JP2023124468A - 細胞分離装置および細胞分離方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞とマイクロキャリアーとの分離を効率的に行うことが可能な細胞分離装置および細胞分離方法を提供する。【解決手段】細胞とマイクロキャリアーとを含む懸濁液を処理して、細胞とマイクロキャリアーとを分離する細胞分離装置１０であって、濾材によりマイクロキャリアーを細胞から分離する分離デバイス１１と、分離デバイス１１に懸濁液を供給する供給経路１２と、分離デバイス１１によりマイクロキャリアーが除去された後の細胞を含む懸濁液を回収する回収経路１３と、懸濁液の圧力を検知する圧力センサー１５と、圧力センサー１５で検知した圧力の変化に応じて供給経路１２を通じた懸濁液の供給を制御する制御部１６と、を備える。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞分離装置および細胞分離方法に関する。

微生物、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などの大量培養は、医薬品、食品、化粧品や、これらの原材料などとして有用な各種物質の生産に広く用いられている。例えば、多細胞生物に由来する全能性幹細胞等、付着依存性（足場依存性）を有する細胞を培養する場合は、他の細胞または細胞外基質の代わりとなる足場の確保が必要になることがある。

培養容器等の培養面に細胞を付着させる接着培養方式では、培養面積の制約から、細胞の収量が低い問題がある。培養液中に細胞を浮遊させる浮遊培養方式では、培養液の体積に応じて収量を増加させることが可能になる。しかし、培養液中での細胞の過剰な凝集を抑制するには、細胞死を起こさない程度の撹拌により培養液に剪断力を加える等の複雑な制御が必要になる。

接着培養方式と浮遊培養方式の利点を兼ね備えた培養方式として、培養液中で浮遊することが可能な足場材（マイクロキャリアー）を用いたマイクロキャリアー培養方式が提案されている。この方式では、細胞が足場材に付着した状態で、培養液に浮遊させることができる。このため、付着依存性を有する細胞の培養制御が容易になる。

しかし、マイクロキャリアー培養方式では、マイクロキャリアーが混在した状態となるため、培養細胞の利用に支障となる場合がある。このため、細胞を培養した後には、マイクロキャリアーから細胞を剥離する工程と、細胞を含む懸濁液からマイクロキャリアーを除去する工程とが必要になる。例えば、特許文献１、２には、多孔質メッシュまたは網状構造によって区画された容器を備える細胞分離装置が提案されている。

特表２０１８－５３７９９３号公報 国際公開第２０２０／０５４７５５号

多孔質メッシュ、網状構造等の濾材を用いた細胞分離装置を用いて細胞を含む培養液を濾過すると、マイクロキャリアーと細胞とを分離することができる。しかし、例えば濾材に多量のマイクロキャリアーが付着したときに、細胞が濾材を通過しにくくなり、細胞の回収が停滞するおそれがある。さらに、濾材の目詰まりにより濾過中の培養液の圧力が高まると、細胞がダメージを受けるおそれがある。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞とマイクロキャリアーとの分離を効率的に行うことが可能な細胞分離装置および細胞分離方法を提供することを課題とする。

前記課題を解決するため、本発明は、細胞とマイクロキャリアーとを含む懸濁液を処理して、前記細胞と前記マイクロキャリアーとを分離する細胞分離装置であって、濾材により前記マイクロキャリアーを前記細胞から分離する分離デバイスと、前記分離デバイスに前記懸濁液を供給する供給経路と、前記分離デバイスにより前記マイクロキャリアーが除去された後の前記細胞を含む懸濁液を回収する回収経路と、前記懸濁液の圧力を検知する圧力センサーと、前記圧力センサーで検知した圧力の変化に応じて前記供給経路を通じた前記懸濁液の供給を制御する制御部と、を備えることを特徴とする細胞分離装置を提供する。

前記圧力センサーは、前記供給経路に配置されていてもよい。
前記分離デバイスにおいて、前記懸濁液が前記濾材に対して上向きに流れてもよい。
前記回収経路は、前記回収経路から前記分離デバイスに逆洗浄液を供給する経路を備えてもよい。
前記供給経路は、前記分離デバイスの逆洗浄を実施した後の前記逆洗浄液を回収する経路を備えてもよい。
前記供給経路と前記回収経路との間で、前記分離デバイスが並列に複数設置されていてもよい。

また、本発明は、細胞とマイクロキャリアーとを含む懸濁液を処理して、前記細胞と前記マイクロキャリアーとを分離する細胞分離方法であって、濾材により前記マイクロキャリアーを前記細胞から分離する分離デバイスと、前記分離デバイスに前記懸濁液を供給する供給経路と、前記分離デバイスにより前記マイクロキャリアーが除去された後の前記細胞を含む懸濁液を回収する回収経路と、前記懸濁液の圧力を検知する圧力センサーと、を用いて、前記圧力センサーで検知した圧力の変化に応じて前記供給経路を通じた前記懸濁液の供給を制御することを特徴とする細胞分離方法を提供する。

本発明によれば、圧力の変化に応じて懸濁液の供給を制御することにより、細胞とマイクロキャリアーとの分離を効率的に行うことが可能になる。

実施形態の細胞分離装置の一例を示す概略図である。

以下、好適な実施形態に基づいて、本発明を説明する。

例えばマイクロキャリアーを用いて細胞を培養して得られる培養液は、細胞がマイクロキャリアーに付着した状態で浮遊している。蛋白質分解酵素や非酵素性剥離剤等の細胞剥離剤を培養液に添加することにより、マイクロキャリアーに対する細胞の接着が解離されて、細胞を液中に浮遊させることができる。これにより得られた懸濁液は、細胞とマイクロキャリアーとを含む。実施形態の細胞分離装置は、細胞剥離処理後の懸濁液を処理して、細胞とマイクロキャリアーとを分離することができる。

以下の説明では、分離デバイス１１で処理される前の、細胞とマイクロキャリアーとを含む懸濁液を「分離前懸濁液」という場合がある。また、分離デバイス１１によりマイクロキャリアーが除去された後の細胞を含む懸濁液を「分離後懸濁液」という場合がある。単に「懸濁液」というときは、分離前懸濁液、分離後懸濁液、および分離デバイス１１内で処理中の懸濁液を包含する場合がある。

図１に、実施形態の細胞分離装置１０の一例を示す。細胞分離装置１０は、濾材を用いてマイクロキャリアーを細胞から分離する分離デバイス１１と、分離デバイス１１に分離前懸濁液を供給する供給経路１２と、分離デバイス１１によりマイクロキャリアーが除去された後の分離後懸濁液を回収する回収経路１３と、を概略として備えている。

供給経路１２および回収経路１３における懸濁液の送液方法は特に限定されないが、例えば、供給経路１２側にポンプ１４を設置し、供給経路１２側から分離前懸濁液を加圧することが好ましい。分離前懸濁液を加圧することにより、懸濁液の流量を増加して、処理時間を短くすることができる。他の送液方法としては、懸濁液の自重による流下、回収経路１３側からの吸引等が挙げられる。

分離デバイス１１は、懸濁液中のマイクロキャリアーを細胞と分離するため、濾材を含む。濾材は、マイクロキャリアーの通過を阻止すると共に、細胞を通過させることが可能である。マイクロキャリアーが濾材に捕捉されても構わないが、マイクロキャリアーが濾材から離れた状態で回収可能であることが好ましい。

分離デバイス１１は、供給経路１２に接続された入口１１ａと、回収経路１３に接続された出口１１ｂとを有する。供給経路１２と回収経路１３との間で、分離デバイス１１が並列に複数設置されていてもよい。

入口１１ａから出口１１ｂへの流れの向きは、特に限定されないが、上向きでもよく、下向きでもよく、横向きでもよく、斜め上向きでもよく、斜め下向きでもよい。分離デバイス１１の内部で、流れの向きが一様であってもよい。分離デバイス１１の内部で、流れの向きが例えば折れ線状、螺旋状、クランク状、放射状等に変化してもよい。

分離デバイス１１中の流れが下向き、横向き、斜め下向きである場合は、懸濁液中の細胞および液体が流れる方向に沿って重力が作用するので、細胞を流すのに必要な運動エネルギーを抑制することができる。しかし、濾材に阻止されたマイクロキャリアーが濾材に捕捉されやすい。

分離デバイス１１中の流れが上向きまたは斜め上向きの場合は、流れを維持するために懸濁液に運動エネルギーを付与する必要がある。しかし、懸濁液中の細胞および液体が流れる方向に抗して重力が作用するので、濾材に捕捉されたマイクロキャリアーが濾材から離れて、分離デバイス１１の入口１１ａ側に沈降しやすくなる。これにより、マイクロキャリアーの目詰まりを抑制することができる。

マイクロキャリアーが濾材から離れやすくするためには、分離デバイス１１において、懸濁液の流れの向きが濾材に対して上向きであればよい。例えば、懸濁液が濾材に流入する面が下向きまたは斜め下向きとなるように、濾材が配置されていてもよい。分離デバイス１１における流れの向きが、入口１１ａ側から一旦は下向きに誘導された後、濾材に向けて上向きに誘導されてもよい。さらに、濾材を通過するときに上向きとされた流れが、出口１１ｂに向けて下向きに誘導されてもよい。

分離デバイス１１中の流れが上向き等の場合であっても、濾材に捕捉されたマイクロキャリアーの量が多くなる等により、細胞を含む液が濾材を通過しにくくなる場合がある。また、何らかの原因で流れが停滞することにより、供給経路１２から分離デバイス１１に供給される懸濁液の流量に比べて、濾材を通過する液の流量が低下すると、供給経路１２内の圧力が増加する場合がある。

供給経路１２内の圧力が増加すると、供給経路１２を通じて供給されている懸濁液中の細胞が損傷するおそれがある。あるいは、分離デバイス１１内においても、濾材より供給経路１２側の空間で圧力が増加し、供給経路１２内と同様の現象が起こるおそれがある。あるいは、濾材に目詰まりを起こしたマイクロキャリアーにより濾材の通路が狭くなると、細胞が狭い通路を通過する際に、損傷を受けるおそれがある。あるいは、細胞が濾材の狭くなった通路を通過できない状況で、圧力を受けることにより、損傷を受けるおそれがある。

細胞が圧力の変化等により損傷を受けると、損傷の程度により、細胞の機能が低下したり、細胞死を引き起こしたりするおそれがある。細胞の種類によっては、力学的ストレスに弱く、細胞が耐久可能な圧力が比較的低い場合がある。細胞が損傷して生じた結果は、しばしば回復できない場合があるため、細胞に損傷を与える要因は、事前に除去することが望まれる。

＜圧力センサー＞
実施形態の細胞分離装置１０は、懸濁液の圧力を検知する圧力センサー１５を備えている。図示例の細胞分離装置１０では、供給経路１２に配置した圧力センサー１５を第１圧力センサーＰ１とし、回収経路１３に配置した圧力センサー１５を第２圧力センサーＰ２としている。特に図示しないが、分離デバイス１１の濾材より入口１１ａ側または濾材より出口１１ｂ側に、圧力センサー１５を配置してもよい。

例えば、第１圧力センサーＰ１では、濾材に捕捉されたマイクロキャリアーの量が増加するにしたがって、供給経路１２の圧力が上昇する状況を観測することができる。細胞の損傷を抑制する観点で、供給経路１２の圧力に関して、許容される上限値等の閾値を設定することが好ましい。例えば、濾材が目詰まりを起こす前で、供給経路１２の圧力が通常の圧力よりも高く、細胞の損傷が顕著になる圧力よりも低い圧力を閾値としてもよい。

第２圧力センサーＰ２では、供給経路１２側と同様に回収経路１３側の圧力が上昇する場合には、回収経路１３の圧力に関して、許容される上限値を閾値として設定してもよい。例えば、濾材が目詰まりを起こす前で、回収経路１３の圧力が通常の圧力よりも高く、細胞の損傷が顕著になる圧力よりも低い圧力を閾値としてもよい。濾材の圧力損失等により、回収経路１３側の圧力が低下する場合には、回収経路１３の圧力に関して、許容される下限値を閾値として設定してもよい。

圧力センサー１５の方式は特に限定されないが、ダイヤフラム式、静電容量式、拡散式、抵抗線式、ピエゾ抵抗式等が挙げられる。細胞やマイクロキャリアーを含む懸濁液の圧力を測定するため、圧力センサー１５は、圧力検出部の滅菌、洗浄または交換が可能であることが好ましい。細胞やマイクロキャリアー等の浮遊物が圧力センサー１５の内部に侵入しにくいように、圧力検出部に対して流入口および流出口を設けて、懸濁液の流体部分のみを圧力センサー１５に導入してもよい。

＜制御部＞
実施形態の細胞分離装置１０は、圧力の変化に応じた懸濁液の供給を制御するため、制御部１６を有する。制御部１６は、第１圧力センサーＰ１または第２圧力センサーＰ２から選択される少なくとも一方の圧力センサー１５で検知した圧力の変化に応じて、供給経路１２を通じた分離前懸濁液の供給を制御する。

制御部１６は、圧力センサー１５等のセンサーから受信した情報に基づいて、機器を制御するため、コントローラー等の処理装置を備えてもよい。制御部１６は、記憶装置、入力装置、出力装置、処理用プログラム等を備えてもよい。制御部１６を用いることにより、自動制御が可能になる。圧力センサー１５を用いた懸濁液の供給制御は、手動の操作で行うことも可能である。制御信号の送受信方式は特に限定されないが、無線でも有線でもよい。

圧力の変化に応じて、分離前懸濁液の供給を制御する方法は、圧力の変化に応じた方法であれば特に限定されないが、懸濁液の供給を停止する方法、懸濁液の流量を削減する方法、懸濁液の流速を低下させる方法などが挙げられる。細胞への影響を抑制する観点からは、徐々に懸濁液の流量を削減しながら、状況に応じて、懸濁液の供給を停止させてもよい。適切でない圧力の変化が継続する場合は、細胞分離装置１０を点検させるため、作業員等に警報を発する等の通知機能を設けてもよい。

懸濁液の供給量を低下させている間に、マイクロキャリアーが濾材から外れる等して、圧力が正常な方向に近づく傾向を示すことも考えられる。このような場合は、懸濁液の供給を停止しないまま、懸濁液の流量を、細胞分離処理における通常の供給量まで増加させてもよい。

分離デバイス１１中の細胞の流れが上向きまたは斜め上向きの場合は、マイクロキャリアーを沈降させることにより、濾材の機能を回復させることができる。そこで、懸濁液の供給を停止または抑制した後、分離デバイス１１の下部等から過剰なマイクロキャリアーを排出してもよい。

懸濁液の流量の削減および供給の停止は、例えばポンプ１４の動作を制御してもよく、供給経路１２に設けられたバルブＶ１を制御してもよい。このバルブＶ１は、分離前懸濁液を貯留した懸濁液容器２１から供給経路１２への流路を制御するバルブである。バルブＶ１は、分離前懸濁液の流れを開状態と閉状態の２通りから選択する機能を有してもよく、分離前懸濁液の流量を段階的または連続的に変更する機能を有してもよい。

第２圧力センサーＰ２を省略して、第１圧力センサーＰ１で検知した圧力の変化に応じて、懸濁液の供給を制御してもよい。第１圧力センサーＰ１を省略して、第２圧力センサーＰ２で検知した圧力の変化に応じて、懸濁液の供給を制御してもよい。第１圧力センサーＰ１および第２圧力センサーＰ２で検知した圧力の変化に応じて、懸濁液の供給を制御してもよい。

＜洗浄機能＞
供給経路１２は、懸濁液容器２１から分離前懸濁液を供給する経路とは別に、洗浄液を供給する洗浄液経路２３を有してもよい。

洗浄液としては、特に限定されないが、細胞を分散させる分散媒として適当な溶液を用いることが好ましい。適宜の緩衝液（バッファー）を洗浄液として用いることができる。液体培地等の成分を洗浄液に含有させてもよい。洗浄液は、細胞を含有しない液であることが好ましく、細胞およびマイクロキャリアーを含有しないことがより好ましいが、マイクロキャリアーを含む洗浄液を使用することも可能である。

図示例の洗浄液経路２３は、洗浄液を貯留した洗浄液容器２２から供給経路１２へと合流している。洗浄液経路２３には、洗浄液の流れを制御するバルブＶ２が配置されることが好ましい。バルブＶ２は、洗浄液の流れを開状態と閉状態の２通りから選択する機能を有してもよく、洗浄液の流量を段階的または連続的に変更する機能を有してもよい。

懸濁液容器２１から分離前懸濁液を分離デバイス１１に供給する間には、バルブＶ２を閉状態に設定する等して、洗浄液経路２３を供給経路１２から分離することが好ましい。洗浄液を分離デバイス１１に供給する間には、バルブＶ２を開状態にすると共に、懸濁液容器２１に通ずるバルブＶ１を閉状態に設定することが好ましい。

洗浄液は、供給経路１２に分離前懸濁液を供給して分離デバイス１１で処理した後で、供給経路１２に供給されることが好ましい。これにより、分離デバイス１１、供給経路１２、回収経路１３等の途中に残留した細胞があれば、細胞を洗浄液で洗い流し、懸濁液と同様に処理して回収することができる。

供給経路１２に細胞およびマイクロキャリアーが残留しているときは、洗浄液により、細胞と共にマイクロキャリアーも洗い流される。このとき、洗浄液は、細胞とマイクロキャリアーとを含む懸濁液となる。分離前懸濁液と同様にして、細胞およびマイクロキャリアーを含む洗浄液を分離デバイス１１に通すことにより、分離後懸濁液と同様にして、マイクロキャリアーを分離し、細胞を含む洗浄液を回収することができる。

特に図示しないが、懸濁液容器２１から供給経路１２に分離前懸濁液を供給して分離デバイス１１で処理した後に、懸濁液容器２１を取り外し、洗浄液容器２２に入れ替えることも可能である。この場合は、供給経路１２が洗浄液容器２２に接続された箇所から、洗浄液経路２３を兼ねることができる。

供給経路１２の途中に洗浄液経路２３を接続する代わりに、分離デバイス１１に直接、洗浄液経路２３を接続することも可能である。この場合は、供給経路１２中の残留物を洗浄することはできないが、分離デバイス１１中の残留物を洗浄することは可能である。また、シリンジ等の器具を用いて、供給経路１２または分離デバイス１１に洗浄液を供給することも可能である。

＜細胞回収＞
図示例の細胞分離装置１０では、回収経路１３は、分離後懸濁液を貯留する細胞回収容器３１を備える。細胞回収容器３１には、回収された細胞の生存や保存に資する物質を貯留または供給してもよい。

回収経路１３には、分離デバイス１１と細胞回収容器３１との間の所望の位置に、バルブＶ３を配置してもよい。このバルブＶ３は、回収経路１３から細胞回収容器３１への流路を制御するバルブである。バルブＶ３は、分離後懸濁液の流れを開状態と閉状態の２通りから選択する機能を有してもよく、分離後懸濁液の流量を段階的または連続的に変更する機能を有してもよい。

分離前懸濁液または洗浄液を分離デバイス１１に供給する間には、バルブＶ３は開状態に設定される。細胞分離処理が終了した後は、バルブＶ３を閉状態に設定することが好ましい。また、例えば分離デバイス１１または供給経路１２の異常時において、細胞回収容器３１に回収されている細胞への影響を回避するため、一時的にバルブＶ３を閉状態にしてもよい。

＜逆洗浄機能＞
回収経路１３は、回収経路１３から分離デバイス１１に逆洗浄液を供給する逆洗浄液供給経路３３を備えてもよい。

逆洗浄液としては、特に限定されないが、逆洗浄液が細胞に触れたり、逆洗浄操作後に逆洗浄液が分離デバイス１１等に残留したりする場合を考慮して、適当な液体を用いることが好ましい。例えば、適宜の緩衝液（バッファー）を逆洗浄液として用いることができる。液体培地等の成分を逆洗浄液に含有させてもよい。

逆洗浄液は、マイクロキャリアーを含有しないことが好ましく、細胞およびマイクロキャリアーを含有しないことがより好ましい。逆洗浄液が洗浄液と同一の組成を有してもよく、異なる組成でもよい。逆洗浄液が洗浄液と同種の成分を含有してもよく、異なる成分を含有してもよい。

図示例の逆洗浄液供給経路３３は、逆洗浄液を貯留した逆洗浄液供給容器３２から回収経路１３へと合流している。逆洗浄液供給経路３３には、逆洗浄液の流れを制御するバルブＶ４が配置されることが好ましい。バルブＶ４は、逆洗浄液の流れを開状態と閉状態の２通りから選択する機能を有してもよく、逆洗浄液の流量を段階的または連続的に変更する機能を有してもよい。

分離前懸濁液または洗浄液を分離デバイス１１に供給する間には、バルブＶ４を閉状態に設定する等して、逆洗浄液供給経路３３を回収経路１３から分離することが好ましい。逆洗浄を行うときは、バルブＶ４を開状態にすると共に、細胞回収容器３１に通ずるバルブＶ３を閉状態に設定することが好ましい。

逆洗浄液を用いた逆洗浄では、分離デバイス１１の出口１１ｂ側から逆洗浄液が濾材に供給される。細胞分離処理における分離前懸濁液とは逆方向に逆洗浄液を流すことにより、濾材に付着したマイクロキャリアーや細胞等を濾材から遊離させることができる。

閉鎖された雰囲気で細胞分離処理を実施する場合は、分離デバイス１１に供給された逆洗浄液を、適宜の容器に誘導して回収することが好ましい。例えば供給経路１２は、分離デバイス１１の逆洗浄を実施した後の逆洗浄液を回収する逆洗浄液回収経路２５を備えることが好ましい。

図示例の細胞分離装置１０では、供給経路１２から分岐する逆洗浄液回収経路２５を通じて、逆洗浄液回収容器２４が設けられている。分離デバイス１１の入口１１ａ側から供給経路１２に逆流させた逆洗浄液は、出口１１ｂ側から逆洗浄液回収容器２４に回収される。

バルブＶ１，Ｖ２を閉状態にしてから逆洗浄液を逆洗浄液回収容器２４で回収することにより、懸濁液容器２１または洗浄液容器２２に対する逆洗浄の影響を回避することができる。また、逆洗浄液回収容器２４に回収された細胞の状態が良好であれば、再び細胞分離処理に供することにより、細胞の収量に貢献させることができる。

逆洗浄液回収経路２５には、逆洗浄液の流れを制御するバルブＶ５が配置されることが好ましい。バルブＶ５は、逆洗浄液の流れを開状態と閉状態の２通りから選択する機能を有してもよく、逆洗浄液の流量を段階的または連続的に変更する機能を有してもよい。

分離前懸濁液または洗浄液を分離デバイス１１に供給する間には、バルブＶ５を閉状態に設定する等して、逆洗浄液回収経路２５を供給経路１２から分離することが好ましい。逆洗浄を行うときは、バルブＶ５を開状態にすると共に、バルブＶ１，Ｖ２を閉状態に設定する。

特に図示しないが、回収経路１３の途中に逆洗浄液供給経路３３を接続する代わりに、分離デバイス１１に直接、逆洗浄液供給経路３３を接続することも可能である。分離デバイス１１の濾材よりも出口１１ｂ側から逆洗浄液を供給することにより、濾材の逆洗浄を実施することができる。また、シリンジ等の器具を用いて、回収経路１３または分離デバイス１１に逆洗浄液を供給することも可能である。

また、供給経路１２の途中に逆洗浄液回収経路２５を接続する代わりに、分離デバイス１１に直接、逆洗浄液回収経路２５を接続することも可能である。分離デバイス１１の濾材よりも入口１１ａ側から逆洗浄液を排出することにより、濾材を逆洗浄した後の逆洗浄液を回収することができる。

＜気泡検出機能＞
供給経路１２は、懸濁液の気泡を検出する気泡検出センサー１７を備えてもよい。分離前懸濁液中に気泡が含まれている場合は、気泡が濾材等で滞留することにより、濾材における懸濁液の流れを停滞させるおそれがある。気泡検出センサー１７が気泡を検出した場合は、圧力センサー１５で検知した圧力の変化にかかわらず、供給経路１２を通じた分離前懸濁液の供給を制御することが好ましい。

気泡検出センサー１７の気泡検出方式は特に限定されないが、光学式、超音波式などの非接触式が好ましい。チューブ等で形成される流路の外側から、検査光または超音波を照射し、流路内を気泡が通過するときと液体が通過するときとの差を検出することで、気泡の有無を検知することができる。

気泡の検出に応じて、分離前懸濁液の供給を制御する方法は、特に限定されないが、懸濁液の供給を停止する方法、懸濁液の流量を削減する方法、懸濁液の流速を低下させる方法などが挙げられる。細胞への影響を抑制する観点からは、徐々に懸濁液の流量を削減しながら、状況に応じて、懸濁液の供給を停止させてもよい。気泡の検出が継続する場合は、細胞分離装置１０を点検させるため、作業員等に警報を発する等の通知機能を設けてもよい。

気泡検出センサー１７は、供給経路１２に洗浄液経路２３が合流する位置よりも懸濁液容器２１に近い側に設置してもよく、供給経路１２に洗浄液経路２３が合流する位置よりも分離デバイス１１に近い側に設置してもよく、洗浄液経路２３に設置してもよい。分離デバイス１１の入口１１ａに近い箇所に気泡検出センサー１７を設置すると、供給経路１２の途中で気泡が発生しても、分離デバイス１１に流入する前に気泡を検知することができる。

＜細胞分離処理の詳細＞
分離デバイス１１の詳細は特に限定されないが、濾材として、シート状のメッシュ、チューブ状のメッシュ、袋状のメッシュ、線材を編んで網の目状としたメッシュ等が挙げられる。フィルム、シート、チューブ等に多数の貫通孔を形成して、メッシュ状としてもよい。

濾材の材質は特に限定されないが、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリエステル、ナイロン等のポリアミド、ステンレス等の金属などが挙げられる。フレキシブルな濾材を用いてもよく、剛直な濾材を用いてもよい。少なくとも細胞分離処理中は、分離デバイス１１に濾材を収容する容器に対して、濾材が固定されていることが好ましい。分離デバイス１１は、濾材の交換が可能であることが好ましい。

分離デバイス１１の入口１１ａと出口１１ｂとが同一の直線上にあってもよく、入口１１ａの中心軸と出口１１ｂの中心軸が平行にずれていてもよく、入口１１ａと出口１１ｂが異なる方向であってもよい。入口１１ａが２つ以上に分かれていてもよく、また、出口１１ｂが２つ以上に分かれていてもよい。分離デバイス１１の入口１１ａ付近の形状は、入口１１ａから断面積が広がるテーパー状であってもよい。分離デバイス１１の出口１１ｂ付近の形状は、出口１１ｂに向けて断面積が狭くなるテーパー状であってもよい。

マイクロキャリアーとしては、特に限定されないが、培養液中で浮遊が可能であることが好ましい。マイクロキャリアーが無撹拌で培養液に浮遊可能でもよく、撹拌速度に応じて浮遊可能な運動エネルギーを得てもよい。培養液の撹拌方式は特に限定されないが、振とう培養でもよい。マイクロキャリアーの比重が、培養液の比重より小さくてもよく、培養液の比重より大きくてもよい。マイクロキャリアーが多孔質、カプセル、中空糸等であってもよい。

マイクロキャリアーは、ナノファイバー等の繊維状足場材でもよく、マイクロビーズ等の粒子状足場材でもよい。繊維状足場材は、短径に対する長径の比率（アスペクト比）が、例えば２以上でもよく、２～５００程度でもよく、１０～３００程度でもよい。粒子状足場材は、アスペクト比が例えば２以下でもよく、１～１．５程度でもよい。マイクロキャリアーの粒子径は特に限定されないが、例えば０．１μｍ～１０ｍｍ程度で適宜選択してもよい。

マイクロキャリアーの材質は特に限定されないが、セルロース、ヘミセルロース、キチン、キトサン、デキストラン、アガロース、アルギン酸塩等の多糖類；コラーゲン、ゼラチン等の蛋白質；ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、シリコーン等の合成ポリマー；ガラス、シリカ、アルミナ等の無機物などが挙げられる。

マイクロキャリアーの表面は、細胞の種類、培養条件等に応じて、被覆材を用いてコーティングしてもよい。被覆材としては、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン等のタンパク質が挙げられる。ポリマーからなるマイクロキャリアーの場合は、表面のポリマーの化学処理により、アミノ基、エポキシ基、カルボキシル基、ホルミル基等の官能基を付与してもよい。マイクロキャリアーに磁性体を含めて、磁気的にマイクロキャリアーの浮遊状態を制御可能にしてもよい。

細胞剥離剤としては、特に限定されないが、トリプシン、プロテアーゼ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヌクレアーゼ等の酵素；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）等のキレート化合物などが挙げられる。細胞剥離剤が１種の物質から構成されてもよく、２種以上の物質から構成されてもよい。細胞剥離処理は、培養容器内で実施してもよく、培養容器から細胞およびマイクロキャリアーを取り出した後に実施してもよい。

細胞分離装置１０に用いられる各容器の構成は特に限定されず、硬質のボトル、タンク等でもよく、フレキシブルなバッグ、パウチ等であってもよい。ここで容器としては、分離デバイス１１で濾材を収容する容器、懸濁液容器２１、洗浄液容器２２、逆洗浄液回収容器２４、細胞回収容器３１、逆洗浄液供給容器３２が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

容器の形状は特に限定されないが、円柱状、円錐状、角柱状、角錐状、扁平状、球状等が挙げられる。容器の材質としては、特に限定されないが、樹脂、ゴム、エラストマー、金属、ガラス等が挙げられる。容器がフレキシブルな場合は、容器の周囲を硬質の外装容器で支持してもよい。

フレキシブル容器の材質は特に限定されないが、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）等のポリオレフィン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル、ナイロン等のポリアミドなどが挙げられる。外装容器の材質としては、特に限定されないが、樹脂、ゴム、エラストマー、金属、ガラス等が挙げられる。

それぞれの容器には、注入口、注出口、給気管、排気管、センサー類、温度調節装置等を設けてもよい。容器の容量は特に限定されないが、試験的な小スケールから、生産用の大スケールまで、所望のスケールに対応することが可能である。

細胞分離装置１０に用いられる各流路の構成は特に限定されず、フレキシブルなチューブ、ホース等でもよく、硬質のパイプ等でもよい。各流路の材質としては、樹脂、ゴム、エラストマー、金属等が挙げられる。流路には、フィルター、フローモニター、流量計、温度調節装置等の適宜の機器を設けてもよい。ここで流路としては、例えば、供給経路１２、回収経路１３、洗浄液経路２３、逆洗浄液回収経路２５、逆洗浄液供給経路３３が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

容器と流路との間を接続する箇所、あるいは、流路の途中で直列または並列にチューブ等の流路を接続する箇所などでは、ポート、コネクタ等の接続器具を用いてもよい。無菌接続が可能な無菌接続ポート、無菌コネクタ等を用いることが好ましい。

流路に設けるバルブの構成は特に限定されないが、操作性、信頼性、利便性、処理量等の観点から適宜選択することができる。フレキシブルなチューブ、ホース等の流路に対しては、流路を外側から圧縮して閉鎖するピンチバルブを用いてもよい。ここでバルブとしては、上述のバルブＶ１，Ｖ２，Ｖ３、Ｖ４，Ｖ５が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

流路に設けるポンプの構成は特に限定されないが、操作性、信頼性、利便性、処理量等の観点から適宜選択することができる。フレキシブルなチューブ、ホース等の流路に対しては、流路を外側から圧縮する動作により、内容液に動力を付与するチューブポンプを用いてもよい。

培養される細胞等の培養物としては、特に限定されないが、菌類、細菌類、ウイルス、酵母、藻類、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などが挙げられる。培養細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞等の細胞株でもよく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞、神経幹細胞等の幹細胞でもよく、分化させた組織細胞などであってもよい。

細胞の培養方式としては、回分培養、流加培養、灌流培養などが挙げられる。マイクロキャリアーを用いた浮遊培養は、細胞およびマイクロキャリアーを培養容器に接着させない条件で、細胞をマイクロキャリアーに接着させた条件で培養される。浮遊培養に用いられる培地は、液体培地であることが好ましい。培地には、塩類、糖分、多糖類など適宜の成分を添加することができる。

実施形態の細胞分離装置１０を用いてマイクロキャリアーから分離される細胞は、当該マイクロキャリアーを用いて培養された細胞であることが好ましい。培養中とは異なるマイクロキャリアーが混在した懸濁液から細胞を分離する目的、またはマイクロキャリアー以外の浮遊物が混在した懸濁液から細胞を分離する目的でも、細胞分離装置１０を使用することができる。

細胞分離処理の対象となる細胞は、多細胞生物の細胞でもよく、単細胞生物の細胞でもよい。マイクロキャリアーから遊離させた細胞が、１個ずつ遊離されていてもよく、複数個の細胞を含む集団を形成していてもよい。

細胞分離処理に使用される容器、流路等は、必要に応じて滅菌処理が施される。滅菌方法としては、特に限定されないが、例えば、γ線、電子線、Ｘ線等の照射による放射線滅菌法、エチレンオキサイドや過酸化水素等を用いたガス滅菌法、熱水浸漬滅菌法、熱水シャワー滅菌法、高圧蒸気滅菌（オートクレーブ）法等が挙げられる。

以上、本発明を好適な実施形態に基づいて説明してきたが、本発明は上述の実施形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の改変が可能である。改変としては、各実施形態における構成要素の追加、置換、省略、その他の変更が挙げられる。

Ｖ１，Ｖ２，Ｖ３，Ｖ４，Ｖ５…バルブ、１０…細胞分離装置、１１…分離デバイス、１１ａ…入口、１１ｂ…出口、１２…供給経路、１３…回収経路、１４…ポンプ、１５…圧力センサー、１６…制御部、１７…気泡検出センサー、２１…懸濁液容器、２２…洗浄液容器、２３…洗浄液経路、２４…逆洗浄液回収容器、２５…逆洗浄液回収経路、３１…細胞回収容器、３２…逆洗浄液供給容器、３３…逆洗浄液供給経路。

Claims (7)

1. 細胞とマイクロキャリアーとを含む懸濁液を処理して、前記細胞と前記マイクロキャリアーとを分離する細胞分離装置であって、
   濾材により前記マイクロキャリアーを前記細胞から分離する分離デバイスと、
   前記分離デバイスに前記懸濁液を供給する供給経路と、
   前記分離デバイスにより前記マイクロキャリアーが除去された後の前記細胞を含む懸濁液を回収する回収経路と、
   前記懸濁液の圧力を検知する圧力センサーと、
   前記圧力センサーで検知した圧力の変化に応じて前記供給経路を通じた前記懸濁液の供給を制御する制御部と、を備えることを特徴とする細胞分離装置。
2. 前記圧力センサーは、前記供給経路に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞分離装置。
3. 前記分離デバイスにおいて、前記懸濁液が前記濾材に対して上向きに流れることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞分離装置。
4. 前記回収経路は、前記回収経路から前記分離デバイスに逆洗浄液を供給する経路を備えることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞分離装置。
5. 前記供給経路は、前記分離デバイスの逆洗浄を実施した後の前記逆洗浄液を回収する経路を備えることを特徴とする請求項４に記載の細胞分離装置。
6. 前記供給経路と前記回収経路との間で、前記分離デバイスが並列に複数設置されていることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞分離装置。
7. 細胞とマイクロキャリアーとを含む懸濁液を処理して、前記細胞と前記マイクロキャリアーとを分離する細胞分離方法であって、
   濾材により前記マイクロキャリアーを前記細胞から分離する分離デバイスと、
   前記分離デバイスに前記懸濁液を供給する供給経路と、
   前記分離デバイスにより前記マイクロキャリアーが除去された後の前記細胞を含む懸濁液を回収する回収経路と、
   前記懸濁液の圧力を検知する圧力センサーと、を用いて、
   前記圧力センサーで検知した圧力の変化に応じて前記供給経路を通じた前記懸濁液の供給を制御することを特徴とする細胞分離方法。

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