JP7480707B2 - バチルス属細菌の培養液を含有する農園芸用組成物 - Google Patents
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Description
れている。FZB42株は、Bacillus amyloliquefaciensの中でも植物との相互作用に関して
最もよく研究されており(非特許文献1)、微生物資材(製品名 RhizoVital42)として販売もされている。また、FZB42株の植物生育促進作用はインドール-3-酢酸(indole-3-acetic acid;IAA)の生産と関連しており、IAA生合成遺伝子の欠損により植物
生育促進作用が低下することが報告されている(非特許文献2)。
[1]
農園芸用組成物であって、
フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性のプレフェン酸デヒドラターゼを有するバチルス属細菌の培養液を含有する、組成物。
[2]
前記バチルス属細菌が、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)またはバチルス・ベルエゼンシス(Bacillus velezensis)である、前記組成物。
[3]
前記培養液が、前記バチルス属細菌の培養液そのもの、該培養液から分離された培養上清、およびそれらの処理物から選択される、前記組成物。
[4]
前記処理物が、濃縮、希釈、分画、滅菌、またはそれらの組み合わせに供されたものである、前記組成物。
[5]
植物の生育促進用である、前記組成物。
[6]
前記プレフェン酸デヒドラターゼが、野生型プレフェン酸デヒドラターゼにおいて、下記より選ばれる1つまたはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有するプレフェン酸デヒドラターゼである、前記組成物:
S213、N229、F247。
[7]
前記変異が、下記より選ばれる1つまたはそれ以上の変異に相当する変異を含む、前記組成物:
S213L、N229Y、F247Y。
[8]
前記野生型プレフェン酸デヒドラターゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、前記組成物:
(a)配列番号2または4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2または4に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質;
(c)配列番号2または4に示すアミノ酸配列に対し90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
[9]
植物の生育を促進する方法であって、
フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性のプレフェン酸デヒドラターゼを有するバチルス属細菌の培養液を植物に施用することを含む、方法。
[10]
植物体を製造する方法であって、
フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性のプレフェン酸デヒドラターゼを有するバチルス属細菌の培養液を植物に施用して植物を栽培すること、および
植物体を回収することを含む、方法。
[11]
前記バチルス属細菌が、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)またはバチルス・ベルエゼンシス(Bacillus velezensis)である、前記方法。
[12]
前記培養液が、前記バチルス属細菌の培養液そのもの、該培養液から分離された培養上清、およびそれらの処理物から選択される、前記方法。
[13]
前記処理物が、濃縮、希釈、分画、滅菌、またはそれらの組み合わせに供されたものである、前記方法。
[14]
前記培養液を、土壌または培地に施用する、前記方法。
[15]
前記培養液を、培養直後の培養液の量に換算して、1L/ヘクタール~10000L/ヘクタールの量で施用する、前記方法。
[16]
前記培養液を、培養直後の培養液の量に換算して、植物の根圏における濃度が0.01
%(w/w)~150%(w/w)となるように施用する、前記方法。
[17]
前記プレフェン酸デヒドラターゼが、野生型プレフェン酸デヒドラターゼにおいて、下記より選ばれる1つまたはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有するプレフェン酸デヒドラターゼである、前記方法:
S213、N229、F247。
[18]
前記変異が、下記より選ばれる1つまたはそれ以上の変異に相当する変異を含む、前記方法:
S213L、N229Y、F247Y。
[19]
前記野生型プレフェン酸デヒドラターゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、前記方法:
(a)配列番号2または4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2または4に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質;
(c)配列番号2または4に示すアミノ酸配列に対し90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
植物の種類は特に制限されない。植物は、木本植物であってもよく、草本植物であってもよい。植物としては、イネ科植物(イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、エンバク、シバ等)、ナス科植物(トマト、ピーマン、ナス、ジャガイモ等)、ウリ科植物(キュウリ、メロン、カボチャ等)、マメ科植物(エンドウ、ダイズ、インゲンマメ、アルファルファ、ラッカセイ、ソラマメ等)、アブラナ科植物(ダイコン、ハクサイ、キャベツ、コマツナ、ナノハナ、チンゲンサイ、シロイヌナズナ等)、バラ科植物(イチゴ、リンゴ、ナシ等)、クワ科植物(クワ等)、アオイ科植物(ワタ等)、セリ科植物(ニンジン、パセリ、セロリ等)、ユリ科植物(ネギ、タマネギ、アスパラガス等)、キク科植物(ゴ
ボウ、ヒマワリ、キク、シュンギク、ベニバナ、レタス等)、ツツジ科植物(ブルーベリー等)、ブドウ科植物(ブドウ等)、ミカン科植物(ウンシュウミカン、レモン、ユズ等)が挙げられる。植物としては、特に、ナス科植物、ウリ科植物、バラ科植物が挙げられる。植物として、さらに特には、トマト、キュウリ、イチゴが挙げられる。植物としては、1種の植物を対象としてもよく、2種またはそれ以上の植物を対象としてもよい。
有効成分(すなわち本発明の培養液)は、本発明の細菌を培養することにより得られる。すなわち、本発明は、本発明の細菌を培地で培養する工程を含む、有効成分の製造方法を提供する。同工程を、「培養工程」ともいう。培養工程は、具体的には、本発明の細菌を培地で培養することにより有効成分を調製する工程であってもよい。
本発明の細菌は、フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性のPDを有するバチルス属細菌である。
バチルス属細菌としては、例えば、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)、バ
チルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・ポリミキサ(Bacillus polymixa)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・ベルエゼンシス(Bacillus velezensis)が
挙げられる。バチルス属細菌としては、特に、バチルス・アミロリケファシエンスやバチルス・ベルエゼンシスが挙げられる。バチルス・サブチリスとして、具体的には、例えば、168 Marburg株(ATCC 6051)、PY79株(Plasmid, 1984, 12, 1-9)、およびそれらの派生株が挙げられる。バチルス・アミロリケファシエンスとして、具体的には、例えば、T
株(ATCC 23842)、N株(ATCC 23845)、AJ11708株(NITE BP-02609)、FZB42株(DSM 23117)、およびそれらの派生株が挙げられる。なお、FZB42株(DSM 23117)は、バチルス
・ベルエゼンシスへの再分類が提唱されている(Dunlap CA, et al., Bacillus velezensis is not a later heterotypic synonym of Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus methylotrophicus, Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum and 'Bacillus oryzicola' are later heterotypic synonyms of Bacillus velezensis based on phylogenomics. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2016), 66, 1212-1217)。よって、本発明において、FZB42株(DSM 23117)は、説明の便宜上、バチルス・アミロリケファシエンスとして記載するが、バチルス・アミロリケファシエンスおよびバチルス・ベルエゼンシスの両方に該当するものとして扱う。すなわち、バチルス・ベルエゼンシスとして、具体的には、例えば、FZB42株(DSM 23117)やその派生株が挙げられる。
株(NITE BP-02609)またはFZB42株(DSM 23117)の16S rRNA遺伝子の塩基配列と99%以
上、99.5%以上、99.7%以上、99.86%以上、99.93%以上、または100%の同一性を有す
る株も挙げられる。そのような株は、例えば、バチルス・アミロリケファシエンスまたは
バチルス・ベルエゼンシスに分類されるものであってよい。
登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る(http://www.atcc.org/参照)。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(住所Inhoffenstrasse 7B 38124 Braunschweig GERMANY)から入手することができる。また、これら
の菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
「プレフェン酸デヒドラターゼ(prephenate dehydratase;PD)」とは、プレフェン酸をフェニルピルビン酸に変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。同活性を、「プレフェン酸デヒドラターゼ活性(PD活性)」ともいう。PDをコードする遺伝子を、「プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子(PD遺伝子)」ともいう。
により確認することができる。
個、さらに好ましくは1~5個、特に好ましくは1~3個を意味する。
間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸で
ある場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸
性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln
、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。
、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましく
は99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、本明
細書において、「相同性」(homology)は、「同一性」(identity)を指す。
タンパク質であってもよい。そのようなプローブは、公知の野生型PD遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、野生型PD遺伝子の塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、よ
り好ましくは95%以上、より好ましくは97%、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、
例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、1回、好ましくは2~3回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、
ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。なお、当業者であれば、塩濃度および温度等の諸条件を適宜設定して、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
=100、ワード長=12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸
配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、
スコア=50、ワード長=3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパ
ク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的
としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST(BLAST 2.0)を利用
できる。また、PSI-BLAST(BLAST 2.0)を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム(例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX)の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
するタンパク質であってよい。また、例えば、阻害耐性型PDは、阻害耐性変異を有する以外は、配列番号2、4、6、または8に示すアミノ酸配列に対して、80%以上、好まし
くは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、PD活性を有するタンパク質であってよい。
S213、N229、F247。
上記表記において、数字は配列番号2に示す野生型PDのアミノ酸配列における位置を、数字の左側の文字は配列番号2に示す野生型PDのアミノ酸配列における当該位置のアミノ酸残基(すなわち、変異前のアミノ酸残基;一文字表記)を、各々示す。すなわち、例えば、「S213」は、配列番号2に示す野生型PDのアミノ酸配列における213位のSer残基を示す。
S213L、N229Y、F247Y。
上記表記において、数字およびその左側の文字の意味は前記と同様である。数字の右側のカッコ内の文字は、変異後のアミノ酸残基(一文字表記)を示す。すなわち、例えば、「S213L」は、配列番号2に示す野生型PDのアミノ酸配列における213位のSer残基がLeu残基に置換される変異を示す。
n位のアミノ酸残基の変異に相当する変異」とは、配列番号2に示すアミノ酸配列におけ
るn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基における変異を意味する。すなわち、例え
ば、「S213Lに相当する変異」とは、配列番号2に示す野生型PDのアミノ酸配列におけ
る213位のSer残基(S213)に相当するアミノ酸残基がLeu残基に置換される変異を示す。
なお、ここでいう「S213に相当するアミノ酸残基」は、通常Ser残基であってよいが、Ser残基でなくてもよい。すなわち、例えば、「S213Lに相当する変異」は、「S213に相当す
るアミノ酸残基」がSer残基である場合に当該Ser残基がLeu残基に置換される変異に限ら
れず、「S213に相当するアミノ酸残基」がLys、Arg、His、Ala、Val、Ile、Gly、Thr、Pro、Phe、Trp、Tyr、Cys、Met、Asp、Glu、Asn、またはGln残基である場合に当該アミノ酸残基がLeu残基に置換される変異も包含する。他の変異についても同様である。
配列番号2のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号2に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。すなわち、上記変異にお
いて、アミノ酸残基の位置は、必ずしも野生型PDのアミノ酸配列における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号2に記載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列からなる野生型PDにおいて、n位より
もN末端側の位置で1アミノ酸残基が欠失した場合、元のn位のアミノ酸残基はN末端から数えてn-1番目のアミノ酸残基となるが、「配列番号2に示すアミノ酸配列におけるn位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とみなされる。同様に、例えば、ある微生物のPDホモログのアミノ酸配列中の100位のアミノ酸残基が、配列番号2に示すアミノ酸配列
中の101位に相当するときは、当該アミノ酸残基は、当該PDホモログにおける「配列番
号2に示すアミノ酸配列における101位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」である
。
Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987;Thompson JD et al., Nucleic
acid Reseach, 22(22), 4673-80. 1994)。
。他のアミノ酸残基としては、プロリン残基やアスパラギン酸残基が挙げられる。他のアミノ酸残基としては、特に、プロリン残基が挙げられる。
様に、配列番号6とのアラインメントにより決定できる。例えば、配列番号6の330位のセリン残基は、配列番号8の235位のセリン残基に相当する。
る方法(Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987);Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987))が挙げられる。
「バチルス属細菌に阻害耐性型PD遺伝子を導入する」ことには、バチルス属細菌の染色体上の野生型PD遺伝子を阻害耐性型PD遺伝子に改変すること、例えば、バチルス属細菌の染色体上の野生型PD遺伝子に阻害耐性変異を導入すること、も包含される。
ロモーター、xylプロモーター、groESLプロモーターが挙げられる。また、プロモーター
としては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる(国際公開第00/18935号)。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu.
Rev., 1, 105-128 (1995))等に記載されている。
本発明の実施に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導
入することもできる(特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1)。染色体への
遺伝子の導入の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含む阻害耐性型PD遺伝子をそのまま染色体に組み込んでもよく、阻害耐性型PDのコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してから染色体に組み込んでもよく、染色体上にもともと存在するプロモーターの下流に阻害耐性型PDのコード領域を組み込んでもよい。
本発明の細菌を培地で培養することにより、有効成分(本発明の培養液)が得られる。
は、1種の硫黄源を用いてもよく、2種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
タミン類;アミノ酸類;核酸類;これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、1種の成分を用いてもよく、2種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
、必要に応じて培地のpHを調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、15~43℃、好ましくは25~37℃であってよく、特に約34℃であってもよい。培養期間は、例えば、10時間以上、15時間以上、20時間以上、30時間以上、50時間以上、または70時間以上であってもよく、240時間以下、180時間以下、120時間以下、90時間以下、70時間以下、または50時
間以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培養期間は、具体的には、例えば、10時間~120時間であってもよい。また、阻害耐性型PDの発現のた
めに誘導型プロモーターを用いる場合は、適宜、阻害耐性型PDの発現を誘導することができる。培養は、回分培養(batch culture)、流加培養(Fed-batch culture)、連続培養(continuous culture)、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。また、培養は、前培養と本培養とに分けて実施してもよい。例えば、前培養を寒天培地等の固体培地上で行い、本培養を液体培地で行ってもよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは本発明の細菌の活性がなくなるまで、継続してもよい。
釈、分画、滅菌、またはそれらの組み合わせ)に供されたものが挙げられる。なお、説明の便宜上、「培養液」という用語を用いるが、有効成分には、上記のような処理の結果として液体以外の形態になったもの(例えば、濃縮乾固物)も包含される。これらの態様の培養液は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、有効成分として用いることができる。
本発明の組成物は、有効成分(すなわち本発明の培養液)を含有する農園芸用組成物である。
%(w/w)以上、または10%(w/w)以上であってもよく、10000%(w/w)以下、5000%(w/w)以下、1000%(w/w)以下、500%(w/w)以下、300%(w/w)以下、200%(w/w)以下、150%(w/w)以下、100%(w/w)以下、70%(w/w)以下、50%(w/w)以下、30%(w/w)以下、10%(w/w)以下、5%(w/w)以下、または1%(w/w)以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。「元の培養液」とは、培養後に濃縮や希釈等の濃度変化が生じていない培養液をいい、具体的には、培養直後の培養液(すなわち、本発明の細菌の培養液そのもの)であってよい。なお、100%(w/w)を超える含有量は、培養液が濃縮されて本発明の組成物に含有されていることを意味する。すなわち、例えば、200%(w/w)という含有量は、培養液が2倍に濃縮されて本発明の組成物に含有されていることを意味する。
本発明の方法は、有効成分(すなわち本発明の培養液)を植物に施用することを含む方法である。
、0.01%(w/w)~150%(w/w)、0.1%(w/w)~150%(w/w)、1%(w/w)~150%(w/w)、5%(w/w)~150%(w/w)、0.01%(w/w)~100%(w/w)、0.01%(w/w)~70%(w/w)、0.01%(w/w)~50%(w/w)、0.1%(w/w)~70%(w/w)、または1%(w/w)~50%(w/w)であってもよい。また、本発明の組成物は、他の成分と併用してもよい。他の成分については、本発明の組成物における有効成分以外の成分についての記載を準用できる。すなわち、本発明の組成物は、例えば、展着剤等の添加剤と併用してもよい。
たは1000L/ヘクタール~3000L/ヘクタールであってもよい。また、本発明の組成物の施用量は、施用面積(二次元的の要素)だけではなく、三次元的要素も考慮して設定することができる。本発明の組成物の施用量は、具体的には、例えば、元の培養液の施用量に換算して、地表面~膝高の植物では1L/ヘクタール~1500L/ヘクタールまたは1L/ヘクタール~150L/ヘクタール、膝高~ヒトの背丈の植物では1L/ヘクタール~3000L/ヘクタールまたは1.5L/ヘクタール~300L/ヘクタール、ヒトの背丈~2Mの植物では1L/ヘクタール~5000L/ヘクタールまたは3L/ヘクタール~500L/ヘクタール、2M以上の植物では1L/ヘクタール~7000L/ヘクタールまたは5L/ヘクタール~700L/ヘクタールであってもよい。上記例示したような本発明の組成物の施用量は、特に、本発明の組成物を葉面散布等の植物体への散布、または土壌や培地への散布により、植物に施用する場合の施用量であってよい。
また、本発明は、上記のような用途での有効成分の使用を提供する。すなわち、本発明は、例えば、植物の生育促進のための有効成分の使用や、植物の生育促進用の組成物の製造のための有効成分の使用を提供する。また、本発明は、上記のような用途に用いるための有効成分を提供する。すなわち、本発明は、例えば、植物の生育促進に用いるための有効成分や、植物の生育促進用の組成物の製造に用いるための有効成分を提供する。
Bacillus amyloliquefaciens AJ11708株(NITE BP-02609)およびFZB42株(DSM 23117
)を親株として、それぞれ、0.4 g/L f-Phe(p-fluoro-phenylalanine)を含む寒天培地
で培養し、生育したf-Phe耐性株を単離した。これらのf-Phe耐性株の変異点を決定した結果、それぞれPheA(prephenate dehydratase;PD)に以下の変異が生じていた。AJ11708由来f-Phe耐性株1株(AG14924=VKPM B12841=AJ111345株(NITE BP-02610) PheA(F247Y))、FZB42由来f-Phe耐性株4株(AG15091=VKPM B12834-2株 PheA(S213L)、AG15092=VKPM B12834-3株 PheA(N229Y)、AG15093=VKPM B12834-4株 PheA(S213L)、AG15094=VKPM
B12834-5株 PheA(S213L))。これらのf-Phe耐性株の培養液をTLC分析またはアミノ酸分
析に供したところ、親株の培養液と比較してPheの蓄積量が増加していた。よって、これ
らのf-Phe耐性株は、PheによるPheAに対するフィードバック阻害が低減または解除されている株(すなわち阻害耐性型PDを有する株)であると判断した。また、これらのf-Phe
耐性株は、例えば、遺伝子工学的手法により上記親株のPDに上記変異を導入することによっても再現的に取得できる。
立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD;郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8 122号室)にブダペスト条約に基づく国際寄託として寄託され、受託番号NITE BP-02610が付与されている。
Bacillus amyloliquefaciensの親株およびf-Phe耐性株を、それぞれ、300 mLフラスコ
に張り込んだ20 mLの培地(表1)に植菌し、34℃、150 rpmで2日間旋回培養を行った。
培養液を遠心して培養上清を回収し、0.22 μmのフィルターにてろ過滅菌し、培養液サンプルとした。
ロイヌナズナ芽生えを、各菌株の培養液サンプルを最終濃度1%となるように添加した、1%ショ糖とMS無機塩を含む無菌ゲランガム培地(0.5%ゲランガム)に移植した。移植後7日
間培養した芽生えについて、側根数を測定した(n=6)。また、植物の生重量の増加は、例えば、各菌株の培養液サンプルを最終濃度0.01~1%となるように添加した同培地で同様に培養することで測定することができる。
結果(平均値±SD)を図1に示す。f-Phe耐性株(すなわち阻害耐性型PDを有する
株)の培養液サンプルを施用することにより、野生株の培養液サンプルを施用した場合と比較して、シロイヌナズナ芽生えの側根数の増大が認められた。すなわち、阻害耐性型PDを有するバチルス属細菌の培養液を施用することにより、植物の生育を促進できることが明らかとなった。
配列番号1:Bacillus amyloliquefaciens AJ11708の野生型PD遺伝子の塩基配列
配列番号2:Bacillus amyloliquefaciens AJ11708の野生型PDのアミノ酸配列
配列番号3:Bacillus amyloliquefaciens FZB42の野生型PD遺伝子の塩基配列
配列番号4:Bacillus amyloliquefaciens FZB42の野生型PDのアミノ酸配列
配列番号5:Escherichia coli K-12 MG1655の野生型PD遺伝子の塩基配列
配列番号6:Escherichia coli K-12 MG1655の野生型PDのアミノ酸配列
配列番号7:Brevibacterium lactofermentum AJ12125の野生型PD遺伝子の塩基配列
配列番号8:Brevibacterium lactofermentum AJ12125の野生型PDのアミノ酸配列
Claims (13)
- 農園芸用組成物であって、
フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性のプレフェン酸デヒドラターゼを有するバチルス属細菌の培養液を含有し、
前記プレフェン酸デヒドラターゼが、野生型プレフェン酸デヒドラターゼにおいて変異を有するプレフェン酸デヒドラターゼであり、
前記変異が、下記より選ばれる1つまたはそれ以上の変異に相当する変異を含み:
S213L、N229Y、F247Y、
前記プレフェン酸デヒドラターゼが、前記変異を有する以外は、配列番号2または4に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、プレフェン酸デヒドラターゼ活性を有するタンパク質である、組成物。 - 前記バチルス属細菌が、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)またはバチルス・ベルエゼンシス(Bacillus velezensis)である、請求項1に記
載の組成物。 - 前記培養液が、前記バチルス属細菌の培養液そのもの、該培養液から分離された培養上清、およびそれらの処理物から選択される、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記処理物が、濃縮、希釈、分画、滅菌、またはそれらの組み合わせに供されたものである、請求項3に記載の組成物。
- 植物の生育促進用である、請求項1~4のいずれか1項に記載の組成物。
- 植物の生育を促進する方法であって、
フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性のプレフェン酸デヒドラターゼを有するバチルス属細菌の培養液を植物に施用することを含み、
前記プレフェン酸デヒドラターゼが、野生型プレフェン酸デヒドラターゼにおいて変異を有するプレフェン酸デヒドラターゼであり、
前記変異が、下記より選ばれる1つまたはそれ以上の変異に相当する変異を含み:
S213L、N229Y、F247Y、
前記プレフェン酸デヒドラターゼが、前記変異を有する以外は、配列番号2または4に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、プレフェン酸デヒドラターゼ活性を有するタンパク質である、方法。 - 植物体を製造する方法であって、
フェニルアラニンによるフィードバック阻害に耐性のプレフェン酸デヒドラターゼを有するバチルス属細菌の培養液を植物に施用して植物を栽培すること、および
植物体を回収することを含み、
前記プレフェン酸デヒドラターゼが、野生型プレフェン酸デヒドラターゼにおいて変異を有するプレフェン酸デヒドラターゼであり、
前記変異が、下記より選ばれる1つまたはそれ以上の変異に相当する変異を含み:
S213L、N229Y、F247Y、
前記プレフェン酸デヒドラターゼが、前記変異を有する以外は、配列番号2または4に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、プレフェン酸デヒドラターゼ活性を有するタンパク質である、方法。 - 前記バチルス属細菌が、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)またはバチルス・ベルエゼンシス(Bacillus velezensis)である、請求項6また
は7に記載の方法。 - 前記培養液が、前記バチルス属細菌の培養液そのもの、該培養液から分離された培養上清、およびそれらの処理物から選択される、請求項6~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記処理物が、濃縮、希釈、分画、滅菌、またはそれらの組み合わせに供されたものである、請求項9に記載の方法。
- 前記培養液を、土壌または培地に施用する、請求項6~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養液を、培養直後の培養液の量に換算して、1L/ヘクタール~10000L/ヘクタールの量で施用する、請求項6~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養液を、培養直後の培養液の量に換算して、植物の根圏における濃度が0.01%(w/w)~150%(w/w)となるように施用する、請求項6~12のいずれか1項に記載の方法。
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