CN101688212A - 产l-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌变种及其制备方法 - Google Patents

产l-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌变种及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101688212A
CN101688212A CN200880002490A CN200880002490A CN101688212A CN 101688212 A CN101688212 A CN 101688212A CN 200880002490 A CN200880002490 A CN 200880002490A CN 200880002490 A CN200880002490 A CN 200880002490A CN 101688212 A CN101688212 A CN 101688212A
Authority
CN
China
Prior art keywords
arginine
ala
argd2
gene
microorganism
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200880002490A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101688212B (zh
Inventor
金蕙圆
崔惠真
李智惠
黄水渊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ Corp
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CJ Corp filed Critical CJ Corp
Publication of CN101688212A publication Critical patent/CN101688212A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101688212B publication Critical patent/CN101688212B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种产L－精氨酸的突变菌株及其制备方法。特别是，本发明涉及包含谷氨酸棒状杆菌的精氨酸生物合成中涉及的乙酰鸟氨酸氨基转移酶的推定基因argD2基因(Ncg12355)的多核苷酸、该多核苷酸编码的多肽、包含该多核苷酸的重组载体、通过引入该重组载体至产L－精氨酸的宿主微生物以过表达argD2基因来制备的能够以高产率生产L－精氨酸的转化体和通过培养该转化体生产L－精氨酸的方法。本发明的转化体过表达argD2基因以高产率生产L－精氨酸，从而应用于医药工业。

Description

产L-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌变种及其制备方法
发明领域
本发明涉及一种产L-精氨酸的突变菌株及其制备方法，这种菌株以高产率生产医药工业中使用的L-精氨酸。特别是，本发明涉及包含argD2基因(Ncgl2355)的多核苷酸，该基因是谷氨酸棒状杆菌中精氨酸生物合成中涉及的乙酰鸟氨酸氨基转移酶的推定基因、由该多核苷酸编码的多肽、包含该多核苷酸的重组载体，能够以高产率生产L-精氨酸的转化体，其通过将重组载体引入生产L-精氨酸的宿主微生物来过表达argD2基因来制备、以及通过培养该转化体来生产L-精氨酸的方法。
背景技术
L-精氨酸是在植物种子或大蒜中发现的游离形式的氨基酸。L-精氨酸广泛用于医药、食品等等中作为有效的添加剂。L-精氨酸作为提高肝功能和脑功能、治疗男性不育的药物以及复合氨基酸补充剂的组分是十分有用的。此外，L-精氨酸已用作鱼饼和保健饮料中的食品添加剂，且近来还作为高血压病人的盐替代品。
通过生物发酵生产L-精氨酸的常规方法是基于碳源和氮源直接生产L-精氨酸。例如，L-精氨酸可使用来源于属于短杆菌属或棒状杆菌属的生产谷氨酸的微生物的突变株(日本未经审查的专利公开号Sho57-163487、Sho60-83593和Sho62-265988)，或使用通过细胞融合提高生长性质的生产氨基酸的微生物(日本未经审查的专利公开号Sho59-158185)来生产。近来，有报道L-精氨酸可使用重组菌株来生产，该菌株中参与调节精氨酸生物合成的argR基因失活(美国专利申请号2002/0045223A1)，还可使用过表达精氨酸操纵子的argF基因的方法(韩国专利申请号10-2004-107215)来生产。
在微生物中，L-精氨酸的生物合成要经过八个酶步骤，起始于前体L-谷氨酸以及随后的两个不同途径，线性途径或循环途径。
在属于棒状杆菌属的微生物中，L-精氨酸通过从L-谷氨酸开始，经N-乙酰谷氨酸、N-乙酰谷氨酰磷酸盐、N-乙酰谷氨酸半醛、N-乙酰鸟氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸代琥珀酸的循环途径来合成。这些中间体通过酶例如谷氨酸N-乙酰转移酶、N-乙酰谷氨酸激酶、乙酰谷氨酸半醛脱氢酶、乙酰鸟氨酸氨基转移酶、鸟氨酸羧基转移酶(cabomoyltransferase)、精氨酸琥珀酸酯合酶和精氨基琥珀酸裂解酶催化的连续反应来合成。这些酶分别由argJ、argB、argC、argD、argF、argG和argH基因编码。
为了以高产率生产L-精氨酸，本发明者长期进行了L-精氨酸生物合成中涉及的酶的研究。他们发现在精氨酸生物合成的中间步骤中，放大N-乙酰谷氨酸半醛至N-乙酰鸟氨酸的转化中涉及的酶反应可以增加L-精氨酸流量，从而提高L-精氨酸的产率。
在细胞中存在多种氨基转移酶，根据它们的相互结构亲缘关系分为四个亚型。亚型I包含天冬氨酰鸟氨酸、丙氨酸、酪氨酸、histidiolphosphate和苯丙氨酸氨基转移酶，亚型II包含乙酰鸟氨酸、鸟氨酸、ω-氨基酸、氨基丁酸盐和苯丙氨酸氨基转移酶，亚型III包含D-丙氨酸和支链氨基酸氨基转移酶，亚型IV包含丝氨酸和磷酸丝氨酸氨基转移酶(Perdeep K.MEHTA等人，Eur.J.Biochem.，214，549-561，1993)。
已知在谷氨酸棒状杆菌中，精氨酸生物合成中涉及的argCJBDF基因作为操纵子存在，且由于精氨酸的反馈抑制被调控(Vehary Sakanyan等人，Microbiology，142：9-108，1996)。因此，这限制了L-精氨酸的高产率生产。
发明内容
【技术问题】
相应地，本发明者努力开发能够以较高产率生产L-精氨酸的菌株。他们发现argD2基因转化的微生物过表达argD2基因并且以比亲缘菌株高的产率生产L-精氨酸，从而完成本发明，其中argD2基因是具有与编码乙酰鸟氨酸氨基转移酶的argD基因相同的功能的一个推定基因。
【技术方案】
本发明的目的是提供argD2基因(Ncgl2355)编码的多肽，argD2基因是谷氨酸棒状杆菌的精氨酸生物合成中涉及的乙酰鸟氨酸氨基转移酶的推定基因。
本发明的另一个目的是提供包含编码该多肽的碱基序列的重组载体。
本发明的另一个目的是提供能够以高产率生产L-精氨酸的转化体，其通过引入该重组载体来制备。
本发明的另一个目的是提供通过培养该转化体来生产L-精氨酸的方法。
附图说明
图1表明了重组质粒pHC131T-argD2的构建过程，其中所述质粒包含argD2基因、CJ1启动子和rrnB1B2终止子。
实施本发明的最佳方式
在一个实施方案中，本发明提供了argD2基因(Ncgl2355)编码的多肽，argD2基因是谷氨酸棒状杆菌的精氨酸生物合成中涉及的乙酰鸟氨酸氨基转移酶的推定基因。优选地，该多肽的氨基酸序列表示为SEQ ID NO.1。
根据基于基因组的分析，作为谷氨酸棒状杆菌的精氨酸生物合成中涉及的乙酰鸟氨酸氨基转移酶的推定基因的argD2基因(Ncgl2355)是归类为亚型II的氨基转移酶(AliceC.McHardy等人，J.Biotechnology，104，229-240，2003)，但是，argD2编码的蛋白质的功能还没有清楚地鉴定。在argD和argD2基因间有少许序列同源性，然而，这两种基因均具有相同基序，氨基转移酶亚型II。因此推断argD2基因编码的蛋白质与argD基因编码的且是精氨酸生物合成所需要的乙酰鸟氨酸氨基转移酶(www.genome.jp/kegg/)具有相似的功能。
在本发明的一个具体实施方案中，可以看到用包含argD2基因的重组载体转化的生产L-精氨酸的菌株以比亲缘菌株高的产率生产L-精氨酸。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列的多核苷酸。优选地，该多核苷酸的碱基序列可表示为SEQ ID NO.2。此外，本发明提供了与SEQ ID NO.2的碱基序列具有70％或更高同源性的多核苷酸，优选与SEQ ID NO.2的碱基序列具有90％或更高同源性。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了包含该多核苷酸的重组载体。优选地，该重组载体可包含SEQ ID NO.2表示的多核苷酸，并且可以是根据本发明的一个具体实施方案制备的重组载体pHC131T-argD2。
该重组载体可根据使用DNA重组技术的任何已知方法由本领域技术人员很容易地制备。例如，在本发明的一个实施方案中，基因组DNA分离自L-精氨酸生产菌株，使用分离的基因组DNA作为模板进行PCR以扩增argD2基因的ORF区域。为了制备过表达的重组载体，CJ1启动子(韩国专利号10-0620092)和rrnB1B2终止子区域分别用pECCG117-CJ1和大肠杆菌K-12作为模板来扩增。已知为产氨短杆菌Hsp60上游区域且在谷氨酸棒状杆菌中强烈表达的CJ1启动子和可商业获得的rrnB1B2终止子分别用作启动子和终止子。在这个关系中，argD2基因的碱基序列通过常规测序方法分析。启动子区域、终止子区域和argD2基因克隆至适合的质粒或其它克隆载体上，然后转化至适合的感受态细胞中以制备重组载体(图1)。
在重组载体的制备中，任何原核或真核细胞中表达的载体都可用作克隆载体，在本发明的一个具体的实施方案中，使用了质粒pECCG117(Han J.K.等人，Biotechnologyletters，13(10)：721-726，1991或韩国专利公开号92-7401)。此外，L-精氨酸生产菌株包含所有能够生产L-精氨酸的微生物，包括原核或真核细胞，优选能够生产L-精氨酸的大肠杆菌、棒状杆菌和杆菌属，更优选能够生产L-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌。
在另一个实施方案中，本发明提供了能够以高产率生产L-精氨酸的转化体，其通过将重组载体引入至L-精氨酸生产宿主微生物以过表达argD2基因来制备。
特别地，该宿主微生物具有高DNA引入效率和表达效率，并且可以是任何能够生产L-精氨酸的微生物，包括原核或真核细胞。其优选的实例包括选自由大肠杆菌属、产气杆菌属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、念珠菌属、汉森酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、毛霉菌属、球拟酵母属、甲基杆菌属、沙门氏菌属、杆菌属、链霉菌属、假单胞杆菌属、短杆菌属、趋磁螺菌属和棒状杆菌属组成的组的任何一个，更优选的微生物属于棒状杆菌属，其具有对L-精氨酸类似物的抗性且生产L-精氨酸，最优选谷氨酸棒状杆菌ATCC21493或ATCC21831。L-精氨酸类似物的实例包括洋刀豆中发现的α-氨基酸刀豆氨酸和精氨酸异羟肟酸盐/酯。
在本发明的一个具体的实施方案中，将重组载体pHC131T-argD2引入至具有L-精氨酸类似物抗性且生产L-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌ATCC21493和谷氨酸棒状杆菌ATCC21831中以制备转化的微生物CA06-0012和CA06-0013。转化的微生物CA06-0012和CA06-0013于2006年12月13日保存于韩国微生物培养中心(在下文中缩写为“KCCM”)，其保藏编号分别为KCCM10820P和KCCM10821P。
转化的微生物可以由本领域技术人员通过任何已知方法很容易地制备。如本文所用的术语“转化”意为将DNA引入至宿主细胞中以便复制DNA，即可作为染色体外元件也可整合至染色体，即通过引入外源DNA至宿主细胞的人工基因改造。其实例包括CaCl2沉淀、通过使用DMSO(二甲亚砜)作为还原物质的改良CaCl2方法的Hanahan方法、电穿孔法、磷酸钙沉淀、原生质融合、使用碳化硅纤维的搅拌、土壤杆菌介导的转化、PEG、硫酸葡聚糖和脂质体(lipofectamine)介导的转化。在本发明的一个实施方案中，重组载体pHC131T-argD2通过电穿孔法引入至宿主细胞中以制备转化体，然后使用其抗生素耐药性筛选出含有该重组载体的菌株。
为了增加根据本发明制备的转化体的L-精氨酸产率，该转化体的染色体中存在的argD2基因可通过常规的重组技术另外表达或删除。在本领域中已知其碱基序列可通过使用荧光的测序方法来分析。
在L-精氨酸的生物合成途径中，鸟氨酸是精氨酸的代谢途径中的一个中间体并且是氮代谢和尿素循环中的重要物质。通过本发明的方法转化的CA06-0012和CA06-0013菌株是过表达argD2基因的转化体，通过以下方法制备。编码具有乙酰鸟氨酸氨基转移酶的功能的推定蛋白质的argD2基因是通过对L-精氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC21831的染色体进行PCR获得的，将它***至一个载体中，然后引入L-精氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC21493和ATCC21831中。发现根据本发明的转化的CA06-0012和CA06-0013菌株过表达argD2基因以增加N-乙酰鸟氨酸的合成，从而活化精氨酸生物合成途径以高产率生产L-精氨酸。
相应地，在另一个实施方案中，本发明提供了生产L-精氨酸的方法，包含培养转化体的步骤，优选由保藏编号KCCM10820P和KCCM10821P代表的转化体。
根据本发明的L-精氨酸生产方法，转化的L-精氨酸过表达微生物的培养可在适合的培养基和本领域已知的培养条件下进行。培养方法可由本领域技术人员根据所选菌株容易地调整。培养方法的实例包括但是不限于分批型、连续型和补料型方法。在文献中公开了多种培养方法，例如“Biochemical Engineering”(James M.Lee，Prentice-HallInternational Editions，pp 138-176，1991)。
在培养中，可适当添加氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸以调节培养物的pH。可适当添加消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯以降低培养物中泡沫的形成。此外，为了在需氧状态下维持培养，氧气或含氧气体(例如空气)可注入培养物中。培养物维持在20-45℃，优选25-40℃。可持续培养直到获得预计量的L-精氨酸，优选持续10-160小时。从肉汤培养物中分离L-精氨酸可通过本领域已知的常规方法来进行。其实例可包括离心、过滤、离子交换色谱和结晶。例如，培养物可低速离心以除去生物质，然后上清液可通过离子交换色谱分离。
【实施例】
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。但是，这些实施例仅作说明目的，而本发明不受这些实施例的限制。
实施例1.argD2基因、CJ1启动子和rrnB 1 B 2 终止子的制备
为了构建包含argD2基因、CJ1启动子和rrnB1B2终止子的重组载体pHC131T，其中argD2基因是谷氨酸棒状杆菌的精氨酸生物合成中涉及的乙酰鸟氨酸氨基转移酶的推定基因、CJ1启动子在谷氨酸棒状杆菌中被强烈表达，一个包括argD2基因的开放阅读框(在下文中缩写为“ORF”)的DNA片段(1.371Kb)获得自L-精氨酸生产菌株ATCC21831的基因组DNA(gDNA)，然后分别使用pECCG117-CJ1(韩国专利申请号10-2004-107215)和大肠杆菌K-12W3110作为模板进行PCR以获得CJ1启动子(0.3Kb)和rrnB1B2终止子(0.4Kb)。
实施例1-1.包括argD2基因的ORF的DNA片段的扩增
基因组DNA(gDNA)使用Genomic-tip***(QIAGEN，在下文中相同)提取自L-精氨酸生产菌株ATCC21831。为了扩增包括argD2基因的ORF的DNA片段(1.371Kb)，聚合酶链反应(在下文中缩写为“PCR”)使用gDNA作为模板和PTC-200Piltier ThermalCycler(MJ Research，USA，在下文中相同)进行。同时，扩增argD2基因的ORF区域所使用的引物如下：SEQ ID NO.7：5’-tcccccgggggattggcatgaagggttac-3’和SEQ ID NO.8：5’-gctctagagcttagaacaacgccccagc-3’。PCR条件包括25个循环的94℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃延伸1分钟。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，然后从胶上洗脱1.3kb的条带。
实施例1-2.CJ1启动子的扩增
为了扩增CJ1启动子，使用pECCG117-CJ1(韩国专利申请号10-2004-107215)作为模板和PTC-200Piltier Thermal Cycler进行PCR。同时，扩增CJ1启动子所用的引物如下：SEQ ID NO.3：5’-cgggtaccaccgcgggcttattccattacat-3’和SEQ ID NO.4：5’-acgcgatatcttaatctcctagattgggtttc-3’。PCR条件包括25个循环的94℃变性30秒、55℃退火30秒和68℃延伸30秒。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，然后从胶上洗脱0.3kb的条带。
实施例1-3.rrnB 1 B 2 终止子的扩增
基因组DNA(gDNA)使用Genomic-tip***提取自大肠杆菌K-12W3110。为了扩增rrnB1B2终止子，使用gDNA作为模板和PTC-200Piltier Thermal Cycler进行PCR。同时，扩增rrnB1B2终止子所用的引物如下：SEQ ID NO.5：5’-gctctagagctgttttggcggatgaga-3’和SEQ ID NO.6：5’-ataagaatgcggccgccgcaaaaaggccatccgtcag-3’。PCR条件与扩增CJ1启动子相同。PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，然后从胶上洗脱411bp的条带。
实施例2.重组质粒的构建
实施例2-1.重组质粒pHC131T的构建
质粒pECCG-117(Han J.K.等人，Biotechnology letters，13(10)：721-726，1991或韩国专利公开号92-7401)，是大肠杆菌/谷氨酸棒状杆菌穿梭载体，用限制性内切酶EcoRV和KpnI处理，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳以洗脱大约5.9Kb的条带。此外，实施例1-2中制备的CJ1启动子用限制性内切酶KpnI和EcoRV处理，然后使用Quiaquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，在下文中相同)分离。
两个DNA片段使用Quick ligation试剂盒(NEB，在下文中相同)连接以制备重组质粒pECCG117-CJ1。重组质粒pECCG117-CJ1用限制性内切酶XbaI和NotI处理，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳以洗脱大约6.2Kb的条带。制备的pECCG117-CJ1和实施例1-3中制备的rrnB1B2终止子使用Quick ligation试剂盒连接以获得重组质粒pECCG117-CJ1-rrnB1B2(大约6.6Kb)，在本发明中命名为“pHC131T”。
制备的pHC131T质粒用EcoRV和XbaI处理，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳以从胶上洗脱大约6.6Kb的条带。
实施例2-2.质粒pHC131T-argD2的构建
实施例1-1中制备的argD2基因的PCR产物用限制性内切酶smaI和XbaI处理，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳以从胶上洗脱大约1.3Kb的条带。得到的产物使用Quickligation试剂盒与实施例2-1中制备的pHC131T连接，从而构建大约7.4Kb的重组质粒(图1)，在本发明中命名为“pHC131T-argD2”。
实施例3.argD2基因的序列分析
为了分析实施例2-2中制备的pHC131T-argD2的碱基序列，使用0.1ugpHC131T-argD2的DNA作为模板和2mM SEQ ID NOs.3和6的引物对和1μl BigDyeTMTerminator Cycle Sequencing v2.0Ready Reaction(PE Biosystems)进行PCR。PCR条件包括25个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒和72℃延伸2分钟，随后4℃猝灭以终止反应。PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，然后从胶上洗脱2kb的DNA片段。
此DNA片段使用引物SEQ ID NO.3在ABI PRISM 3100Genetic AnalyzerTM(AppliedBiosystems)上进行序列分析。本发明的argD2基因编码的氨基酸序列和其碱基序列分别显示于SEQ ID NOs.1和2。
实施例4.转化体的制备
实施例2-2中制备的重组质粒pHC131T-argD2通过电穿孔法引入至L-精氨酸生产菌株ATCC21493和ATCC21831中以制备过表达argD2基因的转化体，分别命名为CA06-0012和CA06-0013。转化的微生物CA06-0012和CA06-0013于2006年12月13日保存于韩国菌种保藏中心(在下文中缩写为“KCCM”)编号分别为KCCM10820P和KCCM10821P。
菌株和转化体涂至含有25mg/L卡那霉素的固体培养基(组分：3.0g/L牛肉膏、5.0g/L蛋白胨，在下文中相同)上，30℃培养16小时。选择的菌落如以下实施例5进行摇瓶滴度试验(flask titer test)。结果发现根据本发明的argD2过表达的转化体以高产率生产L-精氨酸。
实施例5.在锥形瓶中的精氨酸生产浓度比较
实施例4中制备的转化细胞和亲缘菌株ATCC21831和ATCC21493涂于含有25mg/L卡那霉素的固体培养基上，30℃培养16小时以从每个菌株中选择10个单菌落。选择的菌落在表1中给出的L-精氨酸接种培养基中培养，然后使用表1中给出的浓度培养基来评价锥形瓶中的L-精氨酸产率。计算和比较L-精氨酸产率的平均值。
【表1】
  成分   L-精氨酸接种培养基   L-精氨酸浓度培养基
  葡萄糖   5％   4％
  细菌用蛋白胨   1％   -
  氯化钠(NaCl)   0.25％   -
  酵母提取物   1％   -
  生物素   3μg/L   200μg/L
  尿素   0.4％   0.3％
  pH   7.0   7.2
  硫酸铵((NH4)2SO4)   -   3％
  磷酸二氢钾(KH2PO4)   -   0.1％
  磷酸氢二钾(K2HPO4)   -   0.1％
  七水合硫酸镁(MgSO4 7H2O)   -   0.025％
  CSL(玉米浆)   -   2.0％
选择的菌落接种至接种培养基然后在培养箱中30℃培养16小时。1ml接种培养基接种至24ml浓度培养基中，然后在30℃以220rpm培养72小时。ATCC21831、ATCC21493和转化细胞的L-精氨酸生产浓度试验结果在表2中给出。
如表2所示，精氨酸生产菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC21493和ATCC21831分别显示了0.9g/L和4.4g/L的L-精氨酸产率。同时，本发明的argD2过表达重组菌株CA06-0012和CA06-0013分别显示了1.1g/L和4.9g/L的L-精氨酸产率。可以看出重组菌株CA06-0012和CA06-0013的产率与其亲缘菌株相比增加了0.2g/L(22.2％)和0.5g/L(11.4％)。
【表2】
对本领域技术人员来说很显然可在不脱离本发明的范围和精神下进行多种改良和变化。因此，应当理解以上实施例和实验实施例不限制而是说明所有方面。本发明的范围由所附的权利要求而不是前面的说明书来限定，因此所有落在符合或包含在权利要求范围内的变化和改良或等同体均包含在权利要求内。
【工业应用】
本发明提供了包含谷氨酸棒状杆菌的精氨酸生物合成中涉及的乙酰鸟氨酸氨基转移酶的推定基因argD2基因(Ncgl2355)的多核苷酸、该多核苷酸编码的多肽、包含该多核苷酸的重组载体、通过引入该重组载体至L-精氨酸生产宿主微生物以过表达argD2基因来制备的能够以高产率生产L-精氨酸的转化细胞和通过培养该转化细胞来生产L-精氨酸的方法。本发明的转化细胞过表达argD2基因来以高产率生产L-精氨酸，从而应用于医药工业和食品工业。
关于国际承认的用于专利目的的微生物保藏的布达佩斯条约国际表格
致：CJ株式会社                由下页签章的国际保存管理机构根
韩国，首尔，                  据条约7.1的规定颁发的保藏证明
中区，南大门路5街500号
Figure A20088000249000121
1.根据第6.4条的要求，该日期是该国际保藏机构得到的状态的日期；当保藏是在布达佩斯条约之外所作的，在国际保藏机构获得该状态后，被转成布达佩斯条约的保藏，该日期是国际保藏机构收到该微生物日期。
关于国际承认的用于专利目的的微生物保藏的布达佩斯条约国际表格
致：CJ株式会社               由下页签章的国际保存管理机构根
韩国，首尔，                 据条约7.1的规定颁发的保藏证明
中区，南大门路5街500号
Figure A20088000249000131
1.根据第6.4条的要求，该日期是该国际保藏机构得到的状态的日期；当保藏是在布达佩斯条约之外所作的，在国际保藏机构获得该状态后，被转成布达佩斯条约的保藏，该日期是国际保藏机构收到该微生物日期。
序列表
<110>CJ第一制糖株式会社
<120>产L-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌变种及其制备方法
<130>OPA08001/PCT
<150>KR10-2007-0005831
<151>2007-01-18
<160>8
<170>Kopatentln 1.71
<210>1
<211>456
<212>PRT
<213>合成序列
<220>
<223>ArgD2的氨基酸序列
<400>1
Leu Thr Leu Lys Gly Tyr Thr Asn Phe Asp Gly Glu Phe Ile Glu Phe
  1                5                   10                    15
Gly Ser Ala Gln Ala Lys Glu Glu Glu Lys Arg Ala Phe Asp Asn Asp
              20                     25                   30
Arg Ala His Val Phe His Ser Trp Ser Ala Gln Asp Lys Ile Ser Pro
          35                    40                     45
Lys Val Trp Ala Ala Ala Glu Gly Ser Thr Leu Tyr Asp Phe Asp Gly
     50                     55                    60
Asn Ala Phe Ile Asp Met Gly Ser Gln Leu Val Ser Ala Asn Leu Gly
 65                   70                     75                  80
His Asn Asn Pro Arg Leu Val Glu Ala Ile Gln Arg Gln Ala Ala Arg
                  85                     90                    95
Leu Thr Asn Ile Asn Pro Ala Phe Gly Asn Asp Val Arg Ser Asp Val
            100                   105                    110
Ala Ala Lys Ile Val Ser Met Ala Arg Gly Glu Phe Ser His Val Phe
         115                     120                  125
Phe Thr Asn G ly Gly Ala Asp Ala Ile Glu His Ser Ile Arg Met Ala
    130                    135                      140
Arg Leu His Thr Gly Arg Asn Lys Ile Leu Ser Ala Tyr Arg Ser Tyr
145                   150                    155                   160
His Gly Ala Thr Gly Ser Ala Met Met Leu Thr Gly Glu His Arg Arg
                  165                   170                   175
Leu Gly Asn Pro Thr Thr Asp Pro Asp Ile Tyr His Phe Trp Ala Pro
            180                   185                     190
Phe Leu His His Ser Ser Phe Phe Ala Thr Thr Gln Glu Glu Glu Cys
        195                  200                    205
Glu Arg Ala Leu Lys His Leu Glu Asp Val Ile Ala Phe Glu Gly Ala
    210                    215                   220
Gly Met Ile Ala Ala Ile Val Leu Glu Pro Val Val Gly Ser Ser Gly
225                     230                    235                    240
Ile Ile Leu Pro Pro Ala Gly Tyr Leu Asn Gly Val Arg Glu Leu Cys
                   245                   250                   255
Asn Lys His Gly Ile Leu Phe Ile Ala Asp Glu Val Met Val Gly Phe
             260                     265                    270
Gly Arg Thr Gly Lys Leu Phe Ala Tyr Glu His Ala Gly Asp Asp Phe
        275                    280                   285
Gln Pro Asp Met Ile Thr Phe Ala Lys Gly Val Asn Ala Gly Tyr Ala
    290                   295                    300
Pro Leu Gly Gly Ile Val Met Thr Gln Ser Ile Arg Asp Thr Phe Gly
305                    310                    315                    320
Ser Glu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Ser Gly His Pro Leu Ala
                 325                    330                    335
Val Ala Pro Ala Lys Ala Ala Leu Glu Ile Tyr Ala Glu Gly Glu Ile
             340                    345                     350
Ile Pro Arg Val Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Ile Glu Pro Arg Leu
          355                   360                     365
Arg Glu Leu Ala Glu Glu Asn Val Ala Ile Ala Asp Val Arg Gly Ile
    370                    375                    380
Gly Phe Phe Trp Ala Val Glu Phe Asn Ala Asp Ala Thr Ala Met Ala
385                   390                  395                    400
Ala Gly Ala Ala Glu Phe Lys Glu Arg Gly Val Trp Pro Met Ile Ser
                 405                    410                   415
Gly Asn Arg Phe His Ile Ala Pro Pro Leu Thr Thr Thr Asp Asp Glu
             420                    425                   430
Leu Val Ala Leu Leu Asp Ala Val Glu Ala Ala Ala Gln Ala Val Glu
         435                   440                   445
Leu Thr Phe Ala Gly Ala Leu Phe
    450                   455
<210>2
<211>1371
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>ArgD2的核酸序列
<400>2
ttgacactga agggttacac caactttgac ggtgaattca tcgaattcgg atctgcgcaa      60
gcaaaagaag aggaaaaacg ggcattcgac aacgatcgcg cgcacgtttt ccactcctgg     120
tccgcgcagg acaaaatcag ccccaaagta tgggcagctg ccgaaggttc cacgctgtac     180
gacttcgacg gcaacgcctt catcgacatg ggttcccaac ttgtctcggc aaacttaggc     240
cacaacaacc ctcgattagt tgaggcgatc cagcgccaag cagcccggtt gaccaacatc     300
aacccggctt tcggcaatga tgtgcgctct gatgttgctg caaagatcgt gtcgatggcc     360
cgtggcgaat tctcccacgt gtttttcacc aacggcggcg ccgacgccat cgaacactcc     420
atccgcatgg ctcgcctgca caccggacgc aacaaaattc tgtccgcata ccgcagctac     480
cacggcgcaa ccggatccgc gatgatgctc accggcgaac accgccgcct gggcaacccc     540
accaccgacc cagatatcta ccacttctgg gcaccattcc tgcaccactc ctcattcttt     600
gccaccaccc aagaagaaga atgcgaacgc gcactcaagc acttggaaga tgtcatcgcg     660
tttgaaggtg ctggcatgat cgcagcgatc gtcctggagc cagtggtggg atcatcagga     720
atcatcctgc caccagcagg tta6ttaaat ggcgtgcgcg aactttgcaa caagcacggc     780
atcctcttca tcgccgacga agtcatggtc ggattcggac gcaccggaaa actgtttgct     840
tacgagcatg ctggcgacga tttccagcca gacatgatca ccttcgccaa gggtgttaac     900
gcaggttacg ccccactcgg tggcatcgtg atgacccaat caatccgcga taccttcgga     960
tcagaggcat actccggcgg actcacctac tccggacacc cacttgcagt agcacccgcc    1020
aaggcagcgc tggagattta cgcggaagga gagatcattc cacgcgtagc tcgacttggc    1080
gctgaactga tcgaacctcg ccttcgtgaa ctagcggaag aaaacgtagc gatcgctgac    1140
gtgcggggca tcggattctt ctgggcagtg gagttcaatg cagacgccac tgccatggct    1200
gccggtgctg cagaattcaa ggaacgcggc gtgtggccga tgatctccgg caaccgattc    1260
cacatcgcgc cgccgctgac caccactgat gacgaattgg tagcactgct ggacgcggtg    1320
gaagctgcag cccaagctgt cgagctgacc ttcgctgggg cgttgttcta a             1371
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>CJ1启动子进行PCR的正向引物
<400>3
cgggtaccac cgcgggctta ttccattaca t                                     31
<210>4
<211>32
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>PCR of CJ1启动子进行PCR的反向引物
<400>4
acgcgatatc ttaatctcct agattgggtt tc                                    32
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>rrnB1B2终止子进行PCR的正向引物
<400>5
gctctagagc tgttttggcg gatgaga                                          27
<210>6
<211>37
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>rrnB1B2终止子进行PCR的反向引物
<400>6
ataagaatgc ggccgccgca aaaaggccat ccgtcag                               37
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>argD2基因的ORF进行PCR的正向引物
<400>7
tcccccgggg gattggcatg aagggttac                                        29
<210>8
<211>28
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<223>argD2基因的ORF进行PCR的反向引物
<400>8
gctctagagc ttagaacaac gccccagc                                         28

Claims (6)

1.一种产L-精氨酸的微生物，所述微生物被含有编码argD2多肽的多核苷酸的重组载体进行了转化。
2.根据权利要求1所述的产L-精氨酸的微生物，其中所述的argD2多肽具有由SEQ IDNO.1表示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的产L-精氨酸的微生物，其中所述的多核苷酸由SEQ ID NO.2表示。
4.根据权利要求1所述的产L-精氨酸的微生物，其中所述的微生物属于棒状杆菌属。
5.根据权利要求1所述的产L-精氨酸的微生物，其中所述的微生物是保藏编号为KCCM10820P或KCCM10821P的微生物。
6.一种生产L-精氨酸的方法，所述方法包括培养权利要求1-5中任何一项权利要求所述的微生物的步骤。
CN2008800024901A 2007-01-18 2008-01-11 产l-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌变种及其制备方法 Active CN101688212B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070005831 2007-01-18
KR10-2007-0005831 2007-01-18
KR1020070005831A KR100830289B1 (ko) 2007-01-18 2007-01-18 Ｌ－아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법
PCT/KR2008/000204 WO2008088148A1 (en) 2007-01-18 2008-01-11 Corynebacterium glutamicum variety producing l-arginine and method for fabricating the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101688212A true CN101688212A (zh) 2010-03-31
CN101688212B CN101688212B (zh) 2012-07-04

Family

ID=39636117

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008800024901A Active CN101688212B (zh) 2007-01-18 2008-01-11 产l-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌变种及其制备方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8048648B2 (zh)
EP (1) EP2102347B9 (zh)
JP (1) JP5214633B2 (zh)
KR (1) KR100830289B1 (zh)
CN (1) CN101688212B (zh)
AT (1) ATE505553T1 (zh)
DE (1) DE602008006165D1 (zh)
DK (1) DK2102347T3 (zh)
ES (1) ES2364881T3 (zh)
PL (1) PL2102347T3 (zh)
WO (1) WO2008088148A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154160A (zh) * 2010-12-29 2011-08-17 广东环西生物科技股份有限公司 一种产l-精氨酸的菌株和利用该菌株生产l-精氨酸的方法
CN108226346A (zh) * 2018-01-18 2018-06-29 朱路英 一种检测门冬氨酸鸟氨酸特定杂质的分析方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101174267B1 (ko) 2010-01-06 2012-08-14 씨제이제일제당 (주) Ｌ-오르니틴 또는 ｌ-아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법
MY171291A (en) 2013-04-16 2019-10-07 Cj Cheiljedang Corp Microorganisms having l-tryptophan productivity and a method for production of l-tryptophan using same
KR101500073B1 (ko) 2013-04-23 2015-03-06 씨제이제일제당 (주) L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법
KR101835935B1 (ko) 2014-10-13 2018-03-12 씨제이제일제당 (주) L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 제조 방법
KR101687474B1 (ko) * 2015-02-02 2016-12-28 씨제이제일제당 (주) L-아르기닌 생산능이 향상된 코리네박테리움속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 생산 방법
KR20240013961A (ko) * 2022-07-21 2024-01-31 대상 주식회사 L-아르기닌 또는 l-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 또는 l-시트룰린의 생산 방법
KR20240013960A (ko) * 2022-07-21 2024-01-31 대상 주식회사 L-아르기닌 또는 l-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 또는 l-시트룰린의 생산 방법

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6312292A (ja) * 1986-07-03 1988-01-19 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Ｌ−リジンの製造法
AU761990B2 (en) * 1998-10-19 2003-06-12 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid producing bacterium and process for producing L-glutamic acid
KR100834991B1 (ko) 1999-06-25 2008-06-05 백광산업 주식회사 대사 경로 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰유전자
ATE486941T1 (de) * 2000-03-09 2010-11-15 Evonik Degussa Gmbh Corynebacterium glutamicum gene, die für stoffwechselproteine kodieren
EP1201758B1 (en) * 2000-10-27 2008-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Microorganisms and method for L-arginine production by fermentation
BR0211723A (pt) * 2001-08-06 2004-09-21 Degussa Bactérias corineformes que produzem compostos quìmicos i
DE10154292A1 (de) * 2001-11-05 2003-05-15 Basf Ag Gene die für Stoffwechselweg-Proteine codieren

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154160A (zh) * 2010-12-29 2011-08-17 广东环西生物科技股份有限公司 一种产l-精氨酸的菌株和利用该菌株生产l-精氨酸的方法
CN108226346A (zh) * 2018-01-18 2018-06-29 朱路英 一种检测门冬氨酸鸟氨酸特定杂质的分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE602008006165D1 (de) 2011-05-26
JP2010515468A (ja) 2010-05-13
JP5214633B2 (ja) 2013-06-19
US8048648B2 (en) 2011-11-01
ES2364881T3 (es) 2011-09-16
EP2102347A1 (en) 2009-09-23
EP2102347A4 (en) 2010-01-27
WO2008088148A1 (en) 2008-07-24
PL2102347T3 (pl) 2011-09-30
DK2102347T3 (da) 2011-08-01
US20100041109A1 (en) 2010-02-18
EP2102347B9 (en) 2012-01-11
CN101688212B (zh) 2012-07-04
KR100830289B1 (ko) 2008-05-16
EP2102347B1 (en) 2011-04-13
ATE505553T1 (de) 2011-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101688212B (zh) 产l-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌变种及其制备方法
JP5091330B2 (ja) 遺伝子増幅によるリジン産生の増加
CN101027389B (zh) L-精氨酸、l-鸟氨酸或l-瓜氨酸的制备方法
CN101090911B (zh) 产生l-谷氨酸的微生物和产生l-谷氨酸的方法
KR101186128B1 (ko) Ｌ-아미노산 생산 세균 및 ｌ-아미노산의 생산 방법
CN100519740C (zh) 具有改善的l-赖氨酸生产力的棒杆菌属微生物和利用棒杆菌微生物生产l-赖氨酸的方法
CN105392880B (zh) 生产o-乙酰基高丝氨酸的微生物和用其生产o-乙酰基高丝氨酸的方法
CN101600796A (zh) 具有增强的l-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物以及使用所述微生物生产l-赖氨酸的方法
CN105658793A (zh) 具有增强的l-赖氨酸生产力的微生物和用于通过使用该微生物产生l-赖氨酸的方法
CN109777763A (zh) 一株用于l-茶氨酸生产的基因工程菌及其构建与应用
CN102498216A (zh) L-氨基酸的产生方法
CN1367244B (zh) 通过发酵生产l-精氨酸的微生物和方法
CN101960005A (zh) 5＇-鸟苷酸的生产方法
CN107922954A (zh) 具有l‑赖氨酸生产力的微生物和使用其生产l‑赖氨酸的方法
CN109456987A (zh) 高产l-亮氨酸的相关基因及工程菌构建方法与应用
JP2000189169A (ja) Ｌ―グルタミン酸生産菌及びｌ―グルタミン酸の製造法
CN101993904A (zh) 5’-鸟苷酸的生产方法
KR100830290B1 (ko) Ｌ－아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법
KR20080006799A (ko) 역가가 향상된 유전자 ａｒｇＦ 염기서열 및 그를 포함하는형질전환 균주를 이용한 Ｌ―알지닌의 생산방법
TWI789734B (zh) 新穎啟動子及使用其生產麩胱甘肽的方法
CN108026147A (zh) 生产o-乙酰-高丝氨酸的微生物和使用其生产o-乙酰-高丝氨酸的方法
KR101622460B1 (ko) Ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 미생물 및 이를 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법
KR20230053351A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
CN116262915A (zh) 3-异丙基苹果酸脱水酶突变体及其应用
JP2024014657A (ja) Ｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリンの生産方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant