JP7437055B2 - 組成物、抗酸化剤、抗糖化剤、神経突起伸長促進剤及び認知機能改善剤 - Google Patents
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Description
プロポリスは、例えば、常法に従い養蜂産品として入手することができる。プロポリスは、それ自体に抗酸化、抗炎症、認知機能低下抑制等の作用がある。プロポリスは、アレクリン由来、ユーカリ由来、ポプラ由来、クルシア属植物由来等、いずれの植物由来であってもよい。生理活性の高さの観点から、アレクリン由来のプロポリスが好ましい。アレクリンはキク科バッカリス属のバッカリス・ドゥラクンクリフォリア(Baccharis dracunculifolia)である。
イチョウ葉抽出物は、イチョウ(Ginkgo bilobaL.)の葉から得られる抽出物である。イチョウ葉抽出物はそれ自体に、脳血流改善、抗炎症等の作用がある。抽出溶媒は、例えば、エタノール等のアルコール、アセトンなどの有機溶媒、水、又はこれらの混合液であってよい。抽出溶媒は水であることが好ましい。抽出原料であるイチョウ葉は、新鮮なものでも乾燥したものでもよく、粉末であってもよい。イチョウ葉抽出物は、イチョウ葉から得られた抽出物に更に精製、濃縮、乾燥等の処理をしたものであってもよい。イチョウ葉抽出物は、樹脂カラム精製等によってギンコール酸が除去されたものであってもよい。
ホスファチジルセリンは、合成品であってよく、植物又は動物由来のものであってもよい。ホスファチジルセリンは例えば大豆レシチン等の植物由来レシチンを原料として酵素反応により得ることができる。ホスファチジルセリンはそれ自体に、記憶力改善、認知機能改善等の作用がある。
コーヒー果実抽出物は、コーヒー果実から抽出して得られるものである。コーヒー果実とは、コーヒーの木の果実であり、外果皮、果肉、粘質物、殻、茎及び種子を含んでいてよい。コーヒーはアラビカ種を用いることが好ましい。抽出溶媒は、例えば、エタノール、メタノール等のアルコール、アセトンなどの有機溶媒、水であってよく、これらの混合液であってよい。コーヒー果実抽出物としては、コーヒー果実から得られた抽出物を更に精製、濃縮、乾燥等の処理を施したものであってもよい。
クルクミンは、ウコン(Curcuma longa)等の植物に含まれる色素成分である。クルクミンはそれ自体に、抗酸化、抗炎症、アミロイドβ抑制、腸管バリア等の作用がある。クルクミンは、例えばウコン根茎から公知の方法によって抽出することができる。ウコン抽出物としては、例えばウコン根茎から水、熱水、エタノール等の有機溶媒、又はこれらの混合液を抽出溶媒として用いて抽出して得たものであってよい。本実施形態に係る剤又は組成物は、クルクミン源として、例えば、ウコンの根又はその抽出物を含んでいてもよい。上記剤又は組成物は、クルクミン以外のウコン由来成分を含んでいてもよい。クルクミンは、微粒子化等の公知の方法により吸収性が高められたものであってもよい。
ゴツコラ抽出物は、ゴツコラ(Centella asiatica Umbelliferae)から抽出して得ることができる。ゴツコラ抽出物はそれ自体に、認知機能改善、神経障害改善等の作用がある。ゴツコラはツボクサとも呼ばれる。ゴツコラの抽出部位は、花、花穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草であってよい。ゴツコラの抽出部位は葉、茎又は全草であることが好ましい。抽出溶媒は例えば水、エタノール等のアルコールであってよい。ゴツコラ抽出物としては、植物体から得られた抽出物を更に精製、乾燥等の処理を施したものであってもよい。
神経増殖因子(NGF、Nerve Growth Factor)をコリン作動性ニューロンへ標的輸送することで細胞死を防ぎ、NGFがシナプスのコリン作動性受容体を刺激することで、認知改善を促進する報告がなされている。未成熟な細胞は球状に近い形態をとることが多く、分化して機能性を持つ過程でそれぞれ特徴的な構造を持つ傾向にある。神経細胞の場合は、最終分化の際に無数の突起を形成し、ニューロンとなる。本試験においては、あらかじめNGFを低濃度(10ng/ml)で作用させることで、PC12を神経分化方向へプライミングし、ここに、試料を加えることで、試料の神経分化誘導能に与える影響について解析を行った。
プロポリス(プロポリスエタノール抽出物、APIプロポリス、EEP-B55A):分子生物学用エタノールに10mg/mLの濃度で溶解し、0.2μmのフィルターに通したのち-80℃で保管したものを用いた。
イチョウ葉抽出物(水抽出物、常磐植物化学):ジメチルスルホキシド(DMSO)に100mg/mLで溶解し、0.2μmのフィルターに通したのち、-80℃で保管したものを用いた。
神経成長因子-β(ラット由来)
細胞:PC12(JCRB0733,06082017)
培地:CCM(Completely Culture Medium)
RPMI 1640
10%ウマ血清
5%ウシ胎児血清
1%ペニシリン-ストレプトマイシン(ナカライテスク)
DM(Differentiation Medium):
RPMI 1640
2%ウマ血清
1%ウシ胎児血清
1%ペニシリン-ストレプトマイシン
10ng/mL NGF-β
培養条件:37℃、5%CO2
酸化ストレス誘導剤としてメナジオンを用いた抗酸化評価試験を行った。メナジオンの培養細胞への処理は、細胞内に活性酸素(ROS)を生じ、酸化ストレスによる細胞死を誘導することが報告されている。そのためメナジオンは細胞に対する酸化ストレス保護作用のある素材の評価に用いられている。
プロポリスと各試料との組合せによる抗酸化能をORAC(酸素ラジカル吸収能力)試験によって検証した。試料としては以下のものを用いた。
プロポリス:エタノール抽出物粉末(ブラジル産グリーンプロポリス、賦形剤としてアルギニンを含む。)
ホスファチジルセリン:合成品
コーヒー果実抽出物:水/エタノール抽出物粉末
ゴツコラ抽出物:水抽出物粉末(賦形剤としてマルトデキストリン10%未満を含む。)
ホスファチジルセリン:振とう抽出及び超音波抽出の後、遠心分離
プロポリス+ホスファチジルセリン:超音波抽出のみ(遠心分離無し)
ゴツコラ抽出物、プロポリス+ゴツコラ抽出物:超音波抽出の後、遠心分離
上記以外のサンプル:溶解のみ(抽出工程・遠心分離無し)
プロポリスと各試料との組合せによる抗糖化能を、AGEs(advanced glycation end products)測定試験によって検証した。試料としては、プロポリス、ホスファチジルセリン、コーヒー果実抽出物、クルクミン及びイチョウ葉抽出物を用いた。プロポリス、ホスファチジルセリン及びコーヒー果実抽出物については試験例3と同様のものを用いた。イチョウ葉抽出物としては、イチョウ葉エタノール・水抽出物粉末を用いた。クルクミン源としては、ウコン抽出物(酢酸エチル抽出物粉末、クルクミン含有量95質量%)を用いた。
AGEs産生阻害率(%)={1-(A-B)/(C-D)}×100
A:試料溶液・アルブミン溶液・グルコース溶液の混合液における産生量
B:試料溶液・アルブミン溶液の混合液における産生量
C:アルブミン溶液・グルコース溶液の混合液における産生量
D:アルブミン溶液における産生量
Nrf2は酸化ストレスにより活性化される転写因子で、その下流には抗酸化、解毒代謝に関わる遺伝子が存在する。Nrf2経路が認知症に影響することが動物レベルで報告されており、Nrf2の活性化による認知機能改善が期待される。本試験では、Nrf2の下流の転写応答配列であるAREをレポーターベクターに組み込んだ、PC12/AREレポーター細胞を用い試験し、Nrf2経路活性化の相乗作用を調べた。
神戸薬科大学より分与されたPC12/AREレポーター細胞(以下PC12/ARE)を用いた。該細胞は、PC12細胞に、Nrf2の下流遺伝子である、ラット由来NADPH:quinone oxidoreductase 1(NQO1)遺伝子のARE配列を含むプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込み、安定発現させたものである。
維持培地:上記基本培地に、レポーター細胞株選択のため300μg/mLの濃度となるようにHygromycin B(Wako,Cat:085-06153)を添加し調製した。
PC12/AREはPC12/ARE培養プロトコルに従い維持及び継代した。培地は2~3日に1回交換した。
PC12/AREを1×104cells/20μL/wellとなるように、384well plate(White plate)に播種した。培養には基本培地を用いた。一晩培養後、5μlサンプルを添加し、さらに、24時間後にONE-Glo(登録商標)Luciferase Assay Reagent(Promega,Cat:E6120)を25μL加え、3分間インキュベーション後、レポーター活性をEnvision(PerkinElmer)によって測定した。
プロポリス、クルクミン及びイチョウ葉抽出物を、50mg/mlとなるようにDMSOにそれぞれ懸濁し、1時間撹拌した後、遠心分離し上清を得た。プロポリス、クルクミン及びイチョウ葉抽出物としては、試験例3又は4で用いたものと同様のものを用いた。上清は0.22μmのフィルターでろ過後、分注し、-30℃で保存した。各サンプルは試験時に溶解し、DMSO及び基本培地で希釈した。
PC12/ARE細胞に、プロポリス4.5μg/ml、クルクミン13.8μg/ml、イチョウ葉抽出物6.6μg/mlの濃度で、それぞれ単独で、又は表3に示す組み合わせで添加し、24時間後のレポ―ター活性を測定した。その結果、プロポリス及びクルクミンとの組合せ、並びにプロポリス、クルクミン及びイチョウ葉抽出物の組合せでは、それぞれの成分を単独で添加した場合に対して相乗効果が認められた。
プロポリス抽出物、イチョウ葉抽出物、ホスファチジルセリン、クルクミン、コーヒー果実抽出物、及びゴツコラ抽出物を含む複合サプリメントをヒトに投与し効果を検証した。
以下の選択基準を全て満たし、かつ以下の除外基準のいずれにも該当しない90名を試験の対象者とした。
1)選択基準
・同意取得時の年齢が40歳以上80歳未満の男女
・Mini-Mental State Examination(MMSE)が24点以上29点以下の者
・物忘れの自覚を有する者、あるいは物忘れを他人に指摘されたことがある者
2)除外基準
・認知症であると医師に判定されたことがある者、または認知機能に影響を及ぼす可能性がある疾患に罹患している者
・認知症治療薬を服用している者、あるいは服用していたことがある者
・認知に影響を与える可能性がある薬剤(第一世代抗ヒスタミン薬、ベンゾジアゼピン、鎮静剤、オピエート、安定剤、抗うつ剤、コリン作動薬、抗コリン薬、処方抗炎症薬)を定期的に服用している者
・精神障害(うつ症状を含む)、または脳血管疾患の現病歴、既往歴がある者
・認知機能に影響を及ぼす可能性があるサプリメント・健康食品(機能性表示食品を含む)を常用している者
・被験者背景アンケートの結果、食事、睡眠等の生活習慣が極度に不規則であった者
・老年期うつ尺度(Geriatric Depression Scale-Short Version-Japanese:GDS-S-J)が6点以上の者
・アルコール依存の既往歴あるいは現病歴がある者
・日常的にアルコールを多量摂取する者(ビール350mL、ワイン180mL弱を週に14本以上飲む者)
・糖尿病、肝疾患、腎疾患、心疾患等の重篤な疾患現病歴・既往歴を有する者
・薬物依存又は食物アレルギーの既往歴・現病歴がある者
・色覚障害者、近距離でも人の話が聞こえにくい者
・怪我、手術等で両手の機能に問題がある者
複合サプリメントの投与量は、1日当たり3球(ハードカプセル)とした。複合サプリメントは、3球中に、プロポリス(アルテピリンCとして4.25mg)、クルクミン175mg、大豆由来ホスファチジルセリン100mg、イチョウ葉抽出物(イチョウ葉由来フラボノイド配糖体として28.8mg、イチョウ葉由来テルペンラクトンとして7.2mg)、ゴツコラ抽出物(225mg)、及びコーヒー果実抽出物(100mg)を含有する。それぞれの成分は試験例3又は4で用いたものと同様である。複合サプリメントは添加物として更に微粒二酸化ケイ素等を含む。プラセボは上記成分を澱粉で置き換えたものとし、複合サプリメント及びプラセボには互いに外観に類似性をもたせ、食品間で識別がつかないようにした。複合サプリメント及びプラセボの成分組成(1日摂取量、3球当たり)は表4のとおりである。
本試験は日本橋循環器科クリニック試験審査委員会の審議及び承認を得た上で、ヘルシンキ宣言(2013年VMAフォルタレザ総会で修正)、及び人を対象とする医学系研究に関する倫理指針を遵守した。試験プロトコルは大学病院医療ネットワーク臨床試験システムに登録した。
(MCIスクリーン)
軽度認知障害(Mild Cognitive Impairment:MCI)という用語は、認知症の前駆状態という意味で用いられている。新たな治療法開発に伴って認知症の早期判断が重要になったため、MCIの診断が注目されている。MCIスクリーンはShankleらにより開発された記憶力及び注意力を総合的に評価する認知機能検査である。MCIスクリーンのうち、MPIスコア及び即時記憶課題得点について測定した。MPIスコアは主に即時記憶課題及び遅延記憶課題の得点を総合的に評価するものである。
コグニトラックスはCNS Vital Signを基盤とした一般的な認知検査である。本試験では言語記憶テスト(VBM)、視覚記憶テスト(VIM)、指たたきテスト(FTT)、SDCテスト(SDC)、ストループテスト(ST)、注意シフトテスト(SAT)、持続処理テスト(CPT)、4パート持続処理テスト(FPCPT)を実施し、同年代との比較による換算値である標準化スコア(平均100)にて評価した。これらのテストを基に、ST誤反応について評価した。
