JP7511542B2 - タンパク質複合体を特徴づけるための方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年8月30日に出願され、その全体が参照により援用される米国仮特許出願第62/724,700号の利益およびこれに対する優先権を主張するものである。
本発明は概して、タンパク質複合体を特徴づけるシステムおよび方法に関する。
モノクローナル抗体(mAb)は成長中の治療分野であり、現在50を超えるモノクローナル抗体が市販されている。二つ以上のモノクローナル抗体の併用療法は、既存の単剤療法の有効性を改善する可能性がある。特定の可溶性物質、特に複数のエピトープが繰り返される多量体物質は、二つ以上の抗体と結合して、大きな複合体の形成につながる場合がある。大きくて不均質な抗体複合体の産生は、「ペーパードリング(paper-dolling)」と呼ばれる。抗体の大きな複合体は、貪食により速やかに除去され、抗体の有効性の低下につながる可能性がある。また、大きなタンパク質複合体は、mAbの免疫原性を増加させる可能性がある。
[本発明1001]
サンプル中のタンパク質複合体の化学量論およびサイズ分布を評価するための方法であって、
前記サンプルを、非対称フロー式フィールドフロー分画(A4F)によって分画することと、
多角度レーザー光散乱(MALLS)を使用して、前記サンプル中の前記タンパク質複合体の前記モル質量、化学量論、およびサイズ分布を決定することであって、不均質な複合体が、不均質な抗体:リガンド複合体または不均質な融合タンパク質:リガンド複合体からなる、前記決定することと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記リガンドが、可溶性リガンドである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記抗体が、二重特異性抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
リードタンパク質薬物産物を選択するための方法であって、
第一のタンパク質薬物産物の標的を含む第一のサンプルに前記第一のタンパク質薬物産物を添加して、不均質なタンパク質:リガンド複合体を生成することと、
同じ標的を含有する第二のサンプルに第二のタンパク質薬物産物を添加して、タンパク質:リガンド複合体を形成することと、
前記不均質なタンパク質:リガンド複合体を分離し、かつ、非対称フロー式フィールドフロー分画-多角度レーザー光散乱を使用して不均質なタンパク質:リガンド複合体のサイズ分布および化学量論を決定することと、
前記リード標的タンパク質薬物として、より少ないタンパク質:リガンド複合体を形成する前記タンパク質薬物産物を選択することと
を含む、前記方法。
[本発明1006]
選択される前記タンパク質薬物産物が、
3:2、2:3、4:4、6:6または[2:2] n のタンパク質薬物産物対リガンド比を有する、より少ないタンパク質薬物産物複合体
を形成する、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記リガンドが、可溶性リガンドである、本発明1005または1006の方法。
[本発明1008]
前記タンパク質薬物産物が、抗体もしくはその抗原結合断片、融合タンパク質、または組み換えタンパク質である、本発明1005~1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
選択される前記タンパク質薬物産物が、1:0、0:1、1:1、1:2、および2:1からなる群から選択されるタンパク質薬物産物対リガンド比を有するタンパク質薬物産物複合体を形成する、本発明1005~1007のいずれかの方法。
[本発明1010]
本発明1005~1009のいずれかに従って選択された前記リードタンパク質薬物産物を含む、医薬組成物。
[本発明1011]
タンパク質薬物産物とそのリガンドとの間に形成されるタンパク質複合体を特徴づけるための方法であって、
前記タンパク質薬物産物およびそのリガンドを溶液中で組み合わせて、タンパク質薬物産物:リガンド複合体を含むサンプルを形成することと、
前記サンプルを、非対称フロー式フィールドフロー分画を用いて分画することと、
分画されたタンパク質薬物産物:リガンド複合体を多角度レーザー光散乱に供して、タンパク質薬物産物:リガンド複合体の化学量論およびサイズを特徴づけることと
を含む、前記方法。
I.定義
本開示は、本明細書に記載される組成物および方法、ならびに記載された実験条件に限定されず、それ故、変化し得ることを理解されたい。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるため、本明細書に使用される用語は、ある実施形態のみを記述する目的で使用されており、制限することを意図しないことも理解されるべきである。
モノクローナル抗体併用療法は、複数のシグナル伝達経路が関与する癌や炎症性状態などの疾患に対する有望な治療戦略として登場した。さらに、同じ経路を標的とする複数のモノクローナル抗体の投与は、単剤療法だけでは経路を完全に阻害しない場合、疾患の発症に関与する経路を完全に遮断するのに有益であり得る。しかし、治療用mAbが可溶性の多量体標的に結合すると、大きくて不均質な複合体が形成される可能性がある。タンパク質複合体のサイズ、形状、および構造は、他の要因の中でも特に、免疫原性および抗体クリアランス時間に影響を及ぼす可能性がある。タンパク質複合体の分析は、薬剤開発中のmAbの薬物動態に関する洞察を提供するために重要である。
一実施形態では、システムは、非対称フロー式フィールドフロー分画(A4F)システムおよび多角度レーザー光散乱(MALLS)システムを含む。市販のA4Fシステムの一例は、Eclipse(商標)3+ A4F分離システムである。市販のMALLSシステムの一例は、Wyatt Technology Dawn HELEOS(登録商標)IIレーザー光散乱装置である。システムは、典型的には、UV/VIS検出器および/または屈折率検出器を含む。例示的な市販のUV/VIS検出器は、Agilent 1260 Infinity UV検出器である。例示的な市販の屈折率検出器は、Optilab(登録商標)T-rEX屈折率検出器である。一実施形態では、A4Fシステムは、350Wスペーサーおよび4kDa MWCO NADIR(登録商標)親水性PES(PESH)膜を備えたA4F短チャネルを含む。別の実施形態では、A4F短チャンネルには、490Wスペーサーおよび10kDa MWCO Nadir(登録商標)再生セルロース膜が取り付けられている。例示的な移動相は、pH7.0での10mMのリン酸塩および500mMのNaClを含む。しかし、カラムクロマトグラフィー分離に対するA4Fの利点は、使用できる移動相またはキャリア流体の種類に制約がないことである。一実施形態では、サンプルは、60分にわたる直線勾配を使用して分離される。一実施形態では、チャネルフローおよびクロスフロープログラムは、ケースバイケースで望ましい分解能を達成するために特別に最適化されている。当業者であれば、A4Fを使用して分離される特定のサンプルに必要とされる分解能に従って、溶出プロファイルを修正および最適化できることが理解されるべきである。
開示されたシステムおよび方法は、タンパク質複合体、例えば、サンプル中のタンパク質薬物産物:リガンド複合体を特徴づけるために使用され得る。一実施形態は、非対称フロー式フィールドフロー分画(A4F)によってサンプルを分画し、多角度レーザー光散乱(MALLS)を使用してサンプル中のタンパク質複合体のモル質量、化学量論、およびサイズ分布を決定することによって、サンプル中の不均質なタンパク質複合体の化学量論およびサイズ分布を評価する方法を提供し、複合体は、抗体:リガンド複合体または融合タンパク質:リガンド複合体を含むか、またはこれらから成る。いくつかの実施形態では、リガンドは可溶性リガンドである。典型的に、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、タンパク質複合体は、その抗体または融合タンパク質対リガンド比によって特徴づけられる。非限定的な例では、抗体または融合タンパク質対リガンド比は、1:0、0:1、1:1、1:2、2:1、2:2、3:2、2:3、4:4、6:6、または[2:2]nからなる群から選択され得る。抗体または融合タンパク質対リガンド比は、試験される特定の抗体または融合タンパク質およびリガンドに依存することが理解されるべきである。
タンパク質複合体の特性を決定するために、複合体の各成分についてモル質量を実験的に決定して、様々な化学量論を有する複合体の予測モル質量を計算することができる。一実施形態では、混合物中の各タンパク質およびリガンドは、各成分のモル質量を決定するために別々に分析される。一実施形態では、タンパク質薬物産物およびそのリガンドを混合して、タンパク質薬物産物:リガンド複合体を形成し、次いでその複合体を特徴づける。分画されたタンパク質薬物産物:リガンドをA4F-MALLSに供して、複合体のモル質量を決定する。次に、分画された複合体の計算値を、実験的に決定された個々の成分のモル質量と比較して、各複合体中に存在する個々の成分の可能性のある化学量論比を決定する。一実施形態では、本方法は、1:1タンパク質薬物産物:リガンド複合体を検出することができる。別の実施形態では、本方法は、タンパク質薬物産物:リガンドの任意の比率を検出することができる。非限定的な例では、本方法は、1:0、0:1、2:1、1:2、2:2、3:2、2:3、4:4、6:6、または[2:2]nのタンパク質薬物産物:リガンド複合体を検出することができる。抗体または融合タンパク質対リガンド比は、試験される特定の抗体または融合タンパク質およびリガンドに依存することが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、複合体は、共通の可溶性リガンドと複合体化された複数の異なるタンパク質薬物産物を含有する。
タンパク質薬物産物:リガンド複合体のリガンドは、単量体または多量体リガンドであり得る。一実施形態では、リガンドは可溶性リガンドである。いくつかの実施形態では、可溶性リガンドは、膜貫通受容体タンパク質を含むがこれに限定されない膜貫通タンパク質の細胞外部分に対応する。
同じ経路または同じリガンドを標的とする複数のタンパク質薬物産物を用いた併用療法は、人気が高まっている。いくつかの実施形態では、開示された方法を使用して、タンパク質薬物産物によって形成されるタンパク質複合体の化学量論およびサイズ分布に基づいて、同じリガンドを標的とする抗体の異なる組み合わせを区別することができる。二つのタンパク質薬物産物を単量体リガンドと混合すると、タンパク質薬物産物はヘテロマー複合体を形成する可能性がある。本明細書において定義されるヘテロマー複合体は、同じ標的分子に結合する二つの異なるタンパク質薬物産物を指す。さらに、同じ抗体の二つのアームの各々は、二つのリガンドを結合する能力を有し、それらは第二の抗体によって結合されて、ヘテロマー複合体を形成することもできる。図2A~図2Dは、代表的なヘテロマー複合体を示す。図2Aおよび図2Cは、一つのタンパク質薬物産物(黒)または抗体が、二つのリガンドに結合し、リガンドのうちの一方が第二の固有のタンパク質薬物産物(灰色)にも結合する場合に形成される複合体を示す。図2Bおよび図2Dに示すように、灰色タンパク質が別のリガンドに結合し、それが次いで黒色タンパク質に結合する場合、より大きく、より不均質な複合体が形成され得る。
別の実施形態は、第一のタンパク質薬物産物を、第一のタンパク薬物産物の標的を含む第一のサンプルに添加して、不均質なタンパク質:リガンド複合体を生成すること、および第二のタンパク質薬物産物を前記標的を含有する第二のサンプルに添加して、タンパク質:リガンド複合体を形成することによって、リードタンパク質薬物産物を選択するための方法を提供する。本方法は、不均質なタンパク質:リガンド複合体を分離することと、非対称フロー式フィールドフロー分画-多角度レーザー光散乱を使用して不均質なタンパク質:リガンド複合体のサイズ分布および化学量論を決定することとを含む。本方法はまた、より少ない不均質なタンパク質:リガンド複合体を形成するタンパク質薬物産物を、リード標的タンパク質薬物として選択することを含む。いくつかの実施形態では、リガンドは可溶性リガンドである。可溶性リガンドは、単量体リガンドまたは多量体リガンドとすることができる。典型的に、タンパク質薬物産物は、抗体もしくはその抗原結合断片、融合タンパク質、または組み換えタンパク質である。タンパク質複合体は、1:0、0:1、1:1、1:2、2:1、2:2、3:2、2:3、4:4、6:6、または[2:2]nからなる群から選択されるが、これらに限定されない、抗体または融合タンパク質対リガンド比を有するタンパク質複合体として特徴づけられ得る。別の実施形態は、上記の方法を使用して選択されたリードタンパク質薬物産物を含有する医薬組成物を提供する。
一実施形態では、開示された方法は、タンパク質複合体のサイズを決定するために使用され得る。タンパク質薬物産物、および任意で可溶性リガンドの混合物は、A4F分画を使用して分離される。タンパク質複合体のサイズおよび化学量論は、その後、MALLS分析を用いて決定することができる。MALLS分析では、偏光ビーム(またはレーザー)がサンプル分子上に集束され、散乱光が光検出器で検出される。散乱光は、様々な角度で同時に検出される。各角度における散乱光の強度は、複合体のモル質量に比例する。一実施形態では、UV/Vis分光法を使用して、各タンパク質複合体の濃度を決定する。
