CN103204732B - 含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料及其制备方法和应用，属于复合微生物菌肥领域。本发明将地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌通过液体发酵制成菌液，与复配的复合营养素按照1:1的质量比混合制成高效液态复合微生物肥料。本发明在巨大芽孢杆菌的良好解磷能力、苏云金芽孢杆菌良好的抗虫能力以及解淀粉芽孢杆菌良好的降解有机质能力的基础上，配合地衣芽孢杆菌高产γ-聚谷氨酸卓越的保水、保肥、环境无污染性，以达到更优的肥效及更少的用水，从而形成科学合理的复合肥搭配。

Description

含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于复合微生物肥料领域，具体涉及一种含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料及其制备方法和应用。

背景技术

在我国生态环境保护的十大对策中明确提倡要推广“生态农业”，保护生态环境和农田土壤，推动无公害健康食品的生产，保证有足够数量有机质返回土壤，以促进生态***中生物循环，达到保持和增强土壤肥力及生物活性目的。微生物菌剂能起到防止病害并且对人畜无毒无害，是优质无公害农产品生产的优选生产资料。随着我国现代农业的快速发展，特别是绿色有机农业种植面积不断扩大，将特定微生物菌融入到肥料中来，生产出对土壤有益并且功能全面的肥料产品成为当今肥料生产企业研制的重点。

目前田间对作物施用过量的有机/无机肥料进入土壤后，其残留物积累到一定程度时对土壤生态环境造成危害，且尚未有产品添加产聚谷氨酸的菌株。复合微生物肥料是一种复合肥为基肥，富含多种功能菌的新型无公害生物肥料。其中的功能菌会调节土壤菌群的平衡，具有改良土壤结构、提高土壤肥力与产出水平，改善植物品质等作用。尤其添加了聚谷氨酸的生产菌株，其代谢产物聚谷氨酸使其具有更佳的保水、保肥效果。

目前对于复合微生物菌肥的研发已成为趋势，近年来关于复合微生物菌肥的专利也屡见不鲜，但尚未出现添加聚谷氨酸高产菌株的微生物菌肥的发明。本发明在复合生物菌肥的基础上添加卓效成分γ-聚谷氨酸的生产菌株——地衣芽孢杆菌，使其菌株本身与产物功能相结合，既能抗真菌病害、增产，又有卓越的节水、省肥效果。良好的生物降解性使微生物肥料不对环境造成污染，起到好且绿色的肥效作用。

γ-聚谷氨酸是自然界中微生物发酵产生的细胞外阴离子型多聚氨基酸，由D型谷氨酸、L型谷氨酸单体之间通过α氨基和γ-羧基以酰胺键形式形成的高分子聚合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料及其制备方法，本发明提供的复合微生物肥料是以有机-无机复合营养素为基肥，添加各类功能微生物和γ-聚谷氨酸的高产菌株地衣芽孢杆菌，从而有效提高土壤肥力，改善作物生长环境。

本发明的另一目的是将本发明所述含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料应用于土壤施肥中。

本发明的技术方案如下：

所述含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料的组成包括微生物发酵菌液和复合营养素；

所述微生物发酵菌液：复合营养素的质量比为1:1；

所述微生物发酵菌液的组成为：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）四种菌株的发酵液以1:1:1:1的质量比混合；

本发明所述γ-聚谷氨酸高产菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），通过从纳豆中分离得到，于2009年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC3336。

所述复合营养素包括氮、磷、钾元素，微量元素，有机质，复合氨基酸，小麦草粉；

所述氮元素为尿素、硫酸铵、氯化铵中的至少一种；

所述磷元素为磷酸一铵、磷酸二铵、过磷酸钙、磷酸二氢钾中的至少一种；

所述钾元素为硫酸钾、氯化钾、碳酸钾、硝酸钾中的至少一种；

所述微量元素组成为：钙、镁、硅、锌、锰、硼、铁、铜，均以其可溶性化合物的形式添加；

所述有机质为腐植酸或可溶性蛋白或两者的混合物；

所述复合氨基酸的组成为：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；

所述含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料的制备方法如下：

（1）斜面活化

将4℃斜面保存的地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌菌株活化，后将其分别划线接种于LB固体平板培养基上，培养24h；

（2）种子液制备

挑取活化的菌落，分别接种于LB液体培养基中，37℃、180rpm培养20h；

（3）发酵培养

将培养好的种子液分别以10%的接种量接种至发酵培养基，37℃，转速300rpm，通风比1:1，地衣芽孢杆菌发酵24h-48h后收集发酵菌液，苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌菌株活化发酵20h后收集发酵菌液；

所述苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的发酵培养基组成为：以质量百分比计，1%葡萄糖，0.6%磷酸氢二钾，0.3%磷酸二氢钾，0.15%尿素，0.5%酵母粉，0.41‰硫酸镁，其余为水，pH7.0-7.2；

所述地衣芽孢杆菌的发酵培养基组成为：以质量百分比计，2%蔗糖、0.4%牛肉膏、2%谷氨酸钠、1.2%MgSO₄·7H₂0、0.06%K₂HPO₄·3H₂O，其余为水，pH7.5。

（4）硅藻土固定

在步骤（3）收集的发酵菌液中加入质量比10%的硅藻土以固定菌体并促进菌体休眠；

（5）添加复合营养素

将步骤（4）所述四种菌液以1:1:1:1的质量比混合，将复合营养素按照比例添加到混合菌液中，充分混匀；

（6）灌装

将上述混匀液体加入经紫外消毒的塑料瓶中，贴产品标签，即得本发明所述复合微生物肥料。

本发明所述含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料可稀释适当倍数后直接喷涂于种植物叶面或直接用于浸种，也可应用于土壤施肥中。

有益效果：

γ-聚谷氨酸在农业上具有促进作物生长从而提高作物产量潜在的功能。在 γ-聚谷氨酸浸种的发芽试验中发现，小白菜、小麦、玉米、棉花等中字的芽长、 根长、发芽系数、淀粉酶活力和过氧化氢酶活力等均有不同程度的提高，说明γ -聚谷氨酸可以提高种子活力。还证明了γ-聚谷氨酸能提高小白菜的产量，在肥 料较贫乏的时候提高产量的幅度更大，具有显著的保费增效作用。γ-聚谷氨酸 对烟草种子的浸种试验也表明，γ-聚谷氨酸能够显著提高烟草的根长、芽长以 及各种酶的活性。

γ-PGA作为肥料增效剂，具有促进农作物对营养的吸收，节肥增效，增产提质，增强作物抗病能力等功效，并对肥料具有很好的缓释作用，可降低过量或施用化肥不当等造成的环境污染。γ-PGA还具有多阴电性，能有效阻止化肥中的SO₄ ^2-、CO₃ ^2-等离子与Ca²⁺、Mg²⁺等微量元素相结合，避免产生低溶解性盐类的沉淀效应，使作物能更有效吸收土壤中的营养元素，促进作物根系发育，增强抗病性。对于Pb²⁺、Cu²⁺等重金属离子，γ-PGA 有良好的螯合效果，可作为重金属吸收剂；此外，对酸、碱具有较好的缓冲能力，可有效平衡土壤的酸碱值，避免因长期使用化学肥料造成的土质酸化及土壤板结化。γ-PGA为纯天然的生物制剂，可自然分解，生成氨基酸，不会造成对环境的二次污染。γ-聚谷氨酸的水浸液在土壤中具有一定的保水力和较理想的释放效果，有明显的抗旱促苗效应。γ-聚谷氨酸较强的吸水和保水能力，可明显提高小麦和黑麦草的发芽率，并可降低用水成本。

地衣芽孢杆菌为γ-聚谷氨酸的生产菌株，地衣芽孢杆菌对植物的真菌性病害有较好的抑制效果。拮抗性强、抗菌谱广。地衣芽孢杆菌对小麦全蚀病菌、番茄早疫病菌、油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌、辣椒炭疽病菌、马铃薯于腐病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌、柑桔青霉病菌、棉花枯萎病菌等多种病原菌有明显的抑制作用。另外，由于地衣芽孢杆菌在发酵过程中可以产生玉米素、异戊烯基腺嘌呤、玉米素核苷和细胞***素等植物生长调节剂，也可作为玉米增产物质使用。综上所述，在菌肥常用菌种中加入高产γ-聚谷氨酸高产菌株地衣芽孢杆菌，可起到菌、肥、聚谷氨酸协同作用，达到更好的效果。

本发明所述地衣芽孢杆菌，γ-聚谷氨酸产量达到42g/L以上。试验表明，施用了本发明所述的复合微生物肥料能够显著提高油菜的株高、叶片数、叶长、叶宽、茎粗和干重；使用其浸种可提高出苗率；对玉米有增产作用；且由于γ-聚谷氨酸的保水、节水性，可使灌溉用水量节省10%，降低了成本。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1

将地衣芽孢杆菌种子液接入发酵培养基中，37℃，转速300rpm，通风比1:1，发酵24～48小时得发酵菌液，所述发酵培养基组成为：以质量百分比计，2%蔗糖、0.4%牛肉膏、2%谷氨酸钠、1.2%MgSO₄·7H₂0、0.06%K₂HPO₄·3H₂O，其余为水，pH7.5；

将巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的种子液分别接入发酵培养基中，37℃，转速300rpm，通风比1:1，发酵20h得发酵菌液，所述发酵培养基组成为：以质量百分比计，1%葡萄糖，0.6%磷酸氢二钾，0.3%磷酸二氢钾，0.15%尿素，0.5%酵母粉，0.41‰硫酸镁，其余为水，pH7.0-7.2；

上述四种菌株所得发酵菌液，加质量比10%的硅藻土固定，而后菌液以质量比1:1:1:1混合；

复合营养素各组份的重量份数为：尿素8份，磷酸一铵4份，硫酸钾4份，螯合钙15份，螯合镁15份，硅酸钠3份，螯合锌8份，螯合锰4份，硼酸8份，螯合铁8份，螯合铜4份，腐植酸0.5份，可溶性蛋白5份，复合氨基酸3份，小麦草粉5份。

所述复合氨基酸中各组分的重量份数为：丙氨酸5份、精氨酸10份、天冬氨酸5份、胱氨酸3份、谷氨酸2份、甘氨酸2份、组氨酸3份、赖氨酸10份、蛋氨酸3份、苯丙氨酸5份、脯氨酸2份、丝氨酸1份、苏氨酸10份、色氨酸5份、酪氨酸15份、缬氨酸10份；

以菌液：复合营养素的质量比为1:1混匀，即得产品1。

所述苏云金芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌菌种购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为：CGMCC1.792，CGMCC1.1226，CGMCC1.234，购买时间：2012年7月。地衣芽孢杆菌为CGMCC3336。

实施例2

微生物菌液的发酵制备基本同实施例1；

复合营养素各组分的重量份数为：尿素8份，磷酸一铵4份，硫酸钾4份，磷酸二氢钾80份，螯合钙15份，硫酸镁10份，硅酸钠3份，硫酸锌5份，硫酸锰2份，硼酸8份，硫酸亚铁5份，硫酸铜2.5份，腐植酸0.5份，大豆蛋白胨8份，复合氨基酸2份，小麦草粉3份。

所述复合氨基酸各组分的重量份数为：丙氨酸5份、精氨酸10份、天冬氨酸5份、胱氨酸3份、谷氨酸2份、甘氨酸2份、组氨酸3份、赖氨酸10份、蛋氨酸3份、苯丙氨酸5份、脯氨酸2份、丝氨酸1份、苏氨酸10份、色氨酸5份、酪氨酸15份、缬氨酸10份；

以菌液：复合营养素的质量比为1:1混匀，即得产品2。

实施例3

微生物菌液的发酵制备基本同实施例1；

复合营养素各组分的重量份数为：尿素88份，磷酸一铵4份，硫酸钾4份，螯合钙10份，硫酸镁6份，螯合镁6份，硅酸钠2份，硫酸锌3份，螯合锌3份，硫酸锰2份，螯合锰2份，硼酸5份，螯合铁5份，螯合铜2.5份，腐植酸0.5份，大豆蛋白胨3份，复合氨基酸3份，小麦草粉5份。

所述复合氨基酸各组分的重量份数为：丙氨酸5份、精氨酸10份、天冬氨酸5份、胱氨酸3份、谷氨酸2份、甘氨酸2份、组氨酸3份、赖氨酸10份、蛋氨酸3份、苯丙氨酸5份、脯氨酸2份、丝氨酸1份、苏氨酸10份、色氨酸5份、酪氨酸15份、缬氨酸10份；

以菌液：复合营养素的质量比为1:1混匀，即得产品3。

实施例4

将产品1以200g/亩的浓度稀释后施浇于黄瓜，播种前和出苗后各浇1次，每2天施浇清水一次。在苗龄为35d时取样进行各项指标的测定。

表1本发明对黄瓜幼苗生长势的影响

	施用本发明	未施本发明
			株高/cm	12	10
茎粗/cm	0.45	0.65
			叶面积/cm2	60	75
地上鲜重/g	9	12
			地上干重/g	0.5	1.0
地下鲜重/g	0.8	1.6
			地下干重/g	0.05	0.12

实施例5

将产品2以200g/亩的浓度稀释后用于小麦浸种，拔节后期测定小麦株高，并以未加聚谷氨酸生产菌的菌肥为对照组。

表2拔节后期各处理小麦高比较

实施例6

将产品3以200g/亩的浓度稀释后施于玉米后测定玉米各项参数，以未加聚谷氨酸生产菌的菌肥为对照组，结果表明，施用了本发明的玉米各项指标均优于对照组，说明聚谷氨酸生产菌的加入有益于玉米的增产。

表3玉米长势比较

Claims (7)

1.含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料，其特征在于，所述含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料的组成包括微生物发酵菌液和复合营养素；所述微生物发酵菌液：复合营养素的质量比为1:1；

所述微生物发酵菌液的组成为：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)四种菌株的发酵液以1:1:1:1的质量比混合；

所述复合营养素包括氮、磷、钾元素，微量元素，有机质，复合氨基酸，小麦草粉；

所述聚谷氨酸高产菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC 3336；

所述有机质为腐植酸或可溶性蛋白或两者的混合物；

所述复合氨基酸的组成为：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；

所述地衣芽孢杆菌的发酵培养基组成为：以质量百分比计，2％蔗糖、0.4％牛肉膏、2％谷氨酸钠、1.2％MgSO₄·7H₂0、0.06％K₂HPO₄·3H₂O，其余为水，pH 7.5。

2.根据权利要求1所述的含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料，其特征在于，所述氮元素为尿素、硫酸铵、氯化铵中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料，其特征在于，所述磷元素为磷酸一铵、磷酸二铵、过磷酸钙、磷酸二氢钾中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料，其特征在于，所述钾元素为硫酸钾、氯化钾、碳酸钾、硝酸钾中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料，其特征在于，所述微量元素组成为：钙、镁、硅、锌、锰、硼、铁、铜，均以其可溶性化合物的形式添加。

6.根据权利要求1-5任一所述的含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)斜面活化

将4℃斜面保存的地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌菌株活化，后将其分别划线接种于LB固体平板培养基上，培养24h；

(2)种子液制备

挑取活化的菌落，分别接种于LB液体培养基中，37℃、180rpm培养20h；

(3)发酵培养

将培养好的种子液分别以10％的接种量接种至发酵培养基，37℃，转速300rpm，通风比1:1，地衣芽孢杆菌发酵24h-48h后收集发酵菌液，苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌菌株活化发酵20h后收集发酵菌液；

所述苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的发酵培养基组成为：以质量百分比计，1％葡萄糖，0.6％磷酸氢二钾，0.3％磷酸二氢钾，0.15％尿素，0.5％酵母粉，0.41‰硫酸镁，其余为水，pH 7.0-7.2；

所述地衣芽孢杆菌的发酵培养基组成为：以质量百分比计，2％蔗糖、0.4％牛肉膏、2％谷氨酸钠、1.2％MgSO₄·7H₂0、0.06％K₂HPO₄·3H₂O，其余为水，pH 7.5；

(4)硅藻土固定

在步骤(3)收集的发酵菌液中加入10％的硅藻土以固定菌体并促进菌体休眠；

(5)添加复合营养素

将步骤(4)所述四种菌液以1:1:1:1的质量比混合，将复合营养素按照比例添加到混合菌液中，充分混匀；

(6)灌装。

7.根据权利要求1-5任一所述的含聚谷氨酸高产菌的复合微生物肥料在土壤施肥中的应用。