CN114874349B - 一种基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法。该方法对于提取的灵芝粗多糖首先采用Sevag法进行4次除蛋白质，之后通过AF4池道，采用超纯水作为载液，采用10kDa可再生纤维素膜，0.2mL/min的超滤流速进行一段时间的超滤，最后进行非对称场流分离，非对称场流分离时采用超纯水作为载液，初始交叉流流速指数衰减降低至0.05mL/min。本发明在分离纯化灵芝多糖过程中减少了除蛋白质次数，并且整个过程中载液为超纯水，无需透析除盐步骤，在保护灵芝多糖活性的基础上提高了分离纯化效率，并得到了高纯度的灵芝多糖。
Description
技术领域
本发明涉及灵芝多糖分离和纯化技术领域，具体地说是一种基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)是一种多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体。在我国，灵芝已有2000多年的药用历史。根据《神农本草》记载，灵芝具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿的功效。多糖是灵芝主要活性成分之一，因此制备高纯度的灵芝多糖是研究其构效关系的必要条件。
天然植物多糖的分离纯化是一个耗时繁琐的过程，包括粗多糖的提取、除蛋白质、除盐、纯化等步骤。目前，多糖除蛋白质常用的Sevag法和三氯乙酸法效率低，需要反复多次除蛋白质(往往需要十次以上)，易造成多糖糖苷键断裂，影响多糖的生物活性，同时使用大量有机溶剂。透析除盐也是一个耗时的过程(大于24h)。膜分离技术是多糖纯化的一个重要组成部分，需要更换流动水保持其膜透析效率。目前，多糖的纯化通常采用离子交换色谱，流动相为盐溶液，纯化后的多糖溶液需要进一步透析除盐。非对称场流分离技术(Asymmetrical flow field-flow fractionation,AF4)是一种类色谱技术，AF4池道中没有固定相，降低了多糖在分离过程中降解风险。在AF4分离样品过程中，载液通过池道中的超滤膜产生外力，当外力和样品扩散达到平衡时，由于水合直径小的组分扩散系数大，平衡层更接近池道中心，进而被先洗脱出来。AF4载液中往往添加盐来调节其离子强度，提高样品组分的分离度。因此，收集的AF4样品片段需要透析除盐。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法，该方法无需透析除盐即可实现分离纯化灵芝多糖。
本发明是这样实现的：一种基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法，包括以下步骤：
(a)称取脱脂灵芝子实体粉，加入25倍超纯水混匀，超声辅助热水法提取，提取温度为70℃，提取时间为34min，抽滤去除灵芝残渣；
(b)将抽滤液旋蒸浓缩，加Sevag试剂，振荡，除蛋白质4次，静置后去除沉淀；
(c)将步骤(b)上清液旋蒸浓缩至10％，待用；
(d)通过非对称场流分离***对步骤(c)所得浓缩液进行一段时间(Tu)超滤，且30min≤Tu≤45min，载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min；
(e)将步骤(d)中的样品进行非对称场流分离，进样体积为100μL，载液为超纯水，采用指数衰减交叉流流速洗脱，初始交叉流流速(Vc)降低至0.05mL/min，且2.6mL/min≤Vc≤3.0mL/min，半衰期为0.8min；
(f)将步骤(e)中的非对称场流分离的多糖片段进行收集，旋蒸浓缩至1％，冷冻干燥得到高纯度灵芝多糖。
优选地，步骤(b)中加入Sevag试剂，氯仿与正丁醇(V：V)＝4：1，样液与试剂(V：V)＝4：1，振荡时间10min。
优选地，步骤(d)中采用非对称场流分离技术联用紫外可见光检测器和示差折光检测器(AF4-UV-dRI)，进行分离监测时所用载液为超纯水。
本发明是基于非对称场流分离技术分离原理再结合超滤膜而形成的一种分离纯化灵芝多糖的方法。该方法对于提取的灵芝粗多糖首先采用Sevag法进行4次除蛋白质，除去和多糖样品水合直径相似的蛋白质组分。其次，通过AF4池道，采用超纯水作为载液，10kDa可再生纤维素(RC)膜，0.2mL/min的超滤流速进行一段时间(Tu)的超滤，且30min≤Tu≤45min，用以除去盐和部分水合直径小的蛋白质组分，进而提高多糖组分的分离度。最后，采用超纯水作为载液，10kDa可再生纤维素(RC)膜，初始交叉流流速(Vc)指数衰减降低至0.05mL/min，且2.6mL/min≤Vc≤3.0mL/min，半衰期为0.8min，使水合直径较小的蛋白质与多糖分离。
本发明利用AF4分离原理，采用超纯水作为载液，在超滤除去小分子杂质，多糖组分与水合直径较小的蛋白质分离后，收集AF4多糖片段，经浓缩、冷冻干燥得到高纯度的灵芝多糖。本发明在分离纯化灵芝多糖过程中减少了除蛋白质次数，并且整个过程中载液为超纯水，无需透析除盐步骤，在保护灵芝多糖活性的基础上提高了分离纯化效率，并得到了高纯度的灵芝多糖。
附图说明
图1是采用对比例1～5的方法对灵芝多糖进行分离纯化的AF4-UV图谱。
图2是采用对比例1～5的方法对灵芝多糖进行分离纯化的AF4-dRI图谱。
图3是采用对比例6～10的方法对灵芝多糖进行分离纯化的AF4-UV图谱。
图4是采用对比例6～10的方法对灵芝多糖进行分离纯化的AF4-dRI图谱。
图5是采用实施例1～2、对比例11～13的方法对灵芝多糖进行分离纯化的AF4-UV图谱。
图6是采用实施例1～2、对比例11～13的方法对灵芝多糖进行分离纯化的AF4-dRI图谱。
图7是采用实施例1、对比例14的方法对灵芝多糖进行分离纯化的AF4-UV图谱。
图8是采用实施例1、对比例14的方法对灵芝多糖进行分离纯化的AF4-dRI图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，下述实施例仅作为说明，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
在下述实施例中未详细描述的过程和方法是本领域公知的常规方法，实施例中所用试剂均为分析纯，且均可市购或通过本领域普通技术人员熟知的方法制备。下述实施例均实现了本发明的目的。
在下述实施例中，采用以下方法制备灵芝多糖：称取10g脱脂灵芝子实体粉末置于500mL烧杯中，加入250mL超纯水；将其置于70℃水浴中，超声功率200W提取34min。提取结束后，自然冷却至室温，使用真空泵抽滤去除灵芝残渣，将抽滤液旋蒸浓缩。
采用Sevag法除灵芝粗多糖中蛋白质。按照粗多糖溶液与Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)4：1的比例加入200mL锥形瓶中，充分振荡10min。振荡结束后迅速转移至分液漏斗，静置10min分层后弃去下层沉淀，上层清液旋蒸浓缩至10％得到灵芝粗多糖水溶液备用。
采用非对称场流分离技术联用紫外可见光检测器和示差折光检测器(AF4-UV-dRI)，所用载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，在0.2mL/min的超滤流速下进行一段时间(Tu)的超滤，且30min≤Tu≤45min；超滤后进行非对称场流分离，垫片厚度为350μm，进样体积为100μL，采用指数衰减交叉流流速洗脱，初始交叉流流速(Vc)降低至0.05mL/min，且2.6mL/min≤Vc≤3.0mL/min，半衰期为0.8min，紫外检测器波长λ＝280nm。根据紫外可见光检测器和示差折光检测器分离图谱，将非对称场流分离***分离灵芝多糖片段收集，收集液体积旋蒸浓缩至1％转移至EP管中，-20℃过夜，取出后经冷冻干燥得到纯化的灵芝多糖。
对比例1
对灵芝粗多糖溶液进行检测分析，除蛋白质步骤进行0次，载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min，超滤时间为0min。AF4分离条件为：进样体积为50μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速1.4mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
对比例2
采用Sevag法对灵芝粗多糖进行除蛋白质，按照粗多糖溶液与Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)4：1的比例加入200mL锥形瓶中，充分振荡10min。振荡结束后迅速转移至分液漏斗，静置10min分层后弃去下层沉淀，上层清液体积旋蒸浓缩至10％，除蛋白质步骤进行1次。载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min，超滤时间为0min。AF4分离条件为：进样体积为50μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速1.4mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
对比例3
采用Sevag法对灵芝粗多糖进行除蛋白质，按照粗多糖溶液与Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)4：1的比例加入200mL锥形瓶中，充分振荡10min。振荡结束后迅速转移至分液漏斗，静置10min分层后弃去下层沉淀，上层清液体积旋蒸浓缩至10％，除蛋白质步骤进行2次。载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min，超滤时间为0min。AF4分离条件为：进样体积为50μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速1.4mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
对比例4
采用Sevag法对灵芝粗多糖进行除蛋白质，按照粗多糖溶液与Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)4：1的比例加入200mL锥形瓶中，充分振荡10min。振荡结束后迅速转移至分液漏斗，静置10min分层后弃去下层沉淀，上层清液体积旋蒸浓缩至10％，除蛋白质步骤进行3次。载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min，超滤时间为0min。AF4分离条件为：进样体积为50μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速1.4mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
对比例5
采用Sevag法对灵芝粗多糖进行除蛋白质，按照粗多糖溶液与Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)4：1的比例加入200mL锥形瓶中，充分振荡10min。振荡结束后迅速转移至分液漏斗，静置10min分层后弃去下层沉淀，上层清液体积旋蒸浓缩至10％，除蛋白质步骤进行4次。载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min，超滤时间为0min。AF4分离条件为：进样体积为50μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速1.4mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
对比例1～5所得检测结果如图1和图2所示。由于多糖没有紫外吸收，紫外信号对应的主要是蛋白质。由图1可见随着除蛋白质次数的增加，样品洗脱峰信号强度降低，说明样品中的蛋白质已逐渐减少，当灵芝多糖除4次蛋白质后，紫外信号(2～5min)基本降低至0。图2中示差检测器2～5min仍有信号，说明通过4次除蛋白质可以除去水合直径较大的蛋白质。水合直径较小的蛋白质(1～2min)可以在后续的超滤和AF4分离过程与多糖组分分开。
对比例6
按照对比例5的方法对灵芝粗多糖溶液进行除蛋白质，载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min，超滤时间为0min。AF4分离条件为：进样体积为100μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速1.4mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
对比例7
按照对比例5的方法对灵芝粗多糖溶液进行除蛋白质，载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min，超滤时间为15min。AF4分离条件为：进样体积为100μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速1.4mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
对比例8
按照对比例5的方法对灵芝粗多糖溶液进行除蛋白质，载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min，超滤时间为30min。AF4分离条件为：进样体积为100μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速1.4mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
对比例9
按照对比例5的方法对灵芝粗多糖溶液进行除蛋白质，载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min，超滤时间为45min。AF4分离条件为：进样体积为100μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速1.4mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
对比例10
按照对比例5的方法对灵芝粗多糖溶液进行除蛋白质，载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min，超滤时间为60min。AF4分离条件为：进样体积为100μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速1.4mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
对比例6～10所得检测结果如图3和图4所示。为了增加纯化样品量，进一步提高纯化效率，进样体积由50μL增加至100μL。由图3和图4可知，随着超滤时间增加，样品洗脱峰信号强度降低，说明灵芝粗多糖溶液中部分小分子杂质通过超滤膜，当超滤时间为30min，紫外信号显著降低，当超滤时间为60min时，紫外信号降低不明显。
对比例11
按照对比例9的方法对灵芝粗多糖溶液进行除蛋白质和超滤，超滤时间为45min，AF4分离条件为：进样体积为100μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速1.8mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
对比例12
按照对比例9的方法对灵芝粗多糖溶液进行除蛋白质和超滤，超滤时间为45min，AF4分离条件为：进样体积为100μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速2.2mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
对比例13
按照对比例9的方法对灵芝粗多糖溶液进行除蛋白质和超滤，超滤时间为45min，AF4分离条件为：进样体积为100μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速3.2mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
实施例1
按照对比例9的方法对灵芝粗多糖溶液进行除蛋白质和超滤，超滤时间为45min，AF4分离条件为：进样体积为100μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速2.6mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
实施例2
按照对比例9的方法对灵芝粗多糖溶液进行除蛋白质和超滤，超滤时间为45min，AF4分离条件为：进样体积为100μL，检测器流速为1.0mL/min，初始交叉流流速3.0mL/min指数衰减至0.05mL/min，半衰期为0.8min。
实施例1～2和对比例11～13所得检测结果如图5和6所示。由图5可见，在除蛋白质4次，载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min，超滤时间45min后，随交叉流流速增大，多糖成分分离度逐渐变好，在指数衰减初始交叉流流速为2.6～3.0mL/min时，灵芝多糖可以达到良好的分离效果。当初始交叉流流速3.2mL/min，图6中4～6min处有微弱示差信号，说明有少量的多糖聚集体生成。
对比例14
按照实施例1的方法对灵芝粗多糖溶液进行除蛋白质、超滤和分离，超滤膜为10kDa聚醚砜(PES)膜。
实施例1和对比例14所得检测结果如图7和图8所示。由图7和图8可见，聚醚砜(PES)膜样品洗脱峰信号显著降低，分离度差。这是由于多糖样品与聚醚砜(PES)超滤膜表面发生交联，导致样品洗脱峰信号强度减小。收集实施例1目标片段，采用苯酚硫酸法测定收集的AF4片段的多糖含量为108.37％，RSD＝0.45％。
Claims (4)
1.一种基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法，其特征是，包括如下步骤：
a、称取脱脂灵芝子实体粉，加入超纯水混匀，超声辅助热水法提取，抽滤去除灵芝残渣；
b、将步骤a所得抽滤液旋蒸浓缩，加Sevag试剂，振荡，除蛋白质4次，静置后去除沉淀；
c、将步骤b上清液旋蒸浓缩，待用；
d、通过非对称场流分离***对步骤c所得浓缩液进行超滤，载液为超纯水，超滤膜为可再生纤维素膜；
e、将步骤d中的样品进行非对称场流分离，载液为超纯水，采用指数衰减交叉流流速洗脱；
f、将步骤e中非对称场流分离的多糖片段进行收集，旋蒸浓缩、冷冻干燥得到纯化后的灵芝多糖；
步骤d中，超滤时间为30 ~ 45 min，超滤流速为 0.2 mL/min；
步骤e中，进样体积为100 μL，初始交叉流流速为2.6 ~ 3.0 mL/min，初始交叉流流速指数衰减降低至0.05 mL/min，半衰期为0.8 min。
2.根据权利要求1所述的基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法，其特征是，步骤f中，旋蒸浓缩至1%。
3.根据权利要求1所述的基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法，其特征是，步骤b中加入Sevag试剂，氯仿与正丁醇体积比为4：1，样液与试剂体积比为4：1，振荡时间10min。
4.根据权利要求1所述的基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法，其特征是，步骤d中采用非对称场流分离技术联用紫外可见光检测器和示差折光检测器。
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