organen oder Geweben oder Wucherungen (Auswüchsen) oder Krebs zu identifizieren, worin auch Krankheiten in dem zerebralen und Nervensystem eingeschlossen sind, wobei verschiedenartige immunologische Messungen angewendet werden. Sie sind weiterhin brauchbar für die Entwicklung von therapeutischen und prophylaktischen Mitteln, die, diese Antikörper enthalten. Zum Beispiel wurde gezeigt, daß, wenn Krebsgewebe von verschiedenen Krebspatienten durch ein Fluoreszenz-Färbeverfahren unter Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gegen das GP68 Protein gefärbt werden, werden Gewebe und Zellen nur an der Stelle der Krebsgewebe durch die Antikörper der vorliegenden Erfindung gefärbt. Somit ist es offensichtlich, daß Anti-GP68 Protein-Antikörper als diagnostisches Mittel einsetzbar sind.
Wenn weiterhin Gel-Präzipitin-Reaktionen des GP68 Proteins mit einem Anti-GP68 Protein polyklonalen Kaninchen (Ratten) Antiserum und mit einem Anti-Mäuse-alpha-Fötoprotein polyklonalen Kaninchen Antiserum unabhängig durchgeführt wurden, wobei das Ouchterlony-Verfahren angewendet wurde, zeigten die beiden Antiseren die gleichen Präzipitin- Reaktionen gegen das GP68 Protein, was wiederum nahelegte, daß das GP68 Protein und das Mäuse-alpha-Fötoprotein bemerkenswert homolog waren.
Andererseits zeigte ein Kaninchen Antiserum gegen Human- Placenta alpha-Fötoprotein (Produkt von Hoechst) bei der Gel-Präzipitin-Reaktion, die ähnlich nach der Ouchterlony- Methode durchgeführt wurde, anders als die Reaktion mit dem Kaninchen-Antiserum gegen das GP68 Protein keine Präzipitin-Reaktion mit dem GP68 Protein. In der Tat, wenn das Gewebe Antigen von einem menschlichen Krebspatienten unter Anwendung des Vectastain ABC-Verfahren oder eines Fluoreszenz-Antikörper-Verfahrens gefärbt wurde, dann erschien eine unterschiedliche Differenz in der Mode der Reaktion zwischen den zwei Seren (Tabellen 1A und 1B). Es wurde weiterhin gezeigt, daß das Anti-GP68 Protein- Antiserum ein breiteres Spektrum hatte und intensiver reagierte als das Anti-Human-alpha-Fötoprotein-Antiserum.
Bei der Anwendung eines Affinitätschromatographie-Trägers, der unter Verwendung so erhaltener Antikörper aufgebaut war, wird die zweite Affinitätschromatographie gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt, um so das GP68 Protein zu isolieren und zu reinigen.
Beispiele für den zu verwendenden Träger umfassen Agarose, Sephadex-Produkte, Zellulose-Produkte wie Br-CN-aktivierte Sepharose 4B, Afigel 10 (Bio-Rad Laboratories) und verschiedene Toyopearl-Produkte. Die Bindung an den Träger wird durchgeführt, indem Antikörper in einer geeigneten Pufferlösung oder dergleichen gelöst werden und diese mit dem Träger bei 4ºC über einige Stunden bis über Nacht gemischt werden.
Wenn die Affinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern gegen das GP68 Protein angewendet wird, kann die Eluierung des adsorbierten GP68 Proteins unter Verwendung einer sauren Pufferlösung, eines alkalischen Puffers oder einer neutralen Pufferlösung, die eine hohe Konzentration Salz enthält, durchgeführt werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das GP68 Protein oder Anti-GP68 Protein-Antikörper als einen wirksamen Bestandteil enthält, wird durch Mischen mit verschiedenen geeigneten Zusatzstoffen hergestellt. Beispiele für diese Zusatzstoffe umfassen nicht-ionische oberflächenaktive Mittel wie Polysorbate, z. B. Tween 80, Albumin, Gelatine, Dextran, Polyoxyäthylen-gehärtetes Castoröl, Fettsäurealkoholester, Polyglycoläther, Phosphat-gepufferte Salzlösung, verschiedene Aminosäuren, Zucker wie Dextrose, Mannitol, Glucose, Xylitol, Lactose, Sucrose, Galactose, Fructose, Maltose, Saccharose und Sorbitol. Sie können allein oder in Kombination verwendet werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird in einer Form als Tablette, Kapsel, Pulver, Granulat, Pastille, in eine Arzneikapsel eingebettete Packung, Elixier, Emulsion, Lösung, Sirup, Suspension, Aerosol, Salbe, aseptische Spritze, geformter Breiumschlag, Band, weiche oder harte Gelatinekapsel, Suppositorium oder aseptisch verpackter Pulver verwendet.
Außerdem kann eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung als pharmazeutisch annehmbare Zusatzstoffe für Träger oder dergleichen neben den vorgenannten Beispielen verschiedene Substanzen enthalten, die entsprechend als ein Füllstoff, ein Bindungsmittel, ein Schmiermittel, ein Feuchthaltemittel, ein Zerfallmittel, ein Emulgiermittel, ein Suspensionsmittel, ein Verdünnungsmittel, ein Süßmacher oder ein Aromatisiermittel wirken.
Beispiele für die Zusatzstoffe umfassen Maisstärke, kristallisierte Zellulose, Gummiarabikum, Kalziumphosphat, Alginat, Kalziumsilikat, feine Kristallzellulose, Polyvinylpyrrolidon, Tragacanthaharz, Gelatine, Sirup, Methylzellulose, Carboxymethylzellulose, Methylhydroxybenzoatester, Propyl-hydroxybenzoatester, Talkum, Magnesiumstearat, inaktive Polymere, Wasser und Mineralöle.
Weiterhin kann eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung derart hergestellt werden, daß ein aktiver Bestandteil mit einer gewünschten Rate nach der Verabreichung freigegeben wird.
In dem Fall, wenn eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung oral verabreicht wird, wird zum Beispiel das GP68 Protein oder der Anti-GP68 Protein-Antikörper mit dem vorgenannten Träger oder dergleichen gemischt, um das Mittel in der Form einer Tablette oder einer Kapsel herzustellen.
Wenn eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung parenteral verabreicht wird, das heißt durch intravenöses Eintropfen oder Injektion oder durch intramuskuläre Injektion, kann zum Beispiel eine wirksame Menge des GP68 Proteins oder der Anti-GP68-Protein-Antikörper in einer Lösung wie einer wäßrigen Glucoselösung, isotonischen Salzlösung, sterilem Wasser oder dergleichen gelöst werden, um sie in Fläschchen oder Ampullen abzufüllen.
Wenn das GP68 Protein oder die Anti-GP68 Protein-Antikörper in einer Phiolen oder Ampullenform verwendet werden, können sie in Phiolen oder Ampullen gefriergetrocknet werden.
Die Konzentration des GP68 Proteins oder der Anti-GP68 Protein-Antikörper in einer pharmazeutischen Zusammensetzung kann gemäß der Erfindung geeignet gewählt werden. Beispielsweise kann eine Menge von 0,1 Mikrogramm bis 50 mg pro Dosis Einheit verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird im einzelnen durch Beispiele und Experiment-Beispiele im folgenden erläutert. Diese Beispiele sollen jedoch nur die Erfindung erläutern und nicht den Umfang der Erfindung einschränken.

Beispiel 1

Einhundert Stücke von fötalen ICR Mäusegehirnen (bei 13 Tagen nach Befruchtung) wurden in 100 ml 10 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,6), der 2% Triton X-100, 0,005% PMSF und 0,15 M Natriumchlorid enthielt, homogenisiert und einem Extraktionsverfahren bei 4ºC über 30 Minuten unterworfen. Der erhaltene Roh-Extrakt wurde mit hoher Geschwindigkeit von 120000 · g über 1 Stunde zentrifugiert, und die entstandene überstehende Flüssigkeit wurde auf eine RCA- Agarose-Affinitätschromatographie-Säule (4 ml) aufgebracht, die wie später beschrieben hergestellt war. Die Säule wurde mit 40 ml der vorgenannten Pufferlösung gewaschen.

Aufbringung auf die Säule:

RCA-Agarose (EY Laboratories) wurde in eine Säule mit 4 ml Volumen eingefüllt und dann mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 1% Triton X-100 und 0,005% PMSF enthielt, äquilibriert.
Danach wurde das Eluieren mit 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), der 1% Triton X-100 und 0,005% PMSF, ergänzt mit 0,1 M Lactose, enthielt, so durchgeführt, daß eine Eluatlösung erhalten wurde.
Ein Teil des Eluats wurde vollständig dialysiert, um eine gereinigte Proteinlösung zu erhalten, und gefriergetrocknet, um eine Protein-Zubereitung zu erhalten.
Die Protein-Ausbeute der Protein-Zubereitung war 2,0 mg pro 100 Stücke der fötalen Mäusegehirne.
Der Proteingehalt wurde durch das Lowry Verfahren bestimmt, wobei Rinderserumalbumin (Sigma) als ein Bezugsstandard verwendet wurde. Die Proteingehalt-Bestimmungen wurden in den unten beschriebenen Verfahren auf ähnliche Weise durchgeführt.
Andererseits wurde ein verbleibender Anteil der vorgenannten Eluatlösung getrennt mit einer Zugabe von Äthanol bis zu einer Endkonzentration von 80 bis 90% ausgefällt, um ein Äthanol-ausgefälltes Protein zu erhalten, um so eine Protein-Zubereitung zu erhalten.
Ein Teil der erhaltenen Protein-Zubereitung wurde der zweidimensionalen Elektrophorese unterworfen, wie es unten beschrieben ist, um das Molekulargewicht und den isoelektrischen Punkt zu bestimmen. Als ein Ergebnis wurde ausschließlich ein Protein mit einem Molekulargewicht von näherungsweise 68000 und einem isoelektrischen Punkt von 5,4 bis 5,6 nachgewiesen.
Die Bezugs-Protein-Standards, die bei der Molekulargewichtsbestimmung verwendet wurden, waren Thyroglobulin (Molekulargewicht 330000), Lactoferrin (Molekulargewicht 88000), Rinderserumalbumin (Molekulargewicht 67000), Eiweißalbumin (Molekulargewicht 43000) und Aldolase (Molekulargewicht 34000), die alle Produkte von Sigma waren.

Bedingungen für zweidimensionale Elektrophorese:

a) Eindimensionale Elektrophorese

Ein für die Elektrophorese zu verwendendes Medium umfaßte 2,76 g Harnstoff, 0,67 ml 30% Acrylamid, 1 ml 10% NP-40, 25 ml Ampholin (pH 3,5 bis 10), 10 Mikroliter 10% Ammoniumpersulfat, 0,14 ml 5% Tetramethyläthylendiamin (TEMED, Nakarai Chemicals, Ltd.) und 0,91 ml Wasser. Eine Probe wurde der Elektrophorese unterworfen, wobei 10 mM H&sub3;PO&sub4; für eine Kathodenlösung und 20 mM NaOH als eine Anodenlösung verwendet wurde, und zwar bei 400 Volt über 13 Stunden und dann bei 800 Volt über 1 Stunde.

