JP7507897B2 - 生産効率を向上させる線毛無し大腸菌の構築及び使用 - Google Patents
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Description
本発明は、大腸菌から大腸菌ゲノムにおける線毛遺伝子群の64個の遺伝子をノックアウトして突然変異菌WQM026を得る。WQM026菌株は、栄養不足(M9)培地での増殖が速くなり、菌体の総量が増加した。続いて、PHB及びL-スレオニンの合成に関連する遺伝子をそれぞれコンパクト化菌株WQM026に形質転換し、得られた組み換え菌WQM026/pBHR68及びWQM026/pFW01-thrA*BC-rhtCは、それぞれ、PHB及びスレオニンを効率的に合成できる。合成されたPHBは、細胞の乾燥重量の87.87%を占め、野生型の対照菌MG1655/pBHR68の3.44倍である。L-スレオニンの収量は、2.49g/Lであり、MG1655/pFW01-thrA*BC-rhtCの3.66倍である。
CRISPR/Cas9ノックアウトシステムを用いて大腸菌の遺伝子を跡形もなくノックアウトする。まず、大腸菌(Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655)においてpCasを電気的に形質転換し、L-アラビノースで誘導して組換え酵素Gam、Bet、Exoを発現させた。その後、ホモロジーアームフラグメント、及び、特定のN20配列含有pTargetFプラスミドをMG1655/Cas9コンピテント細胞において同時に電気的に形質転換した。カナマイシン及びスペクチノマイシンに対する二重耐性のプレートに塗布し、30℃で18時間培養した後、コロニーPCRにより突然変異した菌株をスクリーニングした。
発酵液を4℃、4000rpm/minで20分間遠心分離し、上清を捨てた後、菌体を凍結し、凍結乾燥させた。凍結乾燥させた菌体を一定量で秤量し、従来から報告された通常のメチルエステル化方法でメチルエステル化を行い、最終的に、通常のガスクロマトグラフィーによる定量を行った。
細胞の形態を観察するために、大腸菌の細胞を固形のLBプレート上で12時間成長させ、透過型電子顕微鏡(TEM)で画像化した。細胞内のPHA粒子を観察するために、PHAを24時間発酵生産した後に、1%クリスタルバイオレットで菌体懸濁液を調製し、油浸レンズ(倍率=100×)を用いて明視野顕微鏡で観察した。同時に、大腸菌の細胞を4000rpm/minで5分間遠心分離し、リン酸塩緩衝液(PBSバッファ)で2回洗浄した後、2.5%グルタルアルデヒド溶液で少なくとも72時間固定した。G2 spirit透過電子顕微鏡により、電圧100kVでGatan US4000 4kx4k CCDを用いて画像を取得した。
pBHR68を持っている大腸菌細胞を5mL遠心分離して集め、PBS緩衝液(pH7.4)で2回洗浄した。遠心分離して集めた後に、あらかじめ正確に秤量した遠心チューブに細胞を移し、水分を蒸発させるとともに菌体を噴出させないように、この遠心チューブをクリングフィルムで包み、クリングフィルムに複数の小さな穴を開けた。完全に乾燥するまで真空凍結乾燥機で48時間、凍結乾燥させた。チューブの底を触って常温であれば、完全乾燥したことが示され、又は、チューブの底を指でそっと弾いた際に菌体が分離し且つチューブの壁から容易に脱離できれば、完全乾燥と判断した。重量を測定し、乾燥重量を計算する。
大腸菌細胞を、M9培地の中で、対数関数的成長の早期又は対数関数的成長の中期(OD600=0.8-1.0)まで培養し、ATP及びアセチルコエンザイムAのアッセイキットを用いて細胞内のATP及びアセチルコエンザイムAの量を収集した。ATPアッセイキットの説明書に従って、細胞内のATPを抽出・定量し、Agilent 1260シリーズHPLCシステムで、ATP分析を行い、分析カラムは、250mmx4.0mm ODS-2HYPERSIL C18カラムである。
大腸菌MG1655及びWQM026をM9培地の中で指数関数的成長の中期まで培養し、12000rpmで3分間採取し、PBSバッファで2回洗浄した後、液体窒素で急速冷凍させた。RNAライブラリの抽出、構築及び配列決定は、GENEWIZ Biotechnology社により行った。MG1655ゲノムを参照配列として、配列の読み取り、比較及び解析を行った。遺伝子発現の差異は、FIESTA Viewer v.1.0 ソフトウェアにより、それらの発現量及びP値≦0.05に基づいて算出した。
Thermo 250mm×4.0mm ODS-2HYPERSIL C18 カラムを備えたAgilent 1200シリーズ又は1260シリーズ HPLC システムを用いて、L-スレオニンの濃度を測定した。L-スレオニンの濃度は、o-フタルアルデヒドによるプレカラム誘導体化法(Koros、 A.、 Varga、 Z.、 Molnar-Perl、 I. 2008. Simultaneous analysis of amino acids and amines as their o-phthalaldehyde-ethanethiol-9-fluorenylmethyl chloroformate derivatives in cheese by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr A、 1203(2)、 146-52.)で測定された。
LB培地(g/L):酵母粉末 5、ペプトン 10及びNaCl 10。
M9培地(g/L):グルコース 4、Na2HPO4・12H2O 17.1、KH2PO4 4、NH4Cl 3、NaCl 0.5、MgSO4 0.24及びCaCl2 0.011。
LBG培地(g/L):グルコース 20 、酵母粉末5、ペプトン 10及びNaCl 10。
M9G培地(g/L):グルコース 20、Na2HPO4・12H2O 17.1、KH2PO4 4、NH4Cl 3、NaCl 0.5、MgSO4 0.24及びCaCl2 0.011。
PHB発酵培地(g/L):グルコース 20、Na2HPO4・12H2O 17.1、KH2PO4 4、NH4Cl 3、NaCl 0.5、MgSO4 0.24及びCaCl2 0.011。
L-スレオニン発酵培地(g/L):酵母粉末 2、クエン酸 2、(NH4)2SO4 25、KH2PO4 7.46、グルコース 30、MgSO4・7H2O 2、FeSO4・7H2O 0.005、MnSO4・4H2O 0.005及びCaCO3 20。
線毛欠乏エンジニアリング菌の具体的な構築過程は、以下の通りである。
(1)MG1655/pCas コンピテント細胞の細胞調製
Red組換えヘルパープラスミドpCas9(Jiang、 Y.、 Chen、 B.、 Duan、 C.、 Sun、 B.、 Yang、 J.、 Yang、 S. 2015. Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system. Appl Environ Microbiol、 81(7)、 2506-14.)を持っている大腸菌MG1655を接種し、100μg/mLカナマイシンを含むLB液体培地の中で、30℃、200rpmで一晩培養した。この培養液を2%接種量でLB液体培地100mLに接種し、30℃、200rpmでOD600=0.2まで培養した時に、L-アラビノース(最終濃度30mmol/L)を加えてリコンビナーゼの発現を誘導した。続いて、D600=0.5まで培養し、培養液を氷浴で30分間放置下後、予め冷やしておいた50mL遠心管に入れ、4℃、8000rpmで10分間遠心分離し、菌体を収集した。沈殿を予め冷やしておいた10%グリセロールで3回洗浄し、最後に10%グリセロール1mLに懸濁させた。各チューブ80μLを予め冷やしておいた無菌EPチューブに分注し、保存しておく。
pTargetFシリーズのプラスミドの構築用プライマーを表2に示す。プラスミドpTargetF01は、pTargetFをテンプレートとし、プライマーF-sgRNA-yagV-ZとR-sgRNAを用い、シーケンシングプライマーT-yagV-Z-FとT-sgRNA-Rを用いてプラスミドの正しさを確認した。他のプラスミドpTargetF02、pTargetF03、pTargetF04、pTargetF05、pTargetF06、pTargetF07、pTargetF08、pTargetF09、pTargetF10、pTargetF11、pTargetF12、pTargetF27、pTargetF28、pTargetF29及びpTargetF30は、同じ方法(Jiang、 Y.、 Chen、 B.、 Duan、 C.、 Sun、 B.、 Yang、 J.、 Yang、 S. 2015. Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system. Appl Environ Microbiol、 81(7)、 2506-14.)で構築され、対応するプライマーを使用した。
大腸菌MG1655ゲノムには、ともに12個の線毛合成・組立遺伝子群yagVWXYZ、gltFyhcADEF、fimAICDFGH、sfmACDHF、ycbQRSTUVF、ydeQRST、yraHIJK、yadCKLMhtrEecpDyadN、yehABCD、ybgOPQD及びyfcOPQRSTUVが存在している。この12個の線毛合成・組立遺伝子群は、64個の遺伝子に細分化され、それぞれ、yagV、yagW、yagX、yagY、yagZ、gltF、yhcA、yhcD、yhcE、yhcF、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、fimH、sfmA、sfmC、sfmD、sfmH、sfmF、ycbQ、ycbR、ycbS、ycbT、ycbU、ycbV、ycbF、ydeQ、ydeR、ydeS、ydeT、yraH、yraI、yraJ、yraK、yadC、yadK、yadL、yadM、htrE、yadV、yadN、yehA、yehB、yehC、yehD、ybgO、ybgP、ybgQ、ybgD、yfcO、yfcP、yfcQ、yfcR、yfcS、yfcT、yfcU、yfcV、ygiL、yqiG、yqiH、yqiIであり、それらの配列のNCBIアクセッション番号は、順に946631、947349、947606、948806、948759、947746、947741、947738、4056032、947735、948838、948841、948843、948844、948845、948846、948847、945522、945367、945160、945407、944977、948306、946773、946934、947185、945561、945562、945559、946050、946049、946047、946042、947658、947657、947656、947654、944837、944835、944829、944828、944819、944859、944841、946642、946617、946621、946619、947550、945110、946537、945325、946620、946788、946779、946818、946418、1450268、1450268、949109、947522、947529、947531、947535である。
大腸菌には、線毛を合成し、組み立てるための12個の遺伝子群を含む(図1)。線毛は、細菌の病原性を高めるだけでなく、その合成や組み立ての際に大量のエネルギーと炭素源を消費する。したがって、理論的には、これらの線毛を除去することで、大腸菌のバイオセーフティと生産性を向上させることができると考えられる。
実施例2の結果から、1組の線毛合成・組立遺伝子群の除去によって、いずれも大腸菌の細胞の増殖及びPHAの生合成が促進されたので、大腸菌のMG1655染色体における12個の線毛合成・組立遺伝子群をすべて除去して、線毛欠失菌株WQM026を構築した(構築方法については実施例1を参照)。菌液OD値を2時間ごとに測定し、図5Aに示すように、菌株の増殖曲線をプロットした。WQM026は、LB培地の中での増殖がMG1655よりわずかに良くなり、M9の培地の中での増殖がMG1655よりはるかによくなり、18時間まで培養すると、WQM026のOD値が約MG1655の3倍であった。このことから、大腸菌における12個の線毛遺伝子群のすべてを除去することは、特に栄養の乏しい環境下で、細胞増殖に有利であることが判明した。MG1655細胞とWQM026細胞を電子顕微鏡で観察したところ、MG1655の細胞表面において線毛が大量で覆われていたが(図5B)、WQM026の表面は滑らかであり、線毛の痕跡が見られなかった(図5C)。
WQM026は、対照MG1655と比べて、増殖が良く、ATP及びアセチルコエンザイムAの蓄積量が高いという利点がある。したがって、発酵産業への使用は、検討する価値がある。
大腸菌はL-スレオニン生産のために開発されたものであるため、WQM026でL-スレオニンを効率的に生産する可能性がさらに検討された。L-スレオニン生合成及び輸送に関するキー遺伝子を含むプラスミドpFW01-thrA*BC-rhtCをそれぞれMG1655及びWQM026において形質転換し、MG1655/pFW01 thrA*BC-rhtC及びWQM026/pFW01 thrA*BC-rhtCを得た。
Claims (10)
- 大腸菌ゲノムにおける線毛遺伝子群をノックアウトすることを含む、大腸菌の増殖を促進し且つその発酵生成物の収量を増加する方法であって、前記線毛遺伝子群は、
yagV-Z、gltF-yhcF、fimA-H、sfmA-F、ycbQ-F、ydeQ-T、yraH-K、yadC-N、yehA-D、ybgO-D、yfcO-V及びygiL-Iであるか、又は
yagV-Z、gltF-yhcF、sfmA-F、ycbQ-F、ydeQ-T、yraH-K、yadC-N、yehA-D、ybgO-D、yfcO-V若しくはygiL-Iのいずれか1組の線毛遺伝子群であり、
前記線毛遺伝子群をノックアウトされていない大腸菌と比べ、前記線毛遺伝子群をノックアウトされた大腸菌は、アミノ酸欠乏の環境下での増殖が促進され、発酵生成物の収量が増加する、ことを特徴とする、方法。 - 前記線毛遺伝子群は、64個の遺伝子を含み、前記64個の遺伝子は、順に、yagV、yagW、yagX、yagY、yagZ、gltF、yhcA、yhcD、yhcE、yhcF、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG、fimH、sfmA、sfmC、sfmD、sfmH、sfmF、ycbQ、ycbR、ycbS、ycbT、ycbU、ycbV、ycbF、ydeQ、ydeR、ydeS、ydeT、yraH、yraI、yraJ、yraK、yadC、yadK、yadL、yadM、htrE、yadV、yadN、yehA、yehB、yehC、yehD、ybgO、ybgP、ybgQ、ybgD、yfcO、yfcP、yfcQ、yfcR、yfcS、yfcT、yfcU、yfcV、ygiL、yqiG、yqiH、yqiIであり、それらの配列に対するNCBIアクセッション番号は、順に946631、947349、947606、948806、948759、947746、947741、947738、4056032、947735、948838、948841、948843、948844、948845、948846、948847、945522、945367、945160、945407、944977、948306、946773、946934、947185、945561、945562、945559、946050、946049、946047、946042、947658、947657、947656、947654、944837、944835、944829、944828、944819、944859、944841、946642、946617、946621、946619、947550、945110、946537、945325、946620、946788、946779、946818、946418、1450268、1450268、949109、947522、947529、947531、947535であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記大腸菌は、大腸菌MG1655であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 請求項1から3のいずれか一項に記載の方法により構築される、組み換え大腸菌。
- プラスミドpBHR68又はプラスミドpFW01-thrA*BC-rhtCをさらに含むことを特徴とする、請求項4に記載の組み換え大腸菌。
- 請求項4又は5に記載の組み換え大腸菌の、アミノ酸欠乏の環境下での代謝物合成における使用。
- 請求項5に記載の組み換え大腸菌を用いてアミノ酸欠乏の環境下で発酵させることを特徴とする、PHBの発酵生産方法。
- 前記アミノ酸欠乏の環境は、菌株によりPHBを生産するための発酵培地であり、前記発酵培地の組成は、グルコース 15~20g/L、Na2HPO4・12H2O 15-20g/L、KH2PO4 1-8g/L、NH4Cl 1-8g/L、NaCl 0.2-0.8g/L、MgSO4 0.1-0.5g/L及びCaCl2 0.01-0.05g/Lを含むことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 請求項5に記載の組み換え大腸菌を用いてアミノ酸欠乏の環境下で発酵させることを特徴とする、L-トレオニンを発酵生産する方法。
- 請求項1から3のいずれか一項に記載の方法又は請求項4若しくは5に記載の組み換え大腸菌の、発酵における使用。
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