被験者の血液を採取し、腫瘍壊死因子(TNF-α、血清)、BDNF(血漿)、及び肝機能指標としてASTの量を測定した。TNF-αは、炎症を通した生体防御機構に深く関わるサイトカインとして知られている。ASTは、肝細胞が損傷を受けると血液中に放出され、その原因の1つとして炎症が考えられている。TNF-α及びASTは株式会社LSIメディエンスにて、BDNFは日研ザイル株式会社日本老化制御研究所にて評価した。
VASは、自覚症状を検出するための試験である。睡眠の質について、「睡眠の質はどうですか?」という問いにより評価した。画面上に直線を示し、直線の左端(0)を「非常に悪い」、直線の右端(100)を「非常に良い」とし、被験者のそのときの状態を直線上にマークさせた。
QOL(quality of life)の評価尺度であるSF-36のうち、社会生活機能(過去1カ月間に、身体的あるいは心理的な理由で人つきあいが妨げられた度合い)について評価した。得点は国民標準値に基づいてスコアリング(norm-based scoring:NBS)し、標準スコア(平均50)として算出した。
測定値は平均値±標準偏差で示した。摂取前に対する飲用12週後の群内比較をpaired t-test、プラセボ群に対する複合サプリメント群の群間比較をStudent’s t-testにて実施した。また、摂取前を基準とする摂取12週間後の変化量(Δ)についても同様に群間比較を実施した。検定はいずれも両側検定とした。統計解析ソフトはSPSS Ver.25(アイ・ビー・エム株式会社)を用いた。
合計90名(各群45名)が対象者として試験に参加した。このうち、認知機能との関連が報告されている肝機能指標のAST、ALT及びγ-GTPが異常値(摂取前)から半値以下(摂取12週後)に減少した2名(プラセボ群1名、複合サプリメント群1名)、認知機能との関連が報告されている血圧の摂取前後の変動が外れ値(<平均-3SD)となった1名(複合サプリメント群)、試験食摂取開始時に飲用していた血圧の治療薬を試験期間中に停止した1名(プラセボ群)、認知機能との関連が報告されている炎症マーカーの一つであるhsCRPの摂取前後の変動が外れ値(>平均+3SD)となった2名(プラセボ群1名、複合サプリメント群1名)、摂取前後の体重変動が外れ値(<平均-3SD)となった1名の計7名に関しては、生活習慣を一定に保つことができていない可能性が高く、認知機能に対する影響検証の精度に悪影響がある可能性があると判断し、解析対象から除外した。
(認知機能検査)
MCIスクリーンの結果を表6に示す。摂取前を基準とする摂取12週後のMPIスコア及び即時記憶課題得点の変化量(Δ)において、複合サプリメント群はプラセボ群と比較して有意な改善が認められた(それぞれP=0.047、P=0.010)。
脳内BDNFは健常人と比較して認知症患者では低下すること、血中と脳内のBDNF濃度は相関していることが知られている。そこで、BDNF濃度が第一四分位未満の集団を認知機能が低下するリスクが高い集団として分類し、コグニトラックス検査結果について部分集団解析を実施した。なお、背景の年齢、性別、BMI及びMMSEにおいて群間有意差は認められなかった(表11)。
Claims (9)
- プロポリス及びイチョウ葉抽出物を有効成分として含む、抗糖化剤。
- プロポリス及びイチョウ葉抽出物を有効成分として含む、神経突起伸長促進剤。
- DHA及びEPAの少なくとも一方を含まない、請求項1又は2に記載の剤。
- プロポリスと、コーヒー果実抽出物及びゴツコラ抽出物からなる群から選ばれる少なくとも1種とを含み、前記コーヒー果実が、コーヒー果実の外果皮、果肉、粘質物、殻、及び茎からなる群から選ばれる少なくとも1種を含む、抗酸化剤。
- プロポリスと、ホスファチジルセリンとを含む、抗酸化剤(ただし、ガラナ水抽出物、DHA、及びフォスファチジルコリンを含むものを除く。)。
- プロポリスと、コーヒー果実抽出物及びクルクミンからなる群から選ばれる少なくとも1種とを含み、前記コーヒー果実が、コーヒー果実の外果皮、果肉、粘質物、殻、及び茎からなる群から選ばれる少なくとも1種を含む、抗糖化剤。
- プロポリスと、ホスファチジルセリンとを含む、抗糖化剤(ただし、ガラナ水抽出物、DHA、及びフォスファチジルコリンを含むものを除く。)。
- プロポリス、クルクミン及びイチョウ葉抽出物を含む、抗炎症剤。
- プロポリス、イチョウ葉抽出物、コーヒー果実抽出物、ゴツコラ抽出物、クルクミン、及びホスファチジルセリンを含む組成物。
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