b) Zweidimensionale Elektrophorese

Nach der eindimensionalen Elektrophorese wurde das Gel mit Natriumdodecylsulfat-Probepuffer (10% Glycerin, 5% beta-Mercaptoäthanol, 23% SDS, 62,5 mM Tris-HCl-Puffer (pH 6,8)) äquilibriert und der zweidimensionalen Elektrophorese auf 7,5% Acrylamid-Plattengel (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS) bei 120 Volt für 4 Stunden unterworfen.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel 1 Stunde in einer Lösung, die 0,05% Coomassie-Blau, 10% Methylalkohol und 10% Essigsäure enthielt, eingefärbt, mit 10% Methylalkohol und danach mit 10% Essigsäure behandelt und dann wurden die erhaltenen Flecke jeweils gemessen.
Dann wurde der Zuckergehalt der vorher erhaltenen gefriergetrockneten Zubereitungen (1 mg Protein) von dem GP68 Protein bestimmt, wobei Gasflüssigkeits-Chromatographie nach Methylierungsanalyse durch das Verfahren von Bhatti et al. verwendet wurde,
Andererseits wurde der Sialsäuregehalt der gefriergetrockneten Zubereitung durch Thiobarbitursäure-Reaktion unter Verwendung von N-Acetylneuraminsäure als einem Standard nach Hydrolyse-Reaktion mit 0,05 M H&sub2;SO&sub4; bei 80ºC über 30 Minuten bestimmt.
Weiterhin wurde ein Teil der gefriergetrockneten Zubereitung (1 mg Protein) mit 4 M HCl bei 100ºC über 4 Stunden hydrolysiert, und das erhaltene Hydrolysat wurde auf Hexosamin analysiert, wobei ein Hitachi Aminosäure-Analysiergerät Modell 853 verwendet wurde. Ein weiterer Teil der gefriergetrockneten Zubereitung (98 Mikrogramm Protein) wurde auf ähnliche Weise mit 6 M HCl bei 105ºC über 24 Stunden hydrolysiert und auf Aminosäure-Zusammensetzung analysiert, wobei der gleiche Analysator verwendet wurde.
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Zuckerzusammensetzung (Molverhältnis) Galactose 1
Mannose 1,42
Fructose 0,32
Glucose 0,07
Glucosamin 1,06
Galactosamin 0,10
Sialsäure 0,18
Aminosäurezusammensetzung (Molverhältnis): Aspartinsäure 43,2
Threonin 26,1
Serin 35,8
Glutaminsäure 58,4
Glycin 30,2
Alanin 30,6
Cystein 6,9
Valin 23,3
Methionin 5,2
Isoleucin 9,5
Leucin 48,4
Tyrosin 8,6
Phenylalanin 17,4
Lysin 26,3
Ammonium 90,1
Histidin 10,6
Arginin 18,2
Prolin 26,5
Die vorgenannte gefriergetrocknete Zubereitung von dem GP68 Protein (105 Mikrogramm) wurde in 25 Mikrolitern Wasser gelöst, und ein Anteil von 17 Mikrolitern (71,4 Mikrogramm) wurde auf einen Peptid-Sequenzer (Applied Science, Modell 477A) aufgebracht, um die Aminosäure-Sequenz des N-Endes zu analysieren. Als Ergebnis zeigte sich die folgende Aminosäure-Sequenz: Aminosäure-Sequenz des N-Endes von dem GP68 Protein:
Leu-His-Glu-Asn-Glu-Phe-Gly-Ile-Ala-Ser-Thr- Leu-Asp-Ser-X-Gln-Y-Lys-Thr-Glu-Lys- (X und Y waren nicht bestätigt).
Weiterhin zur Referenz: Die Aminosäure-Sequenz des N-Endes von Mäuse-alpha-Fötoprotein ist folgendermaßen; Michael B. Gorin et al., J.Biol. Chem. 256, 1954, (1981): Aminosäure-Sequenz des N-Endes von Mäuse-alpha-Fötoprotein:
Leu-His-Glu-Asn-Glu-Phe-Gly-Ile-Ala-Ser-Thr- Leu-Asp-Ser-Ser-Gln-Cys-Val-Thr-Glu-Lys- Die Präzipitin-Reaktionen in Gel wurden nach dem Ouchterlony-Verfahren in bezug auf das GP68 Protein (die vorgenannte gefriergetrocknete Zubereitung) mit einem Anti-Mäuse GP68 Protein polyklonalem Kaninchen-Antiserum (hergestellt in Beispiel 2) und mit Anti-Mäuse-alpha- Fötoprotein polyklonalem Kaninchen-Antiserum (Produkt von Hoechst) unabhängig durchgeführt. Beide Antiseren zeigten die ähnlichen Präzipitin-Reaktionen gegen das GP68 Protein.

Beispiel 2

Kaninchen (Neuseeland Weiß) wurden an den Fußpfoten durch Injektion von 100 Mikrogramm einer Mischung aus der gefriergetrockneten Zubereitung von dem GP68 Protein und der Äthanol-ausgefällten Zubereitung (beide in Beispiel 1 erhalten) bei einem Verhältnis von 1 : 1, gelöst in vollständigem Freund-Adjuvans (Nakarai Chemicals, Ltd.) immunisiert.
Zehn Tage nach Beendigung der Immunisierung wurde das gesamte Blut aufgesammelt, und das Serum wurde hergestellt. Das erhaltene Serum wurde durch eine Afigel 10 (Bio Rad Laboratories Co.) Säule laufen gelassen, und das entstandene Eluat wurde weiterhin durch eine Säule, die mit Afigel 10 gefüllt war, laufen gelassen, das mit Natriumbicarbonat-Puff er (pH 8,0), der 1 mg/ml von dem GP68 Protein enthielt, in Berührung kommen konnte. Daraufhin wurden die adsorbierten Antikörper durch Eluieren mit einer 3 M Kaliumthiocyanat-Lösung gereinigt. Die Reinigungsverfahren wurden mehrere Male wiederholt, um eine ausreichende Menge Antikörper-Lösung herzustellen.
Die eluierte Fraktion, die die Antikörper enthielt, wurde vollständig durchdialysiert. Durch Immunblotten-Analyse bei einer Protein-Konzentration von 20 Mikrogramm/ml wurde bestätigt, daß polyklonale Antikörper gegen das GP68 Protein in der Fraktion enthalten waren.

Beispiel 3

Ziegen wurden immunisiert durch intrakutane und subkutane Injektion von 500 Mikrogramm eines Gemisches der gefriergetrockneten Zubereitung von dem GP68 Protein und der Äthanol-ausgefällten Zubereitung (beide in Beispiel 1 erhalten) bei einem Verhältnis von 1 : 1, gelöst in vollständigem Freund-Adjuvans, in 2 wöchigen Intervallen insgesamt viermal. Das Blut wurde bei den Intervallen aufgesammelt.
Das gesamte Blut wurde 5 Monate nach der Immunisierung aufgesammelt, als der Titer ausreichend angestiegen war. Das erhaltene Serum wurde unter Verwendung von Säulen auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, gereinigt, um so polyklonale Antikörper gegen das GP68 Protein aufzusammeln. Eine Analyse eines Teils der Antikörper zeigte, daß die Antikörper spezifisch zu dem GP68 Protein waren.

Beispiel 4

Polyklonale Antikörper wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 mit der Ausnahme aufgesammelt, daß die Tiere, die immunisiert wurden, Pferde waren.

Beispiel 5

Polyklonale Antikörper wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 mit der Ausnahme aufgesammelt, daß die Tiere, die immunisiert wurden, Rinder waren.

Beispiel 6

Wistar-Ratten (5 bis 6 Wochen alt) wurden durch Injektion eines Gemisches von der gefriergetrockneten Zubereitung des GP68 Proteins und der Äthanol-ausgefällten Zubereitung (beide in Beispiel 1 erhalten) bei einem Verhältnis von 1 : 1 in den unten angegebenen Mengen in zweiwöchigen Intervallen immunisiert.
1. (subkutan) 50 Mikrogramm
2. (subkutan) 50 Mikrogramm
3. (intraperitoneal) 100 Mikrogramm
4. (intraperitoneal) 100 Mikrogramm
Milzzellen (1 · 10&sup8;), die drei Tage nach der endgültigen Immunisierung aufgesammelt worden waren, wurden einer Fusion mit 2 · 10&sup7; Zellen von der Mäuse NS-1 Zellinie, die als Myelom-Zellen verwendet wurden, in Anwesenheit von Polyäthylenglycol 400 nach dem Verfahren von Koehler et al. unterworfen.
Polyäthylenglycol wurde entfernt, und die entstandenen Hybridomas wurden in 200 ml HAT-Medium (RPMI 1640 Medium, das HAT und 10% fötales Kälberserum (FCS) enthielt) suspendiert. Die Suspension wurde auf eine 96-Löcher Platte (Falcon) aufgebracht, wobei 1 · 10&sup5; Zellen pro Loch verteilt wurden.
Dann wurde Inkubation bei 37ºC über eine Woche bis 10 Tage fortgeführt.
Alle 3 Tage nach 10 Tagen Inkubation wurde die Hälfte eines Teils der überstehenden Flüssigkeit der Zellkultur von einzelnen Löchern dem ELISA-Test (enzyme linked immuno sorbent assay) nach dem Vectastain ABC-Verfahren unterworfen, wobei das Avidin-biotinisierte Peroxidase-Komplexverfahren (Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd.) angewendet wurde, um positive Löcher zu erfassen. Eine Lösung aus frischem Medium wurde zu den Löchern hinzugegeben und die Inkubation wurde weiter fortgeführt. Weiterhin wurden gewünschte Klone erhalten, indem die Zellen in positiven Löchern geklont wurden, wobei ein begrenzendes Verdünnungsverfahren angewendet wurde.
Die in dem ELISA verwendeten Testplatten 2095 (Falcon) wurden in einer üblichen Weise mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) in Kontakt gebracht, in der das Äthanol-ausgefällte GP68 Protein, das in Beispiel 1 erhalten worden war, so gelöst wurde, daß 100 ng jeweils von dem GP68 Protein an den einzelnen Löchern adsorbiert war.
Als Ergebnis wurden insgesamt 8 positive Klone erhalten.
Von diesen Klonen wurden zwei Klone (EBR 3, EBR 7) unabhängig verwendet, um EBR 3-1 monoklonale Antikörper und EBR 7-1 monoklonale Antikörper auf die folgende Weise zu erhalten:
Die Klone EBR 3 und EBR 7 wurden nach dem Budapester Vertrag bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture, Japan 305) hinterlegt.
Die Hinterlegung wurde am 18.August 1988 unter den Hinterlegungsnummern FERM BP-2002 für Klon EBR 3 und FERM BP-2003 für Klon EBR 7 vorgenommen.

Beispiel 7

Monoklonale Antikörper gegen das GP68 Protein wurden unter Verwendung der Hybridomas (Klone EBR 3 und EBR 7) hergestellt, die in Beispiel 6 erhalten worden waren.
Zuerst wurden die Klone EBR 3 und EBR 7 unabhängig in RPMI 1640 Medium in 10 cm großen Petri-Schalen inkubiert.
Präzipitate (Niederschläge) wurden von den überstehenden Flüssigkeiten in jeweilen Kulturen durch Ausfällung mit 50% Ammoniumsulfat erhalten. Die Präzipitate wurden in 1 bis 2 ml PBS gelöst und gegen PBS 3 Tage dialysiert. Nach der Dialyse wurden die Lösungen unabhängig auf Sephadex G-250 Säulen aufgebracht, um gereinigte EBR 3-1 monoklonale Antikörper und gereinigte EBR 7-1 monoklonale Antikörper zu erhalten.
Weiterhin wurden 8 Wochen alte nackte Ratten, die intraperitoneal mit 0,5 ml/Ratte 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan injiziert worden waren und 1 bis 2 Wochen gezüchtet worden waren (Pristan-Behandlung), unabhängig intraperitoneal mit 1 · 10 &sup7;/Ratte mit Klon EBR 3 oder Klon EBR 7 injiziert, welche beide in Beispiel 6 erhalten worden waren. Das im Aszites Angesammelte (50 ml/Ratte) wurde von den Ratten nach 10 bis 21 Tagen nach der Injektion entfernt und zentrifugiert, um feste Substanzen zu entfernen.
Die erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten wurden mit 50% Ammoniumsulfat und dann mit 40% Ammoniumsulfat ausgesalzt. Die entstandenen überstehenden Flüssigkeiten wurden gegen PBS (pH 7,2) 3 Tage dialysiert.
Die erhaltenen rohen monoklonalen Antikörper wurden auf eine Sephadex G-200 Säule aufgebracht. Die Eluierung wurde mit PBS so durchgeführt, daß Lösungen gewonnen wurden, die zwei Arten von gereinigten monoklonalen Antikörpern enthielten (EBR 3-2 monoklonaler Antikörper und EBR 7-2 monoklonaler Antikörper).

Beispiel 8

Gereinigte monoklonale Antikörper (EBR 3-3 monoklonaler Antikörper und EBR 7-3 monoklonaler Antikörper) waren durch Wiederholen der Verfahrensschritte ähnlich denjenigen in Beispiel 6 und Beispiel 7 erhältlich mit der Ausnahme, daß Balb/c Mäuse anstelle der Wistar Ratten für Hybridoma-Herstellung verwendet wurden.

Beispiel 9

Nach einem üblichen Verfahren wurde eine Säule mit immobilisierten polyklonalen Antikörpern hergestellt, indem Afigel 10 mit der Pufferlösung von polyklonalen Antikörpern, die in Beispiel 2 erhalten worden waren, bei 4ºC über etwa 24 Stunden in Kontakt gebracht wurden.
Der in Beispiel 1 erhaltene fötale Mäusegehirn-Extrakt wurde mit dieser Säule behandelt. Das GP68 Protein wurde so wirksam isoliert und gereinigt.

Beispiel 10

Ein fötaler Mäusegehirn-Extrakt wurde auf die gleiche Weise behandelt, wie es in Beispiel 9 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß die gereinigten monoklonalen Antikörper (EBR 3-1 monoklonale Antikörper und EBR 7-1 monoklonale Antikörper) verwendet wurden. Das GP68 Protein wurde so wirksam isoliert und gereinigt.

Beispiel 11

Die in Beispiel 1 erhaltene gereinigte Proteinlösung (die nach Dialyse von dem Eluat von der RCA Agarose-Säule erhalten worden war) wurde in Phiolen gegeben (100 Mikrogramm des GP68 Proteins in eine Phiole) und gefriergetrocknet. Dann wurde eine Salzlösung von 1,0 ml, ergänzt mit 0,001 bis 0,1% Tween 80, zu diesen Phiolen hinzugegeben, und die Phiolen wurden verschlossen. Auf diese Weise wurde eine pharmazeutische Zubereitung erhalten, die das GP68 Protein enthielt.

Beispiel 12

Eine pharmazeutische Zubereitung, die das GP68 Protein enthielt, wurde auf die ,gleiche Weise erhalten, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist, jedoch mit der Ausnahme, daß eine Salzlösung verwendet wurde, die mit 0,001 bis 10% Albumin anstelle von Tween 80 ergänzt worden war.

Beispiel 13

Eine pharmazeutische Zubereitung, die das GP68 Protein enthielt, wurde auf die gleiche Weise erhalten, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist, jedoch mit der Ausnahme, daß eine Salzlösung verwendet wurde, die mit 0,01 bis 5% Glucose anstelle von Tween 80 ergänzt worden war.

Beispiel 14

Eine pharmazeutische Zubereitung, die das GP68 Protein enthielt, wurde auf die gleiche Weise erhalten, wie es in Beispiel 11 beschrieben ist, jedoch mit der Ausnahme, daß eine Salzlösung verwendet wurde, die mit 0,01 bis 5% Mannitol anstelle von Tween 80 ergänzt worden war.

Beispiele 15a bis 15d

Eine pharmazeutische Zubereitung, die das GP68 Protein enthielt, wurde auf die gleiche Weise erhalten, wie es in den Beispielen 11 bis 14 beschrieben ist, jedoch mit der Ausnahme, daß die Menge des GP68 Proteins, die in einer Phiole gefriergetrocknet werden sollte, 1 mg war.

Beispiel 16

Lösungen, die unabhängig voneinander die zwei gereinigten monoklonalen Antikörper enthielten, die in Beispiel 7 erhalten worden waren, wurden in Phiolen gegeben (100 Mikrogramm Anti-GP68 Protein monoklonale Antikörper in eine Phiole) und gefriergetrocknet. Eine Salzlösung von 1,0 ml, ergänzt mit 0,001 bis 0,1% Tween 80, wurde dann zu den jeweiligen Phiolen hinzugegeben, und die Phiolen wurden verschlossen. Eine pharmazeutische Zubereitung, die Anti- GP68 Protein monoklonale Antikörper enthielt, wurde auf diese Weise erhalten.

Beispiel 17

Eine pharmazeutische Zubereitung, die Anti-GP68 Protein monoklonale Antikörper enthielt, wurde auf die gleiche Weise erhalten, wie es in Beispiel 16 beschrieben ist, jedoch mit der Ausnahme, daß eine Salzlösung verwendet wurde, die mit 0,001 bis 10% Albumin anstelle von Tween 80 ergänzt worden war.

Beispiel 18

Eine pharmazeutische Zubereitung, die Anti-GP68 Protein monoklonale Antikörper enthielt, wurde auf die gleiche Weise erhalten, wie es in Beispiel 16 beschrieben ist, jedoch mit der Ausnahme, daß eine Salzlösung verwendet wurde, die mit 0,01 bis 5% Mannitol anstelle von Tween 80 ergänzt worden war.

Beispiel 19

Eine pharmazeutische Zubereitung, die Anti-GP68 Protein monoklonale Antikörper enthielt, wurde auf die gleiche Weise erhalten, wie es in Beispiel 16 beschrieben ist, jedoch mit der Ausnahme, daß eine Salzlösung verwendet wurde, die mit 0,01 bis 5% Glucose anstelle von Tween 80 ergänzt worden war.

Experimentelles Beispiel 1

Unter Verwendung der polyklonalen Antikörper, die in Beispiel 2 erhalten worden waren, wurden Extrakte durch Triton-X von den Mäuse-Embryos/Föten und verschiedenen Organen von 1 bis 30 Tage alten Mäusen durch das Western- Blot-Verfahren folgendermaßen analysiert:
Zuerst wurden die Mäuse-Embryos (nach 13 Tagen nach Befruchtung) und die verschiedenen Mäuse-Organe (z. B. Gehirn, Ganglion, Herz, Lunge, Leber, Magendarmtrakte, Milz) behandelt, um Extrakte zu erhalten, wie es unten beschrieben ist.
Proben wurden homogenisiert in 0,01 M Tris-HCl-Puffer, der 2% Triton X-100 und 50 Mikrogramm/ml PMSF enthielt, und Extraktion auf Eis über 30 Minuten unterworfen. Die entstandenen Extrakte wurden bei 40000 Umdrehungen pro Minute 1 Stunde zentrifugiert, und die erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten wurden Äthanol-Ausfällung unterworfen. Die in den entstandenen Präzipitaten enthaltenen Mengen Protein wurden durch das Lowry-Verfahren bestimmt.
Dann wurde nach dem Laemmli-Verfahren (Nature 227, 680- 685, 1970) jedes der Präzipitate gelöst, bis eine Endkonzentration von 4 mg/ml in einer SDS löslichmachenden Lösung entstand (9,5 M Harnstoff, 2% NP-40 (Nakarai Chemicals, Ltd.), 2% Ampholin (Pharmacia), 5% Mercaptoäthanol, 0,25% SDS). Die Lösungen wurden unabhängig auf SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese aufgebracht (Gelkonzentration: 10%; 10 bis 15 Mikroliter/Spur, d. h. 40 bis 60 Mikrogramm Protein/Spur).
Nach der Elektrophorese nach dem Verfahren von Towbin et al. (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 4350- 4354, 1979) wurden die in der vorgenannten Gel-Elektrophorese fraktionierten Protein-Fraktionen unter Beibehaltung ihrer Positionen dem Blotten auf einer Nitrozellulose-Membran (Schleicher & Schuell oder Bio-Rad Laboratories) bei 1 Ampere über 2 Stunden unterworfen. Nach dem Blotten wurde die Nitrozellulose-Membran mit PBS, das 3% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, 1 Stunde in Kontakt gebracht.
Dann wurde die Nitrozellulose-Membran mit PBS gewaschen, das 1% Triton X-100 enthielt, und wurde mit Antikörpern zu GP68 Protein (100- bis 500-fach verdünntes Ratten- oder Kaninchen-Antiserum) bei Raumtemperatur 2 bis 3 Stunden behandelt.
Weiterhin wurde die Nitrozellulose-Membran mehrere Male mit PBS, das 1% Triton X-100 enthielt, 1 Stunde jedes Mal gewaschen und dann 1 Stunde mit einer Lösung behandelt, die zu HRP-konjugierte Anti-Ratten IgG oder Anti-Kaninchen IgG Mäuse IgG Antikörper (100-fache Verdünnung) enthielt. HRP (Meerrettich-Peroxidase) war ein Produkt von Cappel.
Danach wurde die Membran 5 bis 6 Mal mit PBS, das 1% Triton X-100 enthielt, 1 Stunde lang jedes Mal gewaschen und dann mit 0,05% 4-Chlor-1-naphtol und H&sub2;O&sub2; in 40 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) behandelt, so daß grau-braune Flecken visuell beobachtet wurden.
Als ein Ergebnis wurden in all den Proben der Extrakte von den Organen von Mäuse-Föten (Embryos) gefärbte Flecke identifiziert.
Es wurden zum Beispiel gefärbte Flecke in all den Extrakten von den Kopf-, abdomenalen und Schwanzbereichen von Mäuse-Embryos nach 13, 15 und 17 Tagen nach Befruchtung beobachtet.
Andererseits wurden auch gefärbte Flecke in den Extrakten von verschiedenen Organen und Zellen von 1 bis 7 Tage alten Mäusen beobachtet.
Es wurden zum Beispiel gefärbte Flecke beobachtet in all den Extrakten von den Kopf-, abdomenalen und Schwanzbereichen der Mäuse sofort nach der Geburt. Weiterhin wurden gefärbte Flecke in all den Proben von Extrakten von dem Gehirn, der Leber, der Niere, der Lunge, des Herzens, der Haut, der Milz, der Muskelabschnitte von Mäusen mit einem Alter von 7 Tagen beobachtet. Hiervon waren die Flecken in den Proben von der Leber und dem Herzen intensiv gefärbt, und die Flecke in dem Extrakt von dem Gehirn waren diffus und schwach gefärbt.
Im Gegensatz dazu wurde keiner der Flecke in den Extrakten von verschiedenen Organen und Zellen der Mäuse mit einem Alter über 1 Woche beobachtet.
Es wurde beispielsweise keiner der Flecken beobachtet in den Extrakten von dem Gehirn, der Leber, der Niere, der Lunge, des Herzens, der Haut, der Milz und der Muskelabschnitte von den Mäusen mit einem Alter von 14 Tagen und 21 Tagen sowie von dem Gehirn, der Leber, der Niere, der Lunge, des Herzens, der Haut, der Milz, der Muskeln, dem Uterus und Wirbelsäulenabschnitten von erwachsenen Mäusen.
Demzufolge wird das GP68 Protein als ein Protein angesehen, das eine biologische Aktivität aufweist, die spezifisch in der Periode von Embryos und kurz nach der Geburt auftritt, wenn Wachstum oder Differenzierung extrem stark ist.

Experimentelles Beispiel 2

Embryos von Mäusen nach 15 Tagen nach Befruchtung wurden schnell in Trockeneis/Aceton abgekühlt und dann in Stücke geschnitten, wobei ein Kryostat verwendet wurde. Zu den Stücken wurden 10-fach verdünnte Lösungen hinzugegeben, die entsprechend EBR 3-1 monoklonale und EBR 7-1 monoklonale Antikörper enthielten. Die entstandenen Mischungen wurden mit HRP-konjugiertem Anti- Ratten IgG Mäuse IgG Antikörper 1 bis 2 Stunden reagieren gelassen. Nach dem Waschen wurden gefärbte Organe beobachtet, wobei ein optisches Mikroskop verwendet wurde.
Weitere Beobachtung wurde durchgeführt unter Verwendung des in Beispiel 6 beschriebenen ABC-Verfahrens.
Als ein Ergebnis wurde beobachtet, daß Nerv und weicher Muskel in der Reaktion mit EBR 3-1 monoklonalen Antikörpern gefärbt war und das Gehirn, Ganglion und Leber in der Reaktion mit EBR 7-1 monoklonalen Antikörpern gefärbt waren.

Experimentelles Beispiel 3

Gehirnzellen von Mäuse-Embryos wurden in täglichen Intervallen aufgenommen, um Gewebekulturen herzustellen. Zu den jeweiligen Gewebekulturen wurden unabhängig EBR 3-1 monoklonale Antikörper oder EBR 7-1 monoklonale Antikörper, die in Beispiel 7 erhalten worden waren, hinzugegeben, um so die Gehirnzellen-Aktivität zu beobachten.

Experimentelles Beispiel 4

Krebszellen, die von verschiedenen Krebspatienten entnommen worden waren, wurden nach dem vorgenannten ABC-Verfahren angefärbt, wobei das Anti-Mäuse GP68 Protein Kaninchen-Antiserum oder das Anti-Human-alpha-Föto-Protein Kaninchen-Antiserum unabhängig verwendet wurde (welche beide in Beispiel 2 hergestellt worden waren).
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1A, 1B, 1C angegeben. In den Tabellen sind die Grade der Anfärbung folgendermaßen bezeichnet: "-" nicht gefärbt, "+-" schwach und diffus gefärbt; "+" mäßig gefärbt, "++" deutlich gefärbt, aber weniger stark gefärbt als solche, die mit "+++" bezeichnet sind; und "+++" deutlich gefärbt.
Andererseits waren keine der Mäuse-Fibroblastenzellen, irgendwelche Zellen von gesunden Menschen oder Zellen von normalen Geweben, die keine Krebsgewebe von Krebspatienten waren, angefärbt, wenn ähnliche Färbeverfahren durchgeführt wurden, was impliziert, daß das Anti-Mäuse GP68 Protein Kaninchen-Antiserum spezifisch mit Krebsgeweben reagiert.
Wie aus den Tabellen 1A, 1B, 1C ersichtlich ist, färbte das Kaninchen-Antiserum zu dem GP68 Protein Gewebe von Krebspatienten, die das Kaninchen-Antiserum zu Humanalpha-Föto-Protein nicht färbte, und deutlich und intensiver färbte als das letztere, und zwar ähnlich oder deutlicher färbte. Somit kann das Antiserum zu dem GP68 Protein als in hohem Maße brauchbar als ein Bestandteil eines diagnostischen Mittels für Krebs angesehen werden. Tabelle 1A Fall Diagnose Stelle Färben mit Antiserum zu Protein Human-alpha-Föto-Protein Wochen alter menschlicher Embryo Astrocytom GehirnCranio-Pharyngiom Glioblastom Multiform Gliom Teratoblastom Medulloblastom Meningiom Premordial-Ektoblastom Leber,fast normal Leber Cholangiom Leberkrebs (Hepatom) Tabelle 1B Fall Diagnose Stelle Färben mit Antiserum zu Protein Human-alpha-Föto-Protein Leberkrebs Leber (Hepatom) Leber-Zirrhose Adenocarcinom Lunge Adenocarcinom der Lunge Ovariencystom Ovarien Adenocarcinom Magen Differenzierungstyp Adenocarcinom Embryonales Carcinom Hoden Seminom Tabelle 1C Fall Diagnose Stelle Färben mit Antiserum zu Protein Human-alpha-Föto-Protein Seminom Hoden Adenocarcinom vom deformierten Differenzierungstyp Uterus

Industrielle Anwendbarkeit

Die vorliegende Erfindung liefert das GP68 Protein in einer isolierten Form, die periodisch-spezifisch im Verlauf der Entwicklung und Differenzierung des zerebralen und Nervensystems erscheint und eine wichtige Rolle im Verlauf der Entwicklung und Differenzierung desselben spielen kann.
Weiterhin macht es ein Verfahren zur Reinigung gemäß der vorliegenden Erfindung nun möglich, eine ausreichende Menge von hoch-gereinigtem GP68 Protein zu erhalten.
Durch Verwendung von Antikörpern gegen das GP68 Protein gemäß der vorliegenden Erfindung können verschiedene Untersuchungen mit der Anwendung der Antikörper leicht verbessert werden.
Das Auftreten neuer Funktionen wird erwartet durch Verabreichung des GP68 Proteins der vorliegenden Erfindung an Erwachsene, da das GP68 Protein nur in einer spezifischen Periode vorhanden ist, das heißt von Befruchtung bis zu einer Woche nach Geburt, und nicht in Erwachsenen produziert wird.
Weiterhin werden durch die Verwendung des GP68 Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung Wirkungen erwartet bei der Förderung der Entwicklung von Organen, Geweben, Zellen und Membranen von verschiedenen Teilen des Körpers und bei der Reformierung genetischer oder organischer Anormalitäten in der Entwicklung und dem Wachstum verschiedener Organe und Gewebe und beim Regenerieren und Wiederherstellen des zerebralen und Nervensystems.
Zubereitungen von m-RNA und c-DNA, die für das GP68 Protein codieren, werden gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, bei der polyklonale und monoklonale Antikörper gegen das GP68 Protein hergestellt werden, so daß der Weg geöffnet werden könnte, um das GP68 Protein gemäß genetischer rekombinanter Techniken herzustellen, zum Beispiel unter Verwendung von Zellen von E. coli, Bacillus subtilis, Hefe und verschiedenen Tieren.
Außerdem kann man erwarten, daß das GP68 Protein oder das aktive Mittel-Peptid davon und die Antikörper, die hierzu spezifisch sind, als therapeutische oder prophylaktische Mittel für verschiedene Krankheiten in dem zerebralen und Nervensystem; als verschiedene Mittel zum Fördern von Wachstum und Entwicklung; als verschiedene therapeutische Mittel für Wachstums-Insuffizienz; Medikamente für Auswüchse oder Wucherungen, Karzinome oder Krebs; Medikamente für tierische Anwendung oder Marker für Krankheiten in dem zerebralen und Nervensystem, Insuffizienz bei Wachstum und Entwicklung, Wucherungen und Auswüchsen oder Krebs in verschiedenen Organen und Geweben und außerdem als ein diagnostisches Mittel brauchbar sind.

Referenz bezüglich der Hinterlegung von Mikroorganismen

1. Klon EBR 3

Hinterlegungsinstitut:

Name: Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industry and Trade
Adresse: 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture 305, Japan
Datum der Hinterlegung: 18.August 1988
Hinterlegungsnummer: FERM BP-2002
(Hinterlegt nach dem Budapester Vertrag).

2. Klon EBR 7

Hinterlegungsinstitut:

Name: Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Industry and Trade
Adresse: 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-Shi, Ibaraki Prefecture 305, Japan
Datum der Hinterlegung: 18.August 1988
Hinterlegungsnummer: FERM BP-2003
(Hinterlegt nach dem Budapester Vertrag).

Claims

1. Ein Protein, das spezifisch in biologischen Materialien von Embryonen/Föten oder Neugeborenen von bis zu einer Woche ihres Lebensalters gefunden wird und ein Molekulargewicht von etwa 68.000 und einen isoelektrischen Punkt von 5,4 bis 5,6 aufweist, mit

a) einer N-endständigen Aminosäuresequenz von Leu-His-Glu-Asn-Glu-Phe-Gly-Ile-Ala-Ser-Thr- Leu-Asp-Ser-; und

b) den folgenden Zucker- und Aminosäurezusammensetzungen:

Zuckerzusammensetzung (molarer Anteil):

Galactose etwa 1

Mannose etwa 1,42

Fructose etwa 0,32

Glucose etwa 0,07

Glucosamin etwa 1,06

Galactosamin etwa 0,10

Sialsäure etwa 0,18

Aminosäurezusammensetzung (molarer Anteil):

Asparaginsäure etwa 43,2

Threonin etwa 26,1

Serin etwa 35,8

Glutaminsäure etwa 58,4

Glycin etwa 30,2

Alanin etwa 30,6

Cystein etwa 6,9

Valin etwa 23,3

Methionin etwa 5,2

Isoleucin etwa 9,5

Leucin etwa 48,4

Tyrosin etwa 8,6

Phenylalanin etwa 17,4

Lysin etwa 26,3

Ammonium etwa 90,1

Histidin etwa 10,6

Arginin etwa 18,2

Prolin etwa 26,5

2. Ein Protein nach Anspruch 1, bei dem diese biologischen Materialien von Mäusen herstammen.

3. Ein Protein nach Anspruch 1, bei dem dieses Protein von einem Extraktfluid von Geweben oder Zellen von Mäusen durch eine Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Lectins als einem Affinitätsmittel isoliert worden ist.

4. Ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins, wie es in Anspruch 1 angegeben ist, das die Schritte umfaßt, daß ein Extraktfluid von Geweben oder Zellen von Embryonen/Föten oder Neugeborenen mit einem Lebensalter bis zu einer Woche mit einem Lectin-tragenden Träger in Kontakt gebracht wird und das Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 68.000 Daltons und einem isoelektrischen Punkt von 5,4 bis 5,6 von auf dem Träger absorbierten Bestandteilen selektiv eluiert und isoliert wird.

5. Ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt von Mäusegeweben oder -zellen von Embryonen/Föten oder neugeborenen Mäusen mit einem Lebensalter bis zu einer Woche herstammt.

6. Polyclonale Antikörper gegen ein Protein nach Anspruch 1, das ein Molekulargewicht von etwa 68.000 und einen isoelektrischen Punkt von 5,4 bis 5,6 aufweist und spezifisch in biologischen Materialien von Embryonen/Föten oder Neugeborenen mit einem Lebensalter von bis zu einer Woche gefunden wird und durch Immunisierung von Tieren mit diesem Protein erhalten wird.

7. Polyclonale Antikörper nach Anspruch 6, bei denen die biologischen Materialien von Mäusen herstammen.

8. Hybridomas, die in der Lage sind, monoclonale Antikörper zu produzieren, die für ein Protein spezifisch sind, wie es in Anspruch 1 angegeben ist, das spezifisch in biologischen Materialien von Embryonen/ Föten oder Neugeborenen mit einem Lebensalter von bis zu einer Woche gefunden wird und ein Molekulargewicht von etwa 68.000 und einen isoelektrischen Punkt von 5,4 bis 5,6 aufweist, wobei diese Hybridomas durch Verschmelzung von Myelomzellen mit Milzzellen von Tieren, die mit diesem Protein immunisiert worden sind, erhalten werden.

9. Hybridomas nach Anspruch 8, bei denen die biologischen Materialien von Mäusen herstammen.

10. Monoclonale Antikörper, die spezifisch für ein Protein sind, wie es in Anspruch 1 angegeben ist, das ein Molekulargewicht von etwa 68.000 und einen isoelektrischen Punkt von 5,4 bis 5,6 aufweist und spezifisch in biologischen Materialien von Embryonen/Föten oder Neugeborenen mit einem Lebensalter von bis zu einer Woche gefunden wird.

11. Monoclonale Antikörper nach Anspruch 10, die durch Hybridomas erzeugt werden, die durch Verschmelzung von Myelomzellen mit Milzzellen von Tieren erhalten werden, die mit einem Protein immunisiert worden sind, das ein Molekulargewicht von etwa 68.000 und einen isoelektrischen Punkt von 5,4 bis 5,6 hat und spezifisch in biologischen Materialien von Embryonen/Föten oder Neugeborenen mit einem Lebensalter von bis zu einer Woche gefunden wird.

12. Monoclonale Antikörper nach Anspruch 11, bei denen die biologischen Materialien von Mäusen herstammen.

13. Ein Verfahren zum Herstellen von monoclonalen Antikörpern gegen ein Protein, wie es in Anspruch 1 angegeben ist, das spezifisch in biologischen Materialien von Embryonen/Föten oder Neugeborenen mit einem Lebensalter von bis zu einer Woche gefunden wird und ein Molekulargewicht von etwa 68.000 und einen isoelektrischen Punkt von 5,4 bis 5,6 aufweist, wobei dieses Verfahren die Schritte umfaßt, daß (A) Myelomzellen mit Milzzellen von Tieren, die mit diesem Protein immunisiert worden sind, verschmolzen werden, um Hybridomas zu erhalten, und (B) unter diesen Hybridomas diejenigen ausgewählt werden, die in der Lage sind, monoclonale Antikörper gegen dieses Protein zu erzeugen und daß diese monoclonalen Antikörper unter Verwendung dieser Hybridomas erzeugt werden.

14. Ein Verfahren zum Herstellen von monoclonalen Antikörpern nach Anspruch 13, bei dem der Schritt (B) umfaßt, daß diese Hybridomas, die in der Lage sind, monoclonale Antikörper zu erzeugen, in einem Gewebekulturfluid gezüchtet werden, diese monoclonalen Antikörper in diesem Kulturfluid erzeugt und aufgesammelt werden und dann diese monoclonalen Antikörper von diesem Kulturfluid isoliert werden.

15. Ein Verfahren zum Herstellen von monoclonalen Antikörpern nach Anspruch 13, bei dem der Schritt (B) umfaßt, daß die Hybridomas, die in der Lage sind, monoclonale Antikörper zu erzeugen, in das Peritoneum einer nackten Ratte oder einer Ratte mit Immunsuppression transplantiert werden, um Aszites-Tumor zu induzieren, diese monoclonalen Antikörper in dem Aszites erzeugt und angesammelt werden und dann die monoclonalen Antikörper von dem Aszites isoliert werden.

16. Ein Verfahren zum Herstellen von monoclonalen Antikörpern nach den Ansprüchen 13, 14 oder 15, bei dem die biologischen Materialien von Mäusen herstammen.

17. Ein Verfahren zum Isolieren eines Proteins, das die Schritte umfaßt, daß ein Gemisch, das ein Protein enthält, wie es in Anspruch 1 angegeben ist, mit einem Träger, der Antikörper gegen das Protein, wie es in Anspruch 1 angegeben ist, trägt, in Kontakt gebracht wird und dieses Protein von den Bestandteilen, die auf dem Träger adsorbiert sind, selektiv eluiert und isoliert werden.

18. Ein Verfahren zum Isolieren eines Proteins nach Anspruch 17, bei dem diese Antikörper polyclonale Antikörper sind, wie sie in Anspruch 6 angegeben sind.

19. Ein Verfahren zum Isolieren eines Proteins nach Anspruch 17, bei dem diese Antikörper monoclonale Antikörper sind, wie sie in Anspruch 10 angegeben sind.

20. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Protein enthält, wie es in Anspruch 1 angegeben ist.

21. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Antikörper enthält, wie sie in Anspruch 6 angegeben sind.

22. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Antikörper enthält, wie sie in Anspruch 10 angegeben sind.