JP7416862B2 - 収穫可能収量を増加させるためのジベレリン代謝操作を介して低草高植物を得るための方法及び組成物 - Google Patents
収穫可能収量を増加させるためのジベレリン代謝操作を介して低草高植物を得るための方法及び組成物 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2016年8月17日出願の米国仮出願第62/376,298号、2017年1月4日出願の米国仮出願第62/442,377号、及び2017年5月5日出願の米国仮出願第62/502,313号の優先権を主張する。これらの米国仮出願はそれぞれ、参照によってそれらの全体が本明細書に援用される。
2017年8月17日に作成された293,398バイト(MS-Windows(登録商標)によって測定)の「P34494WO00_SEQ.txt」という名称のファイルに含まれる配列リストが本明細書と共に電子的に提出され、参照によってその全体が援用される。
本開示は、トウモロコシを含めて、単子葉植物または穀類植物における、耐倒伏性及び収量の増加などの形質を改善するための組成物及び方法に関する。
ジベレリン(ジベレリン酸またはGA)は、多くの主要な植物生育過程及び植物発育過程を制御する植物ホルモンである。コムギ、イネ、及びモロコシの半矮性植物品種ではGAレベルが操作されており、この操作によって、こうした穀類の収量増加及び倒伏減少が20世紀の間にもたらされ、このことが緑の革命に大きな役割を果たした。しかしながら、トウモロコシなどの他の穀類では、GA経路の操作よって良好な収量増加が実現したことはない。実際、GA経路遺伝子の変異によっては、トウモロコシのさまざまな異型と関連しているが、こうした異型が収量を同時に伴うことはなく、このことが、GA経路の操作によって半矮性の多収性トウモロコシ品種を発見することから研究者を遠ざけてきた。
本開示の理解を容易にするために、本明細書で使用されるいくつかの用語及び略語が、次のように以下に定義される:
穀物産生性が最も高い草本(コムギ、イネ、及びモロコシなど)は、円錐花序のそれぞれの小花の中に雄性構造と雌性構造との両方を形成する(すなわち、こうした草本は、単一の生殖構造を有する)。しかしながら、トウモロコシ(corn)またはトウモロコシ(maize)は、雄性(雄穂)花房と雌性(雌穂)花房とを別々に形成するという点において、穀物産生草本の中で独特である。トウモロコシは、雌穂の小花では雄性器官(葯)を、雄穂の小花では雌性器官(胚珠)を、発育の初期段階の内に選択的に形成中断することよって完全に性的二型性の生殖構造を形成する。この選択的な形成中断過程を制御するには、ジベレリンの合成及びシグナル伝達が正確に制御されることが非常に重要であり、雌性生殖性の雌穂は、GA経路のかく乱に対する感受性が最も高い。実際、「葯雌穂(anther ear)」表現型は、トウモロコシのGA変異体において最も一般的な生殖性表現型である。
表1.配列識別子によって示される、トウモロコシのGA20オキシダーゼ遺伝子のDNA配列及びタンパク質配列.
