JP2022543422A - 抗ｐｄ－１／ｈｅｒ２二重特異性抗体を含む製剤及びその調製方法と使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体を含む製剤に関し、特に、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体、緩衝剤、安定剤及び界面活性剤を含む医薬製剤に関する。また、本発明はさらに、これらの製剤の疾患を治療又は予防する使用に関する。

Description

本発明は、抗体製剤の分野に関する。さらに具体的に、本発明は、組換え抗プログラム細胞死受容体１（ＰＤ－１）と抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）である二重特異性抗体（抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体とも呼ばれる）を含む医薬製剤、特に安定な液体製剤、及び前記医薬製剤を調製するための方法、並びに前記医薬製剤の治療及び／又は予防使用に関する。

ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）（ＮＥＵ、ＥＲＢＢ－２、ＣＤ３４０又はｐ１８５とも呼ばれる）の過剰発現は、乳がん、卵巣がん、胃がん、子宮がん、黒色腫や胆管がんなどを含む種々のがんに繋がっている。例えば、侵襲性・転移性乳がんにも、再発率が高い及び／又は患者の予後が悪い乳がんにも、ＨＥＲ２の過剰発現が認められた。

ＨＥＲ２過剰発現がんを治療する方法の一つは、ＨＥＲ２シグナル伝達を阻害する抗ＨＥＲ２抗体を用いることである。例えば、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）は、ＨＥＲ２が介在する細胞内シグナル伝達を遮断する治療用抗ＨＥＲ２抗体であり、ＨＥＲ２過剰発現腫瘍の治療に広く利用されている。残念なことに、その臨床応用における抗腫瘍効果は一般的に、臨床前実験ほど好ましくない。従来の技術においては、通常、抗ＨＥＲ２抗体が化学療法薬などと併用投与される（Ｓｌａｍｏｎ ＤＪ ｅｔ ａｌ．、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３４４：７８３－７９２、２００１）。

近年、免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）分子への研究につれて、免疫チェックポイントの阻害性シグナル経路の活性化によりＴリンパ球が腫瘍への致死効果を効果的に果たせないことが発見されてきて（Ｙａｏ Ｓ、ＺｈｕＹとＣｈｅｎ Ｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ、２０１３、１２（２）：１３０－１４６）、これは、腫瘍細胞における標的のみをターゲットとする医薬（例えばトラスツズマブ）の抗腫瘍効果が良くない要因の一つとなる。

プログラム細胞死タンパク質－１（ＰＤ－１）は、重要な免疫チェックポイントタンパク質の一つで、５５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質であり、主に活性化したＴ細胞表面に誘導的に発現され、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、ＤＣ細胞などの細胞にも発現される。ＰＤ－１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンドはそれぞれ、プログラム細胞死タンパク質リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）とプログラム細胞死タンパク質リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）であることが同定された。ＰＤ－１のリガンドは、多くのがん細胞に高度に発現される。ＰＤ－１とＰＤ－１のリガンドが結合すると、Ｔ細胞のアポトーシス、免疫不応答、Ｔ細胞の「枯渇」やＩＬ－１０の分泌などになり得るため、ＰＤ１経路を遮断することにより、がん患者においてＴ細胞機能を回復させることができる（Ｓｈｅｒｉｄａｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（２０１２）、７２９－７３０）。ＰＤ－１のモノクローナル抗体は既に記載されており、例えば、ブリストルマイヤーズスクイブ（ＢＭＳ）社のニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）とメルク（Ｍｅｒｃｋ）社のペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）である。ニボルマブ（商品名ＯＰＤＩＶＯ^{（登録商標）}）は完全ヒト化ＩｇＧ４抗体分子で、ペムブロリズマブ（商品名ＫＥＹＴＲＵＤＡ^{（登録商標）}）はヒト化ＩｇＧ４抗体分子である。前記抗ＰＤ－１モノクローナル抗体はＴリンパ球におけるＰＤ－１と結合すると、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２との結合を阻害することができることで、Ｔリンパ球の活性化、増殖とＩＬ－２のような免疫活性サイトカインの産生が促進されるとともに、ＰＤ－１による抗腫瘍活性を有するＴリンパ球の免疫学的監視への阻害が解消される。

免疫応答の調節における免疫チェックポイント分子ＰＤ－１の重要性に鑑み、本発明者は鋭意に検討することにより、腫瘍細胞におけるＨＥＲ２を標的にすると同時に、Ｔリンパ球を活性化することができ、抗腫瘍作用を向上させるとともに副作用を低減するメリットを有する、ＰＤ－１を標的にするとともにＨＥＲ２を標的にする抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体を得た。前記抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体の特許出願番号はＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７５８５１（出願日：２０１８年２月８日）で、その中に、抗ＰＤ－１半抗体と抗ＨＥＲ２半抗体とからなる抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体が構築されて発現されている。ＨＣＣ１９５４ヒト乳がん細胞で免疫不全ＮＣＧマウスに接種して得られた担腫瘍マウスに抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体を投与した結果、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体又は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体を投与する場合と比べて、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体は、明らかに向上した抗腫瘍活性を有し、腫瘍の体積を著しく縮小することができることが分かる。

この分野では、ＨＥＲ２シグナル伝達経路及びＰＤ－１シグナル伝達経路に関連する種々の疾患を治療、予防又は遅延可能な抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体製剤が求められており、かつ、この製剤は安定性が良く、液体に配合される時に、液体溶液における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体は容易に分解したり、凝集したり、望ましくない化学的修飾を発生したりすることはしない。

本発明は、上記の需要に対応するために、ＰＤ－１及びＨＥＲ２と特異的に結合する抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質を含む医薬製剤を提供する。本発明の抗体製剤は、抗体を対象への投与に適するように配合することができるとともに、保存及び後の使用期間にその安定性を維持することができる。

一態様において、本発明は、（ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質と、（ｉｉ）緩衝剤と、（ｉｉｉ）安定剤と、（ｉｖ）界面活性剤とを含む液体抗体製剤を提供する。

本発明の抗体製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＰＤ－１と特異的に結合する第１ＶＨ／ＶＬ単位を含む第１半抗体と、ＨＥＲ２と特異的に結合する第２ＶＨ／ＶＬ単位を含む第２半抗体と、を含む。幾つかの実施形態において、前記抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、少なくとも約１０⁷ Ｍ^-1、好ましくは約１０⁸ Ｍ^-1、さらに好ましくは約１０⁹ Ｍ^-1又はそれ以上の親和性定数でＴリンパ球表面のＰＤ－１と結合することで、ＰＤ－１とそのリガンドとの結合を阻害し、Ｔリンパ球の活性化、増殖及びＩＬ－２のような免疫活性サイトカインの産生を促進するとともに、少なくとも約１０⁷ Ｍ^-1、好ましくは約１０⁸ Ｍ^-1、さらに好ましくは約１０⁹ Ｍ^-1又はそれ以上の親和性定数で腫瘍細胞表面のＨＥＲ２と結合することで、ＨＥＲ２が介在する細胞内シグナル伝達を遮断して抗腫瘍作用を果たすことができる。

一実施形態において、前記抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７５８５１（出願日：２０１８年２月８日）に開示された組換え抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質である。本願の目的のために、当該ＰＣＴ出願の内容の全ては、ここで参考として本明細書に組み込まれる。一実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＰＤ－１と特異的に結合する第１ＶＨ／ＶＬ単位を含む第１半抗体と、ＨＥＲ２と特異的に結合する第２ＶＨ／ＶＬ単位を含む第２半抗体と、を含み、前記第１ＶＨ／ＶＬ単位は配列番号１２／配列番号１０の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる全ての重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲを含み、前記第２ＶＨ／ＶＬ単位は配列番号６／配列番号２の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる全ての重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲを含む。

一実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＰＤ－１と特異的に結合する第１ＶＨ／ＶＬ単位を含む第１半抗体と、ＨＥＲ２と特異的に結合する第２ＶＨ／ＶＬ単位を含む第２半抗体と、を含み、前記第１ＶＨ／ＶＬ単位は配列番号１２／配列番号１０の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、前記第２ＶＨ／ＶＬ単位は配列番号６／配列番号２の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。

一実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＮからＣ方向の配列番号１２及び配列番号１４の重鎖配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する重鎖配列及びＮからＣ方向の配列番号１０及び配列番号４の軽鎖配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する軽鎖配列を含む第１半抗体と、ＮからＣ方向の配列番号６及び配列番号８の重鎖配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する重鎖配列及びＮからＣ方向の配列番号２及び配列番号４の軽鎖配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する軽鎖配列を含む第２半抗体と、を含む。

一実施形態において、前記抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３細胞を基に改変して得られたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、若しくはＨＥＫ２９３Ｅ細胞、及びＣＨＯ細胞又はＣＨＯ細胞を基に改変して得られたＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ^-、ＣＨＯ／ＤＧ４４、若しくはＥｘｐｉＣＨＯ細胞で組換え発現した抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質である。

一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の濃度は、約１～１５０ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態において、本発明の液体抗体製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の濃度は、約１０～１００ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態において、本発明の液体抗体製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の濃度は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｍＬである。

一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における緩衝剤の濃度は、約５～５０ｍＭである。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における緩衝剤の濃度は、約１０～３０ｍＭ、例えば、約１０、１５、２０、２５、３０ｍＭである。

一実施形態において、前記緩衝剤は、ヒスチジン、ヒスチジン塩酸塩及びそれらの組み合わせから選ばれる。

一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における安定剤の濃度は、約５０～５００ｍＭである。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における安定剤の濃度は、約１００～４００ｍＭ、例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｍＭである。

一実施形態において、前記安定剤はポリオール（例えば、ソルビトール）、糖類（例えば、スクロース、トレハロース）及びそれらの任意の組み合わせから選ばれる。

また別の実施形態において、前記安定剤はポリオール（例えば、ソルビトール）、糖類（例えば、スクロース、トレハロース）及びそれらの任意の組み合わせと酸化防止剤との組み合わせから選ばれる。一実施形態において、前記液体抗体製剤における安定剤の総濃度は約５０～５００ｍＭで、好ましくは約１００～４００ｍＭ、例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｍＭであり、そのうち、酸化防止剤の濃度は約１～５０ｍＭ、好ましくは約５～４０ｍＭ、例えば、約５、１０、２０、３０、４０ｍＭである。一実施形態において、前記酸化防止剤はメチオニンである。

一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における界面活性剤の濃度は、約０．１～１ｍｇ／ｍＬである。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における界面活性剤の濃度は約０．２～０．８ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８ｍｇ／ｍＬである。

一実施形態において、前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。一実施形態において、前記界面活性剤は、ポリソルベート界面活性剤から選ばれる。一具体的な実施形態において、本発明の液体抗体製剤における界面活性剤は、ポリソルベート８０である。

一実施形態において、前記液体製剤のｐＨ値は、約５．０～６．５である。幾つかの実施形態において、前記液体製剤のｐＨ値は、約５．０～６．５のうちの任意の値で、例えば、約５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４である。

一実施形態において、前記液体製剤は医薬製剤で、好ましくは注射剤、さらに好ましくは皮下注射剤又は静脈内注射剤である。一実施形態において、前記液体製剤は、静脈内注入剤である。

一実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、
（ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約１～１５０ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｉ）ヒスチジン及び／又はヒスチジン塩酸塩約５～５０ｍＭと、
（ｉｉｉ）ソルビトール、スクロース、トレハロース及びそれらの任意の組み合わせ約５０～５００ｍＭ、又は、
ソルビトール、スクロース、トレハロース及びそれらの任意の組み合わせと、濃度が約１～５０ｍＭであるメチオニンとの、総濃度が約５０～５００ｍＭである組み合わせと、
（ｉｖ）ポリソルベート８０約０．１～１ｍｇ／ｍＬと、を含み、
前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５である。

一好ましい実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、
（ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約１０～１００ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｉ）ヒスチジン及び／又はヒスチジン塩酸塩約１０～３０ｍＭと、
（ｉｉｉ）ソルビトール、スクロース、及び／又はトレハロース約１００～４００ｍＭ、又は、
ソルビトール、スクロース及び／又はトレハロースと、濃度が約５～４０ｍＭであるメチオニンとの総濃度が約１００～４００ｍＭである組み合わせと、
（ｉｖ）ポリソルベート８０約０．２～０．８ｍｇ／ｍＬと、を含み、
前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５である。

一好ましい実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、
（ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約２０ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｉ）ヒスチジン約１０ｍＭと、
（ｉｉｉ）ソルビトール約５０ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｖ）ポリソルベート８０約０．３ｍｇ／ｍＬと、を含み、
前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５である。

一好ましい実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、
（ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約５０ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｉ）ヒスチジン約２０ｍＭと、
（ｉｉｉ）ソルビトール約５０ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｖ）ポリソルベート８０約０．２ｍｇ／ｍＬと、を含み、
前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５である。

一好ましい実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、
（ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約５０ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｉ）ヒスチジン約２０ｍＭと、
（ｉｉｉ）スクロース約８０ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｖ）ポリソルベート８０約０．２ｍｇ／ｍＬと、を含み、
前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５である。

一好ましい実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、
（ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約５０ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｉ）ヒスチジン約２０ｍＭと、
（ｉｉｉ）トレハロース約８０ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｖ）ポリソルベート８０約０．２ｍｇ／ｍＬと、を含み、
前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５である。

一好ましい実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、
（ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約５０ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｉ）ヒスチジン約２０ｍＭと、
（ｉｉｉ）スクロース約８０ｍｇ／ｍＬ及びメチオニン約１．４９ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｖ）ポリソルベート８０約０．２ｍｇ／ｍＬと、を含み、
前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５である。

一好ましい実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、
（ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約４２ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｉ）ヒスチジン約０．８５ｍｇ／ｍＬ及びヒスチジン塩酸塩約３．１７ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｉｉ）スクロース約８０ｍｇ／ｍＬと、
（ｉｖ）ポリソルベート８０約０．２ｍｇ／ｍＬと、を含み、
前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５である。

別の態様において、本発明は本発明の液体抗体製剤に対して固化処理を行うことで得られる固体抗体製剤を提供する。前記固化処理は、例えば、結晶法、噴霧乾燥法、冷凍乾燥法により実施される。一好ましい実施形態において、前記固体抗体製剤は、例えば、注射用の凍結乾燥粉末の形態である。固体抗体製剤は、使用前に適切な溶媒に再構成されることにより、本発明の再構成製剤を形成することができる。前記再構成製剤も、本発明の液体抗体製剤である。一実施形態において、前記適切な溶媒は、注射用水、注射用有機溶媒から選ばれ、注射用油、エタノール、プロピレングリコールなど、又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。

本発明の液体製剤は、例えば、少なくとも２４カ月又はそれ以上の期間など、長期間に安定して保存することができる。一実施形態において、本発明の液体製剤は、約－８０℃から約４５℃、例えば、－８０℃、約－３０℃、約－２０℃、約０℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３８℃、約４０℃、約４２℃又は約４５℃の条件で、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、少なくとも７カ月、少なくとも８カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１０カ月、少なくとも１１カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも１８カ月、少なくとも２４カ月、少なくとも３６カ月又はそれ以上の期間かつ安定して保存することができる。

一実施形態において、本発明の液体製剤は、少なくとも２４カ月安定して保存することができる。さらに別の一実施形態において、本発明の液体製剤は、少なくとも４０℃で安定である。さらに別の一実施形態において、本発明の液体製剤は、約２℃～８℃で少なくとも３カ月、好ましくは少なくとも１２カ月、さらに好ましくは２４カ月安定して保持される。一実施形態において、本発明の液体製剤は、室温又は例えば約２５℃で、少なくとも２カ月、好ましくは少なくとも３カ月、さらに好ましくは６カ月安定して保持される。さらに別の一実施形態において、本発明の液体製剤は、約４０℃で少なくとも２週間、好ましくは少なくとも１カ月安定して保持される。

一実施形態において、製剤の外観、可視の異物、タンパク質の含有量、濁度、純度、及び／又は電荷変異体の変化を検出することにより、保存後の製剤の安定性を示してもよい。一実施形態において、高温苛酷な強制実験では、例えば４０℃±２℃で少なくとも１週間、２週間若しくは好ましくは１カ月保存した後、又は加速実験では、例えば、２５℃±２℃で少なくとも１カ月若しくは２カ月保存した後、又は長期実験では、例えば５℃±３℃で少なくとも２カ月若しくは３カ月保存した後、本発明の液体製剤の安定性を検出してもよい。

一実施形態において、保存した後、本発明の液体製剤の安定性を目で検査すると、本発明の液体製剤は、外観上で透明から薄い乳白光のままで、無色から薄黄色の液体であり、異物がない。一実施形態において、透明度検出器において目で検査すると、製剤には可視の異物がない。一実施形態において、保存した後、タンパク質の含有量の変化を測定することにより、本発明の液体製剤の安定性を検査し、ここで、例えば、紫外線分光光度（ＵＶ）法によると、保存０日目の初期値に対して、タンパク質の含有量の変化率は２０％以下、好ましくは１０％以下、例えば７～８％、さらに好ましくは５％以下である。一実施形態において、保存した後、本発明の液体製剤の濁度の変化を測定することにより、本発明の液体製剤の安定性を検査し、ここで、例えば、ＯＤ_350nm法により検出すると、保存０日目の初期値に対して、変化値は０．０６以下、好ましくは０．０６以下、さらに好ましくは０．０４以下である。一実施形態において、保存した後、本発明の液体製剤の純度の変化を測定することにより、本発明の液体製剤の安定性を検査し、ここで、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によると、保存０日目の初期値に対して、モノマーの純度の変化値は１０％以下、例えば５％、４％、３％以下で、例えば、変化値は１～２％以下、好ましくは１％以下である。一実施形態において、保存した後、本発明の液体製剤の純度の変化を測定することにより、本発明の液体製剤の安定性を検査し、ここで、非還元型及び／又は還元型ラウリル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法によると、モノマーの純度の変化値は１０％以下、例えば５％、４％、３％以下低下する。一実施形態において、保存した後、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）により本発明の液体製剤の安定性を測定し、ここで、保存０日目の初期値に対して、抗体の電荷変異体（主成分、酸性成分、及び塩基性成分）の変化値は合わせて５０％以下、例えば、４０％、３０％、２０％、１０％、５％以下である。一実施形態において、保存した後、カチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ法）により本発明の液体製剤の安定性を検出し、ここで、保存０日目の初期値に対して、抗体の電荷変異体（主成分、酸性成分、及び塩基性成分）の変化値は合わせて４０％以下、例えば、３８％、３６％、３４％、３２％、３０％以下である。

一実施形態において、製剤は保存した後、例えば、２～８℃で少なくとも２４カ月保存した後、又は室温で少なくとも３カ月保存した後、又は４０℃±２℃で１カ月保存した後、安定であり、好ましくは、以下の：
（ｉ）ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法で測定すると、製剤は９０％よりも高い純度、好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％よりも高い純度を有し、
（ｉｉ）還元型又は非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法で測定すると、製剤は９０％よりも高い純度、好ましくは９２％、９４％、９６％、又は９８％よりも高い純度を有し、
（ｉｉｉ）ｉＣＩＥＦ法で測定すると、保存０日目の初期値に対して、製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の各成分（主成分、酸性成分、及び塩基性成分）の変化値は合わせて５０％以下、例えば４０％、３０％、２０％、１０％、又は５％以下であり、
（ｉｖ）ＥＬＩＳＡ法で測定すると、保存０日目の初期値に対して、製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の相対結合活性は７０％～１３０％、例えば７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、
という特徴のうちの１つ又は複数を有する。

一態様において、本発明は、本発明の液体抗体製剤又は固体抗体製剤を含む送達装置を提供する。一実施形態において、本発明の送達装置は、本発明の液体抗体製剤又は固体抗体製剤を含む薬剤充填済み注射器の形で提供され、例えば、静脈内、皮下、皮内又は筋肉内注射、静脈内注入に用いられる。

さらに別の態様において、本発明は、例えば哺乳類のような対象へ抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質を送達する方法を提供し、本発明の液体抗体製剤又は固体抗体製剤を対象に投与する工程が含まれ、前記送達は、例えば、薬剤充填済み注射器を利用する送達装置により実施される。

さらに別の態様において、本発明は、対象でＨＥＲ２シグナル伝達経路とＰＤ－１シグナル伝達経路に関連する障害を治療、予防又は遅延する送達装置（例えば、薬剤充填済み注射器）又は医薬の製造に用いられる、本発明の液体抗体製剤又は固体抗体製剤の使用を提供し、前記障害は例えば、種々の血液病と固形腫瘍であり、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮がん、非小細胞肺がん、鼻咽頭がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、肝がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫を含むが、これらに限定されない。

本発明の他の実施形態は、後述する詳細な説明を参照することにより明らかになる。
以下の図面と合わせて読めば、次に詳細に記載される本発明の好ましい実施形態がより良く理解される。本発明を説明するために、図面には現在の好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の精確な配置と手段に限定されないと理解すべきである。

抗ＰＤ－１半抗体分子と抗ＨＥＲ２半抗体分子を含む抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体の構造を例示する。 抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体製剤がｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５で４０℃±２℃で異なる時間置かれた後、ＯＤ_350nm法により測定された各試料の濁度の変化トレンドグラフである。図中、横軸でのＴ０は０日間、１Ｗは１週間、２Ｗは２週間、１Ｍは１カ月を示す。 抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体製剤がｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５で４０℃±２℃で異なる時間置かれた後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法により測定された各試料におけるタンパク質の純度の変化トレンドグラフである。図中、横軸でのＴ０は０日間、１Ｗは１週間、２Ｗは２週間、１Ｍは１カ月を示す。 抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体製剤がｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５で４０℃±２℃で異なる時間置かれた後、非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法により測定された各試料におけるタンパク質の純度の変化トレンドグラフである。図中、横軸でのＴ０は０日間、１Ｗは１週間、２Ｗは２週間、１Ｍは１カ月を示す。 抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体製剤がｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５で４０℃±２℃で異なる時間置かれた後、還元型ＣＥ－ＳＤＳ法により測定された各試料におけるタンパク質の純度の変化トレンドグラフである。図中、横軸でのＴ０は０日間、１Ｗは１週間、２Ｗは２週間、１Ｍは１カ月を示す。 抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体製剤がｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５で４０℃±２℃で異なる時間置かれた後、ｉＣＩＥＦ法により測定された各試料における電荷変異体の主成分の変化トレンドグラフである。図中、横軸でのＴ０は０日間、１Ｗは１週間、２Ｗは２週間、１Ｍは１カ月を示す。 異なる安定剤を有する抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体製剤（調合法１～４）を約４０℃で置いて０日間、１週間、２週間と４週間保存した後、ｉＣＩＥＦ法により測定された電荷変異体の主成分の経時変化のグラフである。図中、横軸でのＴ０は０日間、１Ｗは１週間、２Ｗは２週間、４Ｗは４週間、Ｆ１は調合法１、Ｆ２は調合法２、Ｆ３は調合法３、Ｆ４は調合法４を示す。 異なる安定剤を有する抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体製剤（調合法１～４）を２５℃±２℃で置いて０日間、１週間、２週間と４週間保存した後、ｉＣＩＥＦ法により測定された電荷変異体の主成分の経時変化のグラフである。図中、横軸でのＴ０は０日間、１Ｍは１カ月、２Ｍは２カ月、Ｆ１は調合法１、Ｆ２は調合法２、Ｆ３は調合法３、Ｆ４は調合法４を示す。

本発明を詳しく説明するに先立ち、前記方法及び条件は変更可能であるため、本発明は本明細書中の特定の方法及び実験条件に限定されないと理解しておくべきである。なお、本明細書に用いられる用語は制限的ではなく、特定の実施形態を説明するためのものである。

定義
別に定義しない限り、本明細書に用いられる全ての技術と科学用語はいずれも、当業者に通常に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の目的のために、以下、下記の用語を定義する。

用語「約」は、数値と共に用いられる場合、下限として記載数値より５％小さく、上限として記載数値より５％大きい範囲における数値を含むことを意味する。

用語「及び／又は」は、２つ又は複数のオプションの接続に用いられる場合、オプションのうちの何れか１項又はオプションのうちの何れか２項若しくは複数項を指すと理解すべきである。

本明細書で使用されるように、「包含する」又は「含む」という用語は、前記要素、整数又は工程を含むが、任意の他の要素、整数又は工程を排除しないことを意味する。本明細書において、「包含する」又は「含む」という用語を用いる場合、特記しない限り、記載される要素、整数又は工程からなる場合も含まれる。例えば、ある具体的な配列の抗体可変領域を「包含する」ことに言及する場合、当該配列からなる抗体可変領域を含むことも意図する。

本明細書において、「抗体」という用語は最も広い意味で使用されており、抗原結合部位を含むタンパク質を意味し、種々の構造の天然抗体及び人工抗体をカバーし、完全な抗体及び抗体の抗原結合断片を含むが、これらに限定されない。

「全抗体」、「全長抗体」、「完全抗体」及び「完全な抗体」という用語は、本明細書において、ジスルフィド結合を介して互いに接続される少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質を交換可能に指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域とからなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインからなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、さらに、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）であり、その間に保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ））が介在している）に分けることができる。それぞれのＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列されている。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示している。

「ヒト化」抗体という用語は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体である。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体に含まれる全て又はほぼ全てのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）は非ヒト抗体の前記ＨＶＲに対応し、全て又はほぼ全てのＦＲ領域はヒト抗体の前記ＦＲに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体から誘導される抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形」は、既にヒト化した抗体を指す。

「半抗体」又は「半重合体」という用語は、１価抗原結合ポリペプチドである。幾つかの実施形態において、半抗体又は半重合体は、ＶＨ／ＶＬ単位と場合による免疫グロブリン定常ドメインの少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態において、半抗体又は半重合体は、１本の免疫グロブリン軽鎖に結合される１本の免疫グロブリン重鎖、又はその抗原結合断片を含む。幾つかの実施形態において、半抗体又は半重合体は単一特異的であり、すなわち、単一の抗原又はエピトープと結合する。幾つかの具体的な実施形態において、半抗体は、ＨＥＲ２と結合するとともに、ＰＤ－１と結合しない。幾つかの具体的な実施形態において、半抗体は、ＰＤ－１と結合するとともに、ＨＥＲ２と結合しない。当業者であれば、半抗体は、単一可変ドメインからなる（例えば、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）由来）抗原結合ドメインを有してもよいことが容易に理解される。

「ＶＨ／ＶＬ単位」という用語は、抗体に少なくとも１つのＶＨ ＣＤＲ及び少なくとも１つのＶＬ ＣＤＲが含まれる抗原結合領域である。幾つかの実施形態において、ＶＨ／ＶＬ単位は、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は全３つのＶＨ ＣＤＲと、少なくとも１つ、少なくとも２つ又は全３つのＶＬ ＣＤＲとを含む。特定の実施形態において、ＶＨ／ＶＬ単位は、フレームワーク領域（ＦＲ）の少なくとも一部をさらに含む。幾つかの実施形態において、ＶＨ／ＶＬ単位は、３つのＶＨ ＣＤＲと３つのＶＬ ＣＤＲを含む。幾つかの実施形態において、ＶＨ／ＶＬ単位は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ又は全４つのＶＨ ＦＲと、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ又は全４つのＶＬ ＦＲとを含む。

本明細書において、「二重特異性抗体」という用語は、２種の異なる生体分子上のエピトープと特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。特に説明しない限り、挙げられた二重特異性抗体の名前には、二重特異性抗体の結合する抗原の順番がランダムである。すなわち、幾つかの実施形態において、「抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体」と「抗ＨＥＲ２／ＰＤ－１二重特異性抗体」という用語は、交換して用いてもよい。幾つかの実施形態において、二重特異性抗体は２つの半抗体を含み、それぞれの半抗体は、単一重鎖可変領域と場合による重鎖定常領域の少なくとも一部、及び単一軽鎖可変領域と場合による軽鎖定常領域の少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態において、二重特異性抗体は２つの半抗体を含むが、それぞれの半抗体は、単一重鎖可変領域と単一軽鎖可変領域を含むとともに、１つより多い単一重鎖可変領域を含まず、１つより多い単一軽鎖可変領域を含まない。幾つかの実施形態において、二重特異性抗体は２つの半抗体を含み、それぞれの半抗体は、単一重鎖可変領域と単一軽鎖可変領域を含み、第１半抗体は第１抗原と結合するとともに第２抗原と結合せず、第２半抗体は第２抗原と結合するとともに第１抗原と結合しない。

「抗体製剤」という用語は、活性成分である抗体の生物活性が効果的に発揮できる形であるとともに、当該製剤が投与されるべき対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。これらの抗体製剤は、一般的に、滅菌のものである。通常、抗体製剤には、薬学的に使用可能な賦形剤が含まれる。「薬学的に使用可能な」賦形剤は、製剤に使用される活性成分の有効投与量が対象に送達できるように、被験哺乳類に適当に投与可能な試薬である。賦形剤の濃度は、投与方式に対応し、例えば、注射に許容可能な濃度であってもよい。

「抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体製剤」という用語は、本明細書で「本発明の抗体製剤」とも略称され、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質を活性成分として含むとともに、薬学的に使用可能な賦形剤を含む調製物を指す。抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質と薬学的に使用可能な賦形剤を組み合わせると、活性成分である抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ヒト又は非ヒト動物への治療的又は予防的投与に適するようになる。本発明の抗体製剤は、例えば、すぐに使える薬剤充填済み注射器のような水性形の液体製剤として調製してもよく、又は、使用直前に生理的に許容される溶液に溶解及び／又は懸濁されることで再構成（すなわち、再溶解）された凍結乾燥製剤として調製してもよい。幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質製剤は、液体製剤形である。

「安定な」抗体製剤とは、製剤における抗体が、所定の条件で保存された後、許容される程度の物理的安定性及び／又は化学的安定性を維持しているものである。抗体製剤に含まれる抗体は、所定の期間保存された後、その化学構造が１００％維持できない恐れがあるが、一般的に、所定の期間保存された後、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の抗体構造又は機能が維持されれば、抗体製剤は「安定」であると考えられる。幾つかの具体的な実施形態において、本発明の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質製剤は、製造、調製、輸送と長期保存の過程中に検出されないほど低い抗体の凝集又は分解又は化学的修飾が表れているので、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の生物活性の損失が極めて少なく、ひいては無くて、高い安定性を示している。幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質製剤は保存後、その物理的及び化学的安定性がほぼ保たれる。好ましくは、本発明の液体製剤は、室温で又は４０℃で少なくとも２週間安定し、及び／又は２５℃で少なくとも２カ月安定し、及び／又は２～８℃で少なくとも２４カ月安定することができる。

この分野では、複数の解析技術がタンパク質の安定性の測定に利用できることが知られており、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７～３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ（１９９１）ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９～９０（１９９３）が参照される。選定された温度及び選定された保存時間で安定性を測定することができる。例えば、予期する製剤保存可能期間によって保存時間を選択してもよい。場合により、加速安定性試験を採用してもよい。幾つかの実施形態において、抗体製剤に対して種々の苛酷テストを実施することにより安定性テストが行われる。これらのテストは、調製された抗体製剤の製造、保存又は輸送期間に遭遇可能な苛酷条件を表してもよく、非製造、保存又は輸送期間に抗体製剤における抗体の不安定性を加速可能な条件を表してもよい。例えば、高温苛酷での抗体の安定性を検証するために、配合された抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質製剤をガラスバイアルに充填してもよい。

一定の期間保存した後、製剤は凝集、沈殿、混濁及び／又は変性を示さず、又は非常に少ない凝集、沈殿、混濁及び／又は変性を示せば、抗体は製剤において「その物理的安定性が保たれる」と考えられる。製剤における抗体の凝集により、患者の免疫反応を潜在的に増加させることができるため、安全性の問題が引き起こされる。従って、製剤における抗体の凝集を最小化するか、又は凝集を防止する必要がある。光散乱法は、製剤における可視の凝集物の測定に用いることができる。ＳＥＣは、製剤における可溶性凝集物の測定に用いることができる。また、製剤の外観、色及び／又は清澄さを目で検査し、又はＯＤ_350nm法で製剤の濁度を測定し、又は非還元型ＣＥーＳＤＳ法で製剤の純度を測定することにより、製剤の安定性を示すことができる。一実施形態において、所定の温度で所定の期間保存した後の製剤における抗体モノマーの百分率を測定することにより、製剤の安定性を測定し、ここで、製剤における抗体モノマーの百分率が大きいほど、製剤の安定性が高くなる。

「許容される程度の」物理的安定性は、所定の温度で所定の期間保存した後、製剤において少なくとも約９２％の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質モノマーが測定されることを示すことができる。幾つかの実施形態において、所定の温度で少なくとも２週間、少なくとも２８日間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、少なくとも７カ月、少なくとも８カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１０カ月、少なくとも１１カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも１８カ月、少なくとも２４カ月又はそれ以上の期間保存した後、許容される程度の物理的安定性は、少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質モノマーのことを示す。物理的安定性を評価する場合に、医薬製剤を保存する所定の温度は、約－８０℃から約４５℃の任意の温度であってもよく、例えば、約－８０℃、約－３０℃、約－２０℃、約０℃、約４℃～８℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４２℃又は約４５℃で保存される。例えば、約４０℃±２℃で１カ月又は４週間保存した後、少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質モノマーが検出されると、医薬製剤は安定と見なされる。約２５℃で２カ月保存した後、少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質モノマーが検出されると、医薬製剤は安定と見なされる。約５℃で９カ月保存した後、少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質モノマーが検出されると、医薬製剤は安定と見なされる。

一定の期間保存した後、製剤における抗体が著しい化学的変化を示さなければ、抗体は製剤において「その化学的安定性が保たれる」と考えられる。大部分の化学的不安定性は、抗体の共有結合修飾形を形成した（例えば、抗体の電荷変異体）ことに由来する。例えば、アスパラギン酸異性化、Ｎ及びＣ末端修飾により塩基性変異体を形成することができ、脱アミド化、シアル酸化及び糖化により酸性変異体を形成することができる。化学的安定性は、抗体の化学的変化形式を測定及び／又は定量することにより評価することができる。例えば、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）又はイメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）により、製剤における抗体の電荷変異体を検出することができる。一実施形態において、所定の温度で所定の期間保存した後の製剤における抗体の電荷変異体の百分率の変化値を測定することにより、製剤の安定性を測定し、ここで、当該変化値が小さいほど、製剤の安定性が高くなる。

「許容される程度」の化学的安定性は、所定の温度で所定の期間保存した後の製剤における電荷変異体（例えば、主成分、酸性成分又は塩基性成分）の百分率の変化値が５０％以下、例えば３０％以下、２０％以下であることを示すことができる。幾つかの実施形態において、所定の温度で少なくとも２週間、少なくとも２８日間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも５カ月、少なくとも６カ月、少なくとも７カ月、少なくとも８カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１０カ月、少なくとも１１カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも１８カ月、少なくとも２４カ月又はそれ以上の期間保存した後、許容される程度の化学的安定性は、主成分電荷変異体の百分率の変化値が約５０％、４０％、３０％、２０％、１５％以下になるように表われることができる。化学的安定性を評価する場合に、医薬製剤を保存する温度は約－８０℃から約４５℃の任意の温度であってもよく、例えば、約－８０℃、約－３０℃、約－２０℃、約０℃、約４℃～８℃、約５℃、約２５℃又は約４５℃で保存される。例えば、５℃で２４カ月保存した後、主成分電荷変異体の百分率の変化値が約２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％未満になると、医薬製剤は安定と見なされる。２５℃で２カ月保存した後、主成分電荷変異体の百分率の変化値が約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％未満になると、医薬製剤も安定と見なされる。４０℃で１カ月保存した後、主成分電荷変異体の百分率の変化値が約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％又は４％未満になると、医薬製剤も安定と見なされる。

「凍結乾燥製剤」という用語は、液体製剤の冷凍乾燥処理により得られ、又は取得可能な組成物を指す。好ましくは、それは５％よりも少ない、好ましくは３％よりも少ない水含有量を有する固体組成物である。

「再構成製剤」という用語は、固体製剤（例えば、凍結乾燥製剤）を生理的に許容される溶液に溶解及び／又は懸濁することで得られた液体製剤を指す。

本明細書で使用される「室温」という用語は、１５℃から３０℃、好ましくは２０℃から２７℃、さらに好ましくは２５℃の温度を指す。

「苛酷条件」は、化学的及び／又は物理的に抗体タンパク質に不利な環境を指し、前記環境は、許容されない抗体タンパク質が安定しなくなるようにすることができる。「高温苛酷」とは、抗体製剤を室温又はそれ以上の温度（例えば４０℃±２℃）で置いて一定の期間保存することである。高温苛酷加速試験により、抗体製剤の安定性を検査することができる。

本明細書で使用されるように、「非経口投与」という用語は、経腸及び局所投与以外の投与方式を指し、一般的に注射又は注入によるものであり、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下（ｓｕｂｃｕｔｉｃｕｌａｒ）、関節内、嚢下、クモ膜下、脊椎内、硬膜外と胸骨内の注射、及び注入を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本発明の安定な抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質製剤は、対象に非経口投与される。一実施形態において、本発明の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質製剤は、皮下、皮内、筋肉内又は静脈内注射により対象に投与される。

Ｉ． 抗体製剤
本発明は、（ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質と、（ｉｉ）緩衝剤と、（ｉｉｉ）安定剤と、（ｉｖ）界面活性剤とを含む、ｐＨが約５．０～６．５である安定な液体抗体製剤を提供する。一好ましい形態において、本発明の液体抗体製剤は、注射製剤形である。

（ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質
本発明の抗体製剤における「抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質」は、ＰＤ－１と特異的に結合する第１ＶＨ／ＶＬ単位を含む第１半抗体と、ＨＥＲ２と特異的に結合する第２ＶＨ／ＶＬ単位を含む第２半抗体と、を含む。幾つかの実施形態において、前記抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、少なくとも約１０⁷ Ｍ^-1、好ましくは約１０⁸ Ｍ^-1、さらに好ましくは約１０⁹ Ｍ^-1又はそれ以上の親和性定数でＴリンパ球表面のＰＤ－１と結合することができるとともに、少なくとも約１０⁷ Ｍ^-1、好ましくは約１０⁸ Ｍ^-1、さらに好ましくは約１０⁹ Ｍ^-1又はそれ以上の親和性定数で腫瘍細胞表面のＨＥＲ２と結合することができることで、前記抗体は、二重特異的にＰＤ－１分子とＨＥＲ２分子を標的にする治療剤及び／又は予防剤として用いることができる。

前記ＰＤ－１又はＨＥＲ２と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ単位は、従来技術に報告されている抗ＰＤ－１抗体と将来開発される抗ＰＤ－１抗体ＶＨ／ＶＬ単位の何れかから誘導される６つのＣＤＲ、又は前記６つのＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ若しくはそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠損）を有する配列を含み、或いは、従来技術に報告されている抗ＨＥＲ２抗体と将来開発される抗ＨＥＲ２抗体ＶＨ／ＶＬ単位の何れかから誘導される６つのＣＤＲ、又は前記６つのＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ若しくはそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠損）を有する配列を含む。

一実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質のＰＤ－１と特異的に結合する第１ＶＨ／ＶＬ単位は、抗ＰＤ－１半抗体から誘導される配列番号１２／配列番号１０の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる全６つの重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲ、又は前記６つのＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ若しくはそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠損）を有する配列を含む。

一実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質のＨＥＲ２と特異的に結合する第２ＶＨ／ＶＬ単位は、抗ＨＥＲ２半抗体から誘導される配列番号６／配列番号２の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる全６つの重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲ、又は前記６つのＣＤＲのうちの１つ又は複数のＣＤＲに対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠損）を有する配列を含む。

「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」（本明細書では超可変領域「ＨＶＲ」と交換して使用可能）という用語は、抗体可変領域において主に抗原エピトープとの結合を担当するアミノ酸領域である。重鎖と軽鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ－末端から順に番号付けられる。この分野においては、既定のＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨアミノ酸配列にそのＣＤＲ配列を決定する方法が多く公知されている。例えば、Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列変異性によって決定され、最もよく用いられるものである（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、構造リングの位置を指す（ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７（１９８７））。ＡｂＭ ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造リングとの間のトレードオフであり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。「接触性」（Ｃｏｎｔａｃｔ）ＨＶＲは、取得可能な複雑な結晶構造の分析に基づくものである。

前記アミノ酸変異、例えば、アミノ酸置換は、好ましくは保存的なアミノ酸置換である。「保存的なアミノ酸置換」は、特定のアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸に置換されるようにするアミノ酸変動を指す。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、この分野でよく知られているものである。本発明の何れか１つの実施形態において、一好ましい態様では、保守的な置換残基は、下記の保守的な置換表Ａから来るもので、好ましくは、表Ａに示される好ましい置換残基である。

一実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＰＤ－１と特異的に結合する第１ＶＨ／ＶＬ単位を含む第１半抗体と、ＨＥＲ２と特異的に結合する第２ＶＨ／ＶＬ単位を含む第２半抗体と、を含み、前記第１ＶＨ／ＶＬ単位は配列番号１２／配列番号１０の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、前記第２ＶＨ／ＶＬ単位は配列番号６／配列番号２の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。

抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質における第１半抗体と第２半抗体の重鎖定常領域のタイプについては、特に制限しないが、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４免疫グロブリンの重鎖定常領域、又はそれと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上に同一）の配列である。さらに好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの重鎖定常領域、又はそれと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同一）の配列である。

一実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）に使用される重鎖定常領域を含む。別の実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）に用いられる重鎖定常領域を含む。例えば、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体の２本の重鎖のＦｃドメインには、それぞれ「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域が含まれ、及び／又は、それぞれＹ３４９ＣとＳ３５４Ｃ（Ｋａｂａｔの「ＥＵ番号方式」による）が含まれることで、抗ＰＤ－１半抗体と抗ＨＥＲ２半抗体はＦｃ領域において鎖間ジスルフィド結合を形成することになり、これにより、抗ＰＤ－１半抗体と抗ＨＥＲ２半抗体との正確なペアリングが安定化される。

一実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の抗ＰＤ－１半抗体及び／又は抗ＨＥＲ２半抗体は、Ｆｃドメインにおいて抗体エフェクター機能に影響を与えるアミノ酸変異が含まれる。一具体的な実施形態において、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一実施形態において、前記アミノ酸変異は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに存在し、例えば、前記抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、抗ＰＤ－１半抗体及び／又は抗ＨＥＲ２半抗体Ｆｃ領域第２３４位と第２３５位（ＥＵ番号方式）でのアミノ酸置換を含む。一具体的な実施形態において、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡとＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ変異」とも呼ばれる）である。

別の実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の軽鎖は、κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ軽鎖定常領域又はヒトλ軽鎖定常領域を含む。

一実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の２本の重鎖のそれぞれのＦｃドメインには、それぞれ突起（「ノブ（ｋｎｏｂ）」）又は空洞（「ホール（ｈｏｌｅ）」）が含まれ、かつ、一方の重鎖Ｆｃドメインにおける前記突起又は空洞は、それぞれ他方の重鎖Ｆｃドメインにおける前記空洞又は突起に置くことができるので、前記２本の重鎖同士は「ノブ－イン－ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」という安定な結合となる。一実施形態において、前記２本の重鎖の一方にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗが含まれ、前記２本の重鎖の他方にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡとＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号方式）が含まれる。これにより、一方の鎖における突起は他方の鎖における空洞に置くことができ、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の２本の重鎖の正確なペアリングに寄与する。

一実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の各半抗体における重鎖と軽鎖の免疫グロブリンＣＨ１ドメインとＣＬドメインには、それぞれ突起又は空洞が含まれ、かつ、ＣＨ１ドメインにおける前記突起又は空洞は、それぞれＣＬドメインにおける前記空洞又は突起に置くことができるので、各半抗体における重鎖と軽鎖同士も「ノブ－イン－ホール」という安定な結合となる。

一実施形態において、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＮからＣ方向の配列番号１２及び配列番号１４の重鎖配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する重鎖配列と、ＮからＣ方向の配列番号１０及び配列番号４の軽鎖配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する軽鎖配列とを含む第１半抗体と、ＮからＣ方向の配列番号６及び配列番号８の重鎖配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する重鎖配列と、ＮからＣ方向の配列番号２及び配列番号４の軽鎖配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する軽鎖配列とを含む第２半抗体と、を含む。

本明細書において、「配列同一性」は、比較ウィンドウにおけるヌクレオチドごと又はアミノ酸ごとに基づく配列同士がどの程度同じであるかを指す。次の方法により、「配列同一性百分率」を算出することができる。２つの最適に照合される配列を比較ウィンドウで比較し、２つの配列における同じ核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）又は同じアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓとＭｅｔ）の存在する位置の数を確定してマッチング位置の数を取得し、マッチング位置の数を比較ウィンドウにおける全位置数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００をかけることで、配列同一性百分率を生成する。配列同一性パーセントを確定するために行われる最適な照合は、この分野で知られている種々の方式により実現することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアが使用される。当業者は、比較されている全長配列範囲内又は目標配列領域内での最大の照合を実現するために必要な任意のアルゴリズムを含め、配列を照合するための適切なパラメータを決定することができる。

本発明の抗体製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、同時にＰＤ－１とＨＥＲ２タンパク質と結合することができるとともに、各親抗体の親和性定数を維持していることで、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の遮断とＰＤ－１シグナル伝達経路の遮断が可能になるので、種々のＨＥＲ２シグナル伝達経路及び／又はＰＤ－１シグナル伝達経路に関連する疾患又は障害の治療、予防又は遅延に用いられる。

一好ましい実施形態において、本発明の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７５８５１（出願日：２０１８年２月８日）に開示された組換え抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質であり、それは、全ヒト抗ＰＤ－１半抗体とヒト化抗ＨＥＲ２半抗体を含み、そのうち、全ヒト抗ＰＤ－１半抗体は、重鎖配列がＮからＣ方向へ配列番号１２及び配列番号１４で、軽鎖配列がＮからＣ方向へ配列番号１０及び配列番号４であり、ヒト化抗ＨＥＲ２半抗体は、重鎖配列がＮからＣ方向へ配列番号６及び配列番号８で、軽鎖配列がＮからＣ方向へ配列番号２及び配列番号４である。

一実施形態において、当該抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３細胞を基に改変して得られたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、若しくはＨＥＫ２９３Ｅ細胞、及びＣＨＯ細胞又はＣＨＯ細胞を基に改変して得られたＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ^-、ＣＨＯ／ＤＧ４４、若しくはＥｘｐｉＣＨＯ細胞で組換え発現することで発生され、かつ精製されたものである。好ましくは、本発明の液体製剤における前記抗体は、著しい抗腫瘍活性を示している。ＨＣＣ１９５４ヒト乳がん細胞で免疫不全ＮＣＧマウスに接種して得られた担腫瘍マウスに抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体を投与した結果、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体又は抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を投与する場合と比べて、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体を投与する方は、明らかに向上した抗腫瘍活性を有し、腫瘍の体積を著しく縮小することができる。

本発明の抗体製剤に含まれる抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の量は、製剤の特定の目的特性、特定の環境と、製剤を使用する特定の目的によって変えることができる。幾つかの実施形態において、抗体製剤は液体製剤であり、約１～１５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１０～１００ｍｇ／ｍＬ、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質を含んでもよい。

（ii）緩衝剤
緩衝剤は、溶液のｐＨ値を許容される範囲に維持することができる試薬である。幾つかの実施形態において、本発明の製剤に用いられる緩衝剤は、本発明の製剤のｐＨを約５．０～６．５のｐＨ範囲、例えば、ｐＨ約５．５に制御することができる。幾つかの具体的な実施形態において、本発明の抗体製剤は、約５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４のｐＨを有する。

幾つかの実施形態において、本発明の製剤に用いられる緩衝剤は、ヒスチジン、ヒスチジン塩酸塩とそれらの組み合わせから選ばれる。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における緩衝剤の濃度は、約５～５０ｍＭである。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における緩衝剤の濃度は、約１０～３０ｍＭ、例えば、約１０、１５、２０、２５、３０ｍＭである。

一実施形態において、本発明の製剤に用いられる緩衝剤は、約１０ｍＭのヒスチジンである。別の実施形態において、本発明の製剤に用いられる緩衝剤は、約２０ｍＭヒスチジンである。

さらに別の実施形態において、本発明の製剤に用いられる緩衝剤は、ヒスチジン約５．５ｍＭとヒスチジン塩酸塩約１５ｍＭとの組み合わせである。

（iii）安定剤
本発明に用いられる適切な安定剤は、糖類、ポリオール及びそれらの組み合わせから選ばれてもよい。さらに、本発明の安定剤は、酸化防止剤を含んでもよい。

安定剤となる糖類は、二糖、三糖と多糖であってもよく、糖類は、スクロース、右旋性グルコース、ラクトース、マルトース、トレハロース、シクロデキストリン、マルトデキストリンとデキストランから選ばれてもよいが、これらに限定されない。一実施形態において、安定剤となる糖類は、スクロース及び／又はトレハロースである。

安定剤となるポリオールは、マンニトール、ソルビトールとキシリトールから選ばれてもよいが、これらに限定されない。一実施形態において、安定剤となるポリオールは、ソルビトールである。

幾つかの実施形態において、安定剤となる糖類及び／又はポリオールは、本発明の液体製剤において約５０～５００ｍＭ、好ましくは約１００～４００ｍＭ、例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｍＭの濃度で存在する。

本発明の安定剤にさらに包含可能な酸化防止剤は、ホモシステイン、システイン、シスタチオニン、メチオニン、グルタチオン、及びホモシステイン、システイン、シスタチオニン、メチオニンとグルタチオンのうちの何れか１つを含むペプチドから選ばれるが、これらに限定されない。酸化防止剤を含む場合に、安定剤の総濃度は約５０～５００ｍＭ、好ましくは総濃度は約１００～４００ｍＭ、例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｍＭであり、そのうち、酸化防止剤の濃度は約１～５０ｍＭ、好ましくは約５～４０ｍＭ、例えば、約５、１０、２０、３０、４０ｍＭである。

一実施形態において、本発明の液体製剤は、ソルビトールを安定剤として含む。本発明の液体製剤におけるソルビトールの量は、約５０～４００ｍＭであってもよく、例えば、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｍＭである。

一実施形態において、本発明の液体製剤は、スクロースを安定剤として含む。本発明の液体製剤におけるスクロースの量は、約５０～３００ｍＭであってもよく、例えば、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００ｍＭである。

一実施形態において、本発明の液体製剤は、トレハロースを安定剤として含む。本発明の液体製剤におけるトレハロースの量は、約５０～３００ｍＭであってもよく、例えば、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００ｍＭである。

一実施形態において、本発明の液体製剤は、スクロースとメチオニンの組み合わせを安定剤として含む。当該組み合わせにおいて、安定剤の総濃度は約５０～５００ｍＭ、好ましくは総濃度は約１００～４００ｍＭ、例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｍＭであり、そのうち、メチオニンの濃度は約１～５０ｍＭ、好ましくは約５～４０ｍＭ、例えば、約５、１０、２０、３０、４０ｍＭである。

（iv）界面活性剤
本明細書で使用されるように、「界面活性剤」という用語は、両親媒性構造を有する有機物質を指し、すなわち、これらは反対の溶解性傾向を持つ基からなり、一般的に、油溶性の炭化水素鎖及び水溶性のイオン基からなる。

一実施形態において、本発明の液体製剤における界面活性剤は、非イオン性界面活性剤で、例えば、アルキルポリ（オキシレン）である。本発明の製剤に包含可能な特定の非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリソルベート６０、ポリソルベート４０のようなポリソルベート、及びプルロニックなどを含む。一好ましい実施形態において、本発明の液体製剤は、ポリソルベート８０を界面活性剤として含む。

本発明の抗体製剤に含まれる界面活性剤の量は、製剤の特定の目的特性、特定の環境、及び製剤を使用する特定の目的によって変えることができる。幾つかの好ましい実施形態において、製剤は約０．１～１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．２～０．８ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８ｍｇ／ｍＬのポリソルベート界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）を含んでもよい。

（ｖ）他の賦形剤
本発明の抗体液体製剤は、他の賦形剤を含んでも含まなくてもよい。例えば、本発明の抗体液体製剤は、張力調整剤を含んでもよい。張力調整剤は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムと塩化カルシウムからなる群から選ばれる。

これらの賦形剤、その他の既知の医薬賦形剤、及び／又は本発明の製剤に適用される添加剤は、この分野で公知されているものであり、例えば、「Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（２００３）」、及び「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）」に挙げられたものである。

ＩＩ． 製剤の調製
本発明は、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質を含む安定な製剤を提供する。本発明の製剤に用いられる抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、この分野で知られている抗体を製造するための技術により調製することができる。例えば、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質を組換え調製することができる。一好ましい実施形態において、本発明の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３細胞を基に改変して得られたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、若しくはＨＥＫ２９３Ｅ細胞、及びＣＨＯ細胞又はＣＨＯ細胞を基に改変して得られたＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ^-、ＣＨＯ／ＤＧ４４、若しくはＥｘｐｉＣＨＯ細胞で組換え発現することにより調製され、例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７５８５１に記載されるように、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質が組換え調製される。

現在、抗体は医薬の活性成分として幅広く適用されている。治療性抗体を薬用レベルまで精製するための技術は、この分野で公知されているものである。例えば、Ｔｕｇｃｕら（Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｔｅｐｓ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９９（２００８）５９９～６１３．）により、タンパク質Ａ捕捉工程の後にイオン交換クロマトグラフィー（アニオンＩＥＸ及び／又はカチオンＣＥＸクロマトグラフィー）を利用する抗体３カラム精製法が記載されている。Ｋｅｌｌｅｙら（Ｗｅａｋ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０１（２００８）５５３～５６６）により、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーの後に弱分配性アニオンで樹脂を交換する２カラム精製法が記載されている。

一般的に、組換えにより産生される抗体は、抗体製剤調製用として十分な繰返し性及び適切な純度を有する医薬物質を提供するために、通常の精製法により精製することができる。例えば、抗体が組換え発現細胞から培地に分泌された後、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎの限外ろ過装置により、当該発現系からの上清液を濃縮することができる。その後、例えば、クロマトグラフィー、透析、アフィニティー精製などにより抗体の精製を行うことができる。タンパク質Ａは、アフィニティーリガンドとしてＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４型抗体の精製に適用される。例えば、イオン交換クロマトグラフィーなど、他の抗体精製法を使用してもよい。十分な純度の抗体を得た後に、この分野における既知の方法により、抗体が含まれる製剤を調製してもよい。

例えば、（１）発酵完了後に、上清が得られるように発酵液を遠心分離して細胞などの不純物を除去する工程と、（２）アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４型抗体に対して特異的な親和性を有するタンパク質Ａカラム）により抗体を捕捉する工程と、（３）ウィルスの不活化を行う工程と、（４）（一般的にＣＥＸカチオン交換クロマトグラフィーを採用することができる）精製することにより、タンパク質における不純物を除去する工程と、（５）（ウイルス力価が例えば４ｌｏｇ１０以上低減されるように）ウィルスをろ過する工程と、（６）（タンパク質をその安定性に寄与する製剤緩衝液に置換して注射用として適切な濃度に濃縮するために用いることができる）限外ろ過／浸透ろ過する工程と、により調製してもよい。例えば、Ｂ．Ｍｉｎｏｗ，Ｐ．Ｒｏｇｇｅ，Ｋ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．６，２０１２，ｐｐ．４８～５７が参照される。

ＩＩＩ． 製剤の解析方法
抗体製剤の保存過程において、抗体の凝集、分解又は化学的修飾が発生されることで、抗体不均一性（サイズ不均一性及び電荷不均一性を含む）及び凝集物と断片などが引き起こされ、抗体製剤の品質に影響を与える恐れがある。従って、抗体製剤の安定性を監視する必要がある。

この分野では、抗体製剤の安定性の測定に利用可能な方法は、複数知られている。例えば、還元型ＣＥ－ＳＤＳ、非還元型ＣＥ－ＳＤＳとＳＥＣ－ＨＰＬＣなどの方法により、抗体製剤の純度の解析及び抗体の凝集レベルの評価を行うことができ、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）とイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）などにより、抗体製剤における電荷変異体を解析することができる。また、製剤の外観を目で検出することにより、製剤の安定性を迅速に判断することができる。可溶性及び不溶性の凝集物の量に関する情報を出すことができるＯＤ_350nm法により、製剤の濁度の変化を検出することもできる。また、紫外線分光光度法（ＵＶ法）により、製剤におけるタンパク質の含有量の変化を検出することができる。

非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法は、キャピラリーを分離通路とする抗体純度の測定法である。ＣＥ－ＳＤＳにおいて、タンパク質の移行は、ＳＤＳ結合による表面電荷により駆動されるが、当該表面電荷は、タンパク質の分子量に正比例する。全てのＳＤＳ－タンパク質複合物は、類似の質量電荷比を有するため、キャピラリーのモレキュラーシーブゲルマトリックスにおいて、分子のサイズ又は流体力学半径に基づく電気泳動分離を実現することができる。当該方法は、変性された完全な抗体の純度の監視に広く適用されている。一般的に、非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法では、供試品をＳＤＳ試料緩衝液及びヨードアセトアミドと混合する。そして、混合物を６８～７２℃で約１０～１５分間インキュベートし、室温まで冷却した後に遠心分離した上清液を解析に用いる。紫外線検出器によりタンパク質の移行を検出し、電気泳動図を得る。抗体製剤の純度は、全てのピーク面積の合計に対するＩｇＧメインピークのピーク面積の百分率として算出することができる。ＣＥ－ＳＤＳ法についての更なる記載は、例えば、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＥ ＳＤＳ ｇｅｌ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００８，２９，３６１２～３６２０を参照してよい。

サイズ排除高速液体クロマトグラフィーであるＳＥＣ－ＨＰＬＣ法は、抗体の基準及び品質管理に用いられるもう１つの重要な方法である。当該方法は、主に、分子のサイズ又は流体力学半径の差によって分子の分離を行う。ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより、抗体は、高分子量形（ＨＭＭＳ）、メインピーク（主に抗体モノマー）と低分子量形（ＬＭＭＳ）という３つの主要な形に分離することができる。抗体の純度は、クロマトグラフィーにおける全てのピーク面積の合計に対するメインピーク面積の百分率として算出することができる。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法により、製剤製品における抗体モノマーのパーセントを測定して、可溶性凝集物及びせん断物の含有量の情報を出すことができる。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法についての更なる記載は、例えば、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎ．，８３：１６４５～１６５０，（１９９４）；Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１１：４８５（１９９４）；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏ．Ａｎａｌ．，１５：１９２８（１９９７）；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏ．Ａｎａｌ．，１４：１１３３～１１４０（１９８６）を参照してよい。また、例えば、Ｒ．Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＳＥ－ＵＨＰＬＣ），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（２０１５），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｐｂａ．２０１５．０２．０３２、及びＡｌｅｘａｎｄｒｅ Ｇｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉ－Ｎｏｎ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｃｈｒｏｍｂ．２０１７．０５．０１０を参照してもよい。

イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）は、抗体の電荷不均一性の解析に用いることができる。当該方法は、電荷変異体の定量的な分布状況を提供することができる。ｉＣＩＥＦは、ｐＨ勾配における分子の電荷差（見掛けのｐＩ値）に基づき、分子分離の目的を達成させる。ｉＣＩＥＦにおいて、分離カラムは通常、短いキャピラリー（例えば、長さが５ｃｍ、内径が１００μｍのシリカキャピラリー）であり、タンパク質は高電圧でキャピラリーカラムにおいてフォーカスされ、そして２８０ｎＭで操作される全カラムイメージング検出システムによりフォーカスがオンラインでリアルタイム監視される。当該技術の利点の一つとして、当該全カラムイメージング検出システムにより、抗体試料の種々の電荷変異体を同時に記録することができる。一般的に、ｉＣＩＥＦでは、試料を尿素及びｉＣＩＥＦ緩衝液と混合するが、ここで、前記緩衝液にはメチルセルロース、ｐＩ分子量基準及び両性電解質が含まれる。そして、ｉＣＩＥＦアナライザー、例えば、ｉＣＥ２８０アナライザー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）において、ｉＣＩＥＦカラム、例えばＰｒｏｔｉｏｎＳｉｍｐｌｅで組立てられたｉＣＩＥＦカラムにより、試料が一定の期間フォーカスされた後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体電荷変異体にフォーカスされたクロマトグラフィーを得ることができる。ｉＣＩＥＦクロマトグラフィーにおいて、メインピーク（すなわち、主成分）の前に溶出されたタンパク質関連ピークは酸性成分に分類されるのに対して、メインピークの後に溶出されたタンパク質関連ピークは塩基性成分に分類される。主成分、酸性成分、及び塩基性成分の相対的な量は、全ピーク面積に対するパーセントで示すことができる。ｉＣＩＥＦについての更なる記載は、例えば、Ｓａｌａｓ－Ｓｏｌａｎｏ Ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ｏｆ ｉＣＩＥＦ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｎ ｉｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｕｄｙ，Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ．２０１２ Ｎｏｖ；３５（２２）：３１２４～９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｓｓｃ．２０１２００６３３．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｏｃｔ １５、及びＤａｄａ ＯＯ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ＩｇＧ１ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｎｏｎ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＩＥＦ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２０１５ Ｎｏｖ；３６（２１～２２）：２６９５～２７０２．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｌｐｓ．２０１５００２１９．Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｓｅｐ １８を参照してよい。

カチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）により、抗体製剤における抗体の電荷変異体を測定することもできる。当該測定法において、メインピークの保持時間よりも早くＣＥＸ－ＨＰＬＣカラムから溶出されたピークは、「酸性ピーク」と標識され、メインピークの保持時間よりも遅くＣＥＸ－ＨＰＬＣカラムから溶出されたピークは、「塩基性ピーク」と標識される。

加速安定性の研究は、製品の安定性の性質の検査に用いることができ、安定な医薬製剤の形式のふるい分けに寄与する。例えば、製剤試料を上昇された温度、例えば、約４０℃±２℃、２５℃±２℃の条件で置き、加速安定性の研究を行うことができる。検出指標は、外観、可視の異物、タンパク質の含有量、濁度、純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法、非還元型ＣＥーＳＤＳ法）及び電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ法）を含むことができる。

また、抗体の効能又は生物活性を測定することができる。例えば、製剤における抗体とその抗原分子（ＨＥＲ２分子とＰＤ－１分子）との結合能力を測定することができる。当業者には、抗体と抗原との特異的結合を定量するために利用可能な方法、例えば、免疫測定試験、ＥＬＩＳＡなどが複数知られている。

本発明の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質製剤は、安定である。一実施形態において、約５℃、２５℃、３７℃、４０℃又は４５℃で少なくとも１カ月、２カ月又は３カ月保存した後、例えば、５℃±３℃で３カ月保存した後、本発明の抗体製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の純度は、サイズ排除クロマトグラフィー法により又は非還元型ＣＳ－ＳＤＳにより測定されるように、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上である。一実施形態において、約５℃、２５℃、３７℃、４０℃又は４５℃で少なくとも１カ月、２カ月又は３カ月保存した後、例えば、５℃±３℃で３カ月保存した後、本発明の抗体製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％は、ｉＣＩＥＦ法により測定されるように、非塩基性及び非酸性形式（すなわち、メインピーク又は主な電荷形式）である。

ＩＶ． 製剤の使用
本発明の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質を含む本発明の抗体製剤は、種々のＨＥＲ２シグナル伝達経路及び／又はＰＤ－１シグナル伝達経路に関連する疾患又は障害の治療、予防又は遅延に用いることができる。「ＨＥＲ２シグナル伝達経路に関連する疾患又は障害」及び／又は「ＰＤ－１シグナル伝達経路に関連する疾患又は障害」は本明細書において、本発明の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質製剤により治療（例えば、改善）又は予防可能な疾患又は障害を指す。本発明の抗体製剤による治療から利益を得ることができるいずれの疾病や障害も、本発明に適用される。

抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質を含む本発明の製剤は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮がん、非小細胞肺がん、鼻咽頭がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、肝がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫を含むが、これらに限定されない対象の種々の血液病と固形腫瘍の予防又は治療に用いることができる。

本発明は、哺乳類に抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質を送達し、又は前記疾患と障害のうちの１つ又は複数を治療、予防又は改善するための医薬の調製における本発明の製剤の使用をさらに提供する。好ましくは、哺乳類はヒトである。

様々な方法で本発明の抗体製剤を対象又は患者に投与することができる。例えば、投与は、注入により、又は注射器により行われてもよい。従って、一態様において、本発明は、本発明の抗体製剤（例えば、薬剤充填済み注射器）を含む送達装置（例えば、注射器）を提供する。患者は、疾病又は障害の治療、改善又は予防に十分な量である有効量の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質を主な活性成分として受ける。

治療効果は、生理的な症状の軽減を含むことができる。任意の特定の対象に用いられる抗体の最適な有效量と濃度は、患者の年齢、体重、体調及び／又は性別、疾患の性質と程度、特定の抗体の活性、抗体に対する体のクリアランスを含むとともに、前記抗体製剤と組み合わせて投与される任意の可能な他の治療も含む種々の要因によって決定される。具体的な場合に、伝達される有効量は、臨床医の判断範囲内で決定することができる。治療すべき適応症に応じて、有効投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。この点において、既知の抗体に基づく医薬の適用は、一定の指導を与えることができる。投与量は、単回投与量案又は複数回投与量案であってもよい。

本発明の理解を補助するために、以下の実施例を記載する。如何なる方法によっても、実施例を、本発明の請求範囲を制限するものと解釈する意図はなく、そうすべきでもない。

略語の説明
ＣＥ－ＳＤＳ：ラウリル硫酸ナトリウムキャピラリーゲル電気泳動
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定法
ｉＣＩＥＦ：イメージングキャピラリー等電点電気泳動
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ：サイズ排除高速液体クロマトグラフィー

製品の使用期限（少なくとも２４カ月）での品質が管理可能になるように、組換え抗プログラム細胞死受容体１（ＰＤ－１）と抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）である二重特異性抗体注射液が長期間安定して保存される製剤調合法を開発するために、調合法ふるい分け試験を設計し、異なる補助材料の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体製剤の安定性への影響を調べた。試験に用いられる材料と方法は、下記の通りである。

材料及び方法

１．３． 製剤の安定性の検出項目及び検出方法
抗体製剤に対して下記の項目を検出した。（１）外観及び可視の異物の有無を検出した（２）紫外線法（ＵＶ法）により製剤におけるタンパク質の含有量を測定した（３）３５０ｎｍでの吸光度を検出することにより、濁度を測定した（４）サイズ排除クロマトグラフィー、例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ＨＰＬＣ；ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）により、抗体製剤の純度（全てのピーク面積の合計に対するモノマーの面積のパーセントで示す）を測定した（５）還元型ラウリル硫酸ナトリウムキャピラリーゲル電気泳動（還元型ＣＥ－ＳＤＳ）及び／又は非還元型ラウリル硫酸ナトリウムキャピラリーゲル電気泳動（非還元型ＣＥ－ＳＤＳ）により抗体製剤の純度（全てのピーク面積の合計に対するモノマーの面積のパーセントで示す）を測定した（６）イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ法）により抗体製剤における電荷変異体（主成分、酸性成分、及び塩基性成分のパーセントで示す）を測定した（７）免疫測定法、例えば、直接ＥＬＩＳＡ法により、抗体製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体のＰＤ－１抗原とＨＥＲ２抗原に対する相対結合活性を測定した。

可視の異物の測定
国家薬典委員会、中華人民共和国薬典（２０１５年版、四部通則０９０４「可視の異物の検査法」、北京：中国医薬科技出版社、２０１５）に記載されている方法に従って、透明度検出器（天津天大天発製、型番ＹＢ－２）により、試料における可視の異物を検査した。

タンパク質の含有量の測定
紫外線分光光度計（日本島津製、型番ＵＶ－１８００）により、試料におけるタンパク質の含有量を測定した。

濁度の測定
紫外線分光光度計（日本島津製、型番ＵＶ－１８００）により、３５０ｎｍで試料の吸光度を測定し、試料の濁度を確認した。

純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法）
体積排除クロマトグラフィーカラムにより分離したが、流動相はリン酸塩緩衝液（リン酸二水素ナトリウム二水和物３．１２ｇ、塩化ナトリウム８．７７ｇとアルギニン３４．８４ｇを秤量し、超純水で溶解した後塩酸でｐＨ６．８に調整し、１０００ｍＬに定容した）で、クロマトグラフィーカラム保護液は０．０５％（ｗ／ｖ）のＮａＮ₃であり、注入量５０μｌ、流速０．５ｍＬ／分、採取時間３０分間、カラム温度２５℃、検出波長２８０ｎｍである。測定すべき試料を取って超純水で２ｍｇ／ｍＬまで希釈し、供試品溶液とした。製剤緩衝液を取って上記と同様に希釈した後、ブランク溶液とした。ブランク溶液を取り、供試品溶液をそれぞれ５０μｌ取って液体クロマトグラフに注ぎ込み、検出し始めた。

純度（還元型ＣＥ－ＳＤＳ法）
キャピラリーゲル電気泳動法により検出した。キャピラリーはコーティングされていないキャピラリーで、内径５０μｍ、全長３０．２ｃｍ、有効長さ２０．２ｃｍである。電気泳動前に、それぞれ０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸、超純水、電気泳動ゲルにより７０ｐｓｉでキャピラリーカラムを洗浄した。測定すべき試料を適量の超純水で２．０ｍｇ／ｍＬまで希釈し、上記希釈された試料５０μｌを１．５ｍＬの遠心分離管に取り込み、その中にｐＨ６．５の試料緩衝液４５μｌ（クエン酸一水和物０．３２ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物２．４５ｇを秤量し、超純水４５ｍＬに溶解し、５０ｍＬに定容し、クエン酸－リン酸塩緩衝液を調製し、精密に当該緩衝液２００μｌを量り取り、１０％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸ナトリウム溶液８０μｌを入れて、１ｍＬになるまで水を加え、均一に混合することで得た）、内部標準液１μｌ（１０ｋＤａのタンパク質、５ｍｇ／ｍＬ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、製品番号：３９０９５３）とβ－メルカプトエタノール５μｌをそれぞれ加え、十分に均一に混合した後、７０±２℃で１０±２分間加熱し、室温まで冷却してから試料瓶に移転して供試品溶液とした。供試品と同じ体積の製剤緩衝液を取り、上記方法と同様に操作して、ブランク溶液を得た。試料注入条件：－５ｋＶ ２０秒間、分離電圧：－１５ｋＶ ３５分間。キャピラリーカラムの温度は２５℃に制御され、検出波長は２２０ｎｍである。

純度（非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法）
キャピラリーゲル電気泳動法により検出した。キャピラリーはコーティングされていないキャピラリーで、内径５０μｍ、全長３０．２ｃｍ、有効長さ２０．２ｃｍである。電気泳動前に、それぞれ０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸、超純水、電気泳動ゲルにより７０ｐｓｉでキャピラリーカラムを洗浄した。測定すべき試料を適量の超純水で２．０ｍｇ／ｍＬまで希釈し、上記希釈された試料５０μｌを１．５ｍＬの遠心分離管に取り込み、その中にｐＨ６．５の試料緩衝液４５μｌ（クエン酸一水和物０．３２ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物２．４５ｇを秤量し、超純水４５ｍＬに溶解し、５０ｍＬに定容し、クエン酸－リン酸塩緩衝液を取得し、精密に当該緩衝液２００μｌを量り取り、１０％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸ナトリウム溶液８０μｌを入れて、１ｍＬになるまで水を加え、均一に混合することで得た）、内部標準液１μｌ（１０ｋＤａのタンパク質、５ｍｇ／ｍＬ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、製品番号：３９０９５３）と２５０ｍｍｏｌ／ＬのＮＥＭ溶液５μｌ（Ｎ－エチルマレイミド６２ｍｇを秤量し、超純水２ｍＬに溶解する）５μｌをそれぞれ加え、十分に均一に混合した後、７０±２℃で１０±２分間加熱し、室温まで冷却してから試料瓶に移転して供試品溶液とした。供試品と同じ体積の製剤緩衝液を取り、上記方法と同様に操作して、ブランク溶液を得た。試料注入条件：－５ｋＶ ２０秒間、分離電圧：－１５ｋＶ ３５分間。キャピラリーカラムの温度は２５℃に制御され、検出波長は２２０ｎｍである。

電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）
イメージングキャピラリー等電点電気泳動法（ｉＣＩＥＦ法）により検出した。キャピラリーは、内径１００μｍ、全長５ｃｍである。試料の電気泳動前に、それぞれ０．５％のメチルセルロース溶液（以下、ＭＣ溶液とも略す）、超純水によりキャピラリーカラムを洗浄する必要がある。真空注入方式が採用され、プリフォーカス電圧及び時間は１．５ｋＶ、１分間、フォーカス電圧及び時間は３ｋＶ、８分間、注入時間は５５秒間、試料盤の温度は１０℃、検出波長は２８０ｎｍである。陰極安定剤（Ｃａｔｈｏｄｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）は、５００ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン溶液で、０．５％のＭＣ溶液によりタンパク質とキャピラリーとの密着が低減される。供試品を水で１．０ｍｇ／ｍＬまで希釈し、希釈された供試品溶液２０μｌを取り、その中に予混合液（予混合液の配合比は、ｐＩ ０．５％のＭＣ溶液７０μｌ、両性電解質（ｐＨ３～１０）４μｌ、陰極安定剤２μｌ、ｐＩ ５．８５マーカー１μｌ、ｐＩ ９．９９マーカー１μｌである）７８μｌを加え、十分に均一に混合して測定すべき試料溶液を得た。インジェクション分析して、面積正規化法により、主成分、酸性成分、及び塩基性成分の含有量を算出した。

相対結合活性（直接ＥＬＩＳＡ法）
ＣＢＳで抗原（ＰＤ－１に対する抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体の抗ＰＤ－１端の相対結合活性を検出する場合は、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入された組換えヒトＰＤ－１、製品番号：１０３７７－Ｈ０８Ｈを使用し、ＨＥＲ２に対する抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体の抗ＨＥＲ２端の相対結合活性を検出する場合は、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入されたＨｕｍａｎ ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、製品番号：１０００４－Ｈ０８Ｈ－１００を使用した）を０．５μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μｌ／ウェルで、４℃で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにて一晩被覆した。プレートを洗った後、封止液（２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴ、３００μｌ／ウェル）を入れて３７℃で２ｈ封止した。２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴで抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体を３μｇ／ｍＬまで希釈し、３倍の勾配で１１番目の濃度（０．０５～３０００ｎｇ／ｍＬ）まで希釈した。勾配希釈された供試品を１００μｌ／ウェルで、シール液が除去されたＥＬＩＳＡプレートに加入し、１ウェル当たり希釈液（２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴ）１００μｌのみが入れられるように陰性対照を設け、３７℃で恒温培養器にて６０ｍｉｎインキュベートした。プレートを洗った後、２％のＢＳＡ－ＰＢＳＴで希釈されたＨＲＰ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ断片（アメリカ ＢＥＴＨＹＬ、製品番号Ａ８０－１０４Ｐ）を二次抗体（１０００００倍希釈され、１００μｌ／ウェル）として加え、３７℃で３０ｍｉｎ反応した。プレートを洗った後、１ウェル当たりＴＭＢ発色液１００μｌを加え、１０ｍｉｎ発色した後、１ウェルあたり１ｍｏｌ／ＬのＨ₂ＳＯ₄ １００μｌを入れて反応を止めた。６２０ｎｍを参照波長として、４５０ｎｍでのＯＤ値を測定した。各濃度勾配試料の濃度値を横軸として、各勾配試料のＯＤ４５０ｎｍ～ＯＤ６２０ｎｍ値を縦軸として、Ｐｒｉｓｍ４パラメータフィッティングによりＥＣ₅₀を算出し、抗体と各抗原との結合活性を反映した。

実施例１． 抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体の調製と精製
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７５８５１の記載により、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体を調製して精製した。

具体的に、抗ヒトＰＤ－１の抗体重鎖と軽鎖を含むＸ０ＧＣ発現ベクター（Ｘ０ＧＣ発現ベクターの構築は中国特許出願番号２００７８００３８４０３．３を参照する）をそれぞれ構築し、ここで、軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は配列番号９に示され、アミノ酸配列は配列番号１０に示され、軽鎖定常領域ヌクレオチド配列は配列番号３に示され、アミノ酸配列は配列番号４に示され、重鎖可変領域ヌクレオチド配列は配列番号１１に示され、アミノ酸配列は配列番号１２に示され、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は配列番号１３に示され、アミノ酸配列は配列番号１４に示される。

抗ヒトＨＥＲ２の抗体重鎖と軽鎖を含むＸ０ＧＣ発現ベクターをそれぞれ構築し、ここで、軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は配列番号１に示され、アミノ酸配列は配列番号２に示され、軽鎖定常領域ヌクレオチド配列は配列番号３に示され、アミノ酸配列は配列番号４に示され、重鎖可変領域ヌクレオチド配列は配列番号５に示され、アミノ酸配列は配列番号６に示され、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は配列番号７に示され、アミノ酸配列は配列番号８に示される。

前記抗ヒトＰＤ－１抗体の重鎖と軽鎖を含む発現ベクターを２９３Ｆ細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^TM ２９３－Ｆ Ｃｅｌｌｓ、製品番号Ｒ７９００７、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にそれぞれトランスフェクションし、発現・精製して還元プロセスを経て、１本の重鎖と１本の軽鎖を含む抗ヒトＰＤ－１半抗体分子を得た。

同様に、前記抗ヒトＨＥＲ２抗体の重鎖と軽鎖を含む発現ベクターを２９３Ｆ細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^TM ２９３－Ｆ Ｃｅｌｌｓ、製品番号Ｒ７９００７、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にそれぞれトランスフェクションし、発現・精製して還元プロセスを経て、１本の重鎖と１本の軽鎖を含む抗ヒトＨＥＲ２半抗体分子を得た。

還元された抗ＰＤ－１半抗体分子及び還元された抗ＨＥＲ２半抗体分子を等モル比で混合し、４℃の条件で２４時間組換え反応を行うと、抗ＰＤ－１半抗体分子及び抗ＨＥＲ２半抗体分子を含むヘテロ二量体の二重特異性抗体の溶液を得た。前記溶液を限外ろ過濃縮管により限外ろ過して濃縮した後、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００型タンパク質精製システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びイオンクロマトグラフィーカラムＳｏｕｒｃｅ １５Ｓ（１６ｍｍ Ｉ．Ｄ．、１７ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により４℃で精製し、純度９９．９６％の抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体を得た。

実施例２． ｐＨによる製剤の安定性への影響試験の一つ
本実施例は、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体を含む製剤のｐＨ５．０～６．５での安定性を調べた。それぞれ５．０、５．５、６．０と６．５である合計４つのｐＨ値を設計した。

２．１ 実験手順
ヒスチジン１０ｍＭ、５％（ｗ／ｖ）のソルビトール緩衝液を調製し、希塩酸でｐＨ５．０、５．５、６．０と６．５にそれぞれ調整し、実施例１の精製された抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体を限外ろ過して前記異なるｐＨ値の溶液に置換した。置換が完了した後、試料における二重特異性抗体タンパク質の含有量を約２０ｍｇ／ｍＬに調整し、そしてポリソルベート８０の最終濃度が０．３０ｍｇ／ｍＬになるようにポリソルベート８０を加え、ろ過してバイアル瓶に分注し、プラグを入れて蓋をした。各試料に対して４０℃±２℃の条件で安定性を調べたが、具体的な実験方法は表１に示されている。

２．２ 判断基準
試料が変化したか否かを判断するために、製品に対する認識及び器具と方法の精密度に基づき、試料検出指標数値を初期値と比べて品質の変化がない判定基準を設定したが、詳細は表２に示されている。

２．３ 調合法ふるい分け試験の一つの実験結果
（１）外観と可視の異物
４０℃±２℃の条件で１カ月置かれた後、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０とｐＨ６．５の試料は、外観と可視の異物がいずれも合格である。

（２）タンパク質の含有量
ｐＨ５．０、５．５、６．０と６．５で４０℃±２℃で異なる時間置かれた後、各試料のタンパク質の含有量の検出結果は表３に示されている。その結果から明らかなように、４０℃±２℃の条件で１カ月置かれた後、各ｐＨ値の試料のいずれにも著しい変化がなかった。

（３）濁度
ｐＨ５．０、５．５、６．０と６．５で４０℃±２℃で異なる時間置かれた後、各試料の濁度の検出結果は表４に示され、その変化の傾向は図２に示されている。その結果から明らかなように、４０℃±２℃の条件で１カ月置かれた後、各ｐＨ値の試料の濁度はいずれも高くなり、かつ、ｐＨが高いほど、濁度の変化速度が早くなった。

（４）純度
ｐＨ５．０、５．５、６．０と６．５で４０℃±２℃で異なる時間置いた後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法により各試料のタンパク質の純度を測定した。結果は表５に示され、その変化の傾向は図３に示されている。その結果から明らかなように、４０℃±２℃の条件で１カ月調べたところ、異なるｐＨ値の試料の純度のいずれにも明らかな変化がなかった。

ｐＨ５．０、５．５、６．０と６．５で４０℃±２℃で異なる時間置いた後、非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法により各試料のタンパク質の純度をそれぞれ測定した。結果は表６に示され、その変化の傾向は図４に示されている。その結果から明らかなように、４０℃±２℃の条件で１カ月調べたところ、各ｐＨ値の試料の純度はいずれも低下し、０日間の試料の純度と比べてそれぞれ２．６％、２．５％、２．５％と３．２％低下した。

ｐＨ５．０、５．５、６．０と６．５で４０℃±２℃で異なる時間置いた後、還元型ＣＥ－ＳＤＳ法により各試料のタンパク質の純度をそれぞれ測定した。結果は表７に示され、その変化の傾向は図５に示されている。その結果から明らかなように、４０℃±２℃の条件で１カ月調べたところ、各ｐＨ値の試料の純度は、０日間の試料の純度と比べてそれぞれ０．４％、０．７％、０．６％と１．４％低下した。

（５）電荷変異体
ｐＨ５．０、５．５、６．０と６．５で４０℃±２℃で異なる時間置いた後、ｉＣＩＥＦ法により各試料の電荷変異体を測定した。結果は表８に示され、その変化の傾向は図６に示されている。その結果から明らかなように、４０℃±２℃の条件で１カ月調べたところ、各ｐＨ値の試料は、主成分及び酸性成分と塩基性成分がいずれも明らかに変化した。ｐＨ値が高いほど、試料の主成分が速く低下し、酸性成分が速く向上した。

（６）相対結合活性
ｐＨ５．０、５．５、６．０と６．５で４０℃±２℃で異なる時間置いた後、直接ＥＬＩＳＡ法により各試料の相対結合活性を測定した。結果は表９に示されている。その結果から明らかなように、４０℃±２℃の条件で２週間調べたところ、ＰＤ－１抗原及びＨＥＲ２抗原と結合する各試料の相対結合活性はいずれも７０％よりも高く、ｐＨ６．０とｐＨ６．５の試料の抗ＨＥＲ２端の相対結合活性は明らかに低下し、いずれも７０％よりも低くなり、４０℃±２℃の条件で１カ月調べたところ、ＰＤ－１抗原と結合する各試料の相対結合活性は依然として７０％よりも高く、ＨＥＲ２抗原と結合するｐＨ６．０とｐＨ６．５の試料の相対結合活性のみが７０％より低いものの、やはり５０％より高かった。

上記のように行われたｐＨの製剤の安定性への影響試験の結果から、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体はｐＨ５．０～６．５で４０℃±２℃で２週間置かれた後、試料の外観と可視の異物がいずれも合格で、タンパク質の含有量に著しい変化がないとともに、ＨＥＲ２抗原及びＰＤ－１抗原との相対結合活性にも明らかな変化がなく、また、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体はｐＨ５．０～６．５で４０℃±２℃で１カ月置かれた後、試料の外観と可視の異物がいずれも合格で、タンパク質の含有量に著しい変化がないとともに、ＰＤ－１抗原との相対結合活性にも明らかな変化がなく、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体は、ｐＨ６．０とｐＨ６．５の場合のみ、ＨＥＲ２抗原と結合する相対結合活性が低下したものの、依然として５０％よりも高いことが明らかになる。その後の実施例においては、ｐＨ５．０～６．５からｐＨ５．５を選択して実験を行った。

実施例３． 調合法ふるい分け試験
３．１ 安定剤ふるい分け試験
ポリオールとしてのソルビトール、糖類としてのスクロース、トレハロース、酸化防止剤としてのメチオニンなどの異なる安定剤の、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体を含む製剤の安定性への影響を調べた。

３．１．１ 安定剤ふるい分け試験工程
合計４つの調合法を設計したが、詳しい調合法情報は表１０に示されている。表１０に従って各調合法の緩衝液を調製し、抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体を限外ろ過してそれぞれの調合法溶液に置換した。置換完了後、各調合法のタンパク質の含有量を約５０．０ｍｇ／ｍＬに調整し、ポリソルベート８０の最終濃度が０．２０ｍｇ／ｍＬになるように、ポリソルベート８０を入れ、ろ過してバイアル瓶に分注し、プラグを入れて蓋をした。各試料に対して４０℃、２５℃、５℃の条件で安定性を調べたが、具体的な方法は表１１に示されている。検出指標は、外観、可視の異物、タンパク質の含有量、純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法、非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法）及び電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）である。

３．１．２ 判定基準
判定基準の詳細は、実施例２における表２に示されている。
３．１．３ 安定剤ふるい分け試験

（１）外観、可視の異物
４０℃の条件で１カ月、２５℃±２℃の条件で２カ月、５℃±３℃の条件で３カ月観察した結果から明らかなように、各調合法の試料は、外観、可視の異物がいずれも合格である。

（２）タンパク質の含有量
４０℃の条件で１カ月、２５℃±２℃の条件で２カ月、５℃±３℃の条件で３カ月観察したが、各調合法試料のタンパク質の含有量の測定結果は表１２に示されている。その結果から明らかなように、４０℃、２５℃±２℃と５℃±３℃でこの３つの異なる温度条件で、４つの調合法におけるタンパク質の含有量のいずれにも変化がなかった。

（３）純度
純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法）：結果は表１３に示されている。その結果から明らかなように、４０℃の条件で４週間調べたところ、各調合法の試料の純度のいずれにも著しい変化がなく、２５℃±２℃の条件で２カ月した後、各調合法の試料の純度のいずれにも明らかな変化がなく、５℃±３℃の条件で３カ月した後、各調合法の試料の純度にも明らかな変化がなかった。

純度（非還元型ＣＥーＳＤＳ法、％）：結果は表１４に示されている。その結果から明らかなように、４０℃の条件で４週間調べたところ、各調合法の試料の純度のいずれにも著しい変化がなく、２５℃±２℃の条件で２カ月した後、各調合法の試料の純度のいずれにも明らかな変化がなく、５℃±３℃の条件で３カ月した後、各調合法の試料の純度のいずれにも著しい変化がなかった。

純度（還元型ＣＥ－ＳＤＳ法）：結果は表１５に示されている。その結果から明らかなように、４０℃の条件で４週間調べたところ、各調合法の試料の純度のいずれにも著しい変化がなく、２５℃±２℃の条件で２カ月した後、各調合法の試料の純度のいずれにも明らかな変化がなく、５℃±３℃の条件で３カ月した後、各調合法の試料の純度のいずれにも著しい変化がなかった。

（４）電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）
電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）：結果は表１６に示されている。４０℃と２５℃±２℃で、各調合法の電荷変異体の主成分の変化の傾向は、それぞれ図７と図８に示されている。

その結果から明らかなように、４０℃の条件で４週間調べたところ、各調合法の電荷変異体の主成分及び酸性成分と塩基性成分は明らかな変化が発生され、主成分が低下し、酸性成分が向上し、その変化の傾向がほぼ一致しており、調合法１～４の間には明らかな差異がなかった。２５℃±２℃の条件で２カ月加速した後、各調合法の電荷変異体の主成分及び酸性成分と塩基性成分は何れも明らかな変化が発生され、主成分が低下し、酸性成分が向上し、その変化の傾向がほぼ一致しており、調合法１～４の間には明らかな差異がなかった。５℃±３℃の条件で３カ月調べたところ、各調合法の電荷変異体の主成分及び酸性成分と塩基性成分のいずれにも明らかな変化がなかった。

調合法決定実験の結果から明らかなように、調合法１～４の間は変化の傾向が比較的一致しており、それらの間に明らかな差異がなかった。調合法の簡単さから考えると、単一の安定剤を使用する調合法１、調合法２と調合法３はタンパク質への保護に明らかな差異がないが、後の凍結乾燥製剤の開発を考慮した上で、調合法２を選定した。後の生産安全性から考えると、調合法２の緩衝系は、ｐＨの調整のために濃塩酸からヒスチジンとヒスチジン塩酸塩へ調整した。調整後の製剤の調合法の安定性を確保するために、次の実験をさらに実施した。

実施例４． 調合法確認実験
４．１ 調合法の設計と実験方法
調合法５を設計したが、調合法５の詳細は表１７に示されている。

調合法確認実験方法は表１８に示されている。

４．２ 実験結果
４０℃強制実験の結果は表１９に示されている。４０℃の条件で４週間置き、外観、可視の異物と生物学的活性はいずれも合格で、タンパク質の含有量、純度（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法とＣＥ－ＳＤＳ法）のいずれにも著しい変化がなく、電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）の主成分のみが１６．０％低下し、酸性成分が１４．０％向上し、塩基性成分が２．０％向上した。

その結果から明らかなように、４２．０ｍｇ／ｍＬの本発明の組換え全ヒト抗プログラム細胞死受容体１（ＰＤ－１）とヒト化抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）である二重特異性抗体は、調合法５（ヒスチジン０．８５ｍｇ／ｍＬ、ヒスチジン塩酸塩３．１７ｍｇ／ｍＬ、スクロース８０．００ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０ ０．２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５）において、実施例３における調合法２と比較的一致する変化の傾向を有する。

これにより、最適な製剤として、組換え全ヒト抗プログラム細胞死受容体１（ＰＤ－１）とヒト化抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）二重特異性抗体約４２．０ｍｇ／ｍＬ、ヒスチジン０．８５ｍｇ／ｍＬ、ヒスチジン塩酸塩３．１７ｍｇ／ｍＬ、スクロース８０．００ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０ ０．２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５が決定された。

以上、本発明の例示的な実施形態について説明したが、当業者は、これらの開示が例示的なものに過ぎず、本発明の範囲内で種々の他の置換、適用と修正を行うことができると理解すべきである。従って、本発明は、本明細書に列挙された具体的な実施形態に限定されない。

Claims (16)

1. （ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質と、
   （ｉｉ）緩衝剤と、
   （ｉｉｉ）安定剤と、
   （ｉｖ）界面活性剤と、を含む液体抗体製剤であって、
   前記抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＰＤ－１と特異的に結合する第１ＶＨ／ＶＬ単位を含む第１半抗体と、ＨＥＲ２と特異的に結合する第２ＶＨ／ＶＬ単位を含む第２半抗体と、を含み、前記第１ＶＨ／ＶＬ単位は、配列番号１２／配列番号１０の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる全ての重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲを含み、前記第２ＶＨ／ＶＬ単位は、配列番号６／配列番号２の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列に含まれる全ての重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲを含み、
   好ましくは、前記液体抗体製剤のｐＨ値が約５．０～６．５、例えば、約５．０、５．５、６．０、又は６．５である、液体抗体製剤。
2. 前記液体抗体製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の濃度は約１～１５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１０～１００ｍｇ／ｍＬ、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の液体抗体製剤。
3. 前記液体抗体製剤における緩衝剤は、ヒスチジン、ヒスチジン塩酸塩及びそれらの組み合わせから選ばれ、前記緩衝剤の濃度は好ましくは約５～５０ｍＭ、そしてより好ましくは約１０～３０ｍＭ、例えば、約１０、１５、２０、２５、又は３０ｍＭである、請求項１又は２に記載の液体抗体製剤。
4. 前記安定剤は、ポリオール（例えば、ソルビトール）、糖類（例えば、スクロース、トレハロース）及びそれらの任意の組み合わせから選ばれ、前記安定剤の濃度は好ましくは約５０～５００ｍＭ、そしてより好ましくは約１００～４００ｍＭ、例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、又は４００ｍＭである、請求項１～３の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
5. 前記安定剤は、ポリオール（例えば、ソルビトール）、糖類（例えば、スクロース、トレハロース）及びそれらの任意の組み合わせと酸化防止剤との組み合わせから選ばれ、前記安定剤の総濃度は好ましくは約５０～５００ｍＭで、そしてより好ましくは約１００～４００ｍＭ、例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、又は４００ｍＭであり、前記酸化防止剤の濃度は約１～５０ｍＭ、好ましくは約５～４０ｍＭ、例えば約５、１０、２０、３０、又は４０ｍＭであり、前記酸化防止剤は例えばメチオニンである、請求項１～３の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
6. 前記液体抗体製剤における界面活性剤は、ポリソルベート界面活性剤から選ばれ、そして好ましくはポリソルベート８０である、請求項１～５の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
7. 前記界面活性剤の濃度は約０．１～１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．２～０．８ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、又は０．８ｍｇ／ｍＬである、請求項１～６の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
8. 前記抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＰＤ－１と特異的に結合する第１ＶＨ／ＶＬ単位を含む第１半抗体と、ＨＥＲ２と特異的に結合する第２ＶＨ／ＶＬ単位を含む第２半抗体と、を含み、前記第１ＶＨ／ＶＬ単位は配列番号１２／配列番号１０の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、前記第２ＶＨ／ＶＬ単位は配列番号６／配列番号２の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、
   好ましくは、前記第１半抗体は、ＮからＣ方向の配列番号１２及び配列番号１４の重鎖配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する重鎖配列と、ＮからＣ方向の配列番号１０及び配列番号４の軽鎖配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する軽鎖配列とを含み、前記第２半抗体は、ＮからＣ方向の配列番号６及び配列番号８の重鎖配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する重鎖配列と、ＮからＣ方向の配列番号２及び配列番号４の軽鎖配列又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する軽鎖配列とを含む、請求項１に記載の液体抗体製剤。
9. 前記抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３細胞を基に改変して得られたＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、若しくはＨＥＫ２９３Ｅ細胞、及びＣＨＯ細胞又はＣＨＯ細胞を基に改変して得られたＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ^-、ＣＨＯ／ＤＧ４４、若しくはＥｘｐｉＣＨＯ細胞で組換え発現する、請求項１～８の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
10. 前記液体製剤は注射剤であり、好ましくは皮下注射又は静脈内注射に用いられ、又は注入剤であり、例えば静脈内注入に用いられる、請求項１～９の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
11. （ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約１～１５０ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｉ）ヒスチジン及び／又はヒスチジン塩酸塩約５～５０ｍＭと、
    （ｉｉｉ）ソルビトール、スクロース、トレハロース及びそれらの任意の組み合わせ約５０～５００ｍＭ、又は、
    ソルビトール、スクロース、トレハロース及びそれらの任意の組み合わせと、濃度が約１～５０ｍＭであるメチオニンとの、総濃度が約５０～５００ｍＭである組み合わせと、
    （ｉｖ）ポリソルベート８０約０．１～１ｍｇ／ｍＬと、を含み、
    前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５であり、
    例えば、前記液体抗体製剤は、
    （ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約１０～１００ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｉ）ヒスチジン及び／又はヒスチジン塩酸塩約１０～３０ｍＭと、
    （ｉｉｉ）ソルビトール、スクロース、及び／又はトレハロース約１００～４００ｍＭ、又は、
    ソルビトール、スクロース及び／又はトレハロースと、濃度が約５～４０ｍＭであるメチオニンとの、総濃度が約１００～４００ｍＭである組み合わせと、
    （ｉｖ）ポリソルベート８０約０．２～０．８ｍｇ／ｍＬと、を含み、
    前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５であり、
    又は、前記液体抗体製剤は、
    （ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約２０ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｉ）ヒスチジン約１０ｍＭと、
    （ｉｉｉ）ソルビトール約５０ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｖ）ポリソルベート８０約０．３ｍｇ／ｍＬと、を含み、
    前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５であり、
    又は、前記液体抗体製剤は、
    （ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約５０ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｉ）ヒスチジン約２０ｍＭと、
    （ｉｉｉ）ソルビトール約５０ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｖ）ポリソルベート８０約０．２ｍｇ／ｍＬと、を含み、
    前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５であり、
    又は、前記液体抗体製剤は、
    （ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約５０ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｉ）ヒスチジン約２０ｍＭと、
    （ｉｉｉ）スクロース約８０ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｖ）ポリソルベート８０約０．２ｍｇ／ｍＬと、を含み、
    前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５であり、
    又は、前記液体抗体製剤は、
    （ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約５０ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｉ）ヒスチジン約２０ｍＭと、
    （ｉｉｉ）トレハロース約８０ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｖ）ポリソルベート８０約０．２ｍｇ／ｍＬと、を含み、
    前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５であり、
    又は、前記液体抗体製剤は、
    （ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約５０ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｉ）ヒスチジン約２０ｍＭと、
    （ｉｉｉ）スクロース約８０ｍｇ／ｍＬ及びメチオニン約１．４９ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｖ）ポリソルベート８０約０．２ｍｇ／ｍＬと、を含み、
    前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５であり、
    又は、前記液体抗体製剤は、
    （ｉ）抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質約４２ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｉ）ヒスチジン約０．８５ｍｇ／ｍＬ及びヒスチジン塩酸塩約３．１７ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｉｉ）スクロース約８０ｍｇ／ｍＬと、
    （ｉｖ）ポリソルベート８０約０．２ｍｇ／ｍＬと、を含み、
    前記液体製剤のｐＨ値は約５．０～６．５、好ましくは約５．５である、請求項１～１０の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
12. 前記製剤は、保存後、例えば、２～８℃で少なくとも２４カ月保存した後、又は室温で少なくとも３カ月保存した後、又は４０℃±２℃で１カ月保存した後、安定であり、好ましくは、以下の：
    （ｉ）ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法で測定すると、製剤は９０％よりも高い純度、好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％よりも高い純度を有し、
    （ｉｉ）還元型又は非還元型ＣＥ－ＳＤＳ法で測定すると、製剤は９０％よりも高い純度、好ましくは９２％、９４％、９６％、又は９８％よりも高い純度を有し、
    （ｉｉｉ）ｉＣＩＥＦ法で測定すると、保存０日目の初期値に対して、製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の各成分（主成分、酸性成分、及び塩基性成分）の変化値は合わせて５０％以下、例えば４０％、３０％、２０％、１０％、又は５％以下であり、
    （ｉｖ）ＥＬＩＳＡ法で測定すると、保存０日目の初期値に対して、製剤における抗ＰＤ－１／ＨＥＲ２二重特異性抗体タンパク質の相対結合活性は７０％～１３０％、例えば７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、又は１３０％である、という特徴のうちの１つ又は複数を有する、請求項１～１１の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
13. 請求項１～１２の何れか１項に記載の液体抗体製剤を固化させることで得られ、例えば、注射用の凍結乾燥粉末の形態である、固体抗体製剤。
14. 請求項１～１２の何れか１項に記載の液体抗体製剤又は請求項１３に記載の固体抗体製剤を含む送達装置。
15. 請求項１～１２の何れか１項に記載の液体抗体製剤又は請求項１３に記載の固体抗体製剤を含み、静脈内注射又は筋肉内注射に用いられる薬剤充填済み注射器。
16. ＨＥＲ２シグナル伝達経路とＰＤ－１シグナル伝達経路に関連する障害を治療、予防又は遅延する医薬の調製における、請求項１～１２の何れか１項に記載の液体抗体製剤又は請求項１３に記載の固体抗体製剤の使用であって、前記障害は例えば、種々の血液病と固形腫瘍であり、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮がん、非小細胞肺がん、鼻咽頭がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、肝がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫を含むが、これらに限定されない前記使用。

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