JP7501365B2 - 分離デバイスおよびそれを用いて分離対象物を分離する方法 - Google Patents
分離デバイスおよびそれを用いて分離対象物を分離する方法 Download PDFInfo
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Description
〔1〕微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を分離するための分離デバイスであって、
当該分離デバイスは分離室を有し、該分離室は、第1室と第2室とを少なくとも有し、第1室と第2室は分離用網状構造によって仕切られており、当該分離デバイス内に入った前記懸濁液中の液体が、第1室から前記分離用網状構造を通過して第2室へと移動し、その後、当該分離デバイスから出て行くように、内部流路が構成されており、
前記分離用網状構造は、前記分離対象物の通過を抑制するように、予め定められた大きさの網の目を持っており、
前記懸濁液中の液体が前記網の目を通過するときの該液体の進行方向が鉛直上向きの方向成分を有するように、前記分離室中に前記分離用網状構造が配置されている、
前記分離デバイス。
〔2〕前記懸濁液には、前記分離用網状構造を前記液体と共に通過させるべき固体の通過対象物が含まれており、
前記分離用網状構造は、前記分離対象物の通過を抑制し、かつ、前記通過対象物の通過を許容するように、予め定められた大きさの網の目を持っている、
前記〔1〕に記載の分離デバイス。
〔3〕前記懸濁液中の液体が液体培地であり、前記分離対象物が、足場材と接着性細胞を分離する試薬によって液体培地中で細胞から剥離した足場材であり、通過対象物が、足場材から剥離した接着性細胞である、前記〔2〕に記載の分離デバイス。
〔4〕前記足場材が、非水溶性多糖類からなるナノファイバーであり、
前記接着性細胞が、イヌ腎臓尿細管上皮細胞(MDCK細胞)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、及び間葉系幹細胞(MSC)からなる群から選択される細胞である、
前記〔3〕に記載の分離デバイス。
〔5〕前記懸濁液中の液体が液体培地であり、分離対象物が、液体培地中で浮遊培養された接着性細胞が付着した足場材であり、通過対象物が、浮遊培養において細胞から液体培地中に放出された液性因子である、前記〔2〕に記載の分離デバイス。
〔6〕前記懸濁液中の液体が、浮遊培養された接着性細胞の細胞溶解物を含有する液体であり、分離対象物が、該細胞の溶解によって前記液体中に残された足場材であり、通過対象物が、該接着性細胞の溶解によって前記液体中に放出された該接着性細胞由来の物質である、前記〔2〕に記載の分離デバイス。
〔7〕前記分離用網状構造がシート状であるか、または、袋の形状を有する、前記〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の分離デバイス。
〔8〕第1室が、
前記懸濁液を、外部から第1室に流入させるための第1の流入ポートと、
洗浄液または試薬を、外部から第1室に流入させるための第2の流入ポートと、
分離対象物を、第1室から外部に流出させるための流出ポートと
を有する、前記〔1〕~〔7〕のいずれかに記載の分離デバイス。
〔9〕第2室は、第1室の上に位置し、
第1室は、前記懸濁液を外部から流入させるための流入ポートを少なくとも有し、該流入ポートは第1室の側壁に設けられている、
前記〔1〕~〔8〕のいずれかに記載の分離デバイス。
〔10〕前記流入ポートの中心軸線は、第1室の室内の全高さの40%以上の高さに位置する、前記〔9〕に記載の分離デバイス。
〔11〕第2室の上に、上方へと積層された1以上の部屋を分離室としてさらに有し、
前記1以上の部屋のうちの第2室に隣接する部屋と、第2室とは、さらなる分離用網状構造によって仕切られ、
前記1以上の部屋が2以上の部屋である場合には、上下に隣接する部屋同士は、さらなる他の分離用網状構造によって仕切られ、
より上方に位置する分離用網状構造の網の目ほど、前記分離対象物の通過をより抑制するように、該網の目の開口面積がより小さくなっている、
前記〔9〕または〔10〕に記載の分離デバイス。
〔12〕前記懸濁液には、前記液体と共に前記分離用網状構造を通過させるべき固体の通過対象物が含まれており、
前記通過対象物の通過を許容するように、最も上に位置する分離用網状構造の網の目の大きさが予め定められている、
前記〔11〕に記載の分離デバイス。
〔13〕前記〔1〕~〔12〕のいずれかに記載の分離デバイスを用い、
微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を分離する方法。
〔14〕前記懸濁液には、前記分離デバイスの分離用網状構造を前記液体と共に通過させるべき固体の通過対象物が含まれており、
前記分離用網状構造は、前記分離対象物の通過を抑制し、かつ、前記通過対象物の通過を許容するように、予め定められた大きさの網の目を持っており、
該分離用網状構造を通過する前記通過対象物を回収する工程を有する、
前記〔13〕に記載の方法。
〔15〕前記懸濁液中の液体が、前記分離デバイスの分離用網状構造を通過するときの流速が、0.01mm/秒~25mm/秒である、前記〔13〕または〔14〕に記載の方法。
本発明の分離デバイスは、微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を分離するためのものである。分離対象物は、捨てるべきものであってもよく、利用すべきものであってもよい。図1に示す例では、説明のために、浮遊培養における足場材となる微細なナノファイバーを分離対象物とし、そこから剥離した細胞(浮遊培養された細胞)を通過対象物として示している。図1に示すように、当該分離デバイス1は、分離室10を有し、該分離室10は、第1室10aと第2室10bとを少なくとも有する。第1室10aと第2室10bは、分離用網状構造20によって仕切られている。図1の例では、分離室を側方から見たときの形状は、滞留が生じるような隅部(デッドスペース)の少ない円形であるが、楕円形や、適宜に丸みをつけた四角形などであってもよい。第1室10aには、懸濁液Q1が流入するための流入ポート31が設けられ、第2室10bには、分離用網状構造20を通過した液体Q2が流出するための流出ポート32が設けられている。当該分離デバイスの全体の内部流路は、液体が内部に入り、第1室10aから、分離用網状構造20の網の目を通過して第2室10bへと移動し、その後、外部へ出て行くように構成されている。分離用網状構造20は、分離対象物E1の通過を抑制するように、予め定められた大きさの網の目を持っている。通過対象物E2については後述する。ここで重要な特徴は、懸濁液中の液体が分離用網状構造20の網の目を通過するときの該液体の進行方向Fが、鉛直上向きの方向成分Fvを有するように、分離室10中に分離用網状構造20が配置されていることである。図1の例では、液体の進行方向Fは、水平方向成分Fhをも有している。図1の例では、分離用網状構造20は、平坦なシート状のメッシュである。該分離用網状構造は、第2室10b側の面が傾斜面となるように、斜めに傾いて配置されており、よって、該分離用網状構造の第1室10a側の面は、オーバーハング面となっている。分離用網状構造の第1室10a側の面は、全面的にオーバーハング面となっていなくともよく、該分離用網状構造が湾曲や屈曲することで、局所的にオーバーハング面でない面が含まれていてもよい。また、流入ポート31は、必ずしも分離室の最下部に設けられる必要はなく、流出ポート32は、必ずしも分離室の最上部に設けられる必要はない。図1の構成において、流入ポート31が第1室10aの上部に設けられ、流出ポート32が第2室10bの下部に設けられる場合、流入ポート31が流出ポート32よりも高い位置に設けられる場合であっても、懸濁液中の液体が分離用網状構造20の網の目を通過するときの該液体の進行方向Fは、鉛直上向きの方向成分Fvを有する。
以上の構成により、分離用網状構造20の第1室10a側の面にトラップされた分離対象物E1は、該分離用網状構造から剥がれ落ちて沈降する。よって、該分離用網状構造の網の目が分離対象物E1によって目詰まりすることが抑制され、懸濁液中の液体や通過対象物E2は、効率よく分離用網状構造を通過し、当該分離デバイス外に取り出して回収することができる。
(A)接着性細胞が足場材に付着した状態で溶解又は分散している液体(例えば、浮遊培養の状態そのままの液体、そこから、液体培地だけが所定量だけ除去されたものなど)。
(B)足場材と接着性細胞の接着能を低減する試薬によって、接着性細胞が足場材から剥離し、該細胞と足場材が独立して分散している液体。
(C)接着性細胞が細胞溶解試薬によって溶解され、それにより、接着性細胞から剥離した足場材と溶解された接着性細胞に由来する物質が溶解又は分散している液体。
(D)足場材が足場材を分解する試薬によって分解され、それにより、足場材から剥離した細胞と分解された足場材が分散している液体。
(a)懸濁液中の液体が液体培地であり、分離対象物が、細胞が付着した足場材である。この場合、固体の通過対象物は無く、例えば、単なる分離対象物の濃縮や、浮遊培養において細胞から液体培地中に放出された液性因子の回収のために利用可能である。
(b)懸濁液中の液体が液体培地であり、分離対象物が、足場材と接着性細胞を分離する試薬によって液体培地中で細胞から剥離した足場材であり、固体の通過対象物が、足場材から剥離した細胞である。
(c)懸濁液中の液体が、細胞を溶解する試薬によって溶解した該細胞を含有する液体であり、分離対象物が、該細胞の溶解によって前記液体中に残された足場材である。固体の通過対象物は無いが、該細胞の溶解によって前記液体中に放出された該細胞由来の物質が回収対象物である。
浮遊培養される接着性細胞、液体培地、浮遊培養のための足場材、該足場材と接着性細胞を分離する試薬、接着性細胞から液体培地中に放出される液性因子、細胞を溶解する試薬、細胞の溶解によって液体中に放出される該細胞中の物質を、次に例示する。
接着性細胞を、液体培地中の適当な足場材(以下に詳述する)に付着させた状態で培養することにより、接着性細胞を浮遊培養(3次元培養)することができる。本発明において、細胞の浮遊とは、培養容器に対して細胞が接着しない状態(非接着)であることをいい、細胞が沈降しているか否かは問わない。
「接着性細胞」とは、生存や増殖に容器壁等の足場を必要とする細胞である。前記浮遊培養される接着性細胞は、特に限定されるものではないが、例えば、幹細胞、前駆細胞、体性非幹細胞、初代培養細胞、細胞株、癌細胞等を挙げることができる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。接着性の幹細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等の体性幹細胞等を挙げることができる。間葉系幹細胞とは、骨細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞の全て又はいくつかへの分化能を有する幹細胞である。間葉系幹細胞は骨髄、末梢血、臍帯血、脂肪組織等の組織中に低頻度で存在し、これらの組織から公知の方法で単離することが出来る。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。接着性の前駆細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、例えば、前駆脂肪細胞、前駆心筋細胞、前駆内皮細胞、神経前駆細胞、肝前駆細胞、膵臓前駆細胞、腎臓前駆細胞等を挙げることができる。接着性の体性非幹細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、例えば、線維芽細胞、骨細胞、骨周皮細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞(たとえば、平滑筋細胞または骨格筋細胞)、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞等が含まれる。初代培養細胞とは、生体から分離した細胞や組織を播種し、第1回目の継代を行うまでの培養の状態にある細胞をいう。初代培養細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織などの任意の組織から採取された細胞であり得る。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞をいう。本発明において使用する接着性細胞は、好ましくは、イヌ腎臓尿細管上皮細胞(MDCK細胞)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、間葉系幹細胞(MSC)が挙げられ、より好ましくは、間葉系幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
前記浮遊培養に利用可能な液体培地は、使用する接着性細胞の種類等により適宜選択することが可能であり、例えば、哺乳類の接着性細胞の培養を目的とする場合、哺乳類細胞の培養に一般的に使用される培地を、本発明の培地組成物に含まれる培地として使用することができる。哺乳類細胞用の培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium;DMEM)、ハムF12培地(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培地、マッコイ5A培地(McCoy’s 5A medium)、イーグルMEM培地(Eagle’s Minimum Essential Medium;EMEM)、αMEM培地(alpha Modified Eagle’s Minimum Essential Medium;αMEM)、MEM培地(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium;IMDM)、MCDB131培地、ウィリアム培地E、IPL41培地、Fischer’s培地、StemPro34(インビトロジェン社製)、X-VIVO 10(ケンブレックス社製)、X-VIVO 15(ケンブレックス社製)、HPGM(ケンブレックス社製)、StemSpan H3000(ステムセルテクノロジー社製)、StemSpanSFEM(ステムセルテクノロジー社製)、StemlineII(シグマアルドリッチ社製)、QBSF-60(クオリティバイオロジカル社製)、StemProhESCSFM(インビトロジェン社製)、mTeSR1或いは2培地(ステムセルテクノロジー社製)、Sf-900II(インビトロジェン社製)、Opti-Pro(インビトロジェン社製)、などが挙げられる。
前記浮遊培養のための足場材は、接着性細胞を浮遊培養させ得るものであれば特に限定されないが、非水溶性多糖類から構成されるナノファイバーやマイクロキャリアビーズ等が好適に使用される。マイクロキャリアビーズの担体表面に細胞を生着させ、そのビーズを含む培地を撹拌して浮遊状態にて培養する方法は、一般的に「マイクロキャリア培養」や「懸濁培養」等とも称されるが、本明細書においては、当該培養方法も「浮遊培養」に含まれるものとする。
足場材と接着性細胞を分離する試薬としては、足場材と接着性細胞を分離できるものであれば特に限定されない。足場材と接着性細胞を分離する試薬の例としては、「足場材を分解する試薬」や「細胞の接着能を低減させる試薬」等が挙げられるがこれらに限定されない。足場材を分解する試薬としては、足場材を分解し、足場材と接着性細胞を剥離できるものであれば特に限定されない。例えば、足場材としてセルロースナノファイバーを用いる場合、その分解酵素としては、セルラーゼ(エンドグルカナーゼ(EC 3.2.1.4)(“EG”)、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ(EC 3.2.1.91)(“CBH”)、β-グルコシダーゼ([β]-D-グルコシドグルコヒドロラーゼ;EC 3.2.1.21)(“BG”))を使用することができる。セルロース原料中にヘミセルロースが多く含まれる場合、セルラーゼ以外にヘミセルロースを分解するための酵素として、キシラナーゼやマンナナーゼを添加することが好ましい。また、非水溶性多糖類としてキチン又はキトサンを用いる場合、その分解酵素として、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、β-1,3-グルカナーゼ等を使用することができる。複数の足場材を分解する試薬を組み合わせて使用してもよい。例えば、非水溶性多糖類としてキチン又はキトサンを用いる場合、その分解試薬として、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、及びβ-1,3-グルカナーゼからなる群から選択される2、3又は4の酵素の混合物を用いてもよい。Yatalase(タカラバイオ)は、キチナーゼ、キトビアーゼ、キトサナーゼ、及びβ-1,3-グルカナーゼを含む混合物であり、キチン又はキトサンを分解する試薬として好適に用いることができる。
所望の液性因子を産生する接着性細胞を、非水溶性多糖類からなるナノファイバーに付着させた状態で浮遊培養に付し、培養物(例、培養上清)から、目的とする液性因子を本発明の分離デバイスを用いて分離することにより、当該液性因子を得ることが出来る。液性因子としては、抗体、酵素(ウロキナーゼ等)、ホルモン(インシュリン等)、サイトカイン(インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、成長因子等)、ワクチンの抗原、その他の生理活性物質(タンパク質、ペプチド等)を挙げることができるが、これらに限定されない。液性因子を産生する接着性細胞には、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、腎細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞等の非形質転換細胞や、当該液性因子をコードする遺伝子や有用物質の生合成に関与する遺伝子を導入した形質転換細胞が含まれる。所望の液性因子を産生する接着性細胞は、好適には、当該液性因子を細胞外へ分泌する細胞である。液性因子を産生する接着性細胞としては、具体的には、当該液性因子をコードする遺伝子や当該液性因子の生合成に関与する遺伝子を導入した、HEK293、CHO-K1、BHK-21、MDCK、Vero、HepG2、MCF-7等を挙げることができるが、これらに限定されない。組み換えタンパク質等の液性因子の生産に使用される細胞は当業者に周知である。
細胞溶解試薬としては、細胞の膜を破壊もしくは溶解して、細胞内に含まれている所望の物質を細胞外へ溶出させる作用を有するものであれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において公知の化合物や組成物の中から適宜選択して用いることができる。細胞溶解試薬としては、具体的には、有機溶媒、カオトロピック塩、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。なお、細胞溶解試薬としては、1種類の試薬を用いてもよく、2種類以上の試薬を用いてもよい。
細胞の溶解により液体中に放出される物質には、細胞中に含まれるあらゆる物質が含まれ、特に限定されないが、一例としては、培養された接着性細胞の細胞外には分泌されないタンパク質、ウイルス、核酸分子等が挙げられる。
図1の例では、分離用網状構造は、網状の部分がシート状(即ち、薄い平板状)のメッシュであって、該分離用網状構造の第1室10a側の面(下面)は、オーバーハング面となっており、水平面に対して仰角θだけ傾いている。このような構成であれば、分離室の形状によっても異なるが、分離用網状構造が分離室を斜めに横切るので、該分離用網状構造の面積(網の目が存在する面の面積)がより広くなる場合が多く、流量が多くても線流速を下げることが可能であるので好ましい。また、第1室に入った液体の流れが、分離用網状構造に対して角度を成して当たると、分離用網状構造に付着した分離対象物が、該液体の流れにより剥がれやすくなるといった作用を期待することもできる。
一方、図2の例では、分離用網状構造は、図1の例と同様に、網状の部分がシート状のメッシュであるが、該分離用網状構造の第1室10a側の面(下面)は、水平面(仰角θは0度)となっており、真下の方向を向いている(換言すると、懸濁液中の液体が分離用網状構造20の網の目を通過するときの該液体の進行方向Fは、鉛直上向きの方向成分Fvだけを有する)。このような態様は、網の目にトラップされた分離対象物に作用する重力の全てが、分離用網状構造の下面に垂直に引き剥がす力として該分離対象物に作用するので、最も効果的に目詰まりを解消することができ、好ましい。
分離用網状構造の形状(網状の部分の形状)は、図1、図2に示すような平坦なシート状のみならず、図4に例示するような袋の形状であってもよい。
図4(a)に例示する態様では、袋の開口が下方を向くように分離用網状構造20が配置されており、該袋の内部が第1室10aの一部または全部であり、該袋の外部が第2室10bである。図4(a)の例では、該袋の内部が第1室10aの全部であるが、該袋の位置が分離室内で上方へと移動すると、該袋の内部が第1室10aの一部となる。該袋の壁部は、互いに向かい合った内面が、互いに平行ではなく、前記開口から袋内を奥へと進むにつれて、該内面同士の間の距離が狭くなっていく。これによって、該袋の内面は、全て斜めのオーバーハング面または真下を向いた面となっている。
図4(b)に例示する態様では、袋の開口が上方を向くように分離用網状構造20が配置されており、該袋の外部が第1室10aであり、該袋の内部が第2室10bの一部または全部である。図4(b)の例では、該袋の内部が第2室10bの全部であるが、該袋の位置が分離室内で下方へと移動すると、該袋の内部が第2室10bの一部となる。該袋の壁部は、互いに向かい合った内面が、互いに平行ではなく、前記開口から袋内を奥へと進むにつれて、該内面同士の間の距離が狭くなっていく。これによって、該袋の外面は、全て斜めのオーバーハング面または真下を向いた面となっている。
分離用網状構造は、分離対象物が通過しないように(即ち、トラップされるように)予め定められた大きさの網の目を持っている。これにより、当該分離デバイス内に液体と共に入った固体のうち、分離を意図する大きさを持った分離対象物が、分離用網状構造の網の目を通過できず、第1室に滞留する。よって、第1室に滞留した分離対象物を分離することができる。懸濁液から分離された分離対象物は、廃棄されるべきものであってもよいし、回収し利用すべきものであってもよい。
分離用網状構造の貫通孔(網の目)の開口形状の円相当直径は、分離対象物および通過対象物によって異なる。例えば、分離対象物が、ポリスチレンビーズなど、浮遊培養の足場材として用いられる粒状物や球状物(例えば、CellBIND(登録商標)表面マイクロキャリア(粒径125~212μm、Corning社製)であり、通過対象物が該足場材から剥離した細胞であれば、貫通孔の開口形状の円相当直径は、該ビーズが通過し得ない寸法として、20μm~200μm程度が好ましく、20μm~100μmがより好ましく、20μm~50μmがさらに好ましい。通過対象物が無く、液体だけであれば、貫通孔の開口形状の円相当直径は、より小さくてもよい。
分離対象物が、前記ビーズに付着した状態のイヌ腎臓尿細管上皮細胞(MDCK細胞)やチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、間葉系幹細胞(MSC)などの細胞であって、通過対象物が無く、液体だけが通過する場合であれば、貫通孔の開口形状の円相当直径は、1μm~20μm程度)が例示される。
分離対象物が、MDCK細胞、CHO細胞、MSCなどの浮遊培養の足場材として用いられる非水溶性多糖類からなるナノファイバーであって、通過対象物が該足場材から剥離した細胞であれば、貫通孔の開口形状の円相当直径は、10μm~200μm程度が好ましく、20μm~100μmがより好ましく、20μm~50μmがさらに好ましい。通過対象物が無く、液体だけであれば、貫通孔の開口形状の円相当直径は、より小さくてもよい。
また、分離対象物が、前記ナノファイバーに付着した状態のMDCK細胞、CHO細胞、MSCなどの細胞であって、通過対象物が無く、液体だけが通過する場合であれば、貫通孔の開口形状の円相当直径は、1μm~200μm程度が好ましく、より好ましくは5μm~100μmであり、さらに好ましくは10μm~50μmである。
以上の寸法は、それぞれの分離対象物、通過対象物における一例である。各分離対象物のサイズや、通過対象物のサイズ、通過対象物の有無に応じて、該分離対象物の通過が抑制されるように、適宜決定してよい。
以下、接着性細胞がMSCであって、足場材がナノファイバーである場合に対する、各部の好ましい寸法等を例示するが、それら以外の他の細胞や足場材についても、それぞれに適宜応じた寸法へと変更してよい。
そこで、本発明では、足場材だけを分離する場合には、前記の円相当直径の限定に加えて、該開口形状が、直径10μm~200μmの円(以下、収容円と呼ぶ)を収容し得る形状であることをも限定条件に加える。ここで、開口形状が収容円を収容し得るとは、収容円が開口形状に内接する場合や、収容円が開口形状と一致する場合をも含む。収容円の直径は、直径20μm~100μmがより好ましく、直径20μm~50μmがさらに好ましい。開口形状が円形である場合は、収容円の直径=円相当直径であり、それ以外の場合は、収容円の直径<円相当直径である。
また、足場材に細胞が付着したものを分離する場合には、前記の円相当直径の限定に加えて、該開口形状が、直径1μm~200μmの収容円を収容し得る形状であることをも限定条件に加える。収容円の直径は、直径5μm~100μmがより好ましく、直径10μm~50μmがさらに好ましい。
分離用網状構造の網の目の開口形状は、特に限定はされず、三角形、四角形、六角形、その他の多角形や異形などであってもよいが、一般的な安価で高品質なメッシュの開口形状として、正方形が挙げられる。メッシュのシート面を正視した場合には、図5(a)に示すように、縦糸と横糸が直線的に交差しているように見え、かつ、網の目も、平面的な正方形に見える。個々の網の目を微視的に観察すると、縦糸と横糸は互いをよけるように3次元的に編まれているので、1つの正方形の網の目200を取り囲む4辺を構成する4本の線材(2本の縦糸(201、202)と、2本の横糸(211、212))は、図5(b)に示すように、それぞれにメッシュの厚さ方向に大きく波打っている。該正方形の開口の4辺のうち、互いに対向する平行な2辺の間の距離W1は、前記収容円の直径であってよい。
線材の材料は、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、PTFE、EVA、PPS、PEEK、アラミド、ステンレス鋼などが挙げられる。
分離対象物が培養された接着性細胞(細胞塊)である場合、線材をより太くすることで細胞が線材によって分断されることを抑制してもよいし、また、分離用網状構造を通過する液体の流速を遅くすることで、細胞が線材によって分断されることを抑制してもよい。分離用網状構造が配置される分離室の容積をより大きくし、流れの断面積を他の管路の断面積よりも大きくし、分離用網状構造の網の目の開口面積の総和を他の管路の断面積よりも大きくすることで、分離用網状構造を通過する液体培地の流速は遅くなり、細胞が分離用網状構造で分割されることが抑制される。これにより、細胞は、分離用網状構造でトラップされ、第1室10aに滞留する。分離用網状構造の網の目の開口面積の総和は、他の配管用チューブの断面積の0.01倍~1000倍程度が好ましく、0.1倍~500倍程度がより好ましい。例えば、配管用チューブの断面積が、1mm2~50mm2程度である場合、分離用網状構造の網の目の開口面積の総和は、0.01mm2~50000mm2程度が好ましい。
分離用網状構造は、多孔フィルムであってもよい。多孔フィルムは、図6(a)、(b)に示すように、フィルム厚さの方向に貫通する多数の貫通孔200と、該貫通孔同士の間の隔壁であるビーム部220とを有して構成される。貫通孔200は、前記のメッシュと同様に、分離対象物の通過を抑制する大きさの開口形状を持っている。ビーム部220は、隣合った貫通孔同士の間に位置する材料部分(フィルムから貫通孔を除いた残部)である。該ビーム部は、網状をなすように一体的につながっている。多孔フィルムの貫通孔200の開口形状、開口面積、ビーム部の幅は、上記したメッシュの開口形状、開口面積、線材の太さと同様であってよい。多孔フィルムの製造方法としては、樹脂成形、パンチング、フィルムに対するエッチング、電鋳などが例示される。
分離用網状構造の面積(第1室に面し、網の目が存在する領域の面積)は、当該分離デバイスの用途(小規模な実験用や、大規模な産業用)に応じて決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、小規模な実験用であれば100~5000mm2程度が好ましい範囲として例示され、大規模な産業用であれば5000~50000mm2程度が好ましい範囲として例示される。
分離室の容積も、当該分離デバイスの用途に応じて決定すればよく、特に限定はされないが、例えば、小規模な実験用であれば1000~50000mm3程度が好ましい範囲として例示され、大規模な産業用であれば50000~500000mm3程度が好ましい範囲として例示される。
分離室の形状は、特に限定はされず、円柱状、角柱状(直方体)、板状(円板、四角い板状)、塊状(球状、楕円球状、立方体に近い形状)、異形などが挙げられる。このような分離室における流入ポート、分離用網状構造、流出ポートの位置も、特に限定はされず、当該分離デバイス内に入った懸濁液中の液体が、より低い抵抗でスムーズに、第1室から分離用網状構造を好ましく通過して第2室へと移動し、その後、当該分離デバイスから出て行くように、内部流路が構成されていることが好ましい。また、当該分離デバイス内に入った懸濁液中の液体が、分離用網状構造に対してより大きく広がって、該離用網状構造を通過する用に、分離室の形状とポートの位置が決定されることが好ましい。
分離室の壁部を構成する材料は、特に限定はされないが、ポリスチレンやポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、アクリル、シリコン、ポリビニリデンフロライドなどの有機高分子材料や、ステンレスなどの金属材料が挙げられる。安価に成形可能であり、かつ、オートクレーブやガンマ線に対する耐性の観点からは、ポリプロピレンやポリカーボネート、アクリルが好ましい材料として例示される。
分離用網状構造を分離室内に配置するための構成としては、特に限定はされないが、例えば、第1室と第2室とを別個の部品として用意し、これらによって分離用網状構造を挟み込んで固定する構成や、1つの分離室内に、接着しろを持った分離用網状構造を挿入に、該分離室の内壁に分離用網状構造を接着しろを利用して接着して固定し、該分離室を第1室と第2室とに分ける構成などが挙げられる。接着は、接着剤を用いた接着、部品自体同士の溶着などであってよい。
当該分離デバイスには、目的に応じて、第1室、第2室にそれぞれ複数のポートが設けられてもよい。
図7に示す態様例では、第1室に3つのポート(第1の流入ポート311、第2の流入ポート312、および、流出ポート313)が設けられており、第2室には、流出ポート32だけが設けられている。図7に示す態様例では、分離室の外形が円板状(円柱状)であり、各ポートは、分離室の外周側面に角度90度の間隔をおいた位置にある。
図8に示す態様例も同様に、第1室に3つのポート(第1の流入ポート314、第2の流入ポート315、および、流出ポート316)が設けられており、第2室には、流出ポート32だけが設けられている。図8に示す態様例では、分離室の形状が直方体状(薄い板状)であり、各ポートは、分離室の外周側面の4面のうち、互いに対向する2面にそれぞれ2つ設けられている。図8(a)に示す態様のより具体的な例としては、図8(b)に示す態様、および、図8(c)に示す態様が例示される。
図8(b)に示す態様では、分離室は8つの頂点(C11、C12、C13、C14、C31、C32、C33、C34)を持った直方体状(薄い四角形の板を水平に寝かせたような形状)である。該分離室は、水平に配置された方形のシート状の分離用網状構造20によって、下側の第1室10aと、上側の第2室10bとに仕切られている。該分離用網状構造20の4つの頂点は、C21、C22、C23、C24である。第1室における第1の流入ポート314および第2の流入ポート315は、側面(C22、C23、C33、C32)内に位置し、第1室における流出ポート316は、側面(C21、C24、C34、C31)内に位置する。また、第2室の流出ポート32は、側面(C11、C14、C24、C21)内に位置する。
図8(c)に示す態様では、分離室は8つの頂点(C41、C42、C43、C44、C51、C52、C53、C54)を持った直方体状(薄い四角形の板を垂直に立てたような形状)である。該分離室は、斜めに配置された方形のシート状の分離用網状構造20によって、下側の第1室10aと、その斜め上側の第2室10bとに仕切られている。方形のシート状の分離用網状構造20の4つの頂点は、C41、C52、C53、C44である。第1室における第1の流入ポート314および第2の流入ポート315は、側面(C41、C51、C52)内に位置し、第1室における流出ポート316は、側面(C44、C54、C53)内に位置する。また、第2室の流出ポート32は、側面(C44、C53、C43)内に位置する。
図7、図8のいずれの態様でも、第1の流入ポートは、懸濁液を外部から第1室に流入させるためのポートである。また、第2の流入ポートは、洗浄液や試薬などを、外部から第1室に流入させるためのポートである。前記試薬としては、細胞剥離液(例えば、足場材を分解し得る試薬)や、細胞を溶解するための細胞溶解試薬などが挙げられる。また、第1室に設けられる流出ポートは、分離用網状構造によって第1室内に残された分離対象物を外部に流出させるためのポートである。
これらのポートを設けることによって、分離室の第1室に外部の試薬容器を接続し、第1室において該試薬の適用による足場材の剥離や細胞の溶解が可能になる。また、第1室に他の外部容器を接続すれば、第1室内に残留した分離対象物を該外部容器に移動させることもできるようになり、閉鎖系の培養システムに適した流路構築が可能となる。
図9に示す態様例では、第2室10bは、第1室10aの上に位置し、シート状の分離用網状構造20が水平に配置されている。よって、分離用網状構造20の網の目を通過するときの液体の進行方向Fは、鉛直上向きの方向である。
図9に示す態様例では、第1室は、懸濁液Q1を外部から流入させるための流入ポート31を少なくとも有し、該流入ポート31は、第1室の側壁に設けられている。これにより、分離室の底面は平坦になり、安定してベース面上に配置することができる。
また、好ましい態様として、流入ポートの中心軸線の高さh1は、第1室の室内の全高さH1の40%以上の高さ、好ましくは60%以上の高さに位置する。これによって、第1室内には、流入ポート31の中心軸線の高さh1よりも下に、スペースが存在する。このスペースの存在と、側面に設けられた流入ポートから流入する懸濁液Q1の流れとによって、第1室10a内では、分離対象物と通過対象物とが好ましく循環し、分離対象物が分離用網状構造から剥がれ落ちながら、前記スペースに溜まることができる。該スペースに溜まった分離対象物は、新たに流入する通過対象物の障害にはならない。また、流入ポート31は第1室の底面に設けられていないので、新たに流入する懸濁液が、該スペースの底に溜まった分離対象物を上方へと吹き上げることもない。よって、通過対象物が分離用網状構造を好ましく通過する。流入ポートの中心軸線の高さh1の上限は、流入ポートの開口の上端が分離用網状構造の下面に接触する位置である。即ち、開口の口径をdとすると、流入ポートの中心軸線の高さh1の上限は、分離用網状構造の下面からd/2だけ下がった位置である。
図9の態様では、分離室は1つの分離用網状構造によって2つに分けられたものであったが、第2室の上には、上方へと積層された1以上の部屋が分離室としてさらに設けられていてもよい。前記1以上の部屋のうちの第2室に隣接する部屋と、第2室とは、さらなる分離用網状構造によって仕切られる。また、前記1以上の部屋が2以上の部屋である場合には、上下に隣接する部屋同士が、さらなる他の分離用網状構造によって仕切られる。
図10に示す態様例では、図9に示した第2室の上に、上方へと積層された部屋10cが分離室としてさらに設けられている。第2室10bは、第1室10aの上に位置し、それらの間にシート状の分離用網状構造21が水平に配置されており、第3室10cが、第2室10bの上に位置し、それらの間にシート状の分離用網状構造22が水平に配置されている。換言すると、分離室が、2つの分離用網状構造21、22によって、3つの部屋10a、10b、10cに分けられている。流出ポートは、最も上に位置する部屋(第3室10c)に設けられる。このような構成では、より上方に位置する分離用網状構造の網の目ほど、前記分離対象物の通過をより抑制するように、該網の目の開口面積が、より小さくなっている。これにより、分離用網状構造が単一の場合よりも、流量を上げたときの分離能(即ち、流量を上げても、分離対象物を通過させてしまうことなく止める性能)が向上するため好ましい。
図10に示す態様において、懸濁液Q1中に固体として分離対象物E1だけが分散している場合には、最も上に位置する分離用網状構造22の網の目の大きさの下限は、特に限定はされず、通過させるべき液体がより小さい抵抗で効率よく通過できるような大きさであることが好ましい。
一方、図10に示す態様において、懸濁液Q1中に固体として分離対象物E1のみならず、固体の通過対象物E2が含まれている場合、最も上に位置する分離用網状構造22の網の目の大きさは、分離対象物E1の通過を抑制しながらも、通過対象物E2が通過できる大きさであるように定められる。このように、分離用網状構造を多段に設ける態様により、最初の分離用網状構造21の網の目を大きくし、該分離用網状構造21を通過する時に粗いふるい分けを行って大きい分離対象物だけを先に除去することができるため、比較的流量を上げても分離能が低下しないので好ましい。
図11は、当該分離デバイスを用いて構成された細胞培養システムの一例を示すブロック図および配管図である。図では、管路と液体の流れの方向を矢印で表している。図11に例示する構成では、足場材とそれに付着した細胞が、当該分離デバイスによって懸濁液から分離され、液性因子を含んだ液体培地だけが通過し回収されるか、または、細胞から剥離された足場材が、当該分離デバイスによって懸濁液から分離され、細胞を含んだ液体培地が通過して回収される。図の例では、送液ポンプS1、S2はチューブポンプであり、容器110、120、160、170は柔軟なバッグであり、容器同士を接続する配管は軟質チューブであり、細胞や液体培地が外気に露出することのない閉鎖系での細胞培養と細胞の分離、回収を可能にしている。
先ず、液性因子(例えば、INF-β、エクソソーム)を含んだ液体培地だけを回収する場合には、細胞が付着した足場材を含んだ懸濁液は、細胞培養容器120から配管P2を通じて、当該分離デバイス1の第1室10aに送り込まれる。そこで、細胞が付着した足場材が第1室10aに残り、液体培地だけが分離用網状構造20を通過して第2室10bに入り、当該分離デバイスから出て行く。該液体培地は、配管P3、切替えバルブ150、配管P4を通って、液体(上清)回収容器160に収容される。この手順は、細胞培養容器120内の細胞(足場材に付着している)の濃縮にも利用され得る。例えば、その場合、送液ポンプS2を送り方向が逆になるよう操作し、第1室10aに残留していた濃縮物を細胞培養容器120へと戻し、液体培地容器110から液体培地を再度送り込むことで、細胞培養容器120内で培養を続けることができる。
次に、浮遊培養された接着性細胞から足場材を分離し、細胞を含んだ液体培地を回収する場合には、該接着性細胞から足場材を剥離するために、試薬注入ポート140から細胞培養容器120内に試薬(例えば、Yatalase)が送り込まれる。この際には、送液ポンプS2は送り方向が逆になるよう操作される。足場材と細胞とが剥離した懸濁液は、細胞培養容器120から配管P2を通じて、当該分離デバイス1の第1室10aに送り込まれる。そこで、足場材が分離されて第1室10aに残り(第1室内には液体培地も残っている)、細胞と液体培地が分離用網状構造20を通過して第2室10bに入り、当該分離デバイスから出て行く。細胞と液体培地は、配管P3、切替えバルブ150、配管P5を通って、細胞回収容器170に収容される。
これらの回収操作は、細胞培養システムをインキュベーター外に取り出して行っても良いし、インキュベーター内で行っても良い。
上記した本発明の分離デバイスを用いて、微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を好ましく分離する方法を提供することができる。上記したように、懸濁液に含まれる固体と、分離すべき対象物と、通過させるべき対象物との組み合わせは、多岐に渡る。例えば、懸濁液中の液体が液体培地であり、分離対象物が、接着性細胞が付着した足場材である場合、固体の通過対象物は無く、当該方法は、液体の単なる除去(濃縮)や、浮遊培養において接着性細胞から液体培地中に放出された液性因子の回収に利用可能である。分離対象物は回収対象物であってもよい。懸濁液中の液体が液体培地であり、分離対象物が、足場材と接着性細胞を分離する試薬によって液体培地中で接着性細胞から剥離した足場材である場合には、通過対象物(回収対象物)は足場材から剥離した接着性細胞である。懸濁液中の液体が、接着性細胞を溶解する細胞溶解試薬によって溶解した該細胞を含有する液体であり、分離対象物が、該細胞の溶解によって前記液体中に残された足場材である場合には、通過対象物(回収対象物)は、該細胞の溶解によって前記液体中に放出された該細胞由来の物質である。
懸濁液中の液体が、当該分離デバイスの分離用網状構造を通過するときの流速は、特に限定はされないが、分離性を向上させかつ目詰まりを抑制する点からは、0.01mm/秒~25mm/秒が好ましく、0.1mm/秒~15mm/秒がより好ましく、1mm/秒~10mm/秒がさらに好ましい。
分離用網状構造の面積(網として有効に作用する部分の面積)1cm2当たりを通過する液体の流量は、分離性を向上させかつ目詰まりを抑制する点からは、1~10mL/minが好ましく、2~5mL/minがより好ましく、3mL/minがさらに好ましい。後述の実施例3は、30mL/minで実施したものであり、分離用網状構造の面積は約12cm2であるから、分離用網状構造の面積1cm2当たりの流量は2.5mL/minである。
図12は、本発明の分離デバイスを用い、浮遊培養された移植用MSCを回収する場合のプロセスの一例を示すフローチャートである。
該フローチャートに示すように、先ず、足場材(例、キチンナノファイバー)を用いて細胞を浮遊培養する。
次に、懸濁液(液体培地中に、細胞が付着した足場材が分散している)を当該分離デバイスに送り込むことで、所定量の液体培地を通過させ、細胞が付着した足場材を濃縮することができる。このとき、当該分離デバイスを通過した液体培地(培養上清)を回収してよい。
次に、足場材を分解する酵素(例、Yatalase)を含有した溶液を注入し、所定時間インキュベートすることで足場材表面を分解し、細胞を足場材から剥離させる。酵素溶液注入前にPBS(-)(リン酸緩衝液)等で洗浄してもよい。
次に、培地又はPBS(-)を送液し、足場材をトラップし、細胞のみを通過させることで、該細胞を回収する。この際、分離用網状構造のメッシュ面に対して重力方向と逆方向に送液することで、効果的な細胞回収が可能となる。
次に、回収液を遠心分離し、上清を除去することで細胞のみを回収する。
図13は、本発明の分離デバイスを用い、浮遊培養後の液体培地を回収する場合のプロセスの一例を示すフローチャートである。該フローチャートに示すように、足場材を用いて接着性細胞を浮遊培養した後、本発明の分離デバイスに懸濁液(液体培地中に、接着性細胞が付着した足場材が分散している)を送り込むことで、細胞が付着した足場材を除去し、液体培地(培養上清)の回収が可能となる。接着性細胞が付着した足場材は、培養容器に戻し、再度浮遊培養に供してもよい。
図14は、本発明の分離デバイスを用い、浮遊培養後、培養された細胞由来の物質を回収する場合のプロセスの一例を示すフローチャートである。
該フローチャートに示すように、先ず、足場材を用いて細胞を浮遊培養する。
次に、懸濁液(液体培地中に、細胞が付着した足場材が分散している)を当該分離デバイスに送り込み液体培地を通過させ、接着性細胞が付着した足場材を濃縮する。このとき、当該分離デバイスを通過した液体培地(培養上清)を必要に応じて回収してもよい。
次に、細胞溶解試薬によって細胞を溶解する。この結果、懸濁液中には、細胞から剥離した足場材および細胞溶解物が含まれる。
次に、本発明の分離デバイスによって足場材を除去し、細胞溶解物を含んだ液体を通過させ、該液体を回収する。
(キチンナノファイバーを含んだ培地組成物の調製)
上記特許文献1(国際公開第2015/111686号)の記載に準じて調製した2質量%キチンナノファイバー(バイオマスナノファイバー BiNFi-S(ビンフィス)、株式会社スギノマシン)を、1%(w/v)となるように超純水(Milli-Q水)に混合し懸濁させた。その後、これらの水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。得られた1%(w/v)キチンナノファイバー分散液を、終濃度0.01または0.02%(w/v)となるように、間葉系幹細胞増殖培地2(#C-28009、タカラバイオ社製)(以下、培地と表記することもある)に添加し、懸濁することで、キチンナノファイバーが分散した状態で含まれた培地組成物(以下、CNF培地組成物と表記)を調製した。
(分離デバイスの作製)
図15の写真図に外観を示すように、50mLコニカルチューブ(Falcon(R)、Corning社製)を45mL目盛の位置において上側部分と下側部分に切断し、下側部分を上下逆さにし、下端の円錐状部分を上側部分に下から差し込んで、該上側部分の内部を第1室10aとした。
前記の第1室10aの上に、流入ポート31を持ったコネクターリング31Rを接続し、その上に、3つのセルストレーナー(pluriStrainer(登録商標)、pluriSelect Life Science社製)21A、22A、23Aを順に積み重ね接続し、さらにその上に、上下が開口した円錐台状の筒(Funnel、pluriSelect Life Science社製)10dを接続し、本発明の分離デバイスを得た。前記3つのセルストレーナーのそれぞれの分離用網状構造(メッシュ)の方形の開口の円相当直径は、下から順に100μm、60μm、20μmである。
この分離デバイスでは、セルストレーナー21Aのメッシュとセルストレーナー22Aのメッシュとの間の空間が第2室10bであり、セルストレーナー22Aのメッシュとセルストレーナー23Aのメッシュとの間の空間が第3室10cであり、その上の円錐台状の筒10dの内部が第4室である。本実施例の分離デバイスは、構造上の概念では、図10に示す分離デバイスと同様である。
(分離デバイスを用いた細胞と足場材の分離)
実施例1で作製した分離デバイスを用いて、細胞と足場材の分離を検討した。
培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞(C-12974、タカラバイオ社製)を、100万細胞/10mLとなるように調製例1で作製した0.02%(w/v)キチンナノファイバー配合培地組成物と懸濁した後、10mLシリンジ(テルモ社製)に充填した。これを分離デバイスのコネクターリング横部のポートに接続し、注入した。
次に、間葉系幹細胞増殖培地2を40mL充填した50mLシリンジ(テルモ社製)をポートに接続し、0.5mL/secの流速で培地を注入することにより、メッシュに対して重力方向に逆らって下からフローした。
Funnel部に流入した培地を回収し、回収液を遠心分離(300×g、3分間)後、上清を除去した。残った沈降物に培地10mLを加えて再懸濁し、懸濁液の細胞中に含まれるATP量をCellTiter-Glo(プロメガ社)を用いてプレートリーダー(テカン社製)により定量した。
その結果、細胞回収率は89%であった。また、回収後の懸濁液および分離デバイス下部の残渣を倒立顕微鏡で観察したところ、回収後の懸濁液にはほとんどキチンナノファイバーが観察されないことを確認した。図16(a)、(b)にそれぞれの顕微鏡写真を示す。図16(a)は、当該分離デバイスを通過した液体中に含まれる固体を示す顕微鏡写真図であり、図16(b)は、当該分離デバイスの第1室に残った液体中に含まれる固体(残渣)を示す顕微鏡写真図である。
(セルストレーナーでの細胞と足場材の分離)
50mLコニカルチューブにコネクターリングを接続し、20μm、60μm、100μmのセルストレーナーと、Funnelを順に載せて固定した。
培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞(C-12974、タカラバイオ社製)を、100万細胞/10mLとなるように調製例1で作製した0.02%(w/v)キチンナノファイバー配合培地組成物と懸濁した後、電動ピペッター(ビオラモディスポピペット)で吸引し、Funnelを伝わらせてセルストレーナー上にゆっくり吐出した。
次に、無充填の10mLシリンジをコネクターリング横部のポートに接続し、シリンジのピストンをゆっくり引っ張ることでコニカルチューブ内を減圧し、セルストレーナーに通液した。
次に、40mLの間葉系幹細胞増殖培地2を、Funnelを伝わらせてセルストレーナー上にゆっくり注ぎ、無充填の50mLシリンジをコネクターリング横部のポートに接続し、シリンジのピストンをゆっくり引っ張ることでコニカルチューブ内を減圧し、セルストレーナーに通液した。
コニカルチューブ内の培地を遠心分離(300×g、3分間)後、上清を除去した。
残った沈降物に培地10mLを加えて再懸濁し、懸濁液の細胞中に含まれるATP量をCellTiter-Glo(プロメガ社)を用いてプレートリーダー(テカン社製)により定量した。
これは、上部から順にフィルターしたことにより、キチンナノファイバーがメッシュを覆う形で塞いでしまい、細胞の通過を阻害したものと考えられる。また、再懸濁した液を目視観察したところ、細胞とは異なる浮遊物がみられたことから、キチンナノファイバーの混入が確認され、分離が不十分であることもわかった。このことから、実施例1で作製した分離デバイス形状を利用して実施例2で行った分離回収方法の有効性が示された。
(バッグ型セルストレーナーを用いた細胞と足場材の分離)
市販品の一部材である骨髄液ろ過フィルター(カネカ社製)を用いて、細胞と足場材の分離を検討した。
培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞(C-12974、タカラバイオ社製)を、100万細胞/10mLとなるように調製例1で作製した0.02%(w/v)キチンナノファイバー配合培地組成物と懸濁した後、10mLシリンジに充填した。これを骨髄液ろ過フィルターの一端に接続し、下部から上部方向に送液した。
次に、培地を25mL充填した50mLシリンジに着け替え、下部から上部方向に送液し、上部の流路から出てきた培地を50mLコニカルチューブに回収した。
回収液を遠心分離(300×g、3分間)後、上清を除去した。
残った沈降物に培地10mLを加えて再懸濁し、細胞数をセルカウンター(TC-20、Bio-Rad社製)で計測した結果、回収前の細胞数と比較して86%の回収率となった。
また、懸濁液の細胞中に含まれるATP量をCellTiter-Glo(プロメガ社)を用いてプレートリーダー(テカン社製)により定量した。分離操作前の培養後細胞懸濁液を測定して得られたRLU値を基準(細胞回収率100%)として、分離操作をした際に得られるRLU値を比較して細胞回収率を算出した。
その結果、細胞回収率は83%であった。また、回収後の懸濁液および分離デバイス下部の残渣を倒立顕微鏡で観察したところ、懸濁液にはほとんどキチンナノファイバーが観察されないことを確認した。図17(a)、(b)にそれぞれの顕微鏡写真を示す。図17(a)は、当該分離デバイスを通過した液体中に含まれる固体を示す顕微鏡写真図であり、図17(b)は、当該分離デバイスの第1室に残った液体中に含まれる固体(残渣)を示す顕微鏡写真図である。
比較例1では、回収液への足場材の残存が多く観察されたのに対し、実施例2、4では、ほとんどないことを確認した。また、実施例2、4は下部からフローすることにより、細胞が外気に触れにくくなり、回収過程で細胞が乾燥することを防ぎ、効率的な回収を達成することが出来た。
※2…○:空気に暴露低、×:空気に常に暴露
培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞(C-12974、タカラバイオ社製)を、40000細胞/mLとなるように、上記調製例1で作製した0.01%(w/v)キチンナノファイバー配合培地組成物及び未添加培地に播種した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3471)のウェルに1ウェル当たり2mLになるように分注した。
各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、5日間継続した。5日目に細胞回収の操作を行った。培養後、該細胞/キチンナノファイバー懸濁液を15mL遠沈管に回収し、遠心分離(220×g、3分間)を行った。
上清を除去後、D-PBS(#045-29795、富士フイルム和光純薬社製)を3mL添加し、洗浄後、遠心分離(220×g、3分間)を行った。
続いて、足場材を分解する試薬としてYatalase(#T017、タカラバイオ社製)を1%(w/v)となるようにD-PBSに溶解させた。DMEM(低グルコース)(#041-29775、富士フイルム和光純薬社製)に1%(w/v)Yatalase溶液(終濃度0.4%)及びTryple select (1×)(#12563029、Thermo Fisher Scientific社製)(終濃度0.1×)を加えた剥離溶液(サンプル1)、1%(w/v)Yatalase溶液(終濃度0.4%)を加えた剥離溶液(サンプル2)を2mL/15mL遠沈管で添加した。
また、コントロールのサンプルとして、DMEM(低グルコース)のみを2mL添加した(サンプル3)。懸濁後に6ウェル平底超低接着表面マイクロプレートに再度播種し、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて1時間静置した。
続いて、剥離した細胞、キチンナノファイバー及び培地を15mL遠沈管に回収し、遠心分離(220×g、3分間)を行った。
上清を除去後にD-PBSを3mL添加し、洗浄後に遠心分離(220×g、3分間)を行った。上清を除去後に培地を2mL添加し、6ウェル接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3516)に播種し、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて3時間静置した。3時間後に上清及びキチンナノファイバーを回収し、遠心分離(220×g、3分間)を行った。
上清を除去後にATP試薬500μL(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay, Promega社製)を添加した。
また、6ウェル接着表面マイクロプレートに接着した細胞はD-PBSを2mL添加して洗浄を行い、除去した後にATP試薬500μLを添加した。
Enspire(Perkinelmer社製)を用いて、発光値(RLU)の測定を行い、100×(マイクロプレート上のRLU)/(マイクロプレート中のRLU+キチンナノファイバー中のRLU)を算出することにより、剥離溶液による回収率を算出した。その結果、サンプル1及びサンプル2ではそれぞれ78%及び69%の細胞を回収することができた。一方、剥離溶液を処置しなかったコントロール群では回収率は5%であった。
以上の結果から、足場材を分解する試薬を使用することにより、浮遊培養された接着細胞を足場材から簡便に剥離させることができ、さらに、該剥離させた細胞を効率よく回収できることが示された。
(分散培養から細胞と足場材の分離および細胞回収までを一連した検討)
<<Step1:培養工程>>
培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞(C-12974、タカラバイオ社製)を、10000細胞/mLとなるように、上記調製例1で作製した0.01%(w/v)CNF培地組成物に播種した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート(コーニング社製、#3471)のウェルに1ウェル当たり10mLになるように4ウェル分注した。各プレートはCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置状態で培養し、5日間継続した。
<<Step2:基材と細胞の粗分離工程>>
培養後の懸濁液(40mL)を50mLコニカルチューブに回収し、遠心分離(300×g、3分間)を行い、上清(35mL)を除去した。つぎに、密度勾配調整液(Percoll PLUS、GEヘルスケア社製)(45mL)に10×PBS(-)(5mL)を加えることで得られた等張Percoll液(10mL)を加え、ピペッティングにより混合後、遠心分離(400×g、10分間)を行うことで、細胞が付着していない基材は沈殿し、基材に付着した細胞画分のみが上層に留まった。この上層(10mL)を50mLコニカルチューブに回収し、PBS(-)(40mL)を加え希釈後、遠心分離(400×g、3分間)を行い、上清(40mL)を除去することで洗浄した。
<<Step3:基材から細胞の剥離工程>>
つぎに、細胞剥離用酵素(Accumax、ナカライテスク社製)(10mL)を加え、CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)内にて静置することで基材から細胞を剥離した。
<<Step4:基材と細胞の分離・細胞回収>>
つぎに、得られた懸濁液に培地(10mL)を加えたものを50mLシリンジ(ニプロ社製)に充填し、市販品の一部材である骨髄液ろ過フィルター(カネカ社製)の一端に接続後、下部から上部方向に送液し、続けて、培地を25mL充填した50mLシリンジに着け替え、下部から上部方向に送液し、上部の流路から出てきた培地全量(約40mL)を50mLコニカルチューブに回収した。これを遠心分離(300×g、3分間)を行い、上清(35mL)を除去することで濃縮し細胞を回収した。Step1から4の各工程で得られた懸濁液の顕微鏡写真を図18に示す。
10 分離室
10a 第1室
10b 第2室
20 分離用網状構造
F 分離用網状構造の網の目を通過するときの液体の進行方向
Fv 進行方向Fの鉛直上向きの方向成分
Claims (10)
- 微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を分離するための分離デバイスであって、
当該分離デバイスは分離室を有し、該分離室は、第1室と第2室とを少なくとも有し、第1室と第2室は分離用網状構造(分離用網状構造がその網状構造の表面において意図的な***を備えるものを除く)によって仕切られており、当該分離デバイス内に入った前記懸濁液中の液体が、第1室から前記分離用網状構造を通過して第2室へと移動し、その後、当該分離デバイスから出て行くように、内部流路が構成されており、
前記分離用網状構造は、前記分離対象物の通過を抑制し、かつ、通過対象物の通過を許容するように、予め定められた大きさの網の目を持っており、
前記懸濁液中の液体が前記網の目を通過するときの該液体の進行方向が鉛直上向きの方向成分を有するように、前記分離室中に前記分離用網状構造が配置されており、ここで、
前記懸濁液中の液体が液体培地であり、前記分離対象物が、足場材と接着性細胞を分離する試薬によって液体培地中で細胞から剥離した足場材であり、通過対象物が、足場材から剥離した接着性細胞であり、ここで、
前記足場材が、非水溶性多糖類からなるナノファイバーであり、
前記接着性細胞が、イヌ腎臓尿細管上皮細胞(MDCK細胞)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、及び間葉系幹細胞(MSC)からなる群から選択される細胞である、
前記分離デバイス。 - 前記分離用網状構造がシート状であるか、または、袋の形状を有する、請求項1に記載の分離デバイス。
- 第1室が、
前記懸濁液を、外部から第1室に流入させるための第1の流入ポートと、
洗浄液または試薬を、外部から第1室に流入させるための第2の流入ポートと、
分離対象物を、第1室から外部に流出させるための流出ポートと
を有する、請求項1または2に記載の分離デバイス。 - 第2室は、第1室の上に位置し、
第1室は、前記懸濁液を外部から流入させるための流入ポートを少なくとも有し、該流入ポートは第1室の側壁に設けられている、
請求項1~3のいずれか1項に記載の分離デバイス。 - 前記流入ポートの中心軸線は、第1室の室内の全高さの40%以上の高さに位置する、請求項4に記載の分離デバイス。
- 第2室の上に、上方へと積層された1以上の部屋を分離室としてさらに有し、
前記1以上の部屋のうちの第2室に隣接する部屋と、第2室とは、さらなる分離用網状構造によって仕切られ、
前記1以上の部屋が2以上の部屋である場合には、上下に隣接する部屋同士は、さらなる他の分離用網状構造によって仕切られ、
より上方に位置する分離用網状構造の網の目ほど、前記分離対象物の通過をより抑制するように、該網の目の開口面積がより小さくなっている、
請求項4または5に記載の分離デバイス。 - 前記懸濁液には、前記液体と共に前記分離用網状構造を通過させるべき固体の通過対象物が含まれており、
前記通過対象物の通過を許容するように、最も上に位置する分離用網状構造の網の目の大きさが予め定められている、
請求項6に記載の分離デバイス。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載の分離デバイスを用い、
微細な足場材を用いた接着性細胞の浮遊培養によって得られた懸濁液から、該懸濁液中に含まれた固体の分離対象物を分離する方法。 - 前記懸濁液には、前記分離デバイスの分離用網状構造を前記液体と共に通過させるべき固体の通過対象物が含まれており、
前記分離用網状構造は、前記分離対象物の通過を抑制し、かつ、前記通過対象物の通過を許容するように、予め定められた大きさの網の目を持っており、
該分離用網状構造を通過する前記通過対象物を回収する工程を有する、
請求項8に記載の方法。 - 前記懸濁液中の液体が、前記分離デバイスの分離用網状構造を通過するときの流速が、0.01mm/秒~25mm/秒である、請求項8または9に記載の方法。
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