下記のパラグラフは、例示の実施形態のサブセットのリストである。
非コードRNA分子をコードする転写可能なDNA配列を含む組換えDNAコンストラクトであって、前記非コードRNA分子が、穀類の植物または植物細胞の内在性のGA20オキシダーゼタンパク質をコードするmRNA分子の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含み、前記内在性のGA20オキシダーゼタンパク質が、配列番号9に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有し、前記転写可能なDNA配列が、植物発現性プロモーターに機能可能なように連結される、前記組換えDNAコンストラクト。
前記非コードRNA分子が、配列番号7または配列番号8の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含む、実施形態1に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記非コードRNA分子が、単子葉または穀類の植物または植物細胞の内在性のGA20オキシダーゼタンパク質をコードするmRNA分子の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含み、前記内在性のGA20オキシダーゼタンパク質が、配列番号15に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有する、実施形態1に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記非コードRNA分子が、配列番号13または配列番号14の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含む、実施形態3に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、維管束プロモーターである、実施形態1に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記維管束プロモーターが、下記のもののうちの1つを含む、実施形態5に記載の組換えDNAコンストラクト:スクロース合成酵素プロモーター、スクローストランスポータープロモーター、Sh1プロモーター、ツユクサ黄斑ウイルス(CoYMV)プロモーター、コムギ矮化ジェミニウイルス(WDV)長鎖遺伝子間領域(LIR)プロモーター、トウモロコシ縞葉枯病ジェミニウイルス(MSV)コートタンパク質(CP)プロモーター、イネ黄色条斑1(YS1)様プロモーター、またはイネ黄色条斑2(OsYSL2)プロモーター。
前記維管束プロモーターが、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、もしくは配列番号71、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態5に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、RTBVプロモーターである、実施形態1に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、配列番号65もしくは配列番号66、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態8に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、葉プロモーターである、実施形態1に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記葉プロモーターが、下記のもののうちの1つを含む、実施形態10に記載の組換えDNAコンストラクト:RuBisCOプロモーター、PPDKプロモーター、FDAプロモーター、Nadh-Gogatプロモーター、クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)プロモーター、またはMyb遺伝子プロモーター。
前記葉プロモーターが、配列番号72、配列番号73、もしくは配列番号74、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態10に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、構成的プロモーターである、実施形態1に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記構成的プロモーターが、アクチンプロモーター、CaMV35SプロモーターもしくはCaMV19Sプロモーター、植物ユビキチンプロモーター、植物Gos2プロモーター、FMVプロモーター、CMVプロモーター、MMVプロモーター、PCLSVプロモーター、Emuプロモーター、チューブリンプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、オクトピン合成酵素プロモーター、マンノピン合成酵素プロモーター、またはトウモロコシアルコール脱水素酵素、あるいはその機能性部分からなる群から選択される、実施形態13に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記構成的プロモーターが、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、もしくは配列番号83、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態13に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記転写可能なDNA配列がコードする前記非コードRNA分子が、植物細胞においてプロセシングまたは切断を受けることで成熟miRNAまたは成熟siRNAを形成する前駆体miRNAまたは前駆体siRNAである、実施形態1に記載の組換えDNAコンストラクト。
実施形態1に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、形質転換ベクター。
実施形態1に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、穀類のトランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分、またはトランスジェニック植物細胞。
前記トランスジェニック植物が、対照植物と比較して下記の形質のうちの1つまたは複数を有する、実施形態18に記載のトランスジェニック穀類植物:草高の低下、柄直径/茎直径の増加、耐倒伏性の改善、根の深化、葉面積の増加、樹冠閉鎖の早期化、気孔コンダクタンスの上昇、雌穂高の低下、葉の水分含量の増加、乾燥耐性の改善、窒素利用効率の改善、通常条件下または窒素もしくは水を制限するストレス条件下での葉におけるアントシアニンの含量及び面積の減少、雌穂重量の増加、収穫指数の増加、収量の増加、種子数の増加、種子重量の増加、及び/または多収性の増加。
前記トランスジェニック植物が、草高の低下及び/または耐倒伏性の改善を有する、実施形態18に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の高さが、野生型対照植物と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態18に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の1つまたは複数の茎節間の柄直径または茎直径が、野生型対照植物の同一の1つまたは複数の節間の柄直径または茎直径と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%大きい、実施形態18に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック穀類植物が、トウモロコシ植物であり、前記トランスジェニックトウモロコシ植物の雌穂の下の第1の節間、第2の節間、第3の節間、及び/または第4の節間のうちの1つまたは複数の柄直径または茎直径が、野生型対照植物の同一の節間と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%大きい、実施形態18のいずれか1つに記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照植物の同一の節間組織と比較して低い、実施形態18に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照植物の同一の節間組織と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態18に記載のトランスジェニック穀類植物。
実施形態1に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、トウモロコシのトランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分、またはトランスジェニック植物細胞。
トランスジェニック穀類植物の作出方法であって、(a)実施形態1に記載の組換えDNAコンストラクトでの、外植体の少なくとも1つの細胞の形質転換と、(b)前記形質転換された外植体からの、前記トランスジェニック穀類植物の再生または発育と、を含む、前記方法。
前記穀類植物が、Agrobacterium介在性の形質転換、または微粒子銃を介して形質転換される、実施形態25に記載の方法。
非コードRNA分子をコードする転写可能なDNA配列を含む組換えDNAコンストラクトであって、前記非コードRNA分子が、単子葉または穀類の植物または植物細胞の内在性のGA20オキシダーゼタンパク質をコードするmRNA分子の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含み、前記内在性のGA20オキシダーゼタンパク質が、配列番号15に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有し、前記転写可能なDNA配列が、植物発現性プロモーターに機能可能なように連結される、前記組換えDNAコンストラクト。
前記非コードRNA分子が、配列番号13または配列番号14の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含む、実施形態29に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、維管束プロモーターである、実施形態29に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記維管束プロモーターが、下記のもののうちの1つを含む、実施形態31に記載の組換えDNAコンストラクト:スクロース合成酵素プロモーター、スクローストランスポータープロモーター、Sh1プロモーター、ツユクサ黄斑ウイルス(CoYMV)プロモーター、コムギ矮化ジェミニウイルス(WDV)長鎖遺伝子間領域(LIR)プロモーター、トウモロコシ縞葉枯病ジェミニウイルス(MSV)コートタンパク質(CP)プロモーター、イネ黄色条斑1(YS1)様プロモーター、またはイネ黄色条斑2(OsYSL2)プロモーター。
前記維管束プロモーターが、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、もしくは配列番号71、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態31に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、RTBVプロモーターである、実施形態29に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、配列番号65もしくは配列番号66、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態34に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、葉プロモーターである、実施形態29に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記葉プロモーターが、下記のもののうちの1つを含む、実施形態36に記載の組換えDNAコンストラクト:RuBisCOプロモーター、PPDKプロモーター、FDAプロモーター、Nadh-Gogatプロモーター、クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)プロモーター、またはMyb遺伝子プロモーター。
前記葉プロモーターが、配列番号72、配列番号73、もしくは配列番号74、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態36に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、構成的プロモーターである、実施形態29に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記構成的プロモーターが、アクチンプロモーター、CaMV35SプロモーターもしくはCaMV19Sプロモーター、植物ユビキチンプロモーター、植物Gos2プロモーター、FMVプロモーター、CMVプロモーター、MMVプロモーター、PCLSVプロモーター、Emuプロモーター、チューブリンプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、オクトピン合成酵素プロモーター、マンノピン合成酵素プロモーター、またはトウモロコシアルコール脱水素酵素、あるいはその機能性部分からなる群から選択される、実施形態39に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記構成的プロモーターが、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、もしくは配列番号83、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態39に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記転写可能なDNA配列がコードする前記非コードRNA分子が、植物細胞においてプロセシングまたは切断を受けることで成熟miRNAまたは成熟siRNAを形成する前駆体miRNAまたは前駆体siRNAである、実施形態29に記載の組換えDNAコンストラクト。
実施形態29に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、形質転換ベクター。
