KR101910685B1 - 세포 수집 방법 및 시스템 - Google Patents
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Abstract
진동을 사용하여 3D 배양물로 성장하는 세포를 수집하는 방법이 제공된다. 이 방법은 상기 3D 매트릭스에 부착된 세포에 상기 매트릭스로부터 세포를 탈착시키기에 및 상기 탈착된 세포를 매트릭스 물질로부터 쏟아지게 하기에 충분한 진폭, 진동수 및 기간의 힘을 적용하는 것을 동반한다. 본 발명의 방법을 수행하는 장치가 제공된다.
Description
관련출원의 상호 참조
본 출원은 2011년 4월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/475,761호의 이익을 청구하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 참조함으로써 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 배양물로 성장된 세포를 수집하는 방법과 시스템에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 3차원 (“3D”) 기질 상에서 시험관 내에서 배양된 세포를 수집하는 방법과 시스템에 관한 것으로서, 충분한 진동수, 진폭 및 기간의 진동력을 적용하여 상기 세포를 상기 3D 매트릭스로부터 방출시켜서 세포들을 고 효율 및 높은 세포생존능과 활력을 가진 세포들을 고효율로 회수하는 방법과 시스템에 관한 것이다. 상기 진동력은 또한 세포 성장 전에 매트릭스에 세포를 종 배양하는 데 및 또한 3D 생물반응기 시스템에서 세포의 성장 동안 상기 3D 매트릭스를 통하여 배지를 효과적으로 혼합하는 데 사용될 수 있다.
포유 또는 인간 세포와 같은 세포군은 다양한 상이한 의학 조건들을 치료하는 데 유용한 생물학적 제제로서 의학에 점점 더 중요성이 커지고 있다. 예를 들어, 뇌, 심장, 뼈와 간과 같은 손상된 기관의 조직 재생, 및 골수 이식 (BMT)을 지원하는 것을 포함하는 다양한 의학적 적용에 대한 인간 세포의 치료적 가능성에 초점을 맞춘 상당한 관심이 있었다. 인간 세포의 한 종류, 성인 줄기세포는 조혈성 장애, 심장 질환, 파킨슨병, 알츠하이머 병, 뇌졸증, 화상, 근육성 이영양증, 자가면역 질환, 당뇨병 및 관절염과 같은 다양한 상태를 처리 및 치유하는 데 평가되었다.
관심의 대상이 되는 인간 세포의 다른 유형은 부착성 기질 세포 (“ASCs”)이다. ASCs는 골수, 지방조직, 태반, 또는 혈액으로부터 얻을 수 있는 이종군의 세포들이다. ASCs 및 시험관 내에서 조혈 줄기세포를 증식하는 데 이들을 사용하는 용도는 미국 특허 제6,911,201호에 설명되어 있고, 이는 참조함으로 그 전체가 포함된다.
임상 및 연구 목적용으로의 다양한 의학적 용도로 인하여, 대량의 ASCs를 필요로 하는 요구가 커지고 있다. 이러한 세포들을 사용하는 데에 대한 장애들은 대부분 조직에서 이러한 세포들의 제한된 양과 ASCs를 얻기 위한 과정에 연루된 불편함과 위험들로 인하여 부착성 기질 세포들의 정상적 발생 군을 많은 양으로 분리하는 기술적 어려움에 있다.
ASCs의 제한된 수의 문제에 대한 한 가지 해결책은 세포 확대를 허용하는 조건 하의 3D 배양 시스템에서 세포를 시험관 내 배양하는 것이다. 본 발명에 참조함으로 그 전체가 포함된 WO 2007/108003에는 ASCs를 확대한 방법 및 상기 세포를 치료에 사용하는 용도를 개시하고 있다. 3D 매트릭스에서 시험관 내 배양으로써 ASCs를 확대하는 것은 또한 WO 2010/026575에 개시되어 있고, 이는 본 발명에 참조함으로써 그 전체가 포함된다. 이러한 각 참조문헌에서, 3D 매트릭스에서 ASCs를 성장시킨 후, 상기 세포들은 그 세포 및 매트릭스를 완충액으로 여러 번 세척한 후, 세포를 가볍게 진탕하면서 트립신 트립신의 용액에 노출시킴으로써 상기 매트릭스로부터 방출하는 것을 포함하는 과정을 사용하여 수집된다.
이러한 참조문헌에 설명된 수집 과정이 증대된 ASCs를 3D 매트릭스로부터 회수할 수 있게 하는 반면, 상기 매트릭스의 특성들은 이 과정에서 부적절하다. 3D 매트릭스의 장점은 배양되고 있는 세포가 생체 내의 것과 닮을 수 있도록 다 잘할 수 있게 하는 3차원 미세 환경을 제공한다는 것이다. 매트릭스에서 3D 미세환경들이 배양된 세포의 성장과 증식을 촉진하지만, 그들은 또한 수집 과정에서 그로부터 세포를 떼어내기 어려운 내부 공간을 제공한다. 이러한 어려움은 그 세포를 매트릭스의 표면에 부착하도록 하는 배양된 세포에서 분비된 세포외 거대분자의 존재에 의해 뒤섞여 있다.
따라서, 생물반응기에서 사용된 3D 매트릭스로부터의 세포 회수의 효율을 향상시키는 세포 수집 방법이 요구된다.
일 관점에 따라서, 부착성 물질에 세포를 배양하여 상기 세포를 상기 부착성 물질에 부착시키는 단계, 세포를 탈착제에 노출시켜 상기 부착 물질로부터 분리시키는 단계, 상기 부착 물질을 일정 시간 동안 세포를 상기 부착물질로부터 방출하기에 충분한 진동수와 진폭에서 진동시키는 단계, 및 상기 세포를 수집하는 단계를 포함하는 배양물에서 성장한 세포를 수집하는 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 상기 방법은 방출된 세포를 상기 부착성 물질로부터 쏟아지게 하는 데 충분한 진동수와 진폭에서 소정의 시간 동안 상기 부착성 물질을 진동시키는 단계를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 부착성 물질은 세포가 부착하는 2차원 표면을 제공하며, 다른 구체예에서는, 상기 부착성 물질은 세포가 부착하는 3차원 매트릭스를 제공한다.
특정 구체예에서, 상기 3차원 매트릭스는 생물반응기 내에서 채워진 베드 내에 넣어져 있다. 특정 구체예에서, 상기 3차원 매트릭스 단일본 구조체(scaffold), 다중 비드, 다중 운반체, 마이크로섬유, 나노섬유 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 마이크로섬유 또는 나노섬유들은 직포 또는 부직포이다. 다른 구체예에서, 상기 비드들은 매끈하거나 다공성이다. 또 다른 구체예에서, 상기 마이크로섬유 또는 나노섬유들은 부직포이다.
특정 구체예에서, 상기 부착성 물질은 폴리에스터, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌, 폴리플루오로클로로에틸렌, 염화 폴리비닐, 불화 폴리비닐 수지, 폴리스티렌, 폴리설폰, 폴리우레탄, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 셀룰로스, 유리섬유, 세라믹 입자, 마트리젤, 세포외 매트릭스 성분, 콜라젠, 폴리 L 젖산, 덱스트란, 불활성 금속 섬유, 실리카, 나트론 유리, 보로실리케이트 유리, 키토산, 또는 섬유성 스폰지 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 셀룰로스는 셀룰로스 아세테이트. 다른 구체예에서, 상기 세포외 매트릭스 성분은 파이브로넥틴, 비트로넥틴, 콘드로넥틴, 또는 라미닌 중 하나 이상이다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 물질은 정전기적으로 하전되어 있다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 물질은 콜라젠 또는 젤라틴으로 피복되어 있다.
상기 방법의 특정 구체예에서, 상기 탈착제는 트립신, 파파인, 엘라스타제, 히알루로니다제, 콜라게나제 타입 1, 콜라게나제 타입 2, 콜라게나제 타입 3, 콜라게나제 타입 4, 디스파제, 또는 이의 조합이다. 특정 구체예에서, 상기 트립신은 재조합 트립신이다.
특정 구체예에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 특정 구체예에서, 상기 인간 세포는 부착성 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 부착성 세포는 부착성 기질 세포이다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 기질 세포의 기원은 태반, 지방조직, 또는 골수이다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 기질 세포의 기원은 태반이다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 기질 세포는 태반의 태아 또는 모체 부분 중 하나 또는 둘 다로부터 수득된다.
특정 구체예에서, 상기 부착성 물질은 실질적으로 직선적 왕복운동에 의해 진동된다. 또 다른 구체예에서, 상기 왕복 운동은 약 10 mm 내지 약 750 mm 사이의 진폭, 및 3 내지 6 Hz의 진동수를 가진다. 다른 구체예에서, 상기 왕복 운동의 기간은 약 1 초, 15 초, 30 초, 1 분, 2 분, 5 분, 10 분, 또는 20 분이다. 또 다른 구체예에서, 상기 왕복 운동의 진동수는 약 5 Hz이고 기간은 약 30 초 이하이다. 특정 구체예에서, 상기 진폭은 약 25 mm이다. 다른 구체예에서, 상기 실질적으로 직선인 왕복운동의 진폭은 부착성 물질의 포함하는 바스켓의 높이의 15-100%이다.
특정 구체예에서, 상기 수집된 세포는: 적어도 50%의 세포 생존능; b) 적어도 50%의 수집 효율; c) 0.5 이하의 활력 지표(vitality index); 또는 d) 이종성 세포군 중 하나 이상으로 특징된다. 다른 구체예들은 본 발명에서 개시된 방법들 중 임의의 것에 의해 수집된 세포를 포함한다.
다른 관점에서, 생물반응기의 용기 내에 3차원 매트릭스를 유체로 공급하는 단계, 상기 용기 내로 세포를 포함하는 조성물을 도입하는 단계, 상기 세포를 상기 매트릭스 전체에 걸쳐 혼합하기에 충분한 진동수와 진폭에서 특정 시간 동안 상기 매트릭스를 진동시키는 단계; 및 상기 진동을 중단하여 세포가 상기 매트릭스에 부착하게 하는 단계를 포함하는, 생물반응기에서 3차원 매트릭스로 세포를 심는 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 유체는 배양 배지이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 상기 배양 배지를 상기 매트릭스 전체에 걸쳐 혼합하기에 충분한 진동수와 진폭에서 특정 시간 동안 간헐적 진동을 상기 매트릭스에 적용함으로써 상기 생물반응이게서 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 3차원 매트릭스는 생물반응기 내의 채워진 베드에 둘러싸여 있다. 특정 구체예에서, 상기 3차원 매트릭스는 단일본 구조체, 다중 비드, 다중 운반체, 마이크로섬유, 나노섬유, 또는 이의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 마이크로섬유 또는 나노섬유는 직포 또는 부직포이다. 다른 구체예에서, 상기 비드는 매끈하거나 다공성이다.
특정 구체예에서, 상기 3차원 매트릭스는 부착성 물질을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 물질은 폴리에스터, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌, 폴리플루오로클로로에틸렌, 염화 폴리비닐, 불화 폴리비닐 수지, 폴리스티렌, 폴리설폰, 폴리우레탄, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 셀룰로스, 유리섬유, 세라믹 입자, 마트리젤, 세포외 매트릭스 성분, 콜라젠, 폴리 L 젖산, 덱스트란, 불활성 금속 섬유, 실리카, 나트론 유리, 보로실리케이트 유리, 키토산, 또는 섬유성 스폰지 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 셀룰로스는 셀룰로스 아세테이트이다. 다른 구체예에서, 상기 세포외 매트릭스 성분 파이브로넥틴, 비트로넥틴, 콘드로넥틴, 또는 라미닌 중 하나 이상이다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 물질은 정전기적으로 하전되어 있다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 물질은 콜라젠 또는 젤라틴으로 피복되어 있다.
특정 구체예에서, 상기 심겨진 세포들은 인간 세포이다. 특정 구체예에서, 상기 인간 세포들은 부착성 세포이다. 또 다른 구체예에서, 상기 부착성 세포는 부착성 기질 세포이다. 특정 구체예에서, 부착성 기질 세포의 기원은 태반, 지방조직, 또는 골수이다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 기질 세포의 기원은 태반이다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 기질 세포는 태반의 태아 또는 모체 부분의 어느 하나 또는 둘 다로부터 수득된다.
특정 구체예에서, 상기 3차원 매트릭스 실질적으로 직선적인 왕복 운동에 의해 진동된다. 또 다른 구체예에서, 상기 왕복 운동은 약 10 mm 내지 약 750 mm의 진폭 및 1 내지 3 Hz의 진동수를 가진다. 다른 구체예에서, 상기 왕복 운동의 기간은 약 1 초, 15 초, 30 초, 1 분, 2 분, 5, 분, 10 분, 또는 20 분이다. 또 다른 구체예에서, 상기 왕복 운동의 진동수는 약 1 Hz이고 기간은 약 30 초 이하이다. 특정 구체예에서, 상기 진폭은 약 25mm이다. 다른 구체예에서, 상기 실질적으로 직선적인 왕복 운동의 진폭은 상기 부착성 물질을 함유하는 바스켓의 높이의 15-100%인 거리이다.
다른 구체예는 용기 내의 부착성 물질, 및 상기 부착성 물질에 왕복 운동을 부여하는, 상기 왕복 운동의 진폭과 진동수를 조절하는 하나 이상의 제어물을 포함하는 진동자를 포함하는 것으로, 상기 진동자는 상기 부착성 물질 상기 부착성 물질에 부착된 세포가 부착성 물질로부터 탈착되게 하는 방식으로 진동하도록 고안된 장치에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 물질은 2D 매트릭스 또는 3D 매트릭스이고, 특정 구체예에서, 3D 매트릭스이다.
특정 구체예에서, 상기 장치는 생물반응기이다. 특정 구체예에서, 상기 생물반응기는 플러그 유동(plug flow) 생물반응기, 연속 교반 탱크 생물반응기, 정지 베드 생물반응기, 에어 리프트 생물반응기, 또는 세포 살포 관류이다. 특정 구체예에서, 상기 생물반응기는 채워진-베드 3차원 매트릭스를 포함하는 플러그 유동 생물반응기이고, 상기 왕복 장치는 상기 채워진 베드를 실질적으로 감싸는 바스켓을 포함한다.
상기 장치의 특정 구체예에서, 상기 3차원 매트릭스는 단일본 구조체, 다중 비드, 다중 운반체, 마이크로섬유, 나노섬유, 또는 이의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 마이크로섬유 또는 나노섬유는 직포 또는 부직포이다. 다른 구체예에서, 상기 비드는 매끈하거나 다공성이다. 상기 장치의 특정 구체예에서, 상기 3차원 매트릭스는 폴리에스터, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌, 폴리플루오로클로로에틸렌, 염화 폴리비닐, 불화 폴리비닐 수지, 폴리스티렌, 폴리설폰, 폴리우레탄, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 셀룰로스, 유리섬유, 세라믹 입자, 마트리젤, 세포외 매트릭스 성분, 콜라젠, 폴리 L 젖산, 덱스트란, 불활성 금속 섬유, 실리카, 나트론 유리, 보로실리케이트 유리, 키토산, 또는 섬유성 스폰지의 하나 이상을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 셀룰로스는 셀룰로스 아세테이트이다. 다른 구체예에서, 상기 세포외 매트릭스 성분는 파이브로넥틴, 비트로넥틴, 콘드로넥틴, 또는 라미닌 중 하나 이상이다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 물질은 정전기적으로 하전되어 있다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 물질은 콜라젠 또는 젤라틴으로 피복되어 있다.
특정 구체예에서, 상기 장치는 세포를 더 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 세포는 인간세포이다. 특정 구체예에서, 상기 인간세포는 부착성 세포이다. 또 다른 구체예에서, 상기 부착성 세포는 부착성 기질 세포이다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 기질 세포의 기원은 태반, 지방조직, 또는 골수이다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 기질 세포의 기원은 태반이다. 특정 구체예에서, 상기 부착성 기질세포는 태반의 태아 또는 모체 부분 중 어느 하나 또는 둘 다로부터 수득된다.
특정 구체예에서, 상기 장치의 진동자는 실질적으로 직선적인 왕복 운동을 상기 부착성 물질에 부여한다. 또 다른 구체예에서, 상기 왕복운동은 약 10 mm 내지 약 750 mm의 진폭과 1 내지 6 Hz의 진폭을 가진다. 다른 구체예에서, 상기 왕복 운동의 기간은 약 1 초, 15 초, 30 초, 1 분, 2 분, 5 분, 10 분, 또는 20 분이다. 또 다른 구체예에서, 상기 왕복 운동의 진동수는 약 5 Hz이고 기간은 약 30 초 이하이다. 특정 구체예에서, 상기 진폭은 약 25 mm이다. 다른 구체예에서, 실질적으로 직선적인 왕복 운동의 진폭은 상기 부착성 물질을 함유하는 바스켓의 높이의 15%-100%인 거리이다.
본 발명은 첨부 도면을 참조하여 예증적 방식으로만, 설명된다. 도면을 상세히 참조하여, 도시된 상세한 사항들은 예증의 방식이며 본 발명의 바람직한 구체예의 예증적 논의의 목적인 것이고, 본 발명의 원리와 개념적 관점의 가장 유용하고 용이하게 이해할 수 있는 설명이라고 믿어지는 것을 공급하는 것으로 제시되어 있다는 것을 강조한다. 이와 관련하여, 본 발명의 구조적인 상세한 사항을 본 발명의 기초적인 이해에 필요한 것보다 더 상세히 나타내기 위하여 어떠한 시도로 하지 않으며, 본 발명의 몇 개 형태가 실제 어떻게 구체화될 것인가를 당해 분야의 숙련자들에게 명확하게 나타내는 도면을 취하여 설명한다.
도 1A 및 1B는 3D 매트릭스를 함유하는 바스켓을 가진 반응기의 구체예을 나타낸다. 이러한 개방 시스템 구체예는 수집 단계를 위해서만 사용된다.
도 2는 바스켓을 가진 반응기의 다른 구체예를 나타낸다. 이러한 폐쇄-시스템 구체예는 배양 및 수집 단계 둘 다에 사용된다.
도 3은 폐쇄 시스템에 사용되는 용도의 바스켓을 가진 반응기를 나타내는 다른 구체예이다.
도 4A는 통합된 외부 벽을 가지지 않는 바스켓을 나타내는 바스켓 디자인의 일 구체예를 보인다. 도 4B는 도 4C의 절단도로서, 통합된 외부 벽을 가진 바스켓을 나타내는 바스켓 디자인의 다른 구체예를 보인다.
도 5는 반응기 내에 바스켓의 왕복운동에서 협력하는 바스켓 봉과 벨로우즈를 설명하는 반응기의 구체예의 측면도이다.
도 6은 밀봉 기작의 일 구체예를 보이는, 바스켓을 가진 반응기의 일부의 절단도를 나타낸다.
도 7은 반응기와 바스켓 디자인의 다른 구체예로서, 바스켓을 움직이는 왕복 수단과 협력하는 봉 밀봉 디자인을 절단도로 나타낸다.
도 8은 상기 바스켓을 왕복시키는 왕복 장치를 나타내는 구체예이다.
도 9A, 9B, 9C 및 9D는 왕복 장치의 구체예를 위에서 바라본 다양한 도면이다.
도 10은 표 1에 설정한 바와 같은 상이한 조건의 진폭과 진동수의 조건하에서 진동에 이해 수확한 세포에 대한 세포 농도 데이터를 나타낸다.
도 11은 개방 시스템에서 진동(25 mm 진폭, 6 Hz, 1 분)에 의해 3D 운반체로부터 수집한 세포에 대한 세포 농도 데이터를 나타낸다.
도 12는 MTT 분석법을 사용한 광학 밀도에 근거하여 결정된, 운반체로부터 수집 효율을 나타낸다. 상기 운반체들을 25 mm 진폭, 6 Hz에서 20 분간 진동시켜 세포를 탈착시켜, 98%의 수집 효율을 나타낸다.
도 13은 3 또는 6 Hz의 진동수에서 진동 (25 mm 진폭 1 분간)에 의해 3D 운반체로부터 수집한 세포에 대한 세포 농도 데이터를 나타낸다.
도 14는 MTT 분석법을 사용한 광학 밀도에 근거하여 결정된, 운반체로부터의 수집 효율을 나타낸다. 상기 운반체들을 25 mm 진폭에서 1 분간 3 또는 6 Hz에서 진동시켜 상기 세포를 탈착시켰다. 3 Hz에서의 수집 효율은 46%인 반면, 6 Hz에서의 수집효율은 79%였다.
도 15는 3 또는 6 Hz의 진동수를 사용한 진동에 의해 3D 운반체로부터 수집된 세포에 대한 활력 지표를 나타낸다.
도 16은 MTT 분석을 사용한 광학 밀도에 근거하여 결정된 운반체로부터의 수집 효율을 나타낸다. 세포는 교반 (14% 효율) 또는 진동 (87% 효율)에 의해 운반체로부터 수집되었다.
도 17은 동결보존 후 교반 또는 진동에 의해 수집된 세포의 생존능을 나타낸다.
도 18은 교반 또는 진동에 의해 수집된 세포에 대한 해동후 활력 지표를 나타낸다.
도 19는 커패시탄스 값으로 측정된, 진동수 및 수집 효율 간의 양성적인 관계를 증명한다. 최고 효율은 5 Hz의 진폭에서 얻어졌다.
도 20은 진동에 의해 수집된 세포의 수집 효율을 보이는 것으로서, 운반체의 샘플은 운반체를 보유하는 바스켓 내의 상이한 위치로부터 취하였다.
도 21은 3D 운반체에 대한 두 개 상이한 바스켓을 사용하여 진동에 의해 수집된 세포에 대하여 얻어진 수집 효율을 나타낸다.
도 22는 5 Hz의 진동수를 사용하는 진동에 의해 수집된 세포에 대한 진동 기간의 함수로서 세포 농도 (커패시탄스 값으로서 측정된)를 나타낸다.
도 23은 5 Hz의 진동수를 사용한 진동에 의해 수집된 세포의 진동 기간의 함수로서 세포 농도를 나타낸다.
도 24는 진동에 의해 수집된 세포의 수집 효율을 나타내는 것으로서, 운반체를 보유하는 바스켓 내의 상이한 위치로부터 운반체 샘플을 취한 것이다.
도 25는 진동에 의해 수집된 세포의 활력 지표를 나타내는 것으로서, 진동 기간은 최대 120 초까지 지속된다.
도 2는 바스켓을 가진 반응기의 다른 구체예를 나타낸다. 이러한 폐쇄-시스템 구체예는 배양 및 수집 단계 둘 다에 사용된다.
도 3은 폐쇄 시스템에 사용되는 용도의 바스켓을 가진 반응기를 나타내는 다른 구체예이다.
도 4A는 통합된 외부 벽을 가지지 않는 바스켓을 나타내는 바스켓 디자인의 일 구체예를 보인다. 도 4B는 도 4C의 절단도로서, 통합된 외부 벽을 가진 바스켓을 나타내는 바스켓 디자인의 다른 구체예를 보인다.
도 5는 반응기 내에 바스켓의 왕복운동에서 협력하는 바스켓 봉과 벨로우즈를 설명하는 반응기의 구체예의 측면도이다.
도 6은 밀봉 기작의 일 구체예를 보이는, 바스켓을 가진 반응기의 일부의 절단도를 나타낸다.
도 7은 반응기와 바스켓 디자인의 다른 구체예로서, 바스켓을 움직이는 왕복 수단과 협력하는 봉 밀봉 디자인을 절단도로 나타낸다.
도 8은 상기 바스켓을 왕복시키는 왕복 장치를 나타내는 구체예이다.
도 9A, 9B, 9C 및 9D는 왕복 장치의 구체예를 위에서 바라본 다양한 도면이다.
도 10은 표 1에 설정한 바와 같은 상이한 조건의 진폭과 진동수의 조건하에서 진동에 이해 수확한 세포에 대한 세포 농도 데이터를 나타낸다.
도 11은 개방 시스템에서 진동(25 mm 진폭, 6 Hz, 1 분)에 의해 3D 운반체로부터 수집한 세포에 대한 세포 농도 데이터를 나타낸다.
도 12는 MTT 분석법을 사용한 광학 밀도에 근거하여 결정된, 운반체로부터 수집 효율을 나타낸다. 상기 운반체들을 25 mm 진폭, 6 Hz에서 20 분간 진동시켜 세포를 탈착시켜, 98%의 수집 효율을 나타낸다.
도 13은 3 또는 6 Hz의 진동수에서 진동 (25 mm 진폭 1 분간)에 의해 3D 운반체로부터 수집한 세포에 대한 세포 농도 데이터를 나타낸다.
도 14는 MTT 분석법을 사용한 광학 밀도에 근거하여 결정된, 운반체로부터의 수집 효율을 나타낸다. 상기 운반체들을 25 mm 진폭에서 1 분간 3 또는 6 Hz에서 진동시켜 상기 세포를 탈착시켰다. 3 Hz에서의 수집 효율은 46%인 반면, 6 Hz에서의 수집효율은 79%였다.
도 15는 3 또는 6 Hz의 진동수를 사용한 진동에 의해 3D 운반체로부터 수집된 세포에 대한 활력 지표를 나타낸다.
도 16은 MTT 분석을 사용한 광학 밀도에 근거하여 결정된 운반체로부터의 수집 효율을 나타낸다. 세포는 교반 (14% 효율) 또는 진동 (87% 효율)에 의해 운반체로부터 수집되었다.
도 17은 동결보존 후 교반 또는 진동에 의해 수집된 세포의 생존능을 나타낸다.
도 18은 교반 또는 진동에 의해 수집된 세포에 대한 해동후 활력 지표를 나타낸다.
도 19는 커패시탄스 값으로 측정된, 진동수 및 수집 효율 간의 양성적인 관계를 증명한다. 최고 효율은 5 Hz의 진폭에서 얻어졌다.
도 20은 진동에 의해 수집된 세포의 수집 효율을 보이는 것으로서, 운반체의 샘플은 운반체를 보유하는 바스켓 내의 상이한 위치로부터 취하였다.
도 21은 3D 운반체에 대한 두 개 상이한 바스켓을 사용하여 진동에 의해 수집된 세포에 대하여 얻어진 수집 효율을 나타낸다.
도 22는 5 Hz의 진동수를 사용하는 진동에 의해 수집된 세포에 대한 진동 기간의 함수로서 세포 농도 (커패시탄스 값으로서 측정된)를 나타낸다.
도 23은 5 Hz의 진동수를 사용한 진동에 의해 수집된 세포의 진동 기간의 함수로서 세포 농도를 나타낸다.
도 24는 진동에 의해 수집된 세포의 수집 효율을 나타내는 것으로서, 운반체를 보유하는 바스켓 내의 상이한 위치로부터 운반체 샘플을 취한 것이다.
도 25는 진동에 의해 수집된 세포의 활력 지표를 나타내는 것으로서, 진동 기간은 최대 120 초까지 지속된다.
일 구체예에서, 본 명세서는 진동, 예를 들어, 제어된, 실질적으로 직선적인 왕복 운동에서 결과된 진동을 사용하여 시험관 내에서 배양된 세포를 수집하는 방법을 설명한다. 특히, 상기 세포는, 특정의 경우, 3차원 매트릭스인, 부착성 표면 상에서 배양된다. 본 발명자들은 진폭과 진동수 둘 다에 대하여 제어된 적절한 왕복 운동을 적용함으로써, 상기 부착성 물질에 부착되어서 자라는 세포가 높은 효율로 탈착되어, 당해 분야에 공지된 세포를 수집하는 기존의 방법에 비해 더 많은 양의 세포를 회수하는 결과를 낳는다는 것을 인지하였다. 다른 구체예에서, 본 명세서는 제어된 진동을 사용하여 시험관 내, 예를 들어, 생물 반응기에서 배양 전에 부착성 물질 상에 세포를 심는 것을 용이하게 하는 것을 기술한다. 또한, 제어된 진동을 사용하여 시험관 내에서 세포를 배양하면서 부착성 물질 전체에 걸쳐 배양 배지를 혼합하는 것을 용이하게 하는 것을 설명한다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 하나의 구체예는, 폐쇄된 시스템, 예를 들어, 상기 부착성 물질을 함유하는 용기 상에 왕복운동을 부여하기 위한 기기가 있는 생물반응기를 제공하는 장치여서, 본 명세서에서 설명된 방법들이 단일 기기에서 수행된다. 다른 구체예에서, 부착성 물질상에서 시험관내 배양된 세포를 수집하는데 사용되는, 개방 시스템이 설명된다. 다른 구체예에서, 상기 명세서는 여기서 설명된 방법을 실행하는 장치를 개시한다.
본 발명의 원리와 작동은 도면과 후속 설명을 참조하면 더 잘 이해될 수 있을 것이다. 본 발명의 적어도 하나의 구체예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 하기 설명에서 설정된 또는 실시예에 의해 예증된 상세한 사항에 그 적용에서 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 다른 구체예를 또는 다양한 방식으로 실행되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 문장 및 용어들은 설명의 목적을 위한 것이고 제한하는 것으로서 간주되어서는 안된다는 것을 이해하여야 한다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 진동에 의한 힘, 예를 들어, 조절되고 및 실질적으로 직선적인 왕복운동이 시험관 내에서 세포를 배양하기 위한 생물반응기 시스템에서 통상적으로 사용되는 바와 같이, 3D 매트릭스와 같은 부착성 물질 상에서 배양된 세포를 회수하는 데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 이들은 그러한 운반체로부터 세포를 물리적으로 분리하는 것이 두 개의 주요 힘에 의해 영향을 받는다는 것을 발견하였다:
1. 고 빈도 진동(3 내지 6Hz), 이는 운반체에 놓은 모멘트를 발생시켜 운반체의 다공성 매트릭스로부터 세포를 방출한다.
2. 저 빈도 진동(1 내지 3Hz), 이는 운반체의 내외부에 충분한 회전을 발생시키고 이럼으로써 저전단력으로 매우 유용하게 혼합하게 한다.
본 발명자들은 또한, 저빈도 진동으로부터 결과된 일정한 혼합이 세포를 운반체에 심도록 하며 또한 운반체 상에서 세포를 효과적으로 성장시키다는 것을 발견하였다.
진탕하기 위해 그래서 세포를 부착성 물질로부터 탈착시키기 위해 임펠러 또는 유사 기구를 사용하는 것은 당해 분야에 통상적인 것이다. 그러나, 임펠러를 사용하여 발행된 회전 흐름에 의해 부여된 전단력은 배양된 세포에 손상을 가할 수 있다. 본 발명자들은 제어된 왕복 운동을 사용함으로써, 세포에 부여된 전단력을 최소화하면서 부착성 물질로부터 세포를 수집하는 효율을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 특정 구체예에서, 더 적은 진동수와 조합하여 된 더 큰 진폭의 운동을 사용하는 것은 부착성 물질로부터 세포를 가장 효율적으로 방출하게 하면서, 방출된 세포의 온전성과 생존성을 보존한다. 특정 세포유형, 부착성 물질, 및 생물반응기용 용도에 따른 진동의 최적 진폭 및 빈도는 변할 수 있으나, 숙련자들은 본 명세서의 교시가 제시되는 바, 통상적인 시행착오에 의해 진동을 사용하여 세포를 수집하는 적절한 조건을 용이하게 결정할 수 있다.
3D 부착성 물질과 사용하는 것에 덧붙여, 본 명세서에서 설명된 방법들은 2차원인 부착성 물질과 사용될 수 있다. 진동 운동을 사용하여 세포를 수집하는 데 요구되는 조건은 부착성 물질의 성질에 따라 달라질 것이고, 본 명세서의 교시에 기반하여 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 파괴될 부착점이 세포와 세포가 배양되는 용기 사이에만 있는 2D 부착성 물질로부터 세포를 수집하는 것과 달리, 3D 부착성 물질로부터 세포를 수집하는 것에 있어서는, 배양 시스템에서 성장 매개변수에 의존하는 방식으로 형성되는 세포외 매트릭스로부터 세포를 탈착시키는 것이 또한 필요하다. 예를 들어, 성장 주기가 연장되면, 더 짧은 성장 주기에 비해 더 많은 세포외 매트릭스의 형성이 나타나게 되고, 상이한 수집 조건이 요구된다.
따라서, 부착성 물질 상에 왕복 운동을 부여하도록 사용되는 장치는 제어될 수 있어서 왕복 운동의 진폭, 빈도 및 기간이 성장의 임의의 주어진 조건에 대하여 효율적인 세포 수집을 제공하도록 조절될 수 있고, 그 와중에 또한 왕복 운동에 의해 발생된 힘으로부터 나타나는 세포로의 손상에 대한 가능성을 제한한다. 세포 손상의 가능성에 대하여, 본 명세서에서 설명된 방법들은, 힘들이 더 짧은 기간 동안 세포에 적용되고 이럼으로써 시험관 내 배양 동안, 특히 수집 동안 노출되는 세포에의 스트레스 양을 감소시키기 때문에 당해 분야의 통상적인 방법에 비해 유리하다.
본 명세서에서 설명된, 하나의 장치 또는 생물 반응기 시스템에서 세포를 심고, 배양하고 및 수확하게 하는,“폐쇄 시스템”구체예는 효율 면에서 및 모든 단계가 하나의 기구 내에서 수행되게 함으로써 수집된 세포의 오염 가능성을 최소화 시킨다는 면에서 유용한 장점을 제공한다.
일 구체예에서, 3D 배양 시스템에서 배양함으로써 확대된 세포, 더 상세하게는, 확대된 포유동물 세포, 예를 들어, 태반, 지방조직, 또는 골수로부터 기원된 세포를 수집하는 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 진동을 사용하여 상기 매트릭스 내에 세포를 분배하여 세포를 3D 매트릭스 상에 심는다. 일 구체예에서, 진동은 세포가 매트릭스 내에 심어져서 그 매트릭스를 통해 배양 배지를 순환시킨 후에 사용된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 “확대하는” 및 “확대”는 세포 성장, 즉 세포 수의 증가 (예를 들어, 적어도 2 배)를 지칭하는 것으로 그러한 증가에 분화가 동반될 수도 되지 않을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, “세포”는 시험관 내에서 성장될 수 있는 임의의 포유동물 세포를 지칭한다. 특정 구체예에서, 상기 세포는 인간세포이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 “부착성 세포” 정박 의존성, 즉, 시험관 내에서 성장하기 위해 표면에 부착하는 것을 요구하는 세포의 동종 또는 이종군을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 “지방조직”은 지방 세포를 포함하는 결합 조직을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 “태반 조직”은 자궁 벽에 대어져 있고, 임신동안 태아를 발달시키며 여기에 탯줄에 의해 부착되는 포유동물 암컷 기관의 임의의 부위를 지칭한다. 출산 후, 상기 태반은 배출된다(그래서 출산 후 태반으로 지칭된다).
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 “3차원 배양 조건”은 세포 성장에 양립하며 및 세포 성장을 3차원으로 허용하는 매트릭스를 포함하는 조건하에서 세포가 성장되는 배양을 지칭한다. 이는 3차원 구조물로서 살아있는 유기체(또는 조직)에서의 세포의 그 위치 환경인 것으로 잘 이해된다. 세포는 다른 세포들에 둘러싸여 있다. 이들은 다양한 국소적인 미세 환경의 설정을 나타내는, 세포외 매트릭스 나노규모 섬유들의 복잡한 네트워크에 수용된다. 이들의 세포외 리간드들은 기저막으로의 부착뿐 아니라 다양한 혈관과 임파관들로의 접근을 매개한다. 산소, 호르몬 및 영양분들이 세포로 옮겨지고 폐기물은 세포로부터 치워진다.
특정 구체예에서, 상기 부착성 물질은 3D 배양으로 고안되어서, 이에 의해 조직 (예, 태반)의 하부구조를 모사하기 위해 세포의 응집용으로 이용가능한 부착 표면을 실질적으로 증가시키는 성장 매트릭스를 제공한다.
다른 구체예에서, 상기 3D 매트릭스에서의 섬유들은 공극 부피를 40 내지 95%의 총 부피의 백분율 및 10 미크론 내지 400 미크론의 공극 크기를 형성한다. 다른 구체예에서, 상기 매트릭스는 60 내지 95 %의 총 부피의 백분율로서 공극 부피를 가진다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, “심는다”는 것은 세포를 상기 부착성 물질, 예를 들어, 3D 매트릭스로 도입하여, 세포가 그 물질에 부착할 수 있게 하는 과정을 지칭한다. 특정 구체예에서, 세포를 생물반응기, 예를 들어, 정지상 프러그 유동 생물반응기로 심는 단계가 실행되지만, 상기 생물반응기에서의 유동은 심은 후에, 적어도 10 시간 동안 차단된다. 다른 구체예에서, 세포를 심는 것은 낮은 빈도의 진동, 예를 들어, 약 1 내지 3 Hz를 상기 부착성 물질을 함유하는 용기에 적용하여 상기 용기 내의 배지가 상기 부착성 물질 내에서 순환하게 함으로써 촉진된다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, “수집하는” 것은 2차원 또는 3차원 운반체로부터 세포를 제거하는 것을 뜻한다.
세포를 수집하는 특정 구체예에서, 상기 부착성 물질을 먼저 식염수 용액 또는 비견되는 용액으로 먼저 세척 (예, 2-3번) 한다. 세척 단계 후, 해리 단계를 상기 부착성 물질 상에 수행할 수 있다. 일 실시예에서, 적절한 해리 효소를 해리 단계 동안 사용한다.
다른 구체예에서, 상기 세척된 부착성 물질들은 상기 생물반응기에서 세척된다. 이미 언급한 대로, 이것은 폐쇄 시스템으로 지칭된다. 또 다른 구체예에서, 상기 세포가 배양된 상기 부착성 물질들을 수집 시스템의 바스켓으로 옮기고, 그 바스켓을 적절한 해리 효소가 함유된 용기에 두거나 그것으로 적당한 해리 효소를 첨가한다. 이것은 “개방 시스템”이다.
다른 구체예에서, 상기 부착성 물질들을 운반체를 함유하는 생물반응기의 바스켓을 왕복시키기 전 및/또는 시키는 동안에 세척한다. 또 다른 구체예에서, 상기 바스켓을 완전 세척 단계 동안, 세척 주기 동안 간간히, 및/또는 세척 주기의 시작이나 종말점에 왕복시킨다. 또 다른 구체예에서, 완전 해리 단계 동안에, 상기 해리 주기(예, 1 또는 2 또는 3 또는 4 분 주기) 간간히 및/또는 상기 해리 주기 시작 또는 종말점에서 상기 바스켓을 왕복시킨다.
일 구체예에서, 상기 채워진 베드를 왕복시키면서, 동시에 상기 채워진 베드를 실질적으로 정지 상태로 유지하여 하기 중 적어도 하나를 결과하게 한다: a) 적어도 80%의 세포 생존능의 (하기 실시예에서 설명된 방법에 의해); b) 적어도 80%의 수집 효율 (하기 실시예에서 설명된 방법에 의해); c) 0.5 이하의 활력 지표 (하기 실시예에서 설명된 방법에 의해); 및/또는 d) 세포 군의 이종성 조성을 유지하는 것(그래서 배양 단계에서의 세포 군의 이종성 집합이 수집 단계에서 세포 군의 이종성 집합과 실질적으로 유사하다). 다른 구체예에서, 상기 채워진 베드는 세포를 상기 부착성 물질로부터 방출하기에 충분한 진폭, 진동수 및 기간에서 실질적으로 직선적인 운동으로 왕복시킨다.
다른 구체예에서, 상기 채워진 베드를 왕복시키면서, 동시에 상기 채워진 베드를 실질적으로 정지 상태로 유지하여 적어도 70%의 세포생존능(하기 실시예에서 설명된 방법에 의해)을 얻는다. 다른 구체예에서, 상기 채워진 베드를 왕복시키면서 동시에 상기 채워진 베드를 실질적으로 정지 상태로 유지하여 적어도 60%의 세포생존능(하기 실시예에서 설명된 방법에 의해)을 얻는다. 다른 구체예에서, 상기 채워진 베드를 왕복시키면서, 동시에 상기 채워진 베드를 실질적으로 정지 상태로 유지하여 적어도 50%의 세포 생존능(하기 실시예에서 설명된 방법에 의해)을 얻는다.
여전히 다른 구체예에서, 상기 채워진 베드를 왕복시키면서, 동시에 상기 채워진 베드를 실질적으로 정지 상태로 유지하여 적어도 70%의 수집 효율(하기 실시예에서 설명된 방법에 의해)을 얻는다. 다른 구체예에서, 상기 채워진 베드를 왕복시키면서, 동시에 상기 채워진 베드를 실질적으로 정지 상태로 유지하여 적어도 60%의 수집 효율(하기 실시예에서 설명된 방법에 의해)을 얻는다. 다른 구체예에서, 상기 채워진 베드를 왕복시키면서, 동시에 상기 채워진 베드를 실질적으로 정지 상태로 유지하여 적어도 50%의 수집 효율(하기 실시예에서 설명된 방법에 의해)을 얻는다.
특정 구체예에서, 생물 반응기의 바스켓에 대한 왕복 조건은 약 10 mm 내지 약 750 mm (또는 이 범위 내의 적분 값)의 진폭이다. 또 다른 구체예에서, 생물 반응기의 바스켓에 대한 왕복 조건은 약 3 - 6 Hz (예, 4, 5), 또는 그 이상의 진동수이다. 다른 구체예에서, 상기 생물반응기 규모는 5 리터이고, 약 140 mm의 직경과 90 mm의 높이를 가질 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 생물반응기 규모는 14 리터이고, 약 200 mm의 직경과 130 mm의 높이를 가질 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 생물반응기 규모는 75 리터일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 생물반응기 규모는 150 리터일 수 있다. 다른 구체예에서, 생물 반응기의 바스켓에 대한 왕복 조건은 상기 바스켓 높이의 15-100%의 진폭이다. 다른 구체예에서, 상기 바스켓은 약 0.25, 0.5, 1, 5, 10, 20 분, 또는 이상 왕복되었다.
태반-유도 부착성 기질 세포는 태반의 태아(즉, 양막 또는 장막) 및 모체(즉, 기저 탈락막, 및 벽쪽 탈락막) 부분 둘 다로부터 얻을 수 있다. 따라서, 태반으로부터 나온 “모체” 부착성 기질 세포들은 태반의 모체 부분으로부터 나온 세포의 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95 %, 96%, 98%, 99% 또는 100%까지를 포함한다. 유사하게, “태아” 부착성 기질 세포는 태반의 태아 부분으로부터 나온 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98%, 99% 또는 100%까지의 부착성 세포를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이,“탈착제”는 세포 및, 이 세포가 부착되는 표면 사이의 부착 점을 파괴하는 것으로 작용하는 임의의 화합물이다. 특정 구체예에서, 상기 탈착제는 효소이다. 특정 구체예에서, 상기 효소는 트립신이고, 이는 재조합 트립신, 파파인, 엘라스타제, 히알루로니다제, 콜라게나제 타입 1, 콜라게나제 타입 2, 콜라게나제 타입 3, 콜라게나제 타입 4, 또는 디스파제를 포함한다.
모체-유도 및 태아-유도 부착성 기질 세포를 제조하고 특성화시키는 방법은 WO 2011/064669에 설명되어 있고, 이는 참조함으로써 통합된다. 특정 구체예에서, 모체 및 태아 태반 부착성 기질 세포들은 유전자형 및/또는 핵형(예, FISH 또는 G-밴딩) 분석에 기반하여 동정된다. 예를 들어, 암컷 배아의 태반에서 나온 부착성 기질 세포들은 핵형 분석에 기반하여 태아 및 모체 세포로 분리될 수 있다(즉, XX 세포들은 모체 출처이고 반면 XY 세포들은 태아 기원이다). 특정 구체예에서, 태반(예, 융모막 융모로 구성되거나 이를 포함하는)의 태아 부분에서 유래된 부착성 기질 세포들은 CD200를 발현한다. 즉, 음성 발현을 정의하기 위해 이소형 대조군을 사용하여 유동 세포계수법으로 측정시, 상기 세포의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 CD200를 발현한다. 특정 구체예에서, 음성 발현을 정의하기 위해 이소형 대조군을 사용하여 유동 세포계수법으로 측정시, 모체 부분으로부터 나온 상기 부착성 기질 세포의 3.5% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하가 CD200를 발현한다.
태반 부착성 세포들이 모체, 태아 또는 혼합된 모체와 태아-유도이건 간에 관계없이, 조직 시편들을 생리적 완충액(예, 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 행크액)에서 세척한다. 상기 조직을 소화 효소(아래 참조)로 처리하고 또는/및 세척 배지를 사용하여 상기 조직을 나일론 여과지를 통해 또는 부드럽게 피펫팅(Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA)으로 잘게 저미고 씻어내림으로써 단일 세포 현탁액을 만든다.
지방조직 유래 부착성 기질 세포는 당해 분야에 숙련자에게 공지된 다양한 방법으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 그러한 방법들은 미국 특허 제6,153,432호에 설명되어 있다. 상기 지방조직은 망막/내장, 유선, 생식선, 또는 다른 지방조직 부위로부터 유래될 수 있다. 지방조직의 바람직한 출처는 망막 지방이다. 인간에서, 상기 지방은 지방흡입으로 통상적으로 분리된다.
지방조직으로부터 분리된 부착성 기질 세포는 콜라게나제, 트립신 및/또는 디스파제와 같은 소화효소; 및/또는 히알루로니다제 또는 DNAse의 효과적인 농도; 및 에틸렌디아민테트라 아세트산 (EDTA)으로; 25 - 50 ℃의 온도에서, 10 분 내지 3 시간 동안 조직을 처리함으로써 유도될 수 있다. 다음, 세포를 20 미크론 내지 800 미크론의 나일론 또는 치즈천 메쉬 필터를 통과시킨다. 다음, 세포를 배지에 직접적으로, 또는 파이콜(Ficoll) 또는 퍼콜(Percoll) 또는 다른 특정 구배 상에서 차등 원심분리한다. 세포를 100 내지 3000 x g의 속도로 1 분 내지 1 시간 동안 4- 50℃에서 원심분리한다 (참조, 예를 들어, 미국 특허 제7,078,230호).
태반 또는 지방조직 유래 부착성 기질 세포외에, 다른 세포 원으로부터 나온 부착성 기질 세포를 사용할 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 상기 부착성 기질 세포는 골수에서 얻는다. 부탁성 기질 세포를 뽑을 수 있는 다른 조직원은, 제대혈, 모낭[예, 미국 특허 출원번호 20060172304에 설명된 바와 같이], 고환[예, Guan K., 등, Nature. 2006 Apr 27;440(7088): 1 199-203에 설명된 바와 같이], 인간 후각 점막[예, Marshall, CT., 등, Histol Histopathol. 2006 Jun;21 (6):633-43에 설명된 바와 같이], 배아 난황 주머니[예, Geijsen N, Nature. 2004 Jan 8;427(6970): 148-54에 설명된 바와 같은] 및 양수[Pieternella 등. (2004) Stem Cells 22: 1338-1345]를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 조직원으로부터 얻은 부착성 기질 세포는 부착성 표변 상에 세포를 배양하고, 그럼으로써 부착성 기질 세포를 최초 집합체의 다른 세포들로부터 분리하고, 이를 다음으로 본 발명에서 설명된 방법에 따라 수집한다.
기원(예, 태반, 지방조직, 또는 골수)에 관계없이, 세포를 가져오는 것은 일반적으로 멸균 조건하에서 수행된다. 일단 분리된 세포를 얻으면, 이들은 부착성 물질(예, 표면으로서 형상화되는)에 부착되도록 하고 그럼으로써 부착성 기질 세포를 분리한다. 이것은 3D 배양 조건에서 배양하기 전 또는 동시에 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, “부착성 물질”은 세포를 표면에 유지할 수 있는 화학적 구조(예, 하전된 표면 노출 기)를 가지는 비독성(예, 생물학적으로 양립할 수 있는) 합성물, 천연물 또는 이의 조합물을 지칭한다.
본 발명의 이러한 관점에 따라서 사용될 수 있는 부착성 물질들의 예는 폴리에스터, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌, 폴리플루오로클로로에틸렌, 염화 폴리비닐, 불화 폴리비닐 수지, 폴리스티렌, 폴리설폰, 폴리우레탄, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 셀룰로스, 유리섬유, 세라믹 입자, 마트리젤, 세포외 매트릭스 성분, 콜라젠, 폴리-L-젖산, 덱스트란, 불활성 금속 섬유; 실리카, 나트론 유리, 보로실리케이트 유리, 키토산, 또는 섬유성 스폰지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예에서, 상기 셀룰로스는 셀룰로스 아세테이트이다. 다른 구체예에서, 상기 세포외 매트릭스 성분은 파이브로넥틴, 비트로넥틴, 콘드로넥틴, 또는 라미닌 중 하나 이상이다. 또 다른 구체예에서, 상기 부착성 물질은 정전기적으로 하전되어 있다. 다른 구체예에서, 상기 부착성 물질은 콜라젠 또는 젤라틴으로 피복되어 있다.
특정 예에서, 상기 부착성 물질은 Fibra-Cel® 디스크(New Brunswick Scientific)이다. Fibra-Cei 디스크들은 폴리에스터 부직포 및 폴리프로필렌르로 구성되어 있다. Fibra-Cel 디스크들은 또한 정전기적으로 처리되어 디스크에 세포 부착과 상기 섬유 시스템에 포획되는 것을 용이하게 하며, 여기에서 세포들이 전체 과정을 통틀어 남아있게 된다. Fibra-Cel® 디스크들은 그람당 1200 cm2의 표면적 및 6 mm의 디스크 직경을 가진다.
본 발명에 따라 배양에 유용한 기초 배지의 비제한적 예는 이글의 최소필수 배지(Minimum Essential Medium Eagle), ADC-I, LPM(무 소혈청 알부민), FIO(HAM), F12(HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지(Fitton-Jackson 변형이 있거나 없는), 이글 기본 배지(BME-Earle의 염 베이스가 첨가된), 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM-무혈청), Yamane, IMEM-20, 글래스고 변형 이글 배지(GMEM), 라이보비츠 L-15 배지, 맥코이 5A 배지, 배지 Ml 99(M199E-Earle의 염 베이스 첨가), 배지 M 199(M 199H- 행크의 염 베이스 첨가), 이글의 최소 필수 배지(MEM-E-Earle의 염 베이스 첨가), 이글의 최소 필수 배지(MEM-H-행크의 염 베이스 첨가) 및 이글의 최소 필수 배지(MEM-NAA 비필수 아미노산 보유)를 포함하고, 무엇보다 배지 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401 , MCDB 41 1, MDBC 153를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 배지는 DMEM. 이러한 그리고 다른 유용한 배지들은 무엇보다 GIBCO, Grand Island, N. Y., USA 및 Biological Industries, Bet HaEmek, Israel에서 이용가능하다. 수많은 이러한 배지들은 Methods in Enzymology, Volume LVIII, “Cell Culture”, pp. 62 72, William B. Jakoby 및 Ira H. Pastan 편집, Academic Press, Inc 출판에서 집약되어 있다.
상기 배지는, 예를 들어, 소 또는 다른 종의 태아 혈청과 같은 혈청으로, 및 조건적으로 또는 대안적으로 성장 인자, 사이토카인 및/또는 호르몬(예, 성장 호르몬, 에리스포포에틴, 트롬보포이에틴, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 대식세포 콜로니 자극 인자, c-키트 리간드 /줄기 세포 인자, 오스테오프로테제린 리간드, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자, 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 모양체(cilary) 신경 영양 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 및 골형성 단백질을 피코그람/ml 내지 밀리그람/ml 수준의 농도에서 보충된다.
추가의 성분들이 배양 배지에 첨가될 수 있다는 것이 또한 인지된다. 그러한 성분들은 항생제, 항진균, 알부민, 아미노산, 및 세포 성장용으로 당해 분야에 공지된 다른 성분들일 수 있다.
부착성 기질 세포들은 통상적인 2차원(2D) 배양 조건에 의해 또는 3차원(3D) 배양 조건하에서 시험관 내 증식될 수 있다. 용어 “2차원 배양” 또는 “2D”는 조직 배양 접시에서와 같이, 세포가 일차적으로 하나의 평면에서 성장하는 배양을 지칭한다.
일단 부착성 기질 세포를 수득하면, 이들을 3차원 기구로 계대배양할 수 있다. 상기 세포들은 분리 즉시 3D-형상 매트릭스로 옮겨질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 3D 관점의 부착성 물질은 3D 배양용으로 구성되고, 이럼으로써 성장 매트릭스를 제공하게 되고, 이는 부착성 기질 세포의 부착용으로 이용가능한 부착 표면을 실질적으로 증가시켜 조직(예, 태반)의 하부구조와 닮게 된다. 본 발명을 실행할 수 있도록 사용되는 성장 매트릭스의 제조, 용도 및/또는 장점과 관련한 상세한 사항들은 미국 특허 제5,168,085호 및 5,266,476호에 설명되어 있고, 둘 다는 참조에 의해 본 발명에 통합된다. 특정 구체예에서, 상기 3차원 매트릭스는 단일본 구조체, 다중 비드, 다중 운반체, 마이크로섬유, 나노섬유, 또는 이의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 마이크로섬유 또는 나노섬유는 직포 또는 부직포이다. 다른 구체예에서, 상기 비드는 매끈하거나 다공성이다.
특정 구체예에서, 상기 부착성 물질은 용기 내에 있다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, “용기”는 물질이 담길 수 있는 임의의 저장소를 지칭한다. 특정 구체예에서, 상기 용기는 부착성 물질에 더하여 배양 배지와 같은 액체를 담는다. 특정 구체예에서, 상기 용기는 용기의 내외부로 액체를 통과시키는 입구와 출구를 가진다. 다른 구체예에서, 상기 부착성 물질은 용기 내에 있는 바스켓 내에서 담길 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 바스켓은 상기 바스켓 및 그 내용물에 진동 운동을 부여하도록 구성된 진동자와 작동적으로 연계되어 있다.
예를 들어, 높이가 0.5 mm인 성장 매트릭스에 대하여, 상기 성장은, 상기 성장 매트릭스 상에 돌출부에 의해 계산하면, 적어도 5 내지 30 배의 인수이다. 약 5 재지 30 배 인수의 그러한 성장은 단위 층 당이고, 만약 그러한 층들이 다수게 쌓여있거나 스페이서 등과 같은 것으로 분리되어 사용된다면, 5 내지 30 배의 인수는 그러한 각 구조당 적용된다. 상기 매트릭스가 시트 형태로 사용될 때, 이것은 부직포 섬유 시트, 또는 개방된 공극 폼 중합체의 시트일 수 있다. 상기 시트의 두께는 약 50 μm 내지 1000 μm, 내지 2000 μm, 내지 3000 μm, 또는 그 이상일 수 있고, 세포 입구용, 영양분 입구용, 및 시트로부터 폐기물의 제거용으로 적절한 다공성이 제공되어 진다. 일 구체예에 따라, 상기 공극은 10 μm 내지 400 μm의 유효 직경을 가진다. 그러한 시트들은 다양한 두께의 섬유로부터 제조될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 섬유 두께 또는 섬유 직경은 약 0.5 μm 내지 100 μm 범위일 수 있다. 예를 들어, 상기 섬유는 직경이 10 μm 내지 15 μm 범위일 수 있다. 예를 들어, 상기 섬유는 직경이 30 μm 내지 40 μm 범위일 수 있다. 예를 들어, 상기 섬유는 직경이 70 μm 내지 80 μm 범위일 수 있다.
본 발명의 구조물은, 치수의 안정성과 물리적 강도를 제공하는 다공성 지지체 시트 또는 스크린에 의해 지지되거나 다공성 지지체 시트 또는 스크린에 결합될 수 있다. 그러한 매트릭스 시트를 또한, 절단, 구멍을 내거나 조각내어 두께와 동일한 순서(약 50 μm 내지 3000 μm)를 가지면서, 약 0.2 mm2 내지 약 30 mm2, 0.2 mm2 내지 약 100 mm2, 0.2 mm2 내지 약 200 mm2의 순서의 돌출된 면적을 가진 입자를 제공할 수 있다.
상기 부착성 표면은 사각, 고리, 디스크, 및 십자형태로 구성된 군으로부터 선택된 모양을 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 배양은 3D 생물반응기에서 실행된다.
그러한 생물반응기의 예는 플러그 유동 생물반응기, 연속 교반 탱크 생물반응기 및 정지-베드 생물반응기를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 3차원(3D) 플러그 유동 생물반응기(미국 특허 제6,911,201호에 설명된 바와 같은)는 부착성 기질 세포의 성장을 지지하고 유지를 연장할 수 있다. 이러한 생물반응기에서, 부착성 기질 세포는, 폴리에스터의 부직포 매트릭스로 만들어진, 유리 컬럼에 채워진 다공성 운반체에 심겨져서, 많은 세포 수의 증식을 상대적으로 작은 부피에서 실행될 수 있다.
다른 3D 생물반응기를 본 발명에 사용할 수 있다. 다른 비제한적 예는 연속 교반 탱크 생물반응기이고, 여기서 배양배지는 생물반응기로 연속적으로 공급되고, 생성물은 연속적으로 배출되어 반응기 내에서 시간-일정 정상상태를 유지한다. 섬유성 베드 바스켓을 가진 교반된 탱크 생물반응기는, 예를 들어 New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ.로부터 이용가능하다. 다른 예는, 정지 베드 생물반응기, 에어 리프트 생물반응기[여기서 공기는 중앙 흡출관의 바닥으로 통상 공급되어, 방울을 형성하면서 위로 올라가서, 컬럼의 정부에서 가스를 배출한다], 다중활성 폼을 가진 세포 시딩 관류 생물반응기[Wendt, D. 등, Biotechnol Bioeng 84: 205- 214, (2003)에서 설명한 바와 같이], 및 방사-유동 관류 생물 반응기 내 관형 폴리-L-젖산 (PLLA) 다공성 구조체 생물반응기[Kitagawa 등, Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954 (2006)에서 설명된 바와 같은]를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 생물반응기들은 미국 특허 6,277,151, 6,197,575, 6,139,578, 6,132,463, 5,902,741 및 5,629,186에 설명되어 있다. 다른 구체예에서, 복수 개의 생물반응기들을 병렬적 또는 직렬적 방향으로 사용할 수 있다.
상기 생물반응기에서 사용된 매트릭스는, 예를 들어, 시트 형태일 수 있다. 이러한 시트는 부직포 시트 또는 개방 공극 폼 형성된 중합체의 시트일 수 있다. 시트의 두께는, 특정 구체예에서, 약 50 μm 내지 3000 μm 또는 이상의 범위이고, 세포 입구, 영양분 입구 및 시트로부터 폐기물 제거용으로 적절한 다공성이 제공된다.
특정 구체예에서, 세포를 심는 것은 심을 때 1,000-10,000 세포/cm2를 사용하여 수행된다.
3D 배양에서 부착성 세포를 배양하는 것은 배양 배지의 연속 흐름 하에서 수행될 수 있다. 또한 계대 배양하여 세포수를 증가시킬 수 있다. 배양 조건을 연장하고 향상시키기 위해 배양 배지를 교체할 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명의 구체예에 따라, 세포 배양은 배양 배지의 관류하에서 수행된다. 일반적으로, 관류속도는 부착성 세포의 배양 배지에서의 글루코스 농도에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명에 따라서, 배양 배지는 글루코스 농도가 약 500 mg/L, 약 550 mg/L; 또는 약 600 mg/L일 때 교환될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 배양 배지는 글루코스 농도가 200-1000 mg/L일 때 교환될 수 있다.
특정 구체예에서, 세포의 배양은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 20일, 또는 그 이상 동안 수행된다. 생물반응기에서의 배양은 이 기간을 연장시킬 수 있음이 이해될 것이다.
다른 구체예에서, 기질 세포 배양물의 부착성 기질 세포는 상기 부착성 물질의 입방 센티미터당 적어도 1,000개 세포 밀도로 배양된다. 다른 구체예에서, 기질 세포 배양물의 부착성 기질 세포는 상기 부착성 물질의 입방 센티미터당 적어도 5,000 개 세포밀도로 배양된다. 또 다른 구체예에서, 기질 세포 배양물의 기질 세포는 상기 부착성 물질의 입방 센티미터당 적어도 10,000개 세포 밀도로 배양된다. 또 다른 구체예에서, 기질 세포 배양물의 기질 세포는 상기 부착성 물질의 입방 센티미터당 적어도 20,000개 세포 밀도로 배양된다. 또 다른 구체예에서, 기질 세포 배양물의 기질 세포는 상기 부착성 물질의 입방 센티미터당 적어도 30,000개 세포 밀도로 배양된다. 또 다른 구체예에서, 기질 세포 배양물의 기질 세포는 상기 부착성 물질의 입방 센티미터당 적어도 40,000개 세포밀도로 배양된다. 다른 구체예에서, 세포는 입방 센티미터당 100,000개 세포 밀도로 배양한다.
다른 구체예에서, 세포는 2 내지 8 배 세포수 증대를 촉진하는 시간 동안 배양된다.
다른 구체예에서, 세포는 바이오매스 감시에 의해 평가된 용량에 따라 평가된 세포 밀도에 따라 수집된다.
다른 구체예에서, 세포는 글루코스 소비량(GCR)에 따라 평가된 세포 밀도에 따라 수집된다.
본 발명에서 설명된 방법에 의해 심어지고, 배양되고 및/또는 수집된 세포는 부착성 기질 세포(ASC)일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 세포는 방추상 모양을 가질 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 상기 세포는 부착성 기질 세포에 전형적인 마커 또는 수집 마커(예, 표면 마커)를 발현할 수 있다. 부착성 기질 세포 표면 마커(양성 및 음성)의 예는 CD105+, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD34-, CD45-, CD80-, CD19-, CD5-, CD20-, CD1 1B-, CD14-, CD19-, CD79-, HLA-DR-, 및 FMC7-을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 부착성 기질 세포 마커는 타이로신 하이드록실라제, 네스틴 및 H-NF를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 구체예에서, 골수(BM) 부착성 기질 세포가 3D 배양 시스템에서 배양되고, 본 발명에서 설명된 방법에 따라 수집된다. BM 세포는 임의의 공지된 방법으로 수득될 수 있다. 예를 들어, BM 세포는 개흉 수술 또는 BM 생검을 받는 혈액적으로 건강한 공여자의 흡입된 흉골 골수로부터 얻을 수 있다. 골수 흡입물은 예를 들어, HBSS(Hank's Balanced Salts Solution; GIBCO BRL/lnvitrogen, 게티스버그, 메릴랜드)에 3배 희석시키고 Ficoll-Hypaque(Robbins Scientific Corp. 서니베일, 캘리포니아) 밀도 구배 원심분리시킨다. 다음, 골수 단핵세포(<1.077 gm/cm3)를 수집하고, HBSS에서 3번 세척하고, 배양 배지[DMEM (Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel) 10% FCS (GIBCO BRL), 10-4 M 머캅토에탄올 (Merck, White House Station, 뉴저지), Pen-Strep-Nystatin 혼합물 (100 U/m l00 ug/ml: 1.25 un/ml; Beit Ha'Emek), 2 mM L-글루타민 (Beit Ha'Emek)이 보충된]에 재현탁시켰다. 개별 공여자로부터 얻은 세포를 조직 배양 플라스크에서 (Corning, Acton, MA)에서 배양 배지를 일주일 마다 교환하면서 개별적으로 37℃(5% C02)에서 배양한다. 세포를 0.25% 트립신-EDTA(Beit Ha'Emek)를 사용하여 매 3-4일 마다 분리한다. 2-40번 계대 배양후, 60-80% 콘플루언시에 달할 때, 세포를 3D 생물반응기에서 배양하기 위해 수집한다.
다른 구체예에서, 태반으로부터 얻은 세포를 3D 배양 시스템에서 배양하고 본 발명에서 개시된 방법에 따라 수집한다. 태반 세포는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 따라서 얻을 수 있다. 예를 들어, 세포를 만삭 분만 태반의 안쪽 부분으로부터 얻을 수 있다. 태반의 적당한 부분을 멸균하에서 자르고, 행크 완충액으로 3번 세척하고, 3시간 동안 37℃에서 0.1% 콜라제나제(1 mg/ml 조직; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 처리한다. 부드럽게 피펫팅하여, 현탁된 세포를 10% FCS, Pen-Strep-Nystatin 혼합물(100 U/ml: 100 ug/ml: 1.25 un/ml) 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 DMEM으로 세척하고, 75 cm2 플라스크에 넣고, 37 ℃에서 5 % CO2를 가진 습윤 조건하의 조직 배양기에서 배양한다. 다음, 세포를 72 시간 동안 플라스틱 표면에 부착시키고, 이 후 배지를 매 3-4일 마다 교환하였다. 60-80% 콘플루언시에 달할 때(통상 10-12일), 세포를 0.25 % 트립신-EDTA를 사용하여 배양 플라스크로부터 탈착시키고, 새로운 플라스크로 넣었다. 다음, 배양된 세포를 3D 생물반응기에서 배양하기 위해 수집한다.
또 다른 구체예에서, 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 지방조직으로부터 얻은 부착성 기질 세포는 3D 배양 시스템에서 성장시키고 본 발명에서 개시된 방법에 따라 수집된다. 예를 들어, 부착성 기질 세포는 지방흡입 과정으로부터 얻은 인간 지방조직으로부터 분리될 수 있다. 상기 지방조직을 동일한 부피의 PBS로 많이 세척하고 37℃에서 30분간 콜라제나제(20 mg/ml)로 절단시킨다. 다음 세포를 10% FCS, Pen-Strep-Nystatin 혼합물(100 U/ml. 100 ug/ml: 1.25 un/ml) 및 L-글루타민을 함유한 DMEM으로 세척하고, 1200rpm에서 10분간 실온에서 원심분리하고, 용혈 용액에 재현탁시키고(1:10; Biological Industries, Beit Ha'emek, Israel, 적혈구를 용혈하기 위해), 원심분리하고, 및 10% FCS, Pen-Strep-Nystatin 혼합물(100 U/ml: 100 ug/ml: 1.25 un/ml) 및 L-글루타민을 함유하는 DMEM에 재현탁하였다. 다음, 세척된 세포를 멸균 조직 배양 배지 플라스크에 3-10x107 세포/플라스크 밀도로 심는다. 다음날, 세포를 PBS로 세척하여 잔류 및 죽은 세포를 제거한다. 세포를 37 ℃에서, 5 % CO2를 가진 습윤 조건하의 조직 배양기에서 유지시킨다. 배지를 3일 내지 4일마다 교환한다. 60-80% 콘플루언시, 세포를 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 배양 플라스크로부터 탈착하고 새로운 플라스크에 심는다. 2-40번 계대배양 후, 세포가 60-80% 콘플루언시에 도달할 때, 세포를 3D 생물반응기에 배양하기 위해 수집한다.
임의의 생물반응기 시스템이 전술한 부착성 BM, 태반, 또는 지방 세포의 3D 배양에 적합하다. 예를 들어, 일 구체예에서, 미국 특허 번호 6,911,201호에 설명된 바와 같이, 플러그 유동 생물반응기를 사용할 수 있다. 이러한 생물반응기에, 예를 들어, 폴리에스터의 부직포 매트릭스로 만든, 채워진 3D 다공성 운반체(직경 4 mm) 1-100 ml를 적재한다. 이러한, 운반체들은 많은 세포 수를 비교적 작은 부피에서 증식시키게 한다. 상기 생물반응기를 37℃의 배양기에서 유지하면서, 유동속도를 밸브와 페리스태틱 펌프로 제어하고 감시한다. 상기 생물반응기는 세포를 순차적으로 심는 것을 가능하게 하는 샘플링 및 주입 포인트를 포함할 수 있다. 배양 배지는 임의의 적절한 pH, 예를 들어, pH 6.7-7.4에서, 그 저수원으로부터 공급될 수 있다. 상기 저수원은 공기/C02/N2/O2을 생물반응기 내의 세포 밀도에 따라, 상이한 비율로 포함하는 여과된 가스 혼합물에 공급될 수 있다. 상기 O2 비율은, 모니터에 의해 결정되는 바, 생물 반응기 출구에서 용해된 O2의 바람직한 수준을 달성하도록 조정될 수 있다. 상기 가스 혼합물은 실리콘 튜브 또는 확산기를 통해 저수원으로 공급될 수 있다. 배지의 순환은, 예를 들어, 페리스태틱 펌프에 의해 달성될 수 있다.
일 구체예에서, 전술한 바와 같이 배양된, 비-콘플루언트 일차 인간 부착성 기질 세포 2D 배양물(예를 들어, 전술한 BM, 태반, 또는 지방 세포)을 트립신화하고, 세척하고, 10% FBS, Pen-Strep-Nystatin 혼합물(100 U/ml: 100 ug/ml: 1.25 un/ml) 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM에서 재현탁하고, 및 멸균된 플러그 유동 생물반응기 내의 3D 운반체로 주입 포인트를 통해 심는다(103-105 세포/ml). 접종 전에, 상기 생물반응기를 PBS-Ca-Mg와 같은 적절한 완충액으로 채우고, 오토클래이브하고(120 ℃, 30 분) 및 10 % 열불활성화 우태아혈청 및 Pen-Strep-Nystatin 혼합물(100 U/ml: 100 ug/ml: 1.25 un/ml)을 포함하는 둘베코의 배양 배지로 세척한다. 생물반응기 내의 배지 흐름을 임의의 속도, 예를 들어, 0.1-5 ml/분의 속도로 조절할 수 있다. 매트릭스 내에 세포를 심는 과정은, 예를 들어, 배지 순환을 2-48 시간 멈추어 세포가 운반체에 정착하게 함으로써 달성될 수 있다. 상기 생물반응기는 제어된 온도(37 ℃) 및 pH 조건(pH = 6.7-7.8)에서; 필요시 멸균된 공기 및 CO2 가 공급된 배양기를 사용하여 유지될 수 있다. 배양 배지는 필요한 대로, 예를 들어, 일주일에 2-3번 교환된다. 순환 배지는 매 4 시간 내지 7일마다 신선한 DMEM 배지로 교환된다. 일단 세포가 적절한 농도로 배양된 후, 본 발명에서 설명된 방법에 따라 수집될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, “진동자”는 진동을 야기할 수 있는 장치를 뜻한다. “진동”은 약 평형점 대한 기계적 떨림을 의미한다. 이 진동은 주기적 또는 무작위적일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 진동은 진폭과 진동수에 대하여 제어된 왕복 직선 진동에 의한 것이다. 특정 구체예에서, 진동의 진폭과 진동수는 일정하고, 다른 구체예에서는 진폭 또는 진동수 중 하나 또는 둘 다 특정 결과를 얻기 위해 가변된다. 또 다른 구체예에서, 진동에 대한 기간은 또한 당해 분야에 통상적인 수단과 기구를 사용하여 조절된다. 특정 구체예에서, 상기 진동자는 전기기계적 장치, 예를 들어, 구동축 상에서 비균형적인 질량을 가진 전기 모터이다. 다른 구체예에서, 상기 진동자는 전기적 장치이다. 진동을 부여할 수 있는 장치는 당해 분야에 공지되어 있고, 본 발명에서 설명된 방법에 사용하기 적당한 방식으로 기존 진동기를 적용하는 것은 당해 분야의 기술 내에 있다.
진동 수집 시스템은 Pluristem에 의해 개발되었다. 진동 수집 시스템의 이러한 특정 구체예는 5 리터들이 생물반응기(New Brunswick Scientific)용으로 고안된 것이었고, 진동 시스템(도 9A-D에 도시된 바와 같이) 및 l00g의 FibraCel®을 담는 새롭게 고안된 바스켓(도 6에 나타난 바와 같이)으로 구성된다. 본 구체예에 있어서, 및 도 6을 참조하면, 바스켓은 정부 스크린과 바닥 스크린에 수직으로 위치한 벽을 포함하며, 각 스크린은 그 속에 천공을 가지고 있다. 상기 3D 매트릭스는 상기 벽과, 정부 및 바닥 스크린에 의해 둘러싸여 형성된 공간 내에 포함된다. 상기 스크린의 어느 하나 또는 둘 다는 상기 바스켓으로부터 제거되어 상기 3D 매트릭스를 포함하는 공간으로 접근할 수 있도록 고안될 수 있다. 상기 바스켓은 또한 바스켓의 둘레와 생물 반응기 관이나 용기 사이의 밀봉을 제공하는 바스켓 밀봉 씰을 포함한다. 도 4A 및 4B에 도시된 바와 같이, 상기 바스켓은, 중앙에 또는 떨어져서 위치된 하나 이상의 통로를 포함할 수 있고, 여기에 상기 생물반응기의 성분, 예를 들어, 배출관이나 임펠러가 위치할 수 있다.
바스켓에 복수 개의 바스켓 봉들이 부착되어 있는데, 이는 바스켓으로부터 생물반응기 관이나 용기의 외부로 연장되고, 이를 통해 상기 진동자와 연결된다. 본 구체예에서, 상기 용기는 바스켓 봉이 지나가는 홀을 가지고 있는 플레이트와 밀봉된다. 플레이트의 외부에서, 각 바스켓 봉은 진동자에 의해 부여된 왕복 운동을 수용하도록 및 오염물이 상기 관이나 용기로 들어가는 것을 방지하는 씰을 제공하도록 고안된 풀무를 통과한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 “약”은 ± 10 %을 지칭한다.
용어 “포함한다” “포함하는” “내포한다” “내포하는” 및 “가진다”는 것은 포함하지만 한정되지 않는다는 것을 의미한다.
용어 “구성되는”은 포함하지만 한정되지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 단수형 “하나”, “일” 및 “상기”는 명확하게 다르게 기술하지 않는 한 복수 참조물을 포함한다. 예를 들어, 용어 “일 화합물” 또는 “적어도 하나의 화합물”은 복수 개의 화합물을 포함하며, 이의 혼합물도 포함한다.
숫자 범위가 지적될 때마다, 지적된 범위 내의 임의의 인용된 수치 (분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 용어 “범위/” 처음 지시된 숫자와 두 번째 지시된 숫자 “사이의 범위” 및 “범위/” 및 처음 지시된 숫자부터 두 번째 지시된 숫자 “까지 범위”는 상호 교환적으로 사용되고, 처음 및 두 번째 지시된 숫자와, 그 들 사이의 분수와 정수 수치 모두를 포함하는 것을 의미한다.
실시예들
하기 실시예를 참조하며, 이는 전술한 설명과 더불어 본 발명을 비제한적 형식으로 설명한다.
일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어 및 본 명세서에서 사용된 실험실 방법은 분자적, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 그러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, 하기 참조 “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory 30 Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 번호4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057에 설정된 방법론; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E, ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980); 특허와 과학 문헌에 방대하게 설명된 이용가능한 면역분석법, 예를 들어, 하기 참조, 미국 특허 번호 3,791,932; 3,839, 153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J, ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and 10 Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) 및 “Methods in Enzymology” Vol. 1 -317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for 15 Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996).
3D 생물반응기에서의 세포 배양 성장 방법:
RALF 생물반응기 시스템을 사용하여 3D 배양으로 세포를 성장시켰다. 상기 RALF 생물반응기는 둥근바닥, 이중자켓 유리 용기로서 BioEngineering에서 만든 3.7 리터의 총부피를 가진다.
생물반응기에 심기 전에, 2D 단계로부터 180 ± 30 x 106 얻은 세포를 해동하고 배지 (10% FBS 및 25 mM HEPES를 가진 DMEM)에 1:3으로 희석시켰다. 샘플을 취하고, 세포를 트립판 블루 염색을 사용하여 계수하여 세포수와 생존능을 결정하였다. 세포 현탁액을 라미나 유동 후드 하에서 0.5 L 시딩 병으로 옮겼다. 이 시딩 병으로부터, 세포 현탁액을 멸균 튜브를 통해서 중력에 의해 생물반응기로 옮겼다.
상기 생물반응기는 1.8 ± 0.1 L 배지 (DMEM, 10% FBS 및 25 mM HEPES 함유) 및 30-40 그람의 운반체 (FibraCel® disks, New Brunswick Scientific)를 포함하였다. 이러한 운반체는 폴리에스터 및 폴리프로필렌으로 제조된다. 상기 생물반응기 내의 배지를 하기 조건에서 유지하였다: 37℃, 70% 용존 산소(“DO”) 및 pH 7.3. 여과된 가스(공기, CO2, N2 및 O2)를 상기 생물반응기의 제어 시스템에서 결정하는 대로 공급하여 DO 값을 70 %에서 및 pH 값을 7.3에서 유지하였다. 배지는 상기 운반체를 담고 있는 바스켓 위에 위치한 배출 포트를 가진 중공 임펠러 튜브에 의해 상기 생물반응기에서 순환한다. 세포-리프트 임펠러를 사용하는 것과 같이, 이러한 배출 포트를 회전시키면 임펠러 튜브의 바닥에서 낮은 차등 압력을 생성하게 되고, 이는 시스템 전체를 통틀어 배지를 순환시킨다.
처음 4 시간 동안, 배지를 분당 50 회전 (RPM)에서 교반하고, 2일째까지 200 RPM으로 증가시켰다. 처음 2-3 일간, 상기 세포를 배치 형식으로 배양시킨다. 배지 글루코스 농도가 550 mg/리터 이하로 감소될 때 관류를 개시하였다. 관류를 일일 기준으로 조정하여 글루코스 농도를 약 550 ± 50 mg/리터에서 일정하게 유지하였다. 매 1-2일 마다, 성장 배지의 샘플을 취하여 글루코스, 락테이트, 글루타민, 글루타메이트 및 암모늄 농도를 결정하였다(BioProfile 400 analyzer, Nova Biomedical). 세포를 생물반응기에서 6-7 일간 배양하였다.
해양형
임펠러를
사용하여 (
교반
) 3D 운반체로부터 수집:
성장 단계의 말(6-7 일)에 세포 수집 단계를 개시하였다. 상기 생물반응기 용기는 폐기물 용기까지 관을 통해 중력으로 비워져 있다. 헤드 플레이트를 제거하여 상기 용기를 개방하고, 운반체를 용기의 바닥에 놓았다. 상기 세포-리프트 임펠러를 멸균된 해양형 임펠러로 대체하였다. 상기 해양형 임펠러는 축방향 흐름을 생성하여 단일방향 흐름으로 인하여 세포 손상을 야기하지 않고 부드럽게 혼합하는 것을 요구하는 적용을 가능하게 한다.
다음, 상기 생물반응기 용기를 닫고, 1 리터 미리 가온된(37 ℃) PBS로 다시 채운다. 교반 속도를 200 RPM, 2 분으로 설정하였다. 다음, PBS를 압력 또는 중력으로 배관을 통하여 폐기물 명으로 배출한다. 세척 과정을 3 번 반복한다.
상기 운반체로부터 세포를 배출하기 위해, 미리 가온된(37 ℃) 재조합 트립신 용액 (TrypLE; GIBCO) 1 리터를 상기 생물반응기 용기에 첨가하고, 상기 운반체를 15 분간 항온처리하였다. 이 처리 동안, 상기 운반체를 매 5분마다에서, 1 분간200 RPM에서 교반하였다. 다음, 세포 현탁액을 200 ml FBS를 포함하는 2 리터 멸균 용기로 수집하였다. 이 단계는 미리 가열된(37℃) TrypLE를 사용하여 10 분간 반복하였다(운반체들은 4 분마다 1 분간 200 RPM에서 교반하였다). 운반체로부터 탈착된 세포를 세척하기 위해, 배지 1 리터를 상기 생물반응기 용기에 첨가하고, 운반체를 200 RPM에서 2 분간 교반하였다.
상기 3개의 단계로부터 얻은 세포 현탁액을 혼합한 후 500 ml 멸균 원심분리 튜브에 분배하였다. 상기 세포를 원심분리로 농축하고, 계수하였다.
수집 시스템 표본(
prototype
)(진동)을 사용한 3D 운반체로부터의 수집:
성장 단계의 말(6-7 일)에 세포 수집 단계를 개시하였다. 상기 생물반응기 용기는 폐기물 용기까지 관을 통해 중력으로 비워져 있다. 헤드 플레이트를 제거하여 상기 용기를 개방하고, 운반체를 포함하는 바스켓을 개방하고, 멸균 겸자를 사용하여 3D 운반체를 바스켓으로부터 멸균 유리 비이커로 옮겼다. 운반체를 미리 가온된 (37 ℃) 1 리터로 2-3번 세척하였다. 세척된 담체를 수집 시스템(표본)의 바스켓에 옮기고, 세척된 운반체를 함유하는 바스켓을 미리 가온된 (37℃) TrypLE의 1.8리터를 함유하는 2.2 리터 용기에 두었다. TrypLE에서 항온처리 동안 (1-32 분) 상기 바스켓을 저진동수0.7 Hz)에서 진동하여 바스켓 전체에 걸쳐 트립신 용액을 균등하게 혼합하였다. 담체로부터 세포를 배출하기 위해 (수집 단계) 상기 바스켓을, 상술한 바와 같이, 3-8 분마다, 1 분간 12 mm 또는 25 mm의 진폭과 3 Hz 또는 6 Hz의 진동수를 사용하여 진동하였다. 수집 단계 동안, 5 ml 세포 현탁액 샘플을, 상이한 시점에서, 1 ml FBS를 함유하는 50 ml 원심분리 튜브에 수집하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고, 세포 펠렛을 1 ml 배지에 현탁시키고 및 계수하거나, 총 세포 현탁액을 500 ml 멸균 원심분리 튜브로 분배하고, 세포를 원심분리하고, 재현탁시키고, 계수하였다.
세포 샘플 동결보존:
세포를 해동후 생존능 및 활성 측정을 위해 10% DMSO(Wak-Chemie, GMBH) 및 5% Human Serum Albumin(Biotest Pharma, GMBH)을 가진 3D 동결용액(PlasmaLyte, Baxter)에 l0xl06 세포/ml의 농도로 동결보존하였다.
세포 수:
수집 후 세포수는 Cedex(Roche Applied Science - Innovatis) 또는 Countess(Life Technologies - Invitrogen) 장비를 사용하여 트립판 블루 배제 방법으로 측정되었다.
생존능
:
생존능은 Cedex 장비 또는 혈구계수기를 사용하여 트립판 블루 배제 방법으로 측정되었다.
수집 효율:
수집 전후에, 3-[4,5-디메티리아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리둠 브로마이드 (MTT) 분석 O.D.를 사용하여, FibraCel 운반체에 부착된 세포의 수를 평가하였다. 수집 효율은 하기 식에 따라 계산하였다:
상기 값은 수집 후 상기 운반체로부터 제거된 세포의 백분율을 나타낸다(높은 값 = 고 수집 효율 및 그 역도 그렇게 적용된다).
활력:
세포를 해동하고, 24 웰 플레이트의 웰에 분주하고(10,000 세포/웰/ml) 및 1 및 4 일간 배양하였다. 해동 후 활력은 MTT 시험 O.D.를 사용하여 평가하였다. 각 샘플은 삼중으로 시험되었다.
실험 결과:
실시예
1:
성장 단계의 말에, 상기 운반체를 상기와 같이 세척하고, 수집 시스템 바스켓으로 옮겼다. 상기 운반체를 TrypLE에서 32 분간 배양하는 가운데 상기 바스켓을 저진동수(0.7 Hz)로 진동하였다. 3 분마다, 상기 바스켓을 표 1에 상세된 바와 같이, 1 분 동안 상이한 진동수(Hz) 와 진폭(mm)에서 진동시켰다. 각 시점에서, 5 ml 세포 현탁액의 샘플을 50 ml 원심분리 튜브에 수집하고, 세포의 수를 Cedex 기기를 사용하여 계수하였다.
수집 시스템 매개 변수
수집액에서의 세포 농축에 대한 수집 매개 변수(시간, 진동수 및 진폭)의 효과는 도 10에 도시되어 있다. 비록 진폭이 배양 기간 동안(16 분 후) 변하지만, 결과에 따르면, 12 mm에 비해, 25 mm의 진폭을 사용할 때, 세포 수집에 더 많은 효율이 있다는 것을 나타낸다.
실시예
2:
성장 단계의 말에(6일), 상기 운반체를 세척하고 수집 시스템 바스켓에 옮겼다. 상기 운반체를 TrypLE에서 20 분간 배양하는 중에, 바스켓을 25 mm의 진폭과 저진동수 (0.7 Hz)에서 진동시킨다. 4 분마다 상기 바스켓을 1 분간 25 mm의 진폭과 6 Hz의 진폭에서 진동시켰다. 각 시점에서, 5 ml 세포 현탁액의 샘플을 1 ml FBS를 함유하는 50 ml 원심분리 튜브에 모았다. 상기 세포 현탁액을 원심분리하고, 세포를 1 ml 배지(DMEM, 10% FBS 및 25 mM HEPES 함유)에 재현탁하고, Cedex 기기를 사용하여 계수하였다.
5 ml 샘플 내 세포수에 대한 수집 시간의 효과는 도 11에 도시되어 있다. 상기 수집 시스템이 25 mm의 진폭과 6 Hz의 진동수에서 작동할 때, 5분 후의 용액에서 계수되는 세포의 수는 시간에 따라 증가하지 않는다.
다른 실험에서, 상기 운반체를 성장 단계 말에(수집 전) 및 수집 시스템 표본을 사용한 (25 mm의 진폭, 6 Hz의 진동수, 20 분의 기간) 수집 과정의 말에 샘플링하였다. FibraCel 운반체에 부착된 세포의 수를 MTT 분석법을 사용하여 계수하였다. 수집 효율 수치는 수집 과정의 말에서 운반체로부터 제거된 세포의 백분율을 MTT 분석의 O.D. 결과에 기초하여 나타낸다.
수집 과정 전 후의 MTT 분석 결과(도 12)는 수집 효율이 98% 임을 보인다.
실시예
3:
성장 단계 말에(7 일간), 상기 운반체를 세척하고 상기 수집 시스템 바스켓에 옮겼다. 상기 운반체를 TrypLE에서 8 분간 배양하는 중에 상기 바스켓 25 mm의 진폭과 저 진동수(0.7 Hz)에서 진탕하였다. 8분간 배양 후, 상기 바스켓을 1 분간 of 25 mm의 진폭에서 3 Hz 또는 6 Hz의 진동수로, 설명된 대로 진탕하였다. 각 시점에서, 5 ml 세포 현탁액의 샘플을 1 ml FBS를 함유하는 50 ml 원심분리 튜브에 모았다. 상기 세포 현탁액을 원심분리하고, 상기 세포를 1 ml의 배지에 재현탁하고, Countess 기기를 이용하여 계수하였다.
5 ml 샘플 내 세포수에 대한 수집 빈도 및 시간의 효과는 도 13에 도시되어 있다. 1분 동안, 25 mm의 진폭에서, 6 Hz의 진동수는 3 Hz의 진도수보다 수집에서 더 효율적임이 발견되었다.
다른 실험에서, 상기 운반체를 성장 단계의 말에(수집 전) 및 수집 과정의 말에 샘플링하였다. 3 Hz 또는 6 Hz의 진동수를 사용한 수집 전후의, 운반체에 부착된 세포의 수를 도 14에 도시된 바와 같이, MTT 분석법을 사용하여 평가하였다. 수집 효율 값은, 3 Hz 또는 6 Hz의 진동수를 사용하여 수집 후의 운반체로부터 제거한 세포의 백분율을 MTT 분석법의 OD 결과에 기반하여 표시한 것이다. 도 13에 도시된 세포 수와 연계하여, 6 Hz의 빈도수(25 mm 진폭, 1 분)를 사용한 수집 효율은 3 Hz의 빈도수를 사용할 때보다 더 높다.
각군으로부터 (6 Hz 또는 3 Hz의 진동수) 세포를 각 시점에서 샘플링하고 동결보존하였다. 세포를 해동하고, 10,000 세포/ml/웰의 농도로 24 웰 플레이트에 분주하였다. 상기 플레이트를 습윤 배양기 내에서 37 ℃ 및 5% CO2 조건 하 4 일간 배양하였다. 세포의 해동 후 활력을 MTT 분석 O.D.를 사용하여 산정하였다(도 15).
세포의 해동 후 활력에 따르면, 1 분간 적용한 더 높은 진동수(6 Hz)는 3 Hz의 저 진동수보다 더 많이 세포를 손상시키지 않는다.
실시예
4:
성장 단계의 말에(7 일), 해양형 임펠러를 사용하여 교반함으로써, 또는 진동함으로써 (TrypLE에서 8 분 배양하고, 0.7 Hz에서 25 mm 진폭으로, 그 후 6 Hz에서 25 mm의 진폭으로 1 분간 진동) 각 생물반응기로부터 세포를 수집하였다. 각 수집 과정으로부터 얻은 세포 현탁액을 500 ml 멸균 원심분리 튜브에 나눠 넣고, 세포를 원심분리 및 재현탁하고, 총 세포수를 Countess 기구를 사용하여 계수하였다. 하기 표에 나타난 바와 같이, 본 발명의 진동 과정은 임펠러를 사용하여 운반체를 교반할 때보다 더 많은 세포를 매트릭스로부터 방출하였다.
다른 실험에서, 상기 운반체들을, 성장 단계 말에 (수집전) 및 교반 또는 진동 수집 과정의 말에 각 생물반응기 시스템으로부터 샘플링하였다. FibraCel 운반체에 부착된 세포의 수를 MTT 분석 O.D.을 사용하여 산정하였다. 수집 효율은 교반 또는 진동에 의한 수집 후 운반체로부터 제거된 세포의 백분율을, MTT 분석의 O.D. 결과에 기준하여, 표시한다(도 16). 진동 시스템을 사용한 수집 효율이 (87%) 교반 방법을 사용한 수집 효율(14%)보다 높았다.
각 방법(교반 또는 진동)으로 수집한 세포를 동결보존하였다. 세포를 해동하고 세포의 해동 후 생존능을 혈구계산기를 사용하여 트립판 블루 염색 배제 방법으로 산정하였다. 세포의 해동후 생존능에 대한 수집 방법의 효과를 도 17에 도시하였다. 둘 다의 수집 방법을 사용한 세포의 해동 후 생존능은 높았다.
상기 각각의 방법(교반 또는 진동)에 의해 수집한 세포를 동결보존하였다. 세포를 해동하고, 10,000 세포/ml/웰의 농도로 24 웰 플레이트에 분주하였다. 상기 플레이트를 습윤 배양기 내 37 ℃ 및 5% CO2에서 1 또는 4일간 배양하였다. 세포의 해동후 활력은 MTT 분석 O.D.에 기초하여 산정하였다. 각 샘플을 삼중으로 시험하였다.
세포의 해동 후 활력에 대한 상기 수집 방법의 효과는 도 18에 도시되었다. 첫 날에는 두 가지 방법으로 수집한 세포의 해동 후 활력에 대한 차이를 발견하지 못하였지만, 4 일째에는, 진동 시스템을 사용하여 수집한 세포의 해동 후 활력이 교반 방법을 적용하여 수집한 세포에 비하여 약간 더 낮았다.
실시예
5:
염색 방법을 사용하여 진동 3D 매트릭스가 채워진 베드 내에서의 순환 및 혼합 시간을 평가하였다. 진동에 의해 부여된 순환 효율을 하기 2가지 변수의 측정에 따라 산정하였다:
순환 시간: 진동 개시와 채워진 베드의 중앙으로 도입된 붉은 염료가 채워진 베드의 바깥에서 관측될 때까지 기간.
혼합 시간: 진동 개시와 상기 붉은 염료가 생물반응기 용기의 전체에 걸쳐 균등하게 배분될 때까지의 기간.
과정:
ARAN Research & Development과 협력하여 Pluristem에 의해 개발된 진동 수집 시스템 생물반응기(참조 도 6 및 9A-D)를 이중 증류된 물 3.6 L로 채웠다. 주입 장치를 사용하여 Duracet Luminous 붉은 염료 1 ml을 두 개 상이한 위치에서, 각 위치당 염료 0.5 ml을 바스켓의 중앙으로 주입하였다.
바스켓을 25 mm의 진폭에서 1, 2, 또는 3 Hz의 진동수를 사용하여 진동시키면서 순환 및 혼합 시간을 측정하였다. 상기 결과를 하기 표에 제시한다:
염료의 시각적 검사로 측정된 채워진 베드 순환 시간 및 혼합 시간은 진동 운동이 상기 생물반응기의 바스켓 내부와 외부에서 액체 순환을 야기한다는 것을 나타낸다. 상기 채워진 베드 순환 시간 및 혼합 시간은 상기 바스켓 내부 및 용기 내에서의 균등한 유동을 가지기에 충분하여 임펠러를 사용함 없이 세포를 균등하게 분주 및 성장시키고 그래서 세포 현탁액을 얻고 배지를 순환시킨다.
실시예
6:
본 실시예에서, 5 L 수집 시스템을 세포 성장 및 수집 효율에 시험하였다. 평가된 수집 매개 변수는 다음과 같다: 진동 수 및 진동 기간(25 mm의 진폭 사용). 전체 수집 과정 중에, 바이오매스를 온라인으로 감시하고 특정 시점에서 세포 계수를 위해 세포 현탁액 샘플을 취하였다.
Aber Instruments의 바이오매스 모니터를 사용하여 수집 능력을 모니터하기 위해, 살아 있는 세포의 수와 연관된 커패시턴스 값을 측정하였다.
진동수의 함수로서 커패시턴스 값을 도 19에 도시한다. 도면에 나타난 바와 같이, 현탁액의 커패시턴스 값으로 측정한 바와 같이, 진동수 및 수집 효율 간의 관계를 증명하였다. 최대 수집 효율은 5Hz의 진동수에서 얻어지고, 이는 상기 시스템의 기술적 최대 진동수이다.
FibraCel 디스크-운반체에 부착된 세포의 수를, 전술한 바와 같이, MTT 분석법을 사용하여, 수집 전후에 평가하였다. 하기 식에 따라 수집 효율을 계산하였다:
상기 값은 수집 후 운반체로부터 제거된 세포의 백분율을 나타낸다 (높은 값 = 높은 효율, 그 역도 그러하다). 바스켓의 다른 깊이로부터 수집 후 운반체를 샘플링하여 수집 효율과 균일성을 평가하였다. 바스켓의 상이한 깊이에서의 운반체 MTT 분석 결과(O.D) 및 수집 효율 (%)을 하기 표에 제시하였다:
상기 바스켓의 상부, 중간 및 바닥에서의 수집 효율은 각각 97.6%, 91.5% 및 88.4% 였다(도 20 참조). 이것은 진동을 사용하면 상세한 수집 조건 하에서 전체 바스켓에서의 효과적이고 균일한 수집 과정을 제공한다는 것을 의미한다.
고안된 (진동에 의한 수집) 및 원래의 (교반에 의한 수집) 바스켓에 대한 운반체 MTT 분석결과(O.D) 및 수집 효율을 비교하여 수집 능력을 평가하였다. 상기 “원래의” 바스켓은 생물반응기 용기의 내벽에 연장된 두 개의 수평적으로 위치되고, 기공성 금속 스크린(도 4A에서 나타난 바와 같이)을 포함하는 기성품이다. 이러한 스크린들 사이에 에워싸여 있는, Fibracel® 디스크들의 베드는 세포 성장용 고형 지지 매트릭스로서 작용한다. Pluristem에 의해 개발된 “고안된” 바스켓은 바스켓'의 규모로 인하여, 유리 용기의 내부벽과 접촉하지 않아서, 그의 왕복운동을 용이하는 점에서 원래의 바스켓에 대하여 개선되었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 상기 고안된 바스켓은 배지가 생물반응기 용기 및 바스켓 벽 사이 유동하지 못하게 하는 바스켓 씰을 포함한다.
결과를 하기 표에 나타냈다:
* 데이터는 바스켓의 상이한 깊이로부터 취해진 운반체의 평균값을 나타낸다.
전체 교반 수집 효율은 상기 고안된 바스켓의 경우, 92.5%였고, 이에 비해 상기 원래의 바스켓은 88.9%였다(도 21 참조).
다른 실험에서, 25 mm의 진폭과 5 Hz의 진동수를 사용하여 수집 효율 및 세포질에 대한 진동 효과를 시험하였다. 진동 힘을 적용하기 전 배양 시간의 효과를 용액 (DPBS 및 TrypLE)의 효율적인 혼합을 가능하게 하는 25 mm의 진폭 1 Hz의 진동수를 사용하여 부드럽게 진동을 적용하여 조사하였다.
전체 수집 공정 동안, 온라인 바이오매스 감시를 적용하여 특정 시점에서 세포 계수를 위해 세포 현탁액을 취하였다. 결과를 하기 표에 제시한다:
5Hz의 진동수에서 진동 기간 동안의 함수로서의 커패시턴스 값을 도 22에 도시하였다.
각 단계의 말에 Countess를 사용하여 세포 농도 및 생존능을 결정하였다. 5Hz의 진동수에서 진동 기간의 함수로서 세포 농도가 도 23에 도시되어 있다.
수집 과정(5Hz의 진동수에서)은 세포 농도의 면에서, 처음 30초 내에서, 및 현탁액의 커패시턴스 값의 면에서 처음 60초 내에서 매우 효과적이었다. 추가 시간 동안 진동을 계속하는 것은 세포 농도 및 커패시턴스 값 둘 다에 따라 세포 효율에 큰 영향을 끼치지 않았다.
또한, 120 초까지 진동 기간을 연장하는 것은, 모든 경우에 84%를 상회한 세포 생존능에 심대한 영향을 끼치지 않았다.
바스켓의 상이한 깊에서의 운반체 MTT 분석 결과(O.D) 및 수집 효율(%)이 다음 표에 제시되어 있다:
* 데이터는 바스켓의 상이한 깊이로부터 샘플링된 운반체의 평균값을 나타낸다.
바스켓의 상부, 중간 및 바닥에서의 수집 효율은 각각 92.4%, 80.6% 및 94.0%이고(참조 도 24), 이는 특정 수집 조건에서의 전체 바스켓에서의 효율적인 과정(>80%)을 나타낸다. 전체적인 수집 효율은 89%였고, 이는 현재 사용되는 교반 수집 방법의 효율보다 높다.
세포를 또한 활력 시험을 위해 30,000 세포/ml/웰의 농도로 분주하였다. 상기 플레이트를 습윤 배양기 내 37 ℃ 및 5% CO2에서 24 시간 배양하였다. 활력 시험은 MTT 분석에 기초하였고, 각 샘플은 삼중으로 시험되었다.
(신선한) 세포의 활력에 대한 효과가 하기 표에 제시되어 있다:
상기 데이터는 또한 도 25에 나타나 있다. 활력 시험 격과는 세포 활력에 대한 진동 기간(120초까지)의 어떤 유의한 효과도 증명하지 못하였다. 이러한 결과들은 세포 효율, 수집 균일성 및 세포 질의 면에서 진동 수집 시스템의 능력의 효율을 증명하고 있다.
실시예
6:
이러한 실험은 상이한 3D 매트릭스 상에서 성장한 세포를 회수하는 데 있어서 진동 수집 방법의 효과를 증명하고 있다.
상이한 유형의 3D 매트릭스를 사용한 진동-기준 수집 방법의 유용성을 시험하기 위해, 인간 태반-유도 ASC를 세 가지 유형의 부착성 3D 매트릭스에 분주하였다: 다공성 젤화 스폰지, 34 μm 직포 섬유 매트릭스, 및 70 μm 직포 섬유 매트릭스. 분주 및 세포 배양 기간 후(3 또는 5 일), 세포를 진동에 의해 상기 매트릭스로부터 수집하였다. MTT 분석, 세포 염색, 및 세포 계수를 사용하여 수집 효율을 결정하였다.
본 실시예에서 사용된 3D 다공성 겔화 스폰지는 Spongostan® 스폰지(Ethicon, NJ)였다. 상기 스폰지를 생물학적 후드에서 3 cm x 1 cm 조각으로 절단하였다. 스폰지 10 개 조각을 2 mM L-글루타민, 10% FBS, 및 50 mg/ml 젠타마이신이 보충된 둘베코 최소 필수 배지(DMEM)(“완전 DMEM”)45 ml을 함유한 50ml 용기에서(총 2개 용기) 밤새 수화하였다.
상기 수화된 스폰지를 6 웰 플레이크에 두고, 초과 유체는 스폰지로부터 제거하였다. 상기 스폰지를 심기 위해, 1 x 107 ASC를 해동하고 세포 농도를 2 x 106 세포/ml로 조정하였다. 각 스폰지에 세포 현탁액 100 μl(200,000 세포)를 심었다. 스폰지를 배양기 내에 (37℃, 5% CO2) 45 분 동안 두고, 상기 세포 현탁액을 얼음 위에 두었다. 45 분 후, 상기 스폰지를 뒤집고, 추가로 100 μl(200,000 세포)를 각 스폰지에 심었다. 이 후 추가로 45 분 배양하였다. 이러한 두 번째 배양 후, 두 개 스폰지 각각을 20 ml의 완전 DMEM을 가진 50 ml 튜브(총 5 개 튜브)에 두었다. 튜브의 두껑을 가스 교환을 위해 약간 개방되고 두었고, 상기 튜브를 5일간 배양하여 (37℃, 5% CO2) 세포 성장을 허용하였다.
34 μm 직포 섬유 매트릭스(PETEX; 폴리에스터 정밀 직포 스크린, 섬유 직경 34 μm, SEFAR, Switzerland) 및 70 μm 직포 섬유 매트릭스(PES; 폴리에스터, 섬유 직경 70 μm, SAATI, Italy)를 각각 1 x 0.5 cm 조각으로 잘랐다. 상기 매트릭스의 절단 조각을 방추 플라스크 바스켓으로 분배하고 오토클레이브하였다. 그 후, 완전 DMEM의 150 ml를 상기 방추 플라스크 각각에 첨가하고, 매트릭스를 밤새 수화시켰다.
PETEX 및 PES 섬유 매트릭스를 심기 위해, DMEM을 신선한 완전 DMEM의 150 ml로 교체하였다. 각 방추 플라스크에 1.4 x 107 ASC를 첨가하고, 상기 방추 플라스크를 배양기에 (37℃, 5% CO2) 한 시간 두면서, 방추자를 40 PvPM의 속도로 회전시켰다. 4 시간 후, 상기 회전 속도를 120 RPM으로 높이고, ASC를 5일간 배양시켰다.
운반자에서 성장한 ASC를 하기와 같이 진동시킴으로써 수확하였다. 상기 방추 플라스크 및 50 ml 튜브를 배양기로부터 제거하였다. 각 크기(34 μm 및 70 μm)의 10 개 직포 운반체를 사용하여 MTT 분석에 의한 세포 염색 및 평가를 하였다. 유사하게, 2개 스폰지 운반체(3개 조각으로 잘려진 각 스폰지)를 사용하여 세포 염색 및 MTT 분석을 실시하였다.
배양 배지를 버리고, 상기 젤 스폰지를 PBS로 두 번 세척하였다. 상기 스폰지를 절반으로 자르고 방추 플라스크가 채워진 베드에 놓고, 상기 채워진 배드를 미리 가온된(37℃) TrypLE의 800 ml로 채워진 용기에 넣었다. 다음 스폰지를 즉시 5 초 동안 5 Hz에서, 5 분 동안 1 Hz에서 및 30 초 동안 5 Hz에서(모두 25 mm의 진폭) 진동시켰다. 진동 후, 200 ml의 FBS를 첨가하고, 배지를 2개 500 ml 원심분리 튜브로 옮겼다. 세포를 1,200 RPM에서 10 분간 4℃에서 원심분리하고, 세포 펠렛을 재현탁하고, 및 세포를 계수하였다. 두 개 유형의 직포 운반체를 유사한 방식으로 가공하고, 세포를 동일한 진동 조건을 사용하여 그러한 운반체들로부터 수집하였다.
또한, 매트릭스를 세포 수집 전후에, Hoechst 33258 핵 염색으로 염색하고, 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다. 이러한 직접적인 관찰에 따르면 (결과는 미제시), 진동 수집 방법은 상이한 유형의 시험된 3D 매트릭스로부터 대부분 살아있는 세포를 효과적으로 제거하였다는 것을 나타냈다. 이러한 결과들은 MTT 분석 O.D. 값으로 확인하였다.
MTT
결과
BV - 진동 전
AV - 진동 후
3D 매트릭스의 진동은 높은 세포 제거율, 직포 3D 매트릭스의 경우 90 % 이상, 및 다공성 젤라틴 스폰지의 경우 69%의 제거율을 나타낸다. 이러한 실험에서, 이러한 특정적 매트릭스로부터 세포 회수를 최대화하기 위한 진동 특성을 최적화하는 데 어떠한 시도도 하지 않았고, 그래서, 훨씬 더 높은 세포 회수 효율을 얻는 것이 가능할 수 있다.
세포 계수 및 생존성 결과를 하기 표에 제시한다:
세포 계수 및
생존성
결과
이러한 데이터에 기초하여, 진동-기반 세포 수집 방법은 세포 생존성을 높게 유지하면서, 시험된 3D 매트릭스 각각으로부터 세포를 제거하는 데 효과적이다.
이러한 결과들은 진동 세포 수집 방법이 다양한 범위의 3D 구조체 유형에 매우 효과적이라는 것을 나타낸다.
본 발명의 특정 특징들은 명확성을 위해, 분리된 구체예들의 맥락에서 설명되었는 데, 또한 단일 구체예로 조합적으로 제공될 수도 있다. 역으로, 본 발명이 댜양한 특징들은, 간결함을 위해, 단일 구체예의 맥락에서 설명되었는 데, 분리적으로 또는 임의의 적절한 분화된 조합으로 제공될 수 있다.
비록 본 발명이, 이의 특정 구체예와 연합하여 설명되어 있지만, 많은 대안, 변경 및 변형이 당해 분야의 숙련자에게 명확할 것이라는 것은 확실하다. 따라서, 모든 첨부된 청구범위의 사상과 넓은 범위에 속하는 그러한 대안, 변경 및 변형들을 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 언급된 모든 공개물, 특허 및 특허출원서들은 각 개별 공개물, 특허 또는 특허 출원서가 특별히 및 개별적으로 참조로써 포함될 것으로 지적되는 것처럼 동일한 정도로, 그 전체가, 참조로써 본 명세서에 포함된다. 참조로써 포함된 물질이 본 명세서의 개시와 충돌이 있는 경우, 본 명세서가 더 우선한다. 또한, 본 명세서에서의 임의의 참조물의 인용 또는 확인은 그러한 참조물이 본 발명의 대한 선행기술로서 이용가능하다고 허락받은 것으로 해석되어서는 안 된다.
Claims (82)
- 장치 내부의 배양물에서 성장한 세포를 수집하는 방법으로서,
상기 장치가 i) 생물반응기 내부에 배치된 용기 내의 부착성 물질, 및 ii) 생물반응기에 대해 용기에 왕복 운동을 부여하는 진동자 (vibrator)를 포함하고, 진동자가 상기 왕복 운동의 진폭과 진동수를 조정하기 위한 하나 이상의 제어물을 포함하고, 진동자가 부착성 물질에 부착된 세포가 부착성 물질로부터 탈착되도록 야기하는 방식으로 진동하도록 고안된 것으로서, 상기 방법이:
a) 세포를 부착성 물질에 배양하여 세포가 상기 부착성 물질로 부착되게 하는 단계;
b) 세포를 탈착제에 노출시킴으로써 세포를 상기 부착성 물질로부터 해리하는 단계;
c) 세포를 부착성 물질로부터 방출하도록 충분한 진동수와 진폭에서 일정 시간 동안 생물반응기에 대해 용기에 왕복 운동을 부여하는 단계; 및
d) 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 세포 수집 방법. - 제1항에 있어서, 부착성 물질이 세포가 부착하는 3차원 표면을 제공하는 것인, 세포 수집 방법.
- 제2항에 있어서, 3차원 표면이 생물반응기 내의 채워진 베드 (packed bed) 내에 에워싸이는 것인, 세포 수집 방법.
- 제1항에 있어서, 세포가 태반, 지방조직, 또는 골수로부터 유래한 부착성 기질 세포인 것인, 세포 수집 방법.
- 제1항에 있어서, 부착성 물질이 폴리에스터, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌, 폴리플루오로클로로에틸렌, 염화 폴리비닐, 불화 폴리비닐 수지, 폴리스티렌, 폴리설폰, 폴리우레탄 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트의 하나 이상을 포함하는 것인, 세포 수집 방법.
- 제1항에 있어서, 부착성 물질이 직선적인 왕복 운동에 의해 진동되는 것인, 세포 수집 방법.
- 제1항에 있어서, 3차원 표면이 나노 섬유를 포함하는 것인, 세포 수집 방법.
- 제1항에 있어서, 왕복 운동이 10 mm 내지 750 mm의 진폭 및 1 Hz 내지 6 Hz의 진동수를 가지는 것인, 세포 수집 방법.
- 제6항에 있어서, 직선적인 왕복 운동의 진폭이 부착성 물질을 포함하는 바스켓의 높이의 15 내지 100%에 해당하는 거리인 것인, 세포 수집 방법.
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- i) 생물반응기 내부에 배치된 용기 내의 부착성 물질, 및 ii) 생물반응기에 대해 용기에 왕복 운동을 부여하는 진동자를 포함하는 장치로서,
진동자가 상기 왕복 운동의 진폭과 진동수를 조정하기 위한 하나 이상의 제어물을 포함하고, 진동자가 부착성 물질에 부착된 세포가 부착성 물질로부터 탈착되도록 야기하는 방식으로 진동하도록 고안된 것인, 장치. - 제11항에 있어서,
a) 부착성 물질이 3D 매트릭스이고/이거나;
b) 장치가 생물반응기이고/이거나;
d) 진동자가 부착성 물질에 직선적인 왕복 운동을 부여하는 것인, 장치. - 제12항에 있어서,
a) 생물반응기가 관류 생물반응기이고;
b) 생물반응기가 채워진 베드 3차원 매트릭스를 포함하고, 왕복 장치가 채워진 베드를 감싸는 바스켓을 포함하고;
c) 3차원 매트릭스가 폴리에스터, 폴리프로필렌, 폴리알킬렌, 폴리플루오로클로로에틸렌, 염화 폴리비닐, 불화 폴리비닐 수지, 폴리스티렌, 폴리설폰, 폴리우레탄 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트의 하나 이상을 포함하는 것인, 장치. - 삭제
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