CN112601963B - 用于表征蛋白质复合物的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于表征在蛋白质药物产物和可溶性配体之间形成的蛋白质复合物的方法。所公开的方法可以确定蛋白质复合物的大小、异质性和构象。

Description

用于表征蛋白质复合物的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年8月30日提交的美国临时专利申请号62/724,700的权益和优先权，该临时专利申请以引用的方式整体并入。

技术领域

本发明整体涉及表征蛋白质复合物的***和方法。

背景技术

单克隆抗体(mAb)是一个正在发展的治疗领域，目前市场上有50多种单克隆抗体在售。多于一种单克隆抗体的组合疗法具有改善现有的单药疗法的功效的潜力。某些可溶性物质，尤其是具有若干重复表位的多聚体物质，可以两种或多种抗体结合，导致形成大型复合物。大型异质性抗体复合物的产生被称为“纸娃娃换装(paper-dolling)”。大型复合物可以被吞噬作用迅速消除，从而减少抗体的功效。大型蛋白质复合物也可以增加mAb的免疫原性。

蛋白质复合物的大小范围从纳米到可见颗粒，使它们难以通过单一分析技术来表征。一种用于确定从约1nm至约1μ的颗粒大小的最普遍的技术之一是动态光散射法(DLS)。DLS是一种用于确定蛋白质大小分布谱的分析技术，适用于高通量应用(Zhou，M.，et al.，ChemMedChem，11：738-756(2016))。蛋白质在溶液中的布朗运动导致光发生散射，由此产生的散射强度随着颗粒大小而波动。因此，就多分散性而言，可以确定分布的平均半径和宽度。然而，DLS结果通常偏向较大的颗粒，并且颗粒必须相差至少三倍才能解决。因此，仅DLS不足以分析蛋白质复合物。

由于蛋白质复合物的宽泛的大小范围，很多聚集体样品的高多分散性需要基于分离的方法来提供更详细的信息。分子排阻色谱法(SEC)是目前最常用的蛋白质分离色谱技术(Brusotti，et al.，Chromatographia，81：3-23(2018))。在SEC中，根据分子的流体动力学体积或大小进行分离。较小的分子的保留时间更长，因为它们能够扩散到固定相的孔中，而较大的分子则首先洗脱，因为它们被排除在孔外。然而，SEC受到分子量排阻限、样品至固定相的吸附、高压和高流速下的剪切降解以及无法根据组成来分离分析物的限制。

当流场流动分馏法(FFF)被用于分离大型蛋白质和高摩尔质量聚合物时，它是有前景的SEC的替代方法。FFF样品分离使用流动辅助分离和分馏方法，其中分析物通过扩散系数的差异沿着带状通道分离(Fraunhofer，W.and Winter，G.，Eur.J.Pharm.Biopharm，58：369-383(2004))。FFF可以分离宽泛的大小范围(从纳米到微米)的分析物。FFF的开放通道可减少样品损失、降低压力和降低剪切速率。虽然FFF已经与其他分子技术(诸如检测蛋白质聚集体的光散射法)组合使用，但是仍然越来越需要对蛋白质复合物(包括mAb和可溶性配体复合物)的异质性和构象进行更充分地表征。

因此，本发明的目的是提供用于鉴定具有形成大型蛋白质复合物能力的蛋白质药物产物的方法。

本发明的另一个目的是提供鉴定和表征蛋白质药物产物和可溶性配体复合物的方法。

发明内容

提供了用于表征样品中的蛋白质复合物的方法。一个实施方案提供了一种用于通过以下步骤来评估样品中的蛋白质复合物的化学计量和大小分布的方法：通过不对称流场流分馏法(A4F)来分馏样品，以及使用多角度激光光散射法(MALLS)来确定样品中的蛋白质复合物的摩尔质量、化学计量和大小分布。在一些实施方案中，蛋白质复合物含有抗体或结合至抗体的配体的融合蛋白。配体通常是可溶性配体。配体可以是单体或多聚体。在一个实施方案中，配体可以是同源二聚体或异源二聚体。在另一个实施方案中，蛋白质复合物包含抗体∶配体复合物或融合蛋白∶配体复合物或者由抗体∶配体复合物或融合蛋白∶配体复合物组成。

另一个实施方案提供了一种用于通过以下步骤来选择先导蛋白质药物产物的方法：将第一蛋白质药物产物添加至它的靶标或配体以产生蛋白质∶配体复合物，以及将第二蛋白质药物产物添加至第一蛋白质药物产物∶配体复合物以形成多种蛋白质∶配体复合物。所述方法包括分离蛋白质∶配体复合物，以及使用不对称流场流分馏法-MALLS法来确定蛋白质∶配体复合物的摩尔质量、化学计量和大小分布。所述方法还包括选择形成较少的大型蛋白质∶配体复合物的蛋白质药物产物作为先导靶标蛋白质药物。通常，蛋白质药物产物是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白。在一些实施方案中，配体是可溶性配体。配体可以是单体或多聚体。在一些实施方案中，大型蛋白质复合物是异源性的。

另一个实施方案提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有使用上文所述的方法来选择的先导蛋白质药物产物。

在一些实施方案中，所公开的方法可以被用于确定靶向相同的配体的两种单独的抗体是否将形成大型异质性复合物。

又一个实施方案提供了一种用于表征在蛋白质药物产物和可溶性配体之间形成的蛋白质复合物的方法，所述方法通过制备含有蛋白质药物产物及其配体的样品以产生蛋白质药物产物∶配体复合物来进行。所述方法包括分馏蛋白质药物∶配体复合物，以及通过多角度激光光散射法来分析所分馏的蛋白质药物∶配体复合物，以确定蛋白质复合物的摩尔质量和异质性。在一个实施方案中，通过不对称流场流分馏法来进行总蛋白的分馏。蛋白质的浓度通过UV/Vis来确定。

可以通过比较由不同的蛋白质药物产物形成的蛋白质药物产物∶配体复合物的洗脱谱/时间来确定由不同的蛋白质药物产物与相同的配体形成的蛋白质复合物的构象差异。具有相同的摩尔质量的复合物的不同洗脱谱/时间表明，复合物可以具有不同的构象或形状。在一个实施方案中，分别分析每种蛋白质药物产物和相同的可溶性配体，以计算每种单独组分的摩尔质量，其中每种组分的摩尔质量被用于确定每种蛋白质复合物中的所述组分的估算化学计量。

另一个实施方案提供了一种用于表征在蛋白质药物产物和可溶性配体之间形成的蛋白质复合物的方法，所述方法通过以下步骤来进行：使用不对称流场流分馏法来分馏蛋白质药物产物∶配体复合物，通过多角度激光光散射法来分析所分馏的蛋白质药物产物∶配体复合物，以表征蛋白质药物∶配体复合物的摩尔质量、化学计量或它们二者，以及通过将每种蛋白质复合物的大小与每种单独组分的估计大小进行比较来确定构成每种复合物的组分的异质性。

附图说明

图1A是一个抗体和一个配体之间形成的复合物的图示。图1B是一个抗体和两个配体之间形成的复合物的图示。图1C是四个抗体和五个配体之间形成的复合物的图示，它代表“纸娃娃换装”。

图2A-2B是处于非线性构象的抗体1(黑色)、两个配体和抗体2(灰色)之间形成的复合物的图示。图2C-2D是处于线性构象的抗体1(黑色)、两个配体和抗体2(灰色)之间形成的复合物的图示。

图3A是来自Ab1、蛋白质X以及摩尔比为5∶1、1∶1和1∶5的Ab1和蛋白质X的组合的SEC-MALLS分析的色谱图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)，右Y轴表示在280nm处的吸光度(AU)。图3B是来自摩尔比为5∶1、1∶1和1∶5的Ab1和Ab2的组合的不对称流场流分馏法-MALLS法(A4F-MALLS)的分级图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)。右Y轴表示在215nm处的吸光度(AU)。

图4A是来自先导化合物A(先导物A)、先导物A+蛋白质Y(1∶3)和先导化合物B(先导物B)+蛋白质Y(1∶3)的A4F-MALLS分析的分级图。图4B是来自先导物A、先导物A+蛋白质Y(1∶1)和先导物B+蛋白质Y(1∶1)的A4F-MALLS分析的分级图。图4C是来自先导物A、先导物A+蛋白质Y(3∶1)和先导物B+蛋白质Y(3∶1)的A4F-MALLS分析的分级图。X轴表示时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)，右Y轴表示在215nm处的吸光度(AU)。

图5A和5B是抗蛋白质Y复合物与先导物A(图5A)和先导物B(图5B)的小鼠抗人抗体滴定度的线图。X轴表示时间(天)，Y轴表示浓度(μg/ml)。

图6A和6B是显示随着各种抗蛋白质Z mAb(图6A)或Ab3和各种抗蛋白质Z mAb的组合(图6B)的浓度增加的兔红细胞的溶血百分比的线图。X轴表示mAb的浓度(对数[M])。Y轴表示溶血百分比。

图7是来自游离的抗蛋白质Z mAb1、蛋白质Z以及抗蛋白质Z mAb1和蛋白质Z的1μM∶1μM组合的A4F-MALLS分析的分级图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)，右Y轴表示在215nm处的吸光度(AU)。

图8是来自游离的mAb、抗蛋白质Z mAb1和蛋白质Z的1μM∶1μM组合、抗蛋白质ZmAb1、抗蛋白质Z mAb5和蛋白质Z的0.5μM∶0.5μM∶1μM组合以及抗蛋白质Z mAb1、抗蛋白质ZmAb7和蛋白质Z的0.5μM∶0.5μM∶1μM组合的A4F-MALLS分析的分级图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)，右Y轴表示在215nm处的吸光度(AU)。

图9是来自游离的mAb组合、抗蛋白质Z mAb1和蛋白质Z的1μM∶1μM组合、抗蛋白质ZmAb1、抗蛋白质Z mAb3和蛋白质Z的0.5μM∶0.5μM∶1μM组合、以及抗蛋白质Z mAb1、抗蛋白质Z mAb6组合和蛋白质Z的0.5μM∶0.5μM∶1μM组合、以及抗蛋白质Z mAb6、抗蛋白质Z mAb7和蛋白质Z的0.5μM∶0.5μM∶1μM组合的A4F-MALLS分析的分级图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)，右Y轴表示在215nm处的吸光度(AU)。

图10是来自游离的mAb组合、抗蛋白质Z mAb1和蛋白质Z的1μM∶1μM组合、抗蛋白质Z mAb1、抗蛋白质Z mAb2和蛋白质Z的0.5μM∶0.5μM∶1μM组合以及抗蛋白质Z mAb1、COMP1mAb和蛋白质Z的0.5μM∶0.5μM∶1μM组合的A4F-MALLS分析的分级图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)，右Y轴表示在215nm处的吸光度(AU)。

图11是来自游离的mAb组合、抗蛋白质Z mAb1和蛋白质Z的1μM∶1μM组合、抗蛋白质Z mAb1、抗蛋白质Z mAb4和蛋白质Z的0.5μM∶0.5μM∶1μM组合的A4F-MALLS分析的分级图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)，右Y轴表示在215nm处的吸光度(AU)。

图12A和12B是来自同时添加(图12A)或按顺序添加(图12B)0.3μM∶1μM∶1μM抗蛋白质Z mAb1∶COMP1 mAb∶蛋白质Z、1μM∶1μM∶1μM抗蛋白质Z mAb1∶COMP1 mAb∶蛋白质Z以及3μM∶1μM∶1μM抗蛋白质Z mAb1∶COMP1 mAb∶蛋白质Z的A4F-MALLS分析的分级图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)，右Y轴表示在215nm处的吸光度(AU)。

图13是来自代表性mAb、蛋白质W以及比率为1μM∶1μM的mAb和蛋白质W的组合的A4F-MALLS分析的分级图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mo1)，右Y轴表示在215nm处的吸光度(AU)。

图14是来自代表性mAb、蛋白质W、以及比率为1μM∶1μM的mAb2和蛋白质W、mAb3和蛋白质W、COMP1和蛋白质W的组合的A4F-MALLS分析的分级图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)，右Y轴表示在215nm处的吸光度(AU)。

图15是来自COMP2、蛋白质W以及比率为1μM∶1μM的COMP2和蛋白质W的组合的A4F-MALLS分析的分级图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)，右Y轴表示在215nm处的吸光度(AU)。

图16是来自代表性mAb、蛋白质W、以及比率为1μM∶1μM的mAb4和蛋白质W、COMP3和蛋白质W的组合的A4F-MALLS分析的分级图。X轴表示洗脱时间(分钟)。左Y轴表示摩尔质量(g/mol)，右Y轴表示在215nm处的吸光度(AU)。

具体实施方式

I.定义

应当理解，本公开不限于本文所述的组合物和方法以及所述的实验条件，因为它们可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述某些实施方案的目的，而不旨在进行限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限定。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然与本文所述相似或等同的任何组合物、方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中。但是所提及的所有出版物均以引用的方式整体并入本文。

在描述目前要求保护的发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)术语“一个”、“一种”、“所述”和类似的指代词的使用应解释为涵盖单数和复数二者，除非本文另外指明或与上下文明显矛盾。

除非本文另外指明，否则本文中数值范围的列举仅旨在作为分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，如同所述值在本文中被单独列举那样。

术语“约”的使用旨在描述大于或小于所述值的大约+/-10％范围内的值；在其他实施方案中，所述值可以在大于或小于所述值的大约+/-5％范围内的值的范围内；在其他实施方案中，所述值可以在大于或小于所述值的大约+/-2％范围内的值的范围内；在其他实施方案中，所述值可以在大于或小于所述值的大约+/-1％范围内的值的范围内。前述范围旨在通过上下文明确，并且不暗示进一步的限制。除非本文另外指明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。

“蛋白质”是指包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸残基的分子。蛋白质包括多肽和肽，并且还可以包含修饰，诸如糖基化、脂质附接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、烷基化、羟基化和ADP-核糖基化。蛋白质可以具有科学或商业意义，包括基于蛋白质的药物，并且蛋白质包括酶、配体、受体、抗体以及嵌合或融合蛋白等等。蛋白质使用熟知的细胞培养方法通过各种类型的重组细胞来产生，并且通常通过基因工程技术(例如编码嵌合蛋白的序列、或密码子优化的序列、无内含子的序列等等)引入细胞中，蛋白质可以作为附加体驻留在细胞中或整合进细胞的基因组中。

“抗体”是指由四条多肽链(通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链)组成的免疫球蛋白分子。每条重链都具有重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链都具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH和VL区还可以细分为高变区(称为互补决定区(CDR))，所述高变区之间散布有更保守的区域(称为构架区(FR))。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按照下述次序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括对任何同种型或亚类的糖基化的和非糖基化的免疫球蛋白的提及。术语“抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体分子，诸如从转染以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。术语抗体还包括双特异性抗体，所述双特异性抗体包括可以结合至多于一个不同的表位的异源四聚体免疫球蛋白。双特异性抗体通常在美国专利号8,586,713中有所描述，该专利以引用的方式并入本申请。

“Fc融合蛋白”包含两种或更多种蛋白质的一部分或全部，其中一部分是免疫球蛋白分子的Fc部分，该部分在自然界中不会另外共同存在。包含融合至抗体源性多肽的各个部分(包括Fc结构域)的某些异源性多肽的融合蛋白的制备已有所描述，例如Ashkenazi etal.，Proc.Natl.Acad.ScL USA 88：10535，1991；Byrn et al.，Nature 344：677，1990；andHollenbaugh et al.，″Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins″，inCurrent Protocols in Immunology，Suppl.4，pages 10.19.1-10.19.11，1992。“受体Fc融合蛋白”包含偶联至Fc部分的受体的一个或多个胞外结构域，在一些实施方案中，所述胞外结构域包括铰链区，然后是免疫球蛋白的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fc融合蛋白包含结合至一个或多个配体的两个或更多个不同的受体链。例如，Fc融合蛋白是Trap，例如IL-1 Trap或VEGF Trap。

如本文所用，“可溶性配体”是指不容易穿过细胞质膜的极性或带电配体。大多数可溶性配体结合至细胞表面受体的胞外结构域。

“A4F”表示不对称流场流分馏法，这是一种通过样品与外部垂直物理场的相互作用实现分析物的分离的分馏技术。

多角度光散射法(MALS)描述了一种用于测量被样品散射到多个角度的光的技术。它可用于通过检测分子如何散射光来确定溶液中分子的绝对摩尔质量和平均大小。最常用的是来自激光来源的准直光，在这种情况下，该技术可以称为多角度激光光散射法(MALLS)。实际上，术语MALS和MALLS可互换使用。

如本文所用，“布朗运动”是指悬浮在液体中的颗粒的连续运动。

II.用于表征蛋白质复合物的方法

单克隆抗体组合疗法已成为一种针对涉及多个信号传导通路的疾病(诸如癌症和炎性病症)的有前途的治疗策略。此外，当单独的单药疗法不能完全抑制通路时，多于一种靶向相同的通路的单克隆抗体的施用可以有利于完全阻断涉及疾病的发病机理的通路。然而，治疗性mAb与可溶性多聚体靶标的结合可以导致大型异质性复合物的形成。蛋白质复合物的大小、形状和构象可以影响免疫原性和抗体清除时间等因素。蛋白质复合物的分析对于在药物开发过程中提供对mAb的药代动力学的深入了解至关重要。

因此，提供了用于表征蛋白质复合物的方法和***。一个实施方案提供了一种用于通过以下步骤来评估样品中的异质性蛋白质药物产物∶配体复合物的化学计量和大小分布的方法：使用不对称流场流分馏法来分馏样品，以及使用多角度激光光散射法来确定样品中的异质性蛋白质复合物的摩尔质量、化学计量和大小分布。蛋白质复合物通常由特异性结合至所关注的蛋白质的蛋白质组成，所述所关注的蛋白质也称为靶标或配体。在一个实施方案中，特异性结合至靶标的蛋白质是抗体或融合蛋白。

当抗体或融合蛋白在体内或体外与其靶标或配体结合时，可以形成抗体∶配体或融合蛋白∶配体的异质性混合物。在一个实施方案中，治疗性蛋白质(诸如单克隆抗体(mAb)或融合蛋白)与可溶性多聚体靶标的结合产生大型异质性复合物或大型异聚体复合物。例如，大型蛋白质复合物可以表征为具有选自由3∶2、2∶3、4∶4、6∶6或[2∶2]_n组成的组的蛋白质∶配体比率的蛋白质复合物。大型异质性复合物是指在多个多聚体配体分子和多个蛋白质药物产物分子之间形成的复合物。术语大型异聚体复合物是指由两种不同的蛋白质药物产物(例如两种不同的抗体、两种不同的融合蛋白)结合的配体，或者在不同的位点结合相同的配体的抗体和融合蛋白。

另一个实施方案提供了一种鉴定在体内、体外或它们二者与可溶性靶标形成大型异质性复合物的蛋白质药物产物的方法。所述方法包括制备含有蛋白质药物产物及其可溶性配体的样品，以产生蛋白质药物产物∶配体复合物，分馏样品以分离蛋白质药物产物∶配体复合物，以及通过多角度激光光散射法来分析所分馏的蛋白质药物产物∶配体复合物，以确定蛋白质复合物的大小和异质性。在一个实施方案中，使用不对称流场流分馏法来分馏蛋白质样品。

下文提供了所公开的方法和***的更多细节。

A.用于表征蛋白质复合物的***

在一个实施方案中，所述***包括不对称流场流分馏(A4F)***和多角度激光光散射(MALLS)***。可商购获得的A4F***的一个实例是Eclipse^TM 3+A4F分离***。可商购获得的MALLS***的一个实例是Wyatt Technology DawnII激光光散射仪。所述***通常包括UV/VIS检测器和/或折射率检测器。示例性的可商购获得的UV/VIS检测器是Agilent1260Infinity UV检测器。示例性的可商购获得的折射率检测器是/>T-rEX折射率检测器。在一个实施方案中，A4F***包括配备有350W间隔物和4kDa MWCO亲水性PES(PESH)膜的A4F短通道。在另一个实施方案中，A4F短通道配备有490W间隔物和10kDa MWCO/>再生纤维素膜。示例性的流动相包括在pH7.0下的10mM磷酸盐和500mM NaCl。然而，A4F优于柱色谱分离的一个优点是对流动相的类型或可使用的载液没有限制。在一个实施方案中，在60分钟内使用线性梯度来分离样品。在一个实施方案中，对通道流和错流程序进行了特别优化，以根据具体情况实现所期望的分离度。应当理解，本领域的技术人员可以根据使用A4F分离的特定样品所需的分离度来修改和优化洗脱谱。

通常，将样品进样至A4F通道的样品入口。然后通过允许载液从入口和出口二者流入通道中，在通道中的一个点处(通常靠近样品入口)汇合，从而对样品进行聚焦，以形成聚焦区。在聚焦期间，将来自进样样品的颗粒保持在该聚焦区域中，以允许在分馏之前松弛。最后一步是颗粒的分馏。当颗粒沿着通道流动时，垂直相对的错流分离场将分子推向通道的底部。当它们积聚在通道的底部附近时，它们克服错流场反向扩散回通道中。分子可以扩散回通道的程度取决于它们的自然布朗运动，所述布朗运动是由平移扩散系数定义的特征，继而涉及每种单独物类独特的大小和形状。通常，较小的颗粒具有比较大的颗粒更快的扩散系数，并且能够克服错流场而更高地扩散到通道中。通道内的层流速率是不均匀的。它以抛物线模式行进，流的速度朝向通道的中心增加，并且朝向通道的上壁和下壁减少。因此，颗粒行进的速率将取决于它们在通道内的位置。定位于通道中心附近的那些扩散较快的物质将以较高的速度运输。通道底部积聚壁附近的较浅、移动速度较慢的流中的较大颗粒以较低的流速传输，并且洗脱晚于较小的颗粒。这可以实现基于质量的颗粒温和分离，洗脱顺序从最小到最大。

当样品流过A4F通道时，样品的先导部分通过出口离开通道。多角度激光光散射(MALLS)检测器与A4F***流体连通，并且从A4F出口接收样品。在一些实施方案中，样品首先流过UV/VIS检测器，以测量作为吸光度函数的样品浓度。MALLS***将一束偏振光(或激光)聚焦到样品分子上，并且用光探测器来检测散射光。

多角度光散射法(MALS)测量从含有分子、颗粒或蛋白质复合物的样品中散射的光。这种散射取决于设置的光学结构，在典型的实验实现中，然后以一个或若干不同的角度检测光。在单散射角解决方案中，三种最受欢迎的设计是90度(也称为直角光散射或RALS)、7度(也称为低角度光散射或LALS)或173度(也称为非侵入性逆散射或NIBS)。在多角度设置中，原则上存在角度固定的设置(最通常称为MALS或MALLS设置)和角度可变的设置(通常称为光散射测角仪或光谱仪)。MALS通常是指具有多个固定角度的***，该***被用作颗粒分离设置的一部分，例如A4F。MALS的最广泛应用是用作与浓度检测器(如RI或单波长UV)结合的绝对摩尔质量检测器。

MALS可以用于测量：M_w-蛋白质复合物的重均摩尔质量；R_g-蛋白质复合物的平均半径；以及A₂-蛋白质在溶液中的溶解度。

B.表征蛋白质复合物的方法

所公开的***和方法可以用于表征蛋白质复合物，例如样品中的蛋白质药物产物∶配体复合物。一个实施方案提供了一种用于通过以下步骤来评估样品中的异质性蛋白质复合物的化学计量和大小分布的方法：通过不对称流场流分馏法(A4F)来分馏样品，以及使用多角度激光光散射法(MALLS)来确定样品中的蛋白质复合物的摩尔质量、化学计量和大小分布，其中所述复合物包含抗体∶配体复合物或融合蛋白∶配体复合物或者由抗体∶配体复合物或融合蛋白∶配体复合物组成。在一些实施方案中，配体是可溶性配体。通常，抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，蛋白质复合物的特征在于其抗体或融合蛋白与配体的比率。在一个非限制性实例中，抗体或融合蛋白与配体的比率可以选自由1∶0、0∶1、1∶1、1∶2、2∶1、2∶2、3∶2、2∶3、4∶4、6∶6或[2∶2]_n组成的组。应当理解，抗体或融合蛋白与配体的比率将取决于所测试的特异性抗体或融合蛋白和配体。

1.蛋白质复合物的混合物

为了确定蛋白质复合物的特征，可以通过实验确定复合物的每种组分的摩尔质量，以计算具有不同化学计量的复合物的预期摩尔质量。在一个实施方案中，分别分析混合物中的每种蛋白质和配体，以确定每种组分的摩尔质量。在一个实施方案中，将蛋白质药物产物及其配体混合，以形成蛋白质药物产物∶配体复合物，然后对所述复合物进行表征。对所分馏的蛋白质药物产物∶配体进行A4F-MALLS，以确定复合物的摩尔质量。然后将所分馏的复合物的计算值与实验确定的单个组分的摩尔质量进行比较，以确定每种复合物中存在的单个组分的可能的化学计量比率。在一个实施方案中，所述方法可以检测1∶1蛋白质药物产物∶配体复合物。在另一个实施方案中，所述方法可以检测任何比率的蛋白质药物产物∶配体。在一个非限制性实例中，所述方法可以检测1∶0、0∶1、2∶1、1∶2、2∶2、3∶2、2∶3、4∶4、6∶6或[2∶2]_n的蛋白质药物产物∶配体复合物。应当理解，抗体或融合蛋白与配体的比率将取决于所测试的特异性抗体或融合蛋白和配体。在一些实施方案中，复合物含有与常见可溶性配体复合的多种不同的蛋白质药物产物。

a.配体

蛋白质药物产物∶配体复合物中的配体可以是单体或多聚体配体。在一个实施方案中，配体是可溶性配体。在一些实施方案中，可溶性配体对应于跨膜蛋白的胞外部分，包括但不限于跨膜受体蛋白。

单体配体仅含有一个蛋白质或一个蛋白质单元。多聚体配体可以是例如含有多个蛋白质或蛋白质亚基的二聚体、三聚体等。例如，配体可以是同源二聚体或异源二聚体。在一些实施方案中，多聚体配体结合至多于一个分子的蛋白质药物产物。图1A显示了示例性的1∶1抗体∶配体复合物。图1B显示了示例性的1∶2抗体∶配体复合物，图1C显示了“纸娃娃换装”效应的一个实例，其中内部抗体的每个臂结合至不同的配体，以产生大型异质性复合物。

在一个实施方案中，大型异质性蛋白质药物产物∶配体复合物具有的大小为500kDa或更大。在另一个实施方案中，异质性蛋白质药物产物∶配体复合物具有的大小为500-4000kDa。在另一个实施方案中，大型异质性蛋白质药物产物∶配体具有3∶2、2∶3、4∶4或6∶6的蛋白质药物产物∶配体的比率。

在一个实施方案中，所公开的方法被用于确定设计为靶向多聚体配体的先导蛋白质药物产物是否将形成大型异质性蛋白质药物产物∶配体复合物。

在一个实施方案中，所公开的方法可以被用于确定多聚体配体是否将与多于一种蛋白质药物产物或融合蛋白形成复合物。可以形成的复合物包括但不限于1∶0、0∶1、2∶1、1∶2、2∶2、3∶2、2∶3、4∶4、6∶6或[2∶2]_n的蛋白质∶配体比率。图1A-1C显示了可以在多聚体配体和单克隆抗体之间形成的示例性复合物。

b.多种mAb的组合

使用多种蛋白质药物产物来靶向相同的通路或相同的配体的组合疗法正在日益普及。在一些实施方案中，所公开的方法可以被用于基于由蛋白质药物产物形成的蛋白质复合物的化学计量和大小分布来区分靶向相同的配体的抗体的不同组合。当两种蛋白质药物产物与单体配体混合在一起时，蛋白质药物产物可能形成异聚体复合物。如本文所定义，异聚体复合物是指结合相同的靶分子的两种不同的蛋白质药物产物。此外，相同抗体的两个臂中的每个具有结合两个配体的能力，所述配体也可以被第二抗体结合以形成异聚体复合物。图2A-2D显示了代表性异聚体复合物。图2A和2C显示了当一个蛋白质药物产物(黑色)或抗体结合两个配体时形成的复合物，并且一个配体也被第二独特的蛋白质药物产物(灰色)结合。如果灰色蛋白质被另一个配体结合，所述配体又被黑色蛋白质结合，则可以形成更大、更具异质性的复合物，如图2B和2D所示。

2.选择先导蛋白质药物产物

另一个实施方案提供了一种用于通过以下步骤来选择先导蛋白质药物产物的方法：将第一蛋白质药物产物添加至包含第一蛋白质药物产物的靶标的第一样品，以产生异质性蛋白∶配体复合物，以及将第二蛋白质药物产物添加至含有靶标的第二样品，以形成蛋白质∶配体复合物。所述方法包括分离异质性蛋白质∶配体复合物，以及使用不对称流场流分馏法-多角度激光光散射法来确定异质性蛋白质∶配体复合物的大小分布和化学计量。所述方法还包括选择形成较少异质性蛋白质∶配体复合物的蛋白质药物产物作为先导靶标蛋白质药物。在一些实施方案中，配体是可溶性配体。可溶性配体可以是单体配体或多聚体配体。通常，蛋白质药物产物是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白。可以将蛋白质复合物表征为具有选自但不限于由1∶0、0∶1、1∶1、1∶2、2∶1、2∶2、3∶2、2∶3、4∶4、6∶6或[2∶2]_n组成的组的抗体或融合蛋白与配体的比率的蛋白质复合物。另一个实施方案提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有使用上文所述的方法来选择的先导蛋白质药物产物。

3.确定蛋白质复合物的大小和形状

在一个实施方案中，所公开的方法可以被用于确定蛋白质复合物的大小。使用A4F来分离蛋白质药物产物和任选地可溶性配体的混合物。然后可以使用MALLS分析来确定蛋白质复合物的大小和化学计量。在MALLS分析中，将一束偏振光(或激光)聚焦到样品分子上，并且用光探测器来检测散射光。同时以各种不同角度检测散射光。每个角度的散射光的强度与复合物的摩尔质量成正比。在一个实施方案中，UV/Vis光谱法被用于确定每种蛋白质复合物的浓度。

在另一个实施方案中，可以使用所公开的方法来区分在不同的蛋白质药物产物与常见配体之间形成的蛋白质复合物的形状/构象。具有相同的摩尔质量的复合物之间的洗脱时间或洗脱谱的差异表明了蛋白质复合物的形状或构象的差异。具有相同或相似的摩尔质量但是具有不同的洗脱时间的复合物表明，由于复合物的形状或构象的差异，具有较慢的洗脱时间的复合物的流体动力学体积有所增加。

蛋白质复合物的摩尔质量和大小异质性可以被用于预测蛋白质药物产物的清除率。在一个实施方案中，蛋白质复合物越大，蛋白质药物产物从体内清除的速率越快。

C.蛋白质复合物中的蛋白质

在一个实施方案中，蛋白质复合物中的蛋白质之一是蛋白质药物产物或者是适合在原核或真核细胞中表达的所关注的蛋白质。例如，蛋白质复合物中的蛋白质可以是抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、ScFv或其片段、Fc融合蛋白或其片段、生长因子或其片段、细胞因子或其片段、或者细胞表面受体的胞外结构域或其片段。复合物中的蛋白质可以是由单个亚基组成的简单多肽，或者包含两个或多个亚基的复合多亚基蛋白质。所关注的蛋白质可以是生物药物产物、食品添加剂或防腐剂、或者需要纯化和质量标准品的任何蛋白质产物。

在一些实施方案中，蛋白质复合物中的蛋白质是抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双体、三体或四体、双特异性四价免疫球蛋白G样分子(称为双可变结构域免疫球蛋白(DVD-IG))、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG1抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG2抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG4抗体。在另一个实施方案中，抗体包含嵌合铰链。在另外其他实施方案中，抗体包含嵌合Fc。在一个实施方案中，抗体是嵌合IgG2/IgG4抗体。在一个实施方案中，抗体是嵌合IgG2/IgG1抗体。在一个实施方案中，抗体是嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗体。

在一些实施方案中，抗体选自由以下各项组成的组：抗程序性细胞死亡1抗体(例如，抗PD1抗体，如美国专利申请公开号US2015/0203579A1中所述)、抗程序性细胞死亡配体-1(例如，抗PD-L1抗体，如美国专利申请公开号US2015/0203580A1中所述)、抗Dll4抗体、抗血管生成素2抗体(例如，抗ANG2抗体，如美国专利申请公开号9,402,898中所述)、抗血管生成素样3抗体(例如，抗AngPtl3抗体，如美国专利号9,018,356中所述)、抗血小板源性生长因子受体抗体(例如，抗PDGFR抗体，如美国专利号9,265,827中所述)、抗Erb3抗体、抗催乳素受体抗体(例如，抗PRLR抗体，如美国专利号9,302,015中所述)、抗补体5抗体(例如，抗C5抗体，如美国专利申请公开号US2015/0313194A1中所述)、抗TNF抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如，抗EGFR抗体，如美国专利号9,132,192中所述，或者抗EGFRvIII抗体，如美国专利申请公开号US2015/0259423A1中所述)、抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9抗体(例如，抗PCSK9抗体，如美国专利号8,062,640或美国专利号9,540,449中所述)、抗生长和分化因子-8抗体(例如，抗GDF8抗体，也称为抗肌肉生长抑制素抗体，如美国专利号8,871,209或9,260,515中所述)、抗胰高血糖素受体(例如，抗GCGR抗体，如美国专利申请公开号US2015/0337045A1或US2016/0075778A1中所述)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、白介素4受体抗体(例如，抗IL4R抗体，如美国专利申请公开号US2014/0271681A1或美国专利号8,735,095或8,945,559中所述)、抗白介素6受体抗体(例如，抗IL6R抗体，如美国专利号7,582,298、8,043,617或9,173,880中所述)、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗白介素33(例如，抗IL33抗体，如美国专利号9,453,072或9,637,535中所述)，抗呼吸道合胞病毒抗体(例如，抗RSV抗体，如美国专利申请公开号9,447,173中所述)、抗分化簇3(例如，抗CD3抗体，如美国专利号9,447,173和9,447,173以及美国申请号62/222,605中所述)、抗分化簇20(例如，抗CD20抗体，如美国专利号9,657,102和US20150266966A1以及美国专利号7,879,984中所述)、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗分化簇48(例如，抗CD48抗体，如美国专利号9,228,014中所述)、抗Fel d1抗体(例如如美国专利号9,079,948中所述)、抗中东呼吸综合征病毒(例如，抗MERS抗体，如美国专利申请公开号US2015/0337029A1中所述)、抗埃博拉病毒抗体(例如如美国专利申请公开号US2016/0215040中所述)、抗寨卡病毒抗体、抗淋巴细胞活化基因3抗体(例如，抗LAG3抗体或抗CD223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如，抗NGF抗体，如美国专利申请公开号US2016/0017029和美国专利号8,309,088和9,353,176中所述)和抗蛋白质Y抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体选自由以下各项组成的组：抗CD3×抗CD20双特异性抗体(如美国专利申请公开号US2014/0088295A1和US20150266966A1中所述)、抗CD3×抗粘蛋白16双特异性抗体(例如，抗CD3×抗-Muc16双特异性抗体)和抗CD3×抗***特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗CD3×抗PSMA双特异性抗体)。在一些实施方案中，所关注蛋白质选自由以下各项组成的组：阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-阿托(adalimumab-atto)、阿多-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利西尤单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝佐洛单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗维汀(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、卡纳单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、塞妥珠单抗聚乙二醇(certolizumab pegol)、西米普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺单抗(denosumab)、迪妥昔单抗(dinutuximab)、度普利尤单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃洛妥珠单抗(elotuzumab)、艾米希组单抗(emicizumab-kxwh)、美坦新阿利西尤单抗(emtansinealirocumab)、依维那珠单抗(evinacumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、法西单抗(fasinumab)、戈利木单抗(golimumab)、古塞库单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依达赛珠单抗(idarucizumabn)、英夫利昔单抗(infliximab)、英夫利昔单抗-阿伯达(infliximab-abda)、英夫利昔单抗-dyyb(infliximab-dyyb)、伊匹单抗(ipilimumab)、依奇珠单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奈斯伐单抗(nesvacumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥必托昔单抗(obiltoxaximab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、雷珠单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、苏金单抗(secukinumab)、塞妥昔单抗(siltuximab)、托珠单抗(tocilizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲弗单抗(trevogrumab)、优特克单抗(ustekinumab)、和维多珠单抗(vedolizumab)。

在一些实施方案中，复合物中的蛋白质是含有Fc部分和另一个结构域的重组蛋白(例如，Fc融合蛋白)。在一些实施方案中，Fc融合蛋白是受体Fc融合蛋白，它含有偶联至Fc部分的受体的一个或多个胞外结构域。在一些实施方案中，Fc部分包含铰链区，然后是IgG的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，受体Fc融合蛋白含有结合至单个配体或多个配体的两个或更多个不同的受体链。例如，Fc融合蛋白是TRAP蛋白，例如IL-1 Trap(例如，列洛西普(rilonacept)，它含有与融合至hIgG1的Fc的I1-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体结合区；参见美国专利号6,927,004，该专利以引用的方式整体并入本文)或VEGF Trap(例如，阿柏西普(aflibercept)或希夫阿柏西普(ziv-aflibercept)，它们包含与融合至hIgG1的Fc的VEGF受体Flk1的Ig结构域3融合的VEGF受体Flt1的Ig结构域2；参见美国专利号7,087,411和7,279,159)。在其他实施方案中，Fc融合蛋白是ScFv-Fc融合蛋白，它含有一个或多个抗原结合结构域中的一者或多者，诸如偶联至Fc部分的抗体的可变重链片段和可变轻链片段。

实施例

实施例1：与SEC分馏相比，A4F分析为含有大型异质性复合物的样品提供了优良的分离度。

方法

SEC-MALLS流动相缓冲液

对于SEC-MALLS分析，SEC流动相缓冲液的组成是10mM磷酸钠、500mM氯化钠pH7.0，并且在使用前过滤(0.2μm)。

SEC-MALLS分析

SEC-MALLS***由耦合至配备有紫外(UV)二极管阵列检测器的Agilent 1200系列HPLC***的Superose 6GL色谱柱(10mm×300mm；GE Healthcare，产品目录#17-5172-01)、Wyatt Technology miniDawn激光光散射仪(LS)和/>T-rEX差示折射仪(RI)检测器组成。检测器按以下顺序串联：UV-LS-RI。LS和RI检测器根据Wyatt Technology提供的说明进行校准。

将限定量的抗蛋白质X mAb分别与重组蛋白质X组合，并且在1×DPBS pH 7.4中稀释以产生以下摩尔比：5μM抗蛋白质X mAb∶1μM蛋白质X、1μM抗蛋白质X mAb∶1μM蛋白质X和1μM抗蛋白质X mAb∶5μM蛋白质X。所有样品在环境温度下温育2小时，并且在4℃下维持未过滤，然后进样至色谱柱。在每个样品的进样之前，用流动相缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠pH7.0±0.1)以0.3mL/min的流速预平衡色谱柱。将牛血清白蛋白(BSA；2mg/mL；150μg样品载荷)分别进样，并且作为***适用性对照包括在内。

在整个分馏过程中均使用SEC-MALLS流动相缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠pH7.0±0.1)。将每个样品(100～200μg)进行进样，并且以0.3mL/min的流速洗脱。使用相同的参数设置对BSA进行分馏。

A4F-MALLS流动相缓冲液

对于SEC-MALLS分析，SEC流动相缓冲液的组成是10mM磷酸钠、500mM氯化钠pH7.0，并且在使用前过滤(0.2μm)。

A4F-MALLS

A4F-MALLS***由耦合至配备有紫外(UV)二极管阵列检测器的Agilent 1200系列HPLC***的Eclipse^TM 3+A4F分离***、Wyatt Technology DawnII激光光散射仪(LS)和/>T-rEX差示折射仪(RI)检测器组成。检测器按以下顺序串联：UV-LS-RI。LS和RI检测器根据Wyatt Technology提供的说明进行校准。

将限定量的抗蛋白质X mAb分别与重组蛋白质X组合，并且在1×DPBS pH 7.4中稀释以产生以下摩尔比：5μM抗蛋白质X mAb∶1μM蛋白质X、1μM抗蛋白质X mAb∶1μM蛋白质X和1μM抗蛋白质X mAb∶5μM蛋白质X。所有样品在环境温度下温育2小时，并且在4℃下维持未过滤，然后进样至配备有W350间隔箔(350μm间隔厚度，2.2cm间隔宽度)以及使用10kDa MWCONadir再生纤维素膜的Eclipse^TM短通道。在每个样品的进样之前，用流动相缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠pH7.0±0.1)预平衡通道。将牛血清白蛋白(BSA；2mg/mL；10μg样品载荷)分别进样，并且作为***适用性对照包括在内。

分馏方法由四个步骤组成：进样、聚焦、洗脱和通道“冲洗”步骤。在整个分馏法过程中均使用A4F-MALLS流动相缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠pH7.0±0.1)。每个样品(7μg)以0.2mL/min的流速进样1min，随后以1.5mL/min的聚焦流速聚焦2min。样品以1.0mL/min的通道流速洗脱，在45min内线性梯度错流从3.0mL/min至0mL/min。最后，将错流保持在0mL/min再持续5min，以冲洗通道。使用相同的参数设置对BSA进行分馏。

MALLS数据分析

使用ASTRA V软件(版本5.3.4.14，Wyatt Technology)来分析数据。数据被拟合至将过量的散射光与溶质浓度和重均摩尔质量Mw相关联的公式(Wyatt，1993；Kendrick，2001)

公式1：

其中c是溶质浓度R(θ，c)是来自溶质的过量瑞利比，是散射角和浓度的函数，Mw是摩尔质量，P(θ)描述了散射光的角度依赖性(对于回转半径＜50nm的颗粒，角度依赖性为～1)，A₂是渗透压膨胀中的第二维里系数(由于对稀溶液进行测量，可以忽略不计)，以及

公式2：

其中n_o表示溶剂折射率，N_A是阿伏加德罗常数，λ₀是真空中入射光的波长，并且dn/dc表示溶质的比折射率增量。

BSA单体的摩尔质量用于评估在数据收集过程中的光散射和示差折射率检测器的校准常数(***适用性检查)。从UV和RI检测器测得的BSA的平均摩尔质量的相对标准偏差(％RSD)为≤5.0％。

根据所采用的A4F-MALLS条件收集的BSA色谱图，计算光散射检测器的归一化系数、检测器间延迟体积和谱带增宽项。将这些值应用于针对所有其他样品收集的数据文件，以校正这些项。

使用Astra软件提供的蛋白质缀合物分析通过实验确定dn/dc值和在215nm或280nm处的消光系数(针对糖基化进行校正)。经校正的消光系数和dn/dc值被用于分析所有蛋白质-蛋白质复合物样品。

结果

样品的SEC-MALLS分析显示，高级复合物的分离度较差(洗脱体积＝8-14mL)，并且中间复合物无区别(图3A，表1)。相比之下，样品的A4F-MALLS分析显示，高级复合物的分离度优良(洗脱时间＝～11-30min)，并且中间复合物也有明显区别(图3B，表2)。

表1.mAb∶蛋白质X复合物的近似摩尔质量和保留体积。

EV：洗脱体积；M_w：重均摩尔质量；NA：不适用；min：分钟；kDa：千道尔顿；

表2.mAb∶蛋白质X复合物的近似摩尔质量和保留时间

R_t：保留时间；M_w：重均摩尔质量；NA：不适用；min：分钟；kDa：千道尔顿；

实施例2：抗蛋白质Y复合物。

方法

A4F MALLS流动相缓冲液

通过用HPLC级水将500mL 10×DPBS稀释至4.9L的总体积来制备1×DPBS pH 7.4。将0.0025％(w/v)叠氮化钠溶液作为抗微生物剂添加。以小体积增量缓慢添加盐酸(12M)，将pH调整至7.4，然后将最终体积调整至5.0L。缓冲液的最终测量pH为7.4。缓冲溶液在使用前新鲜制备并过滤(0.2μm)。

A4F MALLS分析

将限定量的抗蛋白质X mAb(先导物A和先导物B)分别与重组人蛋白质Y组合，并且在1×DPBS pH 7.4中稀释以产生以下摩尔比：1μM抗蛋白质Y mAb∶3μM hActA、1μM抗蛋白质Y mAb∶1μM蛋白质Y和3μM抗蛋白质Y mAb∶1μM蛋白质Y。所有样品在环境温度下温育2小时，并且在4℃下维持未过滤，然后进样至配备有W490间隔箔(490μm间隔厚度，2.2cm间隔宽度)以及使用10kDa MWCO Nadir再生纤维素膜的Eclipse^TM短通道。在每个样品的进样之前，用1×DPBS缓冲液pH7.4预平衡通道。将牛血清白蛋白(BSA；2mg/mL；10μg样品载荷)分别进样，并且作为***适用性对照包括在内。

分馏方法由四个步骤组成：进样、聚焦、洗脱和通道“冲洗”步骤。在整个分馏法过程中均使用A4F-MALLS流动相缓冲液(1×DPBS，pH7.4)。每个样品(10μg)以0.2mL/min的流速进样1min，随后以1.5mL/min的聚焦流速聚焦2min。样品以1.0mL/min的通道流速洗脱，在20min内线性梯度错流从1.2mL/min至0mL/min。最后，将错流保持在0mL/min再持续5min，以冲洗通道。使用相同的参数设置对BSA进行分馏。

小鼠抗人抗钵滴定度

使用对mAb A或mAb B小鼠IgG的检测具有特异性的夹心ELISA来确定小鼠抗人抗体(MAHA)的滴定度。简而言之，将1μg/mL溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)的mAb A或mAb B在4℃下被动吸附至微量滴定板过夜，然后用溶于PBS的5％牛血清白蛋白(BSA)进行非特异性结合封闭。从1∶100开始，在稀释缓冲液(溶于PBS的0.5％BSA)中制备血清样品的连续稀释液。因此，将相应的稀释因子(100)定义为测定法的检测下限(LOD)。然后将样品添加至mAb A或mAb B涂覆的平板中(100μL/孔)，并且在4℃下温育16-18小时。将仅添加有稀释缓冲液的孔包括在内以确定背景信号。随后，使用40ng/mL辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠Fcγ来检测平板捕获的mAb A或mAb B特异性MAHA。生色HRP底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)被用于检测HRP活性；然后在Perkin Elmer Victor X4多模式读板器上读取所得的450nm处的光密度(OD₄₅₀)。使用GraphPad Prism软件通过非线性回归来分析结合信号与稀释因子的数据，并且计算滴定度。MAHA滴定度被定义为血清样品的计算稀释因子，它对应于相当于测定背景信号的两倍的结合信号。

结果

两种先导mAb与蛋白质Y形成明显不同的复合物。在所有测试条件下，与mAb先导物B相比，mAb先导物A与蛋白质Y形成更小的、异质性更低的复合物(图4A-4C，表3-5)。

表3.mAb∶蛋白质Y复合物的近似摩尔质量和保留时间。

/>

R_t：保留时间；M_w：重均摩尔质量；NA：不适用；min：分钟；kDa：千道尔顿；

表4.mAb∶蛋白质Y复合物的近似摩尔质量和保留时间。

R_t：保留时间；M_w：重均摩尔质量；NA：不适用；min：分钟；kDa：千道尔顿；

表5.mAb∶蛋白质Y复合物的近似摩尔质量和保留时间。

R_t：保留时间；M_w：重均摩尔质量；NA：不适用；min：分钟；kDa：千道尔顿；

抗蛋白质Y复合物的大小和异质性与小鼠PK观察结果很好地相关联(图5A-5B)。观察到的先导物B与蛋白质Y的较大复合物与更快的清除率相关联(图5B)。

实施例3：抗人蛋白质Z复合物。

方法

样品制备

在1×DPBS pH 7.4中制备样品，并且在室温下温育2小时。然后通过A4F-MALLS进行总蛋白的分馏。样品如下：

1mM抗蛋白质Z mAb1+二抗mAb(0.5μM+0.5μM)+1μM补体蛋白质Z(7个组合)或1mM抗蛋白质Z mAb6+抗蛋白质Z mAb7(0.5μM+0.5μM)+1μM补体蛋白质Z。二抗的列表可见于表6中。

表6.样品命名。

测试的二抗mAb	与抗蛋白质Z mAb1的组合的命名
		抗蛋白质Z mAb2	mAb2组合
抗蛋白质Z mAb3	mAb3组合
		抗蛋白质Z mAb4	mAb4组合
抗蛋白质Z mAb5	mAb5组合
		抗蛋白质Z mAb6	mAb6组合
抗蛋白质Z mAb7	mAb7组合
		COMP1 mAb	COMP1组合

A4F MALLS分析

所有样品在环境温度下温育总共2小时，并且在4℃下维持未过滤，然后进样至配备有W350间隔箔(350μm间隔厚度，2.2cm间隔宽度)以及使用4kDa MWCO亲水性PES(PESH)膜的Eclipse^TM短通道。在每个样品的进样之前，用流动相缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠pH7.0±0.1)预平衡通道。将BSA(2mg/mL；10μg样品载荷)分别进样，并且作为***适用性对照包括在内。

分馏方法由四个步骤组成：进样、聚焦、洗脱和通道“冲洗”步骤。在整个分馏法过程中均使用A4F-MALLS流动相缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠pH7.0±0.1)。每个样品(7μg复合物或4μg单个组分)以0.2mL/min的流速进样，并且以1mL/min的聚焦流速聚焦5min。样品以1mL/min的通道流速洗脱，在45min内线性梯度错流从2mL/min至0mL/min。最后，将错流保持在0mL/min再持续5min，以冲洗通道。使用相同的参数设置对BSA进行分馏。

RBC溶血测定法

替代通路(AP)溶血测定法被用作补体活化的度量，以评估抗蛋白质Z mAb阻断兔红细胞(RbRBC)裂解的能力。通过膜攻击复合物进行的兔红细胞的裂解是通过实验测量补体活化的测定法的基础。

在GVB-Mg2+/EGTA缓冲液中洗涤所期望数量的RbRBC，并且以2×10⁸个细胞/ml的浓度重悬。为了测试单个抗C5 mAb或抗C5 mAb的组合的功效，将正常人血清在GVB-Mg²⁺/EGTA缓冲液中稀释至50-96％，在添加至RBC时达到25-48％的终浓度。将圆底96孔板用于测量溶血活性。将总共100μL RbRBC(2×10⁸个细胞/ml)在37℃下铺板于96孔板中，然后添加100μL稀释血清。轻轻混合细胞，并且在37℃下温育30-120分钟。在温育一段时间后，通过在4℃下以1250×g离心将细胞离心分离。将总共100μL上清液转移至新鲜的96孔平底板上，并且在Spectramax微孔板读板器上在412nm处读取。溶血百分比的计算如下文所述进行。

使用以下公式，用吸光度值计算溶血百分比：

公式3：

在该公式中，“背景细胞裂解”是在仅不含血清的GVB-Mg²⁺/EGTA缓冲液中温育的细胞在A412nm处的OD。“最大细胞裂解”是用水处理的细胞在A412nm处的OD。裂解的最大抑制率以曲线中的最低值和最高值之间的差异计算，以最高值的百分比表示。数据以平均值±平均值的标准误差表示。

结果

与不完全阻断溶血的单药疗法(图6A，表7)相比，抗蛋白质Z mAb1(先导抗蛋白质ZmAb)与COMP1 mAb或其他蛋白质Z mAb的组合可以经由替代通路活化来完全阻断兔RBC的溶血(图6B，表8)。因为全部抗蛋白质Z mAb1∶抗蛋白质Z mAb组合均完全阻断兔RBC的溶血，所以重要的是确定复合物形成(诸如大小、形状和取向)是否存在差异，从而可以在药物开发过程中提供对mAb的药代动力学(PK)(诸如免疫原性和/或靶标介导的清除)的深入了解。

表7.抗蛋白质Z抗体对兔RBC溶血的作用。

表8.抗蛋白质Z抗体组合对兔RBC溶血的作用。

在不存在二抗mAb的情况下，当以等摩尔量混合时，抗蛋白质Z mAb1与蛋白质Z形成规范的1∶1和1∶2复合物(图7，表9)。

表9.mAb∶蛋白质Z复合物的近似摩尔质量和保留时间。

R_t：保留时间；M_w：重均摩尔质量；min：分钟；kDa：千道尔顿；

大多数二抗mAb与抗蛋白质Z mAb1的组合都倾向于形成更小的、明确限定的复合物，该复合物与异聚体2∶2 mAb∶蛋白质Z复合物一致(图8和9以及表10-12)。

表10mAb∶蛋白质Z复合物的摩尔质量。

表11.mAb∶蛋白质Z复合物的近似摩尔质量和保留时间。

R_t：保留时间；M_w：重均摩尔质量；min：分钟；kDa：千道尔顿。

表12.mAb∶蛋白质Z复合物的近似摩尔质量和保留时间。

虽然抗蛋白质Z mAb1/抗蛋白质Z mAb3组合与蛋白质Z形成相似大小的复合物，但是洗脱时间/谱的差异表明，与其他组合相比，所形成的复合物的形状/取向有所不同(图9)。抗蛋白质Z mAb1与抗蛋白质Z mAb2和COMP1 mAb的组合倾向于与蛋白质Z形成更大、更具异质性的复合物，它表示“纸娃娃换装”(图10，表13)。

表13.mAb∶蛋白质Z复合物的近似摩尔质量和保留时间。

R_t：保留时间；M_w：重均摩尔质量；min：分钟；kDa：千道尔顿。

抗蛋白质Z mAb4与抗蛋白质Z mAb1的组合显示出与蛋白质Z形成异聚体复合物减少的趋势(图11，表14)。游离的mAb和1∶1mAb∶蛋白质Z物类的存在表明与蛋白质Z形成的异聚体复合物不完全。与蛋白质Z的同聚体和异聚体复合物的混合物也很明显。

表14.mAb∶蛋白质Z复合物的近似摩尔质量和保留时间。

R_t：保留时间；M_w：重均摩尔质量；min：分钟；kDa：千道尔顿

实施例4：添加顺序不会显著影响抗蛋白质Z mAb1、COMP1 mAb和蛋白质Z之间形成的复合物的摩尔质量和分布。

方法

为了确定添加顺序是否影响复合物的形成，在1×DPBS pH 7.4中制备COMP1 mAb和蛋白质Z的等摩尔组合，以产生1μM COMP1 mAb∶1μM蛋白质Z的摩尔比，并且允许在环境温度下温育1小时。在温育后，将不同量的抗蛋白质Z mAb1添加至预先形成的COMP1 mAb∶蛋白质Z复合物中，并且在1×DPBS pH 7.4中稀释以产生以下摩尔比：0.3μM抗蛋白质Z mAb1∶1μM COMP1 mAb∶1μM蛋白质Z、1μM抗蛋白质Z mAb1∶1μM COMP1 mAb∶1μM蛋白质Z和3μM抗蛋白质Z mAb1∶1μM COMP1 mAb∶1μM蛋白质Z。再温育一小时，然后进样至仪器。按照实施例3的A4F MALLS分析方法进行。

结果

就摩尔质量和分布而言，在抗蛋白质Z mAb1、COMP1 mAb和蛋白质Z之间形成了相似的复合物，无论是同时(图12A，表15)还是按顺序(图12B，表15)将抗蛋白质Z mAb1添加至其他组分。在两个数据集之间观察到的洗脱时间的微小变化表明了该方法固有的可变性，因此并不视为异常。

表15.mAb∶蛋白质Z复合物的近似摩尔质量和保留时间。

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实施例5：抗蛋白质W复合物。

方法

A4F-MALLS流动相缓冲液

通过将1.4g磷酸二氢钠一水合物、10.7g磷酸氢二钠七水合物和500mL 5M氯化钠混合来制备流动相缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠pH7.0±0.1)；然后将溶液用HPLC级水调整至5.0L的体积。缓冲液的最终测量pH为7.0。流动相缓冲液在使用前过滤(0.2μm)。

A4F MALLS分析

A4F-MALLS***由耦合至配备有紫外(UV)二极管阵列检测器的Agilent 1200系列HPLC***的Eclipse^TM 3+A4F分离***、Wyatt Technology DawnII激光光散射仪(LS)和/>T-rEX差示折射仪(RI)检测器组成。检测器按以下顺序串联：UV-LS-RI。LS和RI检测器根据Wyatt Technology提供的说明进行校准。

将限定量的抗蛋白质W mAb分别与蛋白质W组合，并且在1×DPBS pH7.4中稀释以产生以下等摩尔比：1μM抗蛋白质WmAb∶1μM蛋白质W。所有样品在环境温度下温育2小时，并且在4℃下维持未过滤，然后进样至配备有W350间隔箔(350μm间隔厚度，2.2cm间隔宽度)以及使用10kDaMWCO再生纤维素膜的Eclipse^TM短通道。在每个样品的进样之前，用流动相缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠pH7.0±0.1)预平衡通道。将牛血清白蛋白(BSA；2mg/mL；10μg样品载荷)分别进样，并且作为***适用性对照包括在内。

分馏方法由四个步骤组成：进样、聚焦、洗脱和通道“冲洗”步骤。在整个分馏法过程中均使用A4F-MALLS流动相缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠pH7.0±0.1)。每个样品(7μg)以0.2mL/min的流速进样1min，随后以1.0mL/min的聚焦流速聚焦3min。样品以1.0mL/min的通道流速洗脱，在25min内线性梯度错流从3.0mL/min至0mL/min。最后，将错流保持在0mL/min再持续5min，以冲洗通道。使用相同的参数设置对BSA进行分馏。

结果：

A4F-MALLS用于评估蛋白质W(二聚体、多结构域配体)和若干特异性结合至配体内的不同结构域的抗蛋白质W抗体之间形成的复合物的相对大小分布。表16提供了与蛋白质W形成的潜在抗体复合物的理论摩尔质量和预测化学计量。

表16.mAb∶蛋白质W复合物的理论摩尔质量。

¹不相等的比率(诸如1∶2和2∶1)无法区分，因为它们具有相同的MW。

总体而言，在mAb组中，当以等摩尔比组合时，靶向结构域A的mAb1形成低级复合物与主要物类的最高比例，这表示与蛋白质W形成离散的1∶1和2∶2复合物(峰2，～289kDa；峰3，～562kDa，图13，表17)。

表17.人蛋白质W复合物与靶向结构域A的mAb1的摩尔质量和保留时间。

R_t：保留时间；M_w：重均摩尔质量；NA：不适用；分钟：分钟；kDa：千道尔顿。

每个靶向结构域B的mAb(mAb2、mAb3和COMP1)主要与蛋白质W形成离散的2∶2复合物(峰3，～563-580kDa，图14，表18)，相对于其他测试的mAb，mAb2和COMP1形成最同质分布的复合物。虽然靶向结构域A的COMP2主要倾向于与蛋白质W形成1∶2和2∶2复合物的混合物(峰3，～550kDa，图15，表19)，但是还观察到中等程度的大型异质性复合物。这表明与mAb1(也靶向结构域A)不同，COMP2结合至蛋白质W上的独特表位，从而可以在称为“纸娃娃换装”的过程中形成扩展的抗体-抗原晶格。在该样品中，观察到摩尔质量为大约835kDa的独特峰(峰4)，然后观察到一系列宽的、分离度较差的物类(峰5)，它们的摩尔质量分布在～1000-1900kDa的范围内(图15，表19)。

表18.与靶向结构域B的mAb形成的人蛋白质W复合物的摩尔质量和保留时间。

R_t：保留时间；M_w：重均摩尔质量；NA：不适用；分钟：分钟；kDa：千道尔顿。

表19.人蛋白质W复合物与靶向结构域A的COMP2的摩尔质量和保留时间。

R_t：保留时间；M_w：重均摩尔质量；NA：不适用；分钟：分钟；kDa：千道尔顿。

根据单个组分的计算摩尔质量，峰4可能表示含有至少3个mAb分子(配合2-3个蛋白质W分子)的复合物，而峰5对应于由≥3个mAb分子(配合≥4个蛋白质W分子)组成的高级异聚体复合物的异质性分布(表18)。相比之下，靶向结构域C的mAb(mAb4和COMP3)形成广泛分布的大型异质性复合物(摩尔质量范围为～700-8000kDa)，mAb4在所测试的mAb组中显示出最广泛的“纸娃娃换装”(图16，表20)。

表20.与靶向结构域C的mAb形成的人蛋白质W复合物的摩尔质量和保留时间。

虽然在前述说明书中已经相对于本发明的某些实施方案描述了本发明，并且出于说明的目的已经提出了很多细节，但是对于本领域的技术人员显而易见的是，本发明容易受另外的实施方案的影响，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文所述的某些细节可以进行相当大的改变。

本文引用的所有参考文献以引用的方式整体并入。在不脱离本发明的精神或实质属性的情况下，本发明可以以其他特定形式来体现，因此，应当参考所附权利要求，而不是前述说明书，以指示本发明的范围。

Claims (20)

1.一种用于评估样品中的异质性蛋白质复合物的化学计量和大小分布的方法，其中所述方法包括以下步骤：

通过不对称流场流分馏法(A4F)来分馏所述样品；

使用多角度激光光散射法(MALLS)来确定所述样品中的所述异质性蛋白质复合物的摩尔质量、化学计量和大小分布，其中所述异质性蛋白质复合物包含异质性蛋白质:配体复合物，所述异质性蛋白质:配体复合物包含一个以上的结合至所述配体的蛋白质，其中所述异质性蛋白质:配体复合物中的蛋白质是单克隆抗体或其抗原结合片段；和

鉴定所述异质性蛋白质:配体复合物中能够形成大型蛋白质:配体复合物的蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述配体是可溶性配体。

3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体是双特异性抗体或其抗原结合片段。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述异质性蛋白质:配体复合物中的所述单克隆抗体与其抗原结合片段是相同类型的抗体。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述异质性蛋白质:配体复合物是抗体:配体复合物，所述抗体:配体复合物具有的单克隆抗体与配体的摩尔比为2:1。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述异质性蛋白质:配体复合物具有700kDa至8000kDa的分子量。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述异质性蛋白质:配体复合物具有500kDa至4000kDa的分子量。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述A4F通过配备有厚度为350μm、宽度为2.2cm的W350间隔箔的通道进行。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述A4F通过配备有厚度为490μm、宽度为2.2cm的W490间隔箔的通道进行。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述分馏步骤包括(i)将所述样品进样至所述A4F通道的样品入口；和(ii)然后通过允许载液从入口和出口流入所述通道对所述样品进行聚焦。

11.如权利要求10所述的方法，其中较小的蛋白质:配体复合物在较大的蛋白质:配体复合物之前洗脱。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述样品以1.0mL/min的通道流速进行洗脱。

13.如权利要求1所述的方法，其进一步包括：通过使用具有线性梯度错流的垂直相对的错流分离场的不对称流场流分馏法(A4F)分馏所述样品。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述样品以从3.0mL/min至0mL/min的线性梯度错流进行洗脱。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述样品以从1.2mL/min至0mL/min的线性梯度错流进行洗脱。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述样品以在20分钟内从1.2mL/min至0mL/min的线性梯度错流进行洗脱。

17.如权利要求13所述的方法，其中所述样品以从2.0mL/min至0mL/min的线性梯度错流进行洗脱。

18.如权利要求13所述的方法，其中所述样品以在45分钟内从2.0mL/min至0mL/min.的线性梯度错流进行洗脱。

19.如权利要求13所述的方法，其中所述样品以在25分钟内从3.0mL/min至0mL/min的线性梯度错流进行洗脱。

20.如权利要求13所述的方法，其中所述样品以在45分钟内从3.0mL/min至0mL/min的线性梯度错流进行洗脱。