実施形態29に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、穀類のトランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分、またはトランスジェニック植物細胞。
前記トランスジェニック植物が、対照植物と比較して下記の形質のうちの1つまたは複数を有する、実施形態44に記載のトランスジェニック穀類植物:草高の低下、柄直径/茎直径の増加、耐倒伏性の改善、根の深化、葉面積の増加、樹冠閉鎖の早期化、気孔コンダクタンスの上昇、雌穂高の低下、葉の水分含量の増加、乾燥耐性の改善、窒素利用効率の改善、通常条件下または窒素もしくは水を制限するストレス条件下での葉におけるアントシアニンの含量及び面積の減少、雌穂重量の増加、収穫指数の増加、収量の増加、種子数の増加、種子重量の増加、及び/または多収性の増加。
前記トランスジェニック植物が、草高の低下及び/または耐倒伏性の改善を有する、実施形態44に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の高さが、野生型対照植物と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態44に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の1つまたは複数の茎節間の柄直径または茎直径が、野生型対照植物の同一の1つまたは複数の節間の柄直径または茎直径と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%大きい、実施形態44に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック穀類植物が、トウモロコシ植物であり、前記トランスジェニックトウモロコシ植物の雌穂の下の第1の節間、第2の節間、第3の節間、及び/または第4の節間のうちの1つまたは複数の柄直径または茎直径が、野生型対照植物の同一の節間と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%大きい、実施形態44のいずれか1つに記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照植物の同一の節間組織と比較して低い、実施形態44に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照植物の同一の節間組織と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態44に記載のトランスジェニック穀類植物。
実施形態29に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、トウモロコシのトランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分、またはトランスジェニック植物細胞。
トランスジェニック穀類植物の作出方法であって、(a)実施形態29に記載の組換えDNAコンストラクトでの、外植体の少なくとも1つの細胞の形質転換と、(b)前記形質転換された外植体からの、前記トランスジェニック穀類植物の再生または発育と、を含む、前記方法。
前記穀類植物が、Agrobacterium介在性の形質転換、または微粒子銃を介して形質転換される、実施形態29に記載の方法。
非コードRNA分子をコードする転写可能なDNA配列を含む組換えDNAコンストラクトであって、前記非コードRNA分子が、単子葉または穀類の植物または植物細胞の内在性のGA3オキシダーゼタンパク質をコードするmRNA分子の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含み、前記内在性のGA3オキシダーゼタンパク質が、配列番号30または配列番号33に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有し、前記転写可能なDNA配列が、植物発現性プロモーターに機能可能なように連結される、前記組換えDNAコンストラクト。
前記非コードRNA分子が、配列番号28、配列番号29、配列番号31、または配列番号32の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含む、実施形態55に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、維管束プロモーターである、実施形態55に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記維管束プロモーターが、下記のもののうちの1つを含む、実施形態57に記載の組換えDNAコンストラクト:スクロース合成酵素プロモーター、スクローストランスポータープロモーター、Sh1プロモーター、ツユクサ黄斑ウイルス(CoYMV)プロモーター、コムギ矮化ジェミニウイルス(WDV)長鎖遺伝子間領域(LIR)プロモーター、トウモロコシ縞葉枯病ジェミニウイルス(MSV)コートタンパク質(CP)プロモーター、イネ黄色条斑1(YS1)様プロモーター、またはイネ黄色条斑2(OsYSL2)プロモーター。
前記維管束プロモーターが、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、もしくは配列番号71、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態57に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、RTBVプロモーターである、実施形態55に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、配列番号65もしくは配列番号66、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態60に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、葉プロモーターである、実施形態55に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記葉プロモーターが、下記のもののうちの1つを含む、実施形態62に記載の組換えDNAコンストラクト:RuBisCOプロモーター、PPDKプロモーター、FDAプロモーター、Nadh-Gogatプロモーター、クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)プロモーター、またはMyb遺伝子プロモーター。
前記葉プロモーターが、配列番号72、配列番号73、もしくは配列番号74、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態62に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、構成的プロモーターである、実施形態55に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記構成的プロモーターが、アクチンプロモーター、CaMV35SプロモーターもしくはCaMV19Sプロモーター、植物ユビキチンプロモーター、植物Gos2プロモーター、FMVプロモーター、CMVプロモーター、MMVプロモーター、PCLSVプロモーター、Emuプロモーター、チューブリンプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、オクトピン合成酵素プロモーター、マンノピン合成酵素プロモーター、またはトウモロコシアルコール脱水素酵素、あるいはその機能性部分からなる群から選択される、実施形態65に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記構成的プロモーターが、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、もしくは配列番号83、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態65に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記転写可能なDNA配列がコードする前記非コードRNA分子が、植物細胞においてプロセシングまたは切断を受けることで成熟miRNAまたは成熟siRNAを形成する前駆体miRNAまたは前駆体siRNAである、実施形態55に記載の組換えDNAコンストラクト。
実施形態55に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、形質転換ベクター。
実施形態55に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、穀類のトランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分、またはトランスジェニック植物細胞。
前記トランスジェニック植物が、対照植物と比較して下記の形質のうちの1つまたは複数を有する、実施形態70に記載のトランスジェニック穀類植物:草高の低下、柄直径/茎直径の増加、耐倒伏性の改善、根の深化、葉面積の増加、樹冠閉鎖の早期化、気孔コンダクタンスの上昇、雌穂高の低下、葉の水分含量の増加、乾燥耐性の改善、窒素利用効率の改善、通常条件下または窒素もしくは水を制限するストレス条件下での葉におけるアントシアニンの含量及び面積の減少、雌穂重量の増加、収穫指数の増加、収量の増加、種子数の増加、種子重量の増加、及び/または多収性の増加。
前記トランスジェニック植物が、草高の低下及び/または耐倒伏性の改善を有する、実施形態70に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の高さが、野生型対照植物と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態70に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の1つまたは複数の茎節間の柄直径または茎直径が、野生型対照植物の同一の1つまたは複数の節間の柄直径または茎直径と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%大きい、実施形態70に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック穀類植物が、トウモロコシ植物であり、前記トランスジェニックトウモロコシ植物の雌穂の下の第1の節間、第2の節間、第3の節間、及び/または第4の節間のうちの1つまたは複数の柄直径または茎直径が、野生型対照植物の同一の節間と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%大きい、実施形態70のいずれか1つに記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照植物の同一の節間組織と比較して低い、実施形態70に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照植物の同一の節間組織と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態70に記載のトランスジェニック穀類植物。
実施形態55に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、トウモロコシのトランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分、またはトランスジェニック植物細胞。
トランスジェニック穀類植物の作出方法であって、(a)実施形態55に記載の組換えDNAコンストラクトでの、外植体の少なくとも1つの細胞の形質転換と、(b)前記形質転換された外植体からの、前記トランスジェニック穀類植物の再生または発育と、を含む、前記方法。
前記穀類植物が、Agrobacterium介在性の形質転換、または微粒子銃を介して形質転換される、実施形態79に記載の方法。
非コードRNA分子をコードする転写可能なDNA配列を含む組換えDNAコンストラクトであって、前記非コードRNA分子が、単子葉または穀類の植物または植物細胞の内在性のGA20オキシダーゼタンパク質をコードするmRNA分子の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含み、前記内在性のGA20オキシダーゼタンパク質が、配列番号12に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有し、前記転写可能なDNA配列が、植物発現性プロモーターに機能可能なように連結される、前記組換えDNAコンストラクト。
前記非コードRNA分子が、配列番号10または配列番号11の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含む、実施形態81に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、維管束プロモーターである、実施形態81に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記維管束プロモーターが、下記のもののうちの1つを含む、実施形態83に記載の組換えDNAコンストラクト:スクロース合成酵素プロモーター、スクローストランスポータープロモーター、Sh1プロモーター、ツユクサ黄斑ウイルス(CoYMV)プロモーター、コムギ矮化ジェミニウイルス(WDV)長鎖遺伝子間領域(LIR)プロモーター、トウモロコシ縞葉枯病ジェミニウイルス(MSV)コートタンパク質(CP)プロモーター、イネ黄色条斑1(YS1)様プロモーター、またはイネ黄色条斑2(OsYSL2)プロモーター。
前記維管束プロモーターが、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、もしくは配列番号71、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態83に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、RTBVプロモーターである、実施形態81に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、配列番号65もしくは配列番号66、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態86に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、葉プロモーターである、実施形態81に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記葉プロモーターが、下記のもののうちの1つを含む、実施形態88に記載の組換えDNAコンストラクト:RuBisCOプロモーター、PPDKプロモーター、FDAプロモーター、Nadh-Gogatプロモーター、クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)プロモーター、またはMyb遺伝子プロモーター。
前記葉プロモーターが、配列番号72、配列番号73、もしくは配列番号74、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態88に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、構成的プロモーターである、実施形態81に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記構成的プロモーターが、アクチンプロモーター、CaMV35SプロモーターもしくはCaMV19Sプロモーター、植物ユビキチンプロモーター、植物Gos2プロモーター、FMVプロモーター、CMVプロモーター、MMVプロモーター、PCLSVプロモーター、Emuプロモーター、チューブリンプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、オクトピン合成酵素プロモーター、マンノピン合成酵素プロモーター、またはトウモロコシアルコール脱水素酵素、あるいはその機能性部分からなる群から選択される、実施形態91に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記構成的プロモーターが、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、もしくは配列番号83、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するDNA配列を含む、実施形態91に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記転写可能なDNA配列がコードする前記非コードRNA分子が、植物細胞においてプロセシングまたは切断を受けることで成熟miRNAまたは成熟siRNAを形成する前駆体miRNAまたは前駆体siRNAである、実施形態81に記載の組換えDNAコンストラクト。
実施形態81に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、形質転換ベクター。
実施形態81に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、穀類のトランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分、またはトランスジェニック植物細胞。
前記トランスジェニック植物が、対照植物と比較して下記の形質のうちの1つまたは複数を有する、実施形態96に記載のトランスジェニック穀類植物:草高の低下、柄直径/茎直径の増加、耐倒伏性の改善、根の深化、葉面積の増加、樹冠閉鎖の早期化、気孔コンダクタンスの上昇、雌穂高の低下、葉の水分含量の増加、乾燥耐性の改善、窒素利用効率の改善、通常条件下または窒素もしくは水を制限するストレス条件下での葉におけるアントシアニンの含量及び面積の減少、雌穂重量の増加、収穫指数の増加、収量の増加、種子数の増加、種子重量の増加、及び/または多収性の増加。
前記トランスジェニック植物が、草高の低下及び/または耐倒伏性の改善を有する、実施形態96に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の高さが、野生型対照植物と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態96に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の1つまたは複数の茎節間の柄直径または茎直径が、野生型対照植物の同一の1つまたは複数の節間の柄直径または茎直径と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%大きい、実施形態96に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック穀類植物が、トウモロコシ植物であり、前記トランスジェニックトウモロコシ植物の雌穂の下の第1の節間、第2の節間、第3の節間、及び/または第4の節間のうちの1つまたは複数の柄直径または茎直径が、野生型対照植物の同一の節間と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%大きい、実施形態96のいずれか1つに記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照植物の同一の節間組織と比較して低い、実施形態96に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照植物の同一の節間組織と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態96に記載のトランスジェニック穀類植物。
実施形態81に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、トウモロコシのトランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分、またはトランスジェニック植物細胞。
トランスジェニック穀類植物の作出方法であって、(a)実施形態81に記載の組換えDNAコンストラクトでの、外植体の少なくとも1つの細胞の形質転換と、(b)前記形質転換された外植体からの、前記トランスジェニック穀類植物の再生または発育と、を含む、前記方法。
前記穀類植物が、Agrobacterium介在性の形質転換、または微粒子銃を介して形質転換される、実施形態105に記載の方法。
前記非コードRNA分子が、単子葉または穀類の植物または植物細胞の内在性のGAオキシダーゼタンパク質をコードするmRNA分子の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含み、前記内在性のGAオキシダーゼタンパク質が、配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号18、配列番号21、配列番号24、配列番号27、配列番号30、及び配列番号33のうちの1つまたは複数に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有する、実施形態1、実施形態29、実施形態55、または実施形態81に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記非コードRNA分子が、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号23、配列番号25、配列番号26、配列番号28、配列番号29、配列番号31、及び配列番号32のうちの1つまたは複数の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含む、実施形態107に記載の組換えDNAコンストラクト。
非コードRNA分子をコードする転写可能なDNA配列を含む組換えDNAコンストラクトであって、前記非コードRNA分子が、単子葉または穀類の植物または植物細胞の内在性タンパク質をコードするmRNA分子の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含み、前記内在性タンパク質が、配列番号86、配列番号90、配列番号94、配列番号97、配列番号101、配列番号104、配列番号108、配列番号112、配列番号116、配列番号118、配列番号121、配列番号125、配列番号129、配列番号133、または配列番号136に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有し、前記転写可能なDNA配列が、植物発現性プロモーターに機能可能なように連結される、前記組換えDNAコンストラクト。
前記非コードRNA分子が、配列番号84、配列番号85、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号95、配列番号96、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号102、配列番号103、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号119、配列番号120、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号134、配列番号135、または配列番号137の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含む、実施形態109に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、維管束プロモーターである、実施形態109に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、RTBVプロモーターである、実施形態109に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、葉プロモーターである、実施形態109に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記植物発現性プロモーターが、構成的プロモーターである、実施形態109に記載の組換えDNAコンストラクト。
実施形態81に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、形質転換ベクター。
実施形態109に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、穀類のトランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分、またはトランスジェニック植物細胞。
前記トランスジェニック植物が、草高の低下及び/または耐倒伏性の改善を有する、実施形態116に記載のトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照植物の同一の節間組織と比較して低い、実施形態116に記載のトランスジェニック穀類植物。
トランスジェニック穀類植物の作出方法であって、(a)実施形態116に記載の組換えDNAコンストラクトでの、外植体の少なくとも1つの細胞の形質転換と、(b)前記形質転換された外植体からの、前記トランスジェニック穀類植物の再生または発育と、を含む、前記方法。
前記穀類植物が、Agrobacterium介在性の形質転換、または微粒子銃を介して形質転換される、実施形態119に記載の方法。
トウモロコシ植物または穀類植物の茎または柄における少なくとも1つの活性型GA分子のレベルの低減方法であって、前記トランスジェニック穀類植物またはトランスジェニックトウモロコシ植物の1つまたは複数の組織において1つまたは複数のGA3オキシダーゼ遺伝子またはGA20オキシダーゼ遺伝子を組換えDNAコンストラクトで抑制することを含む、前記方法。
前記組換えDNAコンストラクトが、1つまたは複数のGA3オキシダーゼ遺伝子またはGA20オキシダーゼ遺伝子を抑制標的とする非コードRNA分子をコードし、前記転写可能なDNA配列が、植物発現性プロモーターに機能可能なように連結される、実施形態121に記載の方法。
前記植物発現性プロモーターが、維管束プロモーターである、実施形態122に記載の方法。
前記植物発現性プロモーターが、RTBVプロモーターである、実施形態122に記載の方法。
前記植物発現性プロモーターが、構成的プロモーターである、実施形態122に記載の方法。
前記植物発現性プロモーターが、葉プロモーターである、実施形態122に記載の方法。
前記トランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物が、トウモロコシ植物である、実施形態121に記載の方法。
組換えDNAコンストラクトを含むトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物であって、前記組換えDNAコンストラクトが、少なくとも1つの内在性のGA20オキシダーゼ遺伝子またはGA3オキシダーゼ遺伝子を抑制標的とする非コードRNA分子をコードする転写可能なDNA配列を含み、前記転写可能なDNA配列が、植物発現性プロモーターに機能可能なように連結され、前記トランスジェニック単子葉植物またはトランスジェニック穀類植物が、野生型対照植物と比較して低い草高を有する、前記トランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物が、前記対照植物と比較して下記の追加の形質のうちの1つまたは複数を有する、実施形態128に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物:柄直径/茎直径の増加、耐倒伏性の改善、根の深化、葉面積の増加、樹冠閉鎖の早期化、気孔コンダクタンスの上昇、雌穂高の低下、葉の水分含量の増加、乾燥耐性の改善、窒素利用効率の改善、通常条件下または窒素もしくは水を制限するストレス条件下での葉におけるアントシアニンの含量及び面積の減少、雌穂重量の増加、収穫指数の増加、収量の増加、種子数の増加、種子重量の増加、ならびに多収性の増加。
前記トランスジェニック植物の高さが、前記対照植物と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態128に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の1つまたは複数の茎節間の柄直径または茎直径が、前記対照植物と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%大きい、実施形態128に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、前記対照植物の同一の節間組織と比較して低い、実施形態128のいずれか1つに記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、前記対照植物の同一の節間組織と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態128のいずれか1つに記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物が、少なくとