CN111235169A - 一种GTP环化水解酶I基因folE及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物基因工程领域，公开了一种GTP环化水解酶I基因folE及应用，所述GTP环化水解酶I基因folE的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的基因来自于食源性植物乳杆菌，具有安全性，可用于后期食品发酵领域。本发明基因敲除菌株筛选的方法提高了敲除菌株的筛选效率。本发明证明了基因folE基因在叶酸合成中的关键作用，为叶酸合成功能性食品的研发提供一定理论基础。本发明分析了基因来源于食品级微生物，具有安全性；本发明分析了基因folE基因除了在叶酸合成中发挥重要作用外，与细胞形态及菌株生长无关。

Description

一种GTP环化水解酶I基因folE及应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，尤其涉及一种GTP环化水解酶I基因folE及应用。尤其涉及GTP环化水解酶I基因folE在提高植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)叶酸生物合成中的应用。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：叶酸，化学名为蝶酰谷氨酸(pteroylglutamicacid)，是一种由蝶呤、对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid,pABA)和一个或多个谷氨酸结合而成的水溶性B族维生素，即维生素B9。叶酸在碱性或者中性溶液中较为稳定，在酸性条件下极不稳定，在光照条件下，尤其是紫外线的照射下易被破坏。

叶酸具有重要生理功能。据报道，叶酸参与DNA和RNA生物合成、DNA修复、氨基酸代谢及血红蛋白合成等生理代谢过程。此外，叶酸因可以提供大量游离碳离子，是形成神经末梢和构成传递神经冲动的重要化学原料物质，进而保障神经***的正常发育，因此在怀孕、婴儿发育过程中尤为重要。

人体无法自身合成叶酸，又因为叶酸有着重要的生理功能，一旦缺乏，会引起不同的疾病，只能通过补充叶酸制剂或者从食物中摄入来满足自身需求。由于大部分的叶酸制剂属于合成叶酸，而化学合成的叶酸与生物合成的天然叶酸相比，在许多方面存在差异之处。大量摄食化学合成叶酸会给人的健康带来许多副作用，如掩盖由维生素B12缺乏所引起的早期贫血临床表现、改变肝脏中二氢叶酸还原酶的活性、促进癌症发生、引发认知功能障碍等，由此提高天然叶酸产量变得尤为重要。然而叶酸自身的不稳定性，加上在烹制过程中叶酸受热损失率高达50％以上，利用微生物合成叶酸，进而研发富含叶酸的功能性食品不失为一种能有效解决上述问题的好方法。

利用食品级微生物(例如乳酸菌)合成叶酸，具有经济效益较高、环境污染少、安全性高等特点。微生物与植物的叶酸生物合成途径相似，包括蝶呤代谢支路及对氨基苯甲酸代谢支路。folE基因编码GTP环化水解酶I(GCHI)，此酶催化蝶呤代谢支路反应的第一步，故在控制整个叶酸生物合成途径中起决定性作用。为了提高天然叶酸产量进而满足人类需求，研究上述通路中叶酸生物合成关键基因或通过基因工程改变植物和微生物中叶酸的代谢受到相当重视。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)目前对微生物叶酸生物合成途径调控机理的研究，仅对对氨基苯甲酸代谢这一支路有较为深入的研究，而另一条蝶呤代谢支路的研究较少，且此通路上相关基因的作用，它对于叶酸生物合成的调控乃至对整个菌株的代谢的影响仍缺乏***的研究。

(2)乳酸菌利用微生物培养基合成叶酸的能力十分不同。多项研究已经证明乳酸菌中某些植物乳杆菌可以合成天然叶酸，不像其他维生素可以用微生物发酵法进行工业生产，目前几乎所有的人工添加叶酸均是以化学法合成。

解决上述技术问题的难度和意义：目前大量研究仅局限于通过过表达叶酸生物合成关键基因的方式来提高叶酸产量，而利用基因敲除技术针对基因本身的功能研究屈指可数。通过对植物叶酸合成基因和酶的充分了解，使叶酸代谢改造成为可能应用最为广泛的就是I型三磷酸鸟苷环化水解酶(GTPCHI)基因folE。因此，folE基因在整个叶酸的合成过程中是高叶酸调控的关键基因，但是其在植物乳杆菌中叶酸合成途径中所起的功能有待确定。并不是所有的物种都含有folE基因。不过有些实验表明了植物乳杆菌研发富含叶酸功能性食品的可能性。本研究通过同源重组的基因敲除技术对植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)YM4-3菌株的folE基因进行敲除，从而研究它对Lactobacillus plantarum叶酸生物合成及生长的作用。中国是合成叶酸工业生产的主要国家之一，所以寻找一种既对环境友好且经济节约的叶酸合成方法变得尤为重要。与化学合成的药品相比，选择食品中存在的或由微生物代谢产生的天然叶酸则更为安全。

本发明深入分析蝶呤代谢支路的叶酸合成基因，更能***性的阐述微生物叶酸合成途径调控机理，完成微生物及其代谢物在工业上的开发利用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种GTP环化水解酶I基因folE及应用。即GTP环化水解酶I基因folE在提高微生物菌株叶酸生物合成中的应用，或在提高微生物菌株生物量中的应用。

本发明是这样实现的，一种GTP环化水解酶I基因folE，所述GTP环化水解酶I基因folE的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述GTP环化水解酶I基因folE编码的蛋白。该蛋白在这篇文献Crystal structure of the stimulatory complex of GTPcyclohydrolase I and its feedback regulatory protein GFRP中有介绍。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述GTP环化水解酶I基因folE构建的敲除载体pFED760-folE，将敲除载体pFED760-folE导入植物乳杆菌感受态进而通过同源重组构建folE基因敲除菌株ΔfolE；通过比较野生型菌株与ΔfolE菌株的生理生化差异，分析folE基因与细胞形态及菌株生长状态无关，但在叶酸合成中起关键作用。

本发明的另一目的在于提供一种所述敲除载体pFED760-folE的构建方法，所述敲除载体pFED760-folE的构建方法包括：

以食源性植物乳杆菌基因组为模板，利用引物对up-EF+up-ER；down-EF+down-ER分别扩增上下游同源臂，PCR产物用作模板，利用引物对up-EF+down-ER扩增得到同源臂敲除片段，该片段纯化后，与温度敏感型质粒pFED760分别用限制性内切酶HindIII和Spe I同步酶切，酶切产物经切胶回收后，进行连接实验，连接产物导入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒得到folE基因敲除载体pFED760-folE。

进一步，引物序列如下：

up-EF：5’-CCCAAGCTTGAACGGCGTAATGGTCAAC-3’；

up-ER：5’-TTGAATTGACCACTGTAATTAATTATCAAATGGTGCGG-3’；

down-EF：5’-CCGCACCATTTGATAATTAATTACAGTGGTCAATTCAA-3’；

down-ER：5’-GCACTAGTACACGGTCAACCGGCCTGG-3’。

进一步，GTP环化水解酶I基因folE及上下游同源臂序列如SEQ ID NO:2所示，来源于食源性植物乳杆菌。

本发明的另一目的在于提供一种所述敲除载体pFED760-folE的筛选方法，所述敲除载体pFED760-folE的筛选方法包括以下步骤：

(1)敲除载体pFED760-folE转化：在90～100μL植物乳杆菌感受态中加入10μL敲除载体pFED760-folE，轻轻混匀，冰浴5min后转入预冷电击杯中，按照12.5kv/cm，200Ω的参数进行电击；电击完成后迅速向电转杯中加入900μL新鲜MRS培养液，用枪头轻轻吹打混匀后，将混合液转移至1.5mL无菌离心管中，28℃静止培养2.5～3h使细胞复苏；培养后菌液8000～10000rpm离心3min，弃900μL上清液，用剩余上清液重悬菌体，涂布于含有5μg/mL红霉素MRS固体平板上，28℃静置培养；

(2)folE基因敲除菌株筛选：步骤(1)中长出的单菌落转接于含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，28℃静置培养直至菌液OD₆₀₀为0.2～0.3时，将菌液转移至37℃继续静置培养过夜，该培养菌液稀释10³～10⁵倍后涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS固体平板上，37℃静置培养24h，挑取单克隆，接种至1mL含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中37℃静置培养过夜，该培养菌液按1％接种至不含抗生素的MRS液体培养基中，28℃静置培养过夜，然后菌液稀释10³～10⁵倍后涂布于无抗生素的MRS固体平板，37℃静置培养至长出单克隆，挑取较小单菌落一一对应划线于含有5μg/mL红霉素和不含抗生素的MRS固体平板，37℃静置培养24h，挑取在含抗生素的MRS琼脂平板上无法生长，而在不含抗生素的平板上可以生长的菌落进行菌液PCR验证；

所述菌液PCR验证中，前引物folE-FF：5’-CAGACGCAAATGACGCAGT-3’位于上游同源臂上游基因组上，后引物folE-RR：5’-CGGATAACGCTCGTTCTGGAT-3’位于下游同源臂下游基因组上；野生型菌株PCR片段比敲除菌株大335bp；

(3)利用构建成功的敲除菌株分析食源性植物乳杆菌的folE基因与植物乳杆菌细胞形态和菌株生长状态无关，在植物乳杆菌的叶酸合成中起关键作用。

本发明的另一目的在于提供一种所述GTP环化水解酶I基因folE来自食源性植物乳杆菌，在食品发酵上的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述GTP环化水解酶I基因folE在叶酸合成功能性食品的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述GTP环化水解酶I基因folE在提高微生物菌株生物量中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明的特点之一在于研究基因来自于食源性植物乳杆菌，具有安全性，可用于后期食品发酵领域。

本发明的特点之二在于基因敲除菌株筛选的方法提高了敲除菌株的筛选效率。

本发明特点之三在于，证明了本发明分析基因folE基因在叶酸合成中的关键作用，为叶酸合成功能性食品的研发提供一定理论基础。

与现有技术相比本发明具有以下优势：分析了基因来源于食品级微生物，具有安全性；本发明分析了基因folE基因除了在叶酸合成中发挥重要作用外，与细胞形态及菌株生长无关。而folKE基因与细胞形态相关，进一步证明folE与folK基因单独编码蛋白。

附图说明

图1是本发明实施例提供的folE基因敲除株的菌液PCR验证，其中泳道M：DNA marker；泳道1和4：植物乳杆菌野生型菌株基因组DNA为模板PCR产物；泳道2：敲除菌株ΔfolE基因组DNA为模板PCR产物；泳道3：水为模板PCR产物。

图2本发明实施例提供的植物乳杆菌野生型菌株和敲除菌株ΔfolE以及敲除菌株ΔfolKE的扫描及透射电镜图；A：野生型菌株扫描电镜图；B：敲除菌株ΔfolE扫描电镜图；C：敲除菌株ΔfolKE扫描电镜图；D：野生型菌株透射电镜图；E：敲除菌株ΔfolE透射电镜图；F：敲除菌株ΔfolKE透射电镜图。

图3本发明实施例提供的植物乳杆菌野生型菌株(A)和敲除菌株ΔfolE(B)的菌液生长状态。

图4本发明实施例提供的植物乳杆菌野生型菌株和敲除菌株ΔfolE的生长曲线,OD₆₀₀和pH动态曲线。

图5本发明实施例提供的植物乳杆菌野生型菌株和敲除菌株ΔfolE发酵液总叶酸含量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。温度敏感型质粒pPED760由伊利诺伊大学MichaelJ Federle博士惠赠；下述实施例中的结果如无特别说明，均为三次重复的平均值。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种GTP环化水解酶I基因folE及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的GTP环化水解酶I基因folE的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明将folE基因与温度敏感型质粒pFED760重组构建了敲除载体pFED760-folE，将其导入植物乳杆菌感受态进而通过同源重组构建folE基因敲除菌株ΔfolE；通过比较野生型菌株与ΔfolE菌株的生理生化差异，证明folE基因与细胞形态及菌株生长状态无关，但在叶酸合成中起关键作用，另有folKE基因与细胞形态相关，证明folE与folK基因单独编码蛋白。本发明在叶酸生物合成的研究及应用领域具有很大潜力。

在本发明实施例中，GTP环化水解酶I基因folE敲除载体的构建方法，包括：

以食源性植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)基因组为模板，利用引物对(up-EF+up-ER；down-EF+down-ER)分别扩增上下游同源臂，PCR产物用作模板，利用引物对(up-EF+down-ER)扩增得到同源臂敲除片段，该片段纯化后，与温度敏感型质粒pFED760分别用限制性内切酶Hind III和Spe I同步酶切，酶切产物经切胶回收后，进行连接实验，连接产物导入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒得到folE基因敲除载体pFED760-folE。

其中引物序列如下：

up-EF：5’-CCCAAGCTTGAACGGCGTAATGGTCAAC-3’；SEQ ID NO:3.

up-ER：5’-TTGAATTGACCACTGTAATTAATTATCAAATGGTGCGG-3’；SEQ ID NO:4。

down-EF：5’-CCGCACCATTTGATAATTAATTACAGTGGTCAATTCAA-3’；SEQ ID NO:5。

down-ER：5’-GCACTAGTACACGGTCAACCGGCCTGG-3’；SEQ ID NO:6。

本发明中GTP环化水解酶I基因folE及其上下游同源臂序列如SEQ ID NO:2所示，来源于食源性植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；植物乳杆菌因其安全无害等特点，广泛应用于食品、药品等领域，故其基因也是对人体安全无害的，这将为该发明将来在叶酸生产领域的应用提供理论的安全保障。

在本发明实施例中，GTP环化水解酶I基因folE敲除菌株筛选方法，包括上述GTP环化水解酶I基因folE敲除载体构建及后期敲除载体转化和敲除菌株筛选；步骤如下：

(1)敲除载体pFED760-folE转化：在90～100μL植物乳杆菌感受态中加入10μL敲除载体pFED760-folE，轻轻混匀，冰浴5min后转入预冷电击杯中，按照12.5kv/cm，200Ω的参数进行电击；电击完成后迅速向电转杯中加入900μL新鲜MRS培养液，用枪头轻轻吹打混匀后，将混合液转移至1.5mL无菌离心管中，28℃静止培养2.5～3h使细胞复苏；培养后菌液8000～10000rpm离心3min，弃900μL上清液，用剩余上清液重悬菌体，涂布于含有5μg/mL红霉素MRS固体平板上，28℃静置培养。

(2)folE基因敲除菌株筛选：步骤(1)中长出的单菌落转接于含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，28℃静置培养直至菌液OD₆₀₀为0.2～0.3时，将菌液转移至37℃继续静置培养过夜，该培养菌液稀释10³～10⁵倍后涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS固体平板上，37℃静置培养24h，挑取单克隆，接种至1mL含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中37℃静置培养过夜，该培养菌液按1％接种至不含抗生素的MRS液体培养基中，28℃静置培养过夜，然后菌液稀释10³～10⁵倍后涂布于无抗生素的MRS固体平板，37℃静置培养至长出单克隆，挑取较小单菌落一一对应划线于含有5μg/mL红霉素和不含抗生素的MRS固体平板，37℃静置培养24h，挑取在含抗生素的MRS琼脂平板上无法生长，而在不含抗生素的平板上可以生长的菌落进行菌液PCR验证；

本发明中所述菌液PCR验证中，前引物(folE-FF：5’-CAGACGCAAATGACGCAGT-3’SEQ IDNO:7)位于上游同源臂上游基因组上，后引物(folE-RR：5’-CGGATAACGCTCGTTCTGGAT-3’SEQID NO:8)位于下游同源臂下游基因组上；野生型菌株PCR片段比敲除菌株大335bp。

(3)利用构建成功的敲除菌株证明了食源性植物乳杆菌的folE基因与植物乳杆菌细胞形态和菌株生长状态无关，但其在植物乳杆菌的叶酸合成中起关键作用。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1：GTP环化水解酶I基因folE敲除同源臂克隆

1、PCR扩增上下游同源臂

使用细菌基因组DNA提取试剂盒(百泰克生物技术有限公司，中国)提取食源性植物乳杆菌YM4-3基因组，具体操作按照试剂盒说明书进行。folE基因编码区上游970bp序列作为上游同源臂，下游1001bp序列作为下游同源臂长；以提取基因组为模板，利用引物对

up-EF(5’-CCCAAGCTTGAACGGCGTAATGGTCAAC-3’，下划线为Spe I酶切位点)+up-ER(5’-TTGAATTGACCACTGTAATTAATTATCAAATGGTGCGG-3’)和

down-EF(5’-CCGCACCATTTGATAATTAATTACAGTGGTCAATTCAA-3’)+down-ER(5’-GCACTAGTACACGGTCAACCGGCCTGG-3’，下划线为Hind III酶切位点)分别扩增上下游同源臂，PCR反应体系及扩增条件如下：

(1)PCR反应体系

(2)PCR扩增条件

95℃预变性3min；95℃变性15s；56℃退火30s；72℃延伸1min；循环30次；72℃延伸5min，12℃保存。反应完成后取5μL，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

2、基因敲除片段克隆与测序

以上下游同源臂PCR产物各1μL为模板，up-EF和down-ER为引物，按照上述PCR反应体系和扩增条件(延伸时间改为2min)进行重叠PCR。切胶回收预期大小PCR产物(即基因敲除片段)，按照大连宝生物公司(中国)TA克隆试剂盒说明书，将PCR产物连接至pMD19-T载体中。通过热激转化法将连接产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于Amp-LB平板上。37℃过夜培养后，随机选取10～15个单菌落，提取其细胞中质粒，并用Spe I和Hind III进行酶切验证，阳性质粒送测序公司测序。

实施例2：folE基因敲除载体构建

使用限制性内切酶Spe I和Hind III分别对测序正确的基因敲除片段和温度敏感型质粒pFED760进行同步酶切，酶切体系为：Spe I，1μL；Hind III，1μL；1×H buffer，2μL；基因敲除片段或pFED760，10～16μL；加灭菌去离子水到20μL，37℃酶切4h；回收酶切产物，按照目的基因:载体＝4:1～2:1(摩尔比)加样后，加入T4 DNA连接酶在16℃连接12～16h。利用热激转化法将连接产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，随后涂布于红霉素-LB固体平板上。28℃过夜培养后，提取10～15个单菌落细胞中质粒，并用Spe I和Hind III酶切验证以获得阳性质粒，命名为pFED760-folE。

实施例3：folE基因敲除菌株构建

1、folE基因敲除载体导入植物乳杆菌感受态细胞

参照费永涛(2015，华南理工大学硕士学位论文)报道方法制备植物乳杆菌感受态细胞。在90～100μL植物乳杆菌感受态中加入10μL基因敲除载体pFED760-folE，轻轻混匀，冰浴5min后转入预冷电击杯中，按照12.5kv/cm，200Ω的参数进行电击。电击完成后迅速向电转杯中加入900μL的新鲜MRS培养液，用枪头轻轻吹打混匀后，将混合液转移至1.5mL无菌离心管中，28℃静止培养2.5～3h使细胞复苏；培养后菌液8000～10000rpm离心3min，弃900μL上清液，用剩余上清液重悬菌体，涂布于含有5μg/mL红霉素MRS固体平板上，28℃静置培养。

2、folE基因敲除菌株的筛选和验证

随机选取2～3个单菌落，转接于含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，28℃静置培养直至菌液OD₆₀₀为0.2～0.3时，将菌液转移至37℃继续静置培养过夜，该培养菌液稀释10³～10⁵倍后涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS固体平板上，37℃静置培养24h，挑取单克隆，接种至1mL含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中37℃静置培养过夜，该培养菌液按1％接种至不含抗生素的MRS液体培养基中，28℃静置培养过夜，然后菌液稀释10³～10⁵倍后涂布于无抗生素的MRS固体平板，37℃静置培养至长出单克隆，挑取较小单菌落一一对应划线于含有5μg/mL红霉素和不含抗生素的MRS固体平板，37℃静置培养24h，挑取在含抗生素的MRS琼脂平板上无法生长，而在不含抗生素的平板上可以生长的菌落进行菌液PCR验证。菌液PCR验证：前引物(folE-FF：5’-CAGACGCAAATGACGCAGT-3’)位于上游同源臂上游基因组上，后引物(folE-RR：5’-CGGATAACGCTCGTTCTGGAT-3’)位于下游同源臂下游基因组上；野生型菌株PCR片段比敲除菌株大335bp。该筛选方法提高了敲除菌株的筛出效率，结果见图1。

实施例4：ΔfolE菌株细胞形态及生长状态检测

1、细胞形态观察

分别取1.5mL培养好的植物乳杆菌野生型菌株，基因敲除菌株ΔfolE和基因敲除菌株ΔfolKE，5000rpm离心5min，弃上清后，菌体先用3.5％戊二醛固定液固定，随后按照下述步骤处理电镜观察样品。

(1)扫描电镜样品制备

戊二醛前固定后→磷酸缓冲液清洗→1％锇酸固定→磷酸缓冲液清洗→不同梯度乙醇脱水→叔丁醇置换→临界点冷冻干燥→离子溅射金→扫描电镜观察。

(2)透射电镜样品制备

戊二醛前固定后→磷酸缓冲液清洗→1％锇酸固定→磷酸缓冲液清洗→乙醇、丙酮逐级脱水→环氧树脂618渗透→包埋→半薄切片→光镜定位，修块→Leica-R型超薄切片机切片→柠檬酸铅-醋酸铀双染色→透射电镜观察。

植物乳杆菌野生型菌株细胞呈杆状，表面光滑、形状完整，且质壁未发生分离。与植物乳杆菌野生型菌株相比，扫描电镜发现，folE基因敲除株的细胞形态与野生株相似，几乎未发生改变。ΔfolKE的胞质出现皱缩，发生质壁分离，菌株之间粘附性增强，有些菌体形态呈不规则杆状，甚至出现凹陷(图2A，图2B和图2C)；另外，透射电镜结果显示，与野生型菌株细胞相比，ΔfolE细胞内部并未发生改变，细胞完好。ΔfolKE菌株部分细胞的细胞壁变薄，胞内容物凝集成颗粒状，甚至有的细胞细胞壁发生破裂，内容物外泄。(图2D,图2E和图2F)；这些结果说明folE基因对其细胞形态没有较大影响，ΔfolKE菌株虽然只敲除folK基因的7个碱基，但是相对ΔfolE菌株的细胞形态发生较大改变，这表明folK和folE基因并非编码一个蛋白。

2、宏观菌液状态观察

将活化后的植物乳杆菌野生型菌株和基因敲除菌株ΔfolE按1.0×10⁶CFU/mL接种量接种至5mL新鲜MRS液体培养基中，37℃静置培养18～24h；菌株生长情况如图3所示，通过观察菌液状态可以发现，ΔfolE菌株的生长状态与野生型菌株的生长状态一样，均是在液体中均匀生长，但生长速度稍慢，所以敲除folE基因后没有改变菌株生长状态。

3、基因敲除菌株ΔfolE动态生长监测

将菌株活化计数后，按照1.0×10⁶CFU/mL接种量接种至300mL新鲜MRS液体培养基中，37℃静置培养86h，每隔2h取样，利用pH计测定pH值；利用分光光度计测定OD₆₀₀；同时，将菌液进行10倍梯度稀释，取100μL稀释菌液涂布于MRS固体平板上，随后在37℃培养箱中静置培养16～24h，选取平板中菌落数在30～300范围内的平板进行计数；结果表明，与植物乳杆菌野生型菌株相比，基因敲除菌株ΔfolE生长缓慢，生长周期延长，产酸能力下降；具体表现为：基因敲除菌株ΔfolE生长周期延长了近35h，然后folE基因敲除严重降低了菌株生物量，使OD₆₀₀最大值比野生型菌株小4.5；另外，基因敲除菌株ΔfolE pH值相对野生型菌株下降较为缓慢，其最终pH值也比敲除菌株高0.3左右(图4)。

实施例5：基因敲除菌株ΔfolE叶酸含量测定

将活化后的植物乳杆菌野生型菌株和基因敲除菌株ΔfolE按1.0×10⁷CFU/mL浓度接种于30mL FACM液体培养基中，37℃静置培养72h，每隔12h取出5mL菌液，避光超声破碎处理20min，12000rpm离心10min后，取1mL上清液冷冻干燥；随后加入1mL 1％氨水溶解，超声5min，12000rpm离心10min，上清液用于HPLC分析叶酸含量。

(1)色谱条件：色谱柱，Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相为甲醇(含5mmol/L甲酸铵)和水(含5mmol/L甲酸铵)；梯度洗脱：0～5min，98％～95％甲醇；5～10min，95％～55％甲醇；10～12min，55％甲醇；12～14min，55％～98％甲醇；14～20min，98％甲醇。流速为0.2mL/min，柱温为35℃，进样量为5μL。

(2)质谱条件：4500QTrap质谱参数设置如下：气帘气(CUR)25，碰撞气(CAD)中等，离子源气1(GS1)45，离子源气2(GS2)50，电喷雾电压5500V，加热器温度350℃，选用正离子模式进行检测，离子源为ESI电离源。

由图5可知，植物乳杆菌野生型菌株和基因敲除菌株ΔfolE发酵液中叶酸含量呈波动式增减。在培养24h、36h和60h的ΔfolE菌株发酵液中叶酸含量均比野生型菌株低，但是72h时，ΔfolE菌株的发酵液中叶酸含量突然上升，且大于野生型菌株。这可能是为了满足自身需求，提高了叶酸合成效率，但是另一种可能性是叶酸含量低至一定限度时会出现回补路径。该结果足以说明folE基因敲除严重影响了菌株叶酸产量，证明folE基因在植物乳杆菌叶酸合成中发挥关键作用；因此，后续可通过过量表达GTP环化水解酶I的方式提高叶酸产量，以达到扩大生产的目的，为植物乳杆菌YM4-3菌株及其代谢产物在工业上的应用提供理论基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种GTP环化水解酶I基因folE及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 570

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌YM4-3(Lactobacillus plantarum YM4-3)

<400> 1

atgattgatg agaagaacca agcaaagatt gagcatgcag tacgagaaat tttaagtgca 60

gttggtgaag atcctgaccg accgggatta gtagaaacac cagcacgggt tgcacgaatg 120

tatgcggaag ttttcgctac taagaccgcc gcaccatttg ataattataa actgttcaag 180

gttgagcatc cgactgaaat ggtattactt aaggatattc cattctattc gatgtgtgag 240

catcaccttt tgccgttttt tggcacggtt caagttgctt atgtgccgca gcatgaacaa 300

gtgattggct tgagtaagat tcctcgcttg attgactatt gcagtcaaca gccgaacgtt 360

caggagcggt tgacagtttc cattgcaaca gaattacaac gaattcttga cccggctggg 420

atcgcggtct caatcacggc gcggcacatg tgcatggaga tgcggggtgt tagcaaaccg 480

ggtgtgcata cggaaagtag ctattacagt ggtcaattca agacggattt agacttgaaa 540

cgagaattct tacagcgaat cgcaaagtag 570

<210> 2

<211> 2342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

ttacgctttc acacgtttaa cggggtactt ccggaagaac ggcgtaatgg tcaacaacta 60

gggctagata ttgccattaa atatcctatc gaaaccaagg ttcaacacga tgacgttcac 120

gagaccatca attacgcggc ggtccgtaac gtggtcgatg aatttgtaac gacccattca 180

tacaagttga ttgaatcgct agctaaccac ttattgcaga cgttattgac aagttttccc 240

gcggcggatg caatcaatat taaaattcgt aaatatagcg taccaatgcc tggaatcttt 300

gatgatgtgg aaattgaggt ggaggggacg ccgaatggca agtagggaag aacgggttta 360

tttgagtgtt ggttccaata ttcatccgcg cgtccaaaat attcagcaag cccttagccg 420

attacgagcc gtcaatgggg taaacgtgat tgacgaatct cattggtatg agactcaacc 480

gtggggaaag cgtgatcagg ccaattttta caatgtttcg gtatccttaa cgactaattt 540

gacaccagaa gaactattgg atgaattaca tacaattgag caggcgggcc accgccaacg 600

cttggttcac tggggaccac gtacgattga tttggacatt attttttggg gcgaccggca 660

aatcaacaca gcgacgctga cgattccgca tgcgcaggca gctaagcgca actttgtgct 720

actgccaact gctgaaatcg ccaaaactga tgtgttagtt ggaccacaag tggcccaatt 780

gattgcggct aatcaggatc agagttggat taaaaaagta agaaatgtga gtgagttaga 840

tgattgatga gaagaaccaa gcaaagattg agcatgcagt acgagaaatt ttaagtgcag 900

ttggtgaaga tcctgaccga ccgggattag tagaaacacc agcacgggtt gcacgaatgt 960

atgcggaagt tttcgctact aagaccgccg caccatttga taattataaa ctgttcaagg 1020

ttgagcatcc gactgaaatg gtattactta aggatattcc attctattcg atgtgtgagc 1080

atcacctttt gccgtttttt ggcacggttc aagttgctta tgtgccgcag catgaacaag 1140

tgattggctt gagtaagatt cctcgcttga ttgactattg cagtcaacag ccgaacgttc 1200

aggagcggtt gacagtttcc attgcaacag aattacaacg aattcttgac ccggctggga 1260

tcgcggtctc aatcacggcg cggcacatgt gcatggagat gcggggtgtt agcaaaccgg 1320

gtgtgcatac ggaaagtagc tattacagtg gtcaattcaa gacggattta gacttgaaac 1380

gagaattctt acagcgaatc gcaaagtagg tgattgagtg gatacaggga cgattgaaca 1440

acgttatcag gacttattag cccaactaaa tcaagccatg ttagccaata atcatcagcg 1500

tgttccgtta ttacggcgca tcatggcaca tcttggccac cctgaccatt attaccatgt 1560

gatccatatc gctggaacta atggcaaagg ctctacggga gccatgttag ccagtatcct 1620

gcgggcgcaa gggtatcaag ttggccgctt cagcagtccc gcgattaatg atgcgcgtga 1680

acaactgcaa tgcaatggga cgtggatcag tccagcggaa tttatcgata cgtatcgtga 1740

aattctaccg gttctgcaaa atatgggact gacggctagc gatgtctcca tctttgaatg 1800

gttctttctc attagtgtcg tttggtttcg gaatcaaaac gtgcaatggg cggtcattga 1860

agccggtttg ggtggcttgt atgatgcgac taacgcctta gccagtcccc aactcacggt 1920

atttactaag attgccctcg atcataccac cattcttggg cccacaatca ccgcgattgc 1980

gcaaaataag tcaaagatca ttaagcccca tacaacagca gtgacattgg ctgaccaaca 2040

cccagaagcc ctggctgttt tgcagaccga agcgctcaat caaggtgttc ggctagtgac 2100

cgctaagcac gcgcaactga cggtgactgg gcaaacactc acgcaaaccg tcgttgatgc 2160

gcacagtcag ctttttgatt ggacgcaatt aacggtcgga ctgagtggca cctatcagct 2220

acaaaatctg cggttggttt taactgtggt tgcagtacta caacagcaac aagttaactt 2280

gacgaacagt gcggttcgcc gaggcttgca acaagtttcc ttgccaggcc ggttgaccgt 2340

gt 2342

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

cccaagcttg aacggcgtaa tggtcaac 28

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

ttgaattgac cactgtaatt aattatcaaa tggtgcgg 38

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

ccgcaccatt tgataattaa ttacagtggt caattcaa 38

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

gcactagtac acggtcaacc ggcctgg 27

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

cagacgcaaa tgacgcagt 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

cggataacgc tcgttctgga t 21

Claims (10)

1.一种GTP环化水解酶I基因folE，其特征在于，所述GTP环化水解酶I基因folE的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种利用权利要求1所述GTP环化水解酶I基因folE编码的蛋白。

3.一种利用权利要求1所述GTP环化水解酶I基因folE构建的敲除载体pFED760-folE，其特征在于，将敲除载体pFED760-folE导入植物乳杆菌感受态进而通过同源重组构建folE基因敲除菌株ΔfolE；通过比较野生型菌株与ΔfolE菌株的生理生化差异，分析得到folE基因与细胞形态及菌株生长状态无关，在叶酸合成中起作用。

4.一种如权利要求3所述敲除载体pFED760-folE的构建方法，其特征在于，所述敲除载体pFED760-folE的构建方法包括：

以食源性植物乳杆菌基因组为模板，利用引物对up-EF+up-ER；down-EF+down-ER分别扩增上下游同源臂，PCR产物用作模板，利用引物对up-EF+down-ER扩增得到同源臂敲除片段，该片段纯化后，与温度敏感型质粒pFED760分别用限制性内切酶Hind III和Spe I同步酶切，酶切产物经切胶回收后，进行连接实验，连接产物导入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒得到folE基因敲除载体pFED760-folE。

5.如权利要求4所述敲除载体pFED760-folE的构建方法，其特征在于，引物序列如下：

up-EF：5’-CCCAAGCTTGAACGGCGTAATGGTCAAC-3’；

up-ER：5’-TTGAATTGACCACTGTAATTAATTATCAAATGGTGCGG-3’；

down-EF：5’-CCGCACCATTTGATAATTAATTACAGTGGTCAATTCAA-3’；

down-ER：5’-GCACTAGTACACGGTCAACCGGCCTGG-3’。

6.如权利要求4所述敲除载体pFED760-folE的构建方法，其特征在于，GTP环化水解酶I基因folE及上下游同源臂序列如SEQ ID NO:2所示，来源于食源性植物乳杆菌。

7.一种如权利要求3所述敲除载体pFED760-folE的筛选方法，其特征在于，所述敲除载体pFED760-folE的筛选方法包括以下步骤：

(1)敲除载体pFED760-folE转化：在90～100μL植物乳杆菌感受态中加入10μL敲除载体pFED760-folE，轻轻混匀，冰浴5min后转入预冷电击杯中，按照12.5kv/cm，200Ω的参数进行电击；电击完成后迅速向电转杯中加入900μL新鲜MRS培养液，用枪头轻轻吹打混匀后，将混合液转移至1.5mL无菌离心管中，28℃静止培养2.5～3h使细胞复苏；培养后菌液8000～10000rpm离心3min，弃900μL上清液，用剩余上清液重悬菌体，涂布于含有5μg/mL红霉素MRS固体平板上，28℃静置培养；

(2)folE基因敲除菌株筛选：步骤(1)中长出的单菌落转接于含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，28℃静置培养直至菌液OD₆₀₀为0.2～0.3时，将菌液转移至37℃继续静置培养过夜，该培养菌液稀释10³～10⁵倍后涂布于含有5μg/mL红霉素的MRS固体平板上，37℃静置培养24h，挑取单克隆，接种至1mL含有5μg/mL红霉素的MRS液体培养基中37℃静置培养过夜，该培养菌液按1％接种至不含抗生素的MRS液体培养基中，28℃静置培养过夜，然后菌液稀释10³～10⁵倍后涂布于无抗生素的MRS固体平板，37℃静置培养至长出单克隆，挑取较小单菌落一一对应划线于含有5μg/mL红霉素和不含抗生素的MRS固体平板，37℃静置培养24h，挑取在含抗生素的MRS琼脂平板上无法生长，而在不含抗生素的平板上可以生长的菌落进行菌液PCR验证；

所述菌液PCR验证中，前引物folE-FF：5’-CAGACGCAAATGACGCAGT-3’位于上游同源臂上游基因组上，后引物folE-RR：5’-CGGATAACGCTCGTTCTGGAT-3’位于下游同源臂下游基因组上；野生型菌株PCR片段比敲除菌株大335bp；

(3)利用构建成功的敲除菌株分析食源性植物乳杆菌的folE基因与植物乳杆菌细胞形态和菌株生长状态无关，在植物乳杆菌的叶酸合成中起关键作用。

8.一种如权利要求1所述GTP环化水解酶I基因folE来自食源性植物乳杆菌，在食品发酵上的应用。

9.一种如权利要求1所述GTP环化水解酶I基因folE在叶酸合成功能性食品的应用。

10.一种如权利要求1所述GTP环化水解酶I基因folE在提高微生物菌株生物量中的应用。

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