一実施形態では、タンパク質複合体中のタンパク質のうちの一つは、タンパク質薬物産物であるか、または原核生物もしくは真核生物細胞での発現に好適な対象タンパク質である。例えば、タンパク質複合体中のタンパク質は、抗体もしくはその抗原結合断片、キメラ抗体もしくはその抗原結合断片、ScFvもしくはその断片、Fc融合タンパク質もしくはその断片、成長因子もしくはその断片、サイトカインもしくはその断片、または細胞表面受容体の細胞外ドメインもしくはその断片であり得る。複合体中のタンパク質は、単一のサブユニットからなる単一ポリペプチドであってもよく、または二つ以上のサブユニットを含む複合的なマルチサブユニットタンパク質であってもよい。対象タンパク質は、バイオ医薬品、食品添加物もしくは保存剤、または精製および品質標準に供される任意のタンパク質製品であってもよい。
方法
SEC-MALLS移動相バッファ
SEC-MALLS分析では、SEC移動相バッファの組成は、10mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH7.0であり、使用前にろ過(0.2μm)された。
SEC-MALLSシステムは、Superose 6 GLカラム(10mm x 300mm;GE Healthcare,cat# 17-5172-01)からなり、紫外線(UV)ダイオードアレイ検出器、Wyatt Technology miniDawn TREOS(登録商標)レーザー光散乱装置(LS)、およびOptilab(登録商標)T-rEX示差屈折計(RI)検出器を備えたAgilent 1200シリーズのHPLCシステムに連結されている。検出器は、以下の順序で直列に接続した。UV-LS-RI。LSおよびRI検出器は、Wyatt Technologyが提供する指示に従って較正された。
SEC-MALLS分析では、SEC移動相バッファの組成は、10mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH7.0であり、使用前にろ過(0.2μm)された。
A4F-MALLSシステムは、紫外線(UV)ダイオードアレイ検出器、Wyatt Technology Dawn HELEOS(登録商標)IIレーザー光散乱装置(LS)、およびOptilab(登録商標)T-rEX示差屈折計(RI)検出器を備えたAgilent 1200シリーズHPLCシステムに連結されたEclipse(商標)3+ A4F分離システムで構成されている。検出器は、以下の順序で直列に接続した。UV-LS-RI。LSおよびRI検出器は、Wyatt Technologyが提供する指示に従って較正された。
データは、ASTRA Vソフトウェア(バージョン5.3.4.14、Wyatt Technology)を用いて分析した。データは、過剰な散乱光を溶質濃度および重量平均モル質量Mwに関連付ける式に適合した(Wyatt,1993;Kendrick,2001)。
式中、cは溶質濃度、R(θ、c)は散乱角と濃度の関数としての溶質からの過剰なローリー比であり、Mwはモル質量であり、P(θ)は散乱光の角依存性(回転半径<50nmの粒子の場合、約1まで)を表し、A2は浸透圧の膨張における第二のウイルス係数(測定は希釈溶液で行われるため無視できる)であり、
式2:
式中、noは溶媒屈折率、NAはアボガドロの数字、λ0は真空中の入射光の波長、dn/dcは溶質に対する特定の屈折率の増分を表す。
サンプルのSEC-MALLS分析では、高次複合体の分解能が不良であり(溶出量=8~14mL)、中間複合体の区別がないことが示された(図3A、表1)。対照的に、サンプルのA4F-MALLS分析では、高次複合体の分解能が優れており(溶出時間=約11~30分)、中間複合体の明確な区別が示された(図3B、表2)。
方法
A4F MALLS移動相バッファ
1X DPBS、pH7.4は、HPLCグレードの水で500mLの10X DPBSを総容量4.9Lに希釈することによって調製された。0.0025%(w/v)アジ化ナトリウムの溶液を抗菌剤として添加した。塩酸(12M)を少量ずつ徐々に添加し、pHを7.4に調整してから、最終容量を5.0Lとした。バッファの最終測定pHは7.4であった。バッファ溶液を仕様前に新たに調製し、ろ過(0.2μm)した。
定義された量の抗タンパク質Y mAb(リードAおよびリードB)をそれぞれ組み換えヒトタンパク質Yと混合し、pH7.4の1X DPBSで希釈して以下のモル比を得た:1μMの抗タンパク質Y mAb:3μMのhActA、1μMの抗タンパク質Y mAb:1μMのタンパク質Y、および3μMの抗タンパク質Y mAb:1μMのタンパク質Y。すべてのサンプルは、周囲温度で2時間インキュベートし、4℃でろ過せずに維持した後、10kDa MWCO Nadir再生セルロース膜を使用して、W490スペーサーホイル(スペーサー厚さ490μm、スペーサー幅2.2cm)を取り付けたEclipse(商標)短チャンネルに注入した。チャネルは、各サンプルの注入前に、pH7.4の1X DPBSバッファで予め平衡化した。ウシ血清アルブミン(BSA;2mg/mL;10μgサンプル量)を別々に注入し、システム適合性対照として含めた。
マウス抗ヒト抗体(MAHA)力価は、mAb AまたはmAb BマウスIgGの検出に特異的なサンドイッチELISAを使用して決定された。簡潔に述べると、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の1μg/mLのmAb AまたはmAb Bを、4℃で一晩マイクロタイタープレートに受動的に吸着させた後、PBS中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)で非特異的結合ブロックを行った。血清サンプルの連続希釈を、1:100から始まる希釈バッファ(PBS中0.5%BSA)で調製した。したがって、対応する希釈係数(100)をアッセイの検出下限(LOD)として定義した。次いで、サンプルをmAb AまたはmAb Bでコーティングしたプレート(100μL/ウェル)に加え、4℃で16~18時間インキュベートした。希釈バッファのみを添加したウェルは、バックグラウンドシグナルを決定するために含めた。その後、プレートで捕捉されたmAb AまたはmAb B特異的MAHAを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗マウスFcγを40ng/mLで使用して検出した。発色性HRP基質、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)を使用してHRP活性を検出し、その結果得られる450nm(OD450)での光学密度をPerkin Elmer Victor X4マルチモードプレートリーダーで読み取った。結合シグナル対希釈係数のデータを、GraphPad Prismソフトウェアを使用した非線形回帰により解析し、力価を算出した。MAHA力価は、アッセイのバックグラウンドシグナルの二倍に相当する結合シグナルに対応する血清サンプルの計算された希釈係数として定義した。
二つのリードmAbは、明確に異なる複合体をタンパク質Yと形成した。試験した全ての条件下で、mAb リードAは、mAb リードBよりも、より小さく、より不均質性の少ない複合体を、タンパク質Yと形成した(図4A~図4C、表3~表5)。
方法
サンプル調製
サンプルをpH7.4の1X DPBSで調製し、A4F-MALLSによる総タンパク質の分画前に室温で2時間インキュベートした。サンプルは以下のとおりであった:
1mMの抗タンパク質Z mAb1+二次mAb(0.5μM+0.5μM)+1μMの補体タンパク質Z(7つの組み合わせ)または1mMの抗タンパク質Z mAb6+抗タンパク質Z mAb7(0.5μM+0.5μM)+1μMの補体タンパク質Z。二次抗体のリストは表6に見出すことができる。
すべてのサンプルは、周囲温度で合計2時間インキュベートし、4℃でろ過せずに維持した後、4kDaのMWCO親水性PES(PESH)膜を使用して、W350スペーサーホイル(スペーサー厚さ350μm、スペーサー幅2.2cm)を取り付けたEclipse(商標)短チャネルに注入した。チャネルを、各サンプルの注入前に、移動相バッファ(10mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH7.0±0.1)で予め平衡化した。BSA(2mg/mL;10μgサンプル量)を別々に注入し、システム適合性対照として含めた。
代替経路(AP)溶血アッセイを補体活性化の尺度として使用して、抗タンパク質Z mAbがウサギ赤血球(RbRBC)の溶解を阻害する能力を評価した。膜侵襲複合体によるウサギ赤血球の溶解は、補体活性化を実験的に測定するアッセイの基礎である。
式3:
この式では、「バックグラウンド細胞溶解」は、血清を含まないGVB-Mg2+/EGTAバッファのみでインキュベートした細胞からのA412nmでのODである。「最大細胞溶解」は、水で処理された細胞からのA412nmでのODである。溶解の最大阻害は、曲線の最低値と最高値との差を、最高値の割合として表したものとして計算した。データは平均値±平均値の標準誤差で表した。
COMP1 mAbまたは他のタンパク質Z mAbと組み合わせた抗タンパク質Z mAb1(リード抗タンパク質Z mAb)は、溶血を完全にブロックしない単剤療法(図6A、表7)と比較して、代替経路の活性化を介してウサギRBCの溶血を完全にブロックする(図6B、表8)。全ての抗タンパク質Z mAb1:抗タンパク質Z mAbの組み合わせがウサギRBCの溶血を完全にブロックしたため、免疫原性および/または標的介在性クリアランスなど、薬剤開発中のmAbの薬物動態(PK)に関する知見を提供することができる、大きさ、形状および配向などの複合体形成における差異があるかどうかを判定することは重要であった。
方法
添加の順序が複合体形成に影響を及ぼすかどうかを判定するために、COMP1 mAbとタンパク質Zの等モル混合物を1X DPBS、pH7.4で調製し、1μMのCOMP1 mAb:1μMのタンパク質Zのモル比を得て、周囲温度で1時間インキュベートした。インキュベーション後、様々な量の抗タンパク質Z mAb1を、予め形成されたCOMP1 mAb:タンパク質Z複合体に添加し、pH7.4の1X DPBSで希釈して、以下のモル比を得た:0.3μMの抗タンパク質Z mAb1:1μMの COMP1 mAb:1μMのタンパク質Z、1μMの 抗タンパク質Z mAb1:1μMのCOMP1 mAb:1μMのタンパク質Z、および3μMの抗タンパク質Z mAb1:1μMのCOMP1 mAb:1μMの タンパク質Z。そして、機器に注入する前にさらに一時間インキュベートした。実施例3のA4F MALLS分析方法に従った。
抗タンパク質Z mAb1が他の成分に対して同時に(図12A、表15)、または順次(図12B、表15)添加されたかどうかに関わらず、モル質量および分布に関して同様の複合体が、抗タンパク質Z mAb1、COMP1 mAb、およびタンパク質Zの間に形成された。二つのデータセット間で観察された溶出時間のわずかなシフトは、本方法に固有の変動性を示すものであり、異常とはみなされない。
方法
A4F-MALLS移動相バッファ
移動相バッファ(10mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH7.0±0.1)は、1.4gのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、10.7gのリン酸二塩基性七水和物、および500mLの5M塩化ナトリウムを混合することにより調製され、次いで、この溶液をHPLCグレードの水で5.0Lの容量にした。バッファの最終測定pHは7.0であった。移動相バッファは使用前にろ過した(0.2μm)。
A4F-MALLSシステムは、紫外線(UV)ダイオードアレイ検出器、Wyatt Technology Dawn HELEOS(登録商標)IIレーザー光散乱装置(LS)、およびOptilab(登録商標)T-rEX示差屈折計(RI)検出器を備えたAgilent 1200シリーズHPLCシステムに連結されたEclipse(商標)3+ A4F分離システムで構成されている。検出器は、以下の順序で直列に接続した。UV-LS-RI。LSおよびRI検出器は、Wyatt Technologyが提供する指示に従って較正された。
A4F-MALLSを使用して、タンパク質Wと、二量体のマルチドメインリガンドと、リガンド内の異なるドメインに特異的に結合するいくつかの抗タンパク質W抗体との間に形成された複合体の相対的なサイズ分布を評価した。タンパク質Wとの潜在的な抗体複合体の理論的なモル質量および予測される化学量論を、表16に示す。
本明細書に引用されるすべての参照文献は、その全体を参照することにより組み込まれる。本発明は、その主旨および本質的な特質から逸脱することなく、他の具体的な形態で具現化されてもよく、したがって、前述の記載ではなく、本発明範囲を示す添付の請求の範囲に対して参照がなされるべきである。
Claims (25)
- サンプル中の不均質なタンパク質複合体の化学量論およびサイズ分布を評価するための方法であって、以下の工程:
前記サンプルを、非対称フロー式フィールドフロー分画(A4F)によって分画する工程と、
多角度レーザー光散乱(MALLS)を使用して、前記サンプル中の前記不均質なタンパク質複合体のモル質量、化学量論、およびサイズ分布を決定する工程であって、不均質なタンパク質複合体が、リガンドに結合した二つ以上の抗体を含む不均質なタンパク質:リガンド複合体またはリガンドに結合した二つ以上の融合タンパク質を含む不均質な融合タンパク質:リガンド複合体を含む、工程と
を含む、前記方法。 - 前記リガンドが、可溶性リガンドである、請求項1に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体中の前記抗体が、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である、請求項1または2に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体中の前記抗体が、二重特異性抗体、またはその抗原結合断片である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体中の前記抗体が、同種の抗体である、請求項1に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体中の前記抗体が、2種類以上の抗体を含む、請求項1に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体が、2:1の抗体対リガンドモル比を有する抗体:リガンド複合体である、請求項1に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体が、3:2の抗体対リガンドモル比を有する抗体:リガンド複合体である、請求項1に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体が、2:3の抗体対リガンドモル比を有する抗体:リガンド複合体である、請求項1に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体が、3:3の抗体対リガンドモル比を有する抗体:リガンド複合体である、請求項1に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体が、3:4の抗体対リガンドモル比を有する抗体:リガンド複合体である、請求項1に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体が、4:4の抗体対リガンドモル比を有する抗体:リガンド複合体である、請求項1に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体が、6:6の抗体対リガンドモル比を有する抗体:リガンド複合体である、請求項1に記載の方法。
- 不均質な融合タンパク質:リガンド複合体中の融合タンパク質がFc融合タンパク質を含む、請求項1に記載の方法。
- Fc融合タンパク質が受容体Fcタンパク質である、請求項14に記載の方法。
- 受容体Fcタンパク質がTRAPタンパク質である、請求項15に記載の方法。
- TRAPタンパク質がVEGFトラップである、請求項16に記載の方法。
- VEGFトラップがアフリベルセプトである、請求項17に記載の方法。
- 不均質な融合タンパク質:リガンド複合体が、リガンドに結合した2つ以上の融合タンパク質を含む、請求項1に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体が700kDa~8000kDaの分子量を有する、請求項1に記載の方法。
- 不均質なタンパク質:リガンド複合体が500kDa~4000kDaの分子量を有する、請求項1に記載の方法。
- A4Fが、厚さ350μm、幅2.2cmのW350スペーサーホイルを有するチャネルで実施される、請求項1に記載の方法。
- A4Fが、厚さ490μm、幅2.2cmのW490スペーサーホイルを有するチャネルで実施される、請求項1に記載の方法。
- 分画する工程が、(i)A4Fチャネルのサンプル入口ポートへのサンプルの注入、および(ii)それに次ぐ、キャリア流体を入口ポートおよび出口ポートからチャネル内に流入させることによる、サンプルの集束を含む、請求項1に記載の方法。
- より小さなタンパク質:リガンド複合体がより大きなタンパク質:リガンド複合体より前に溶出する、請求項24に記載の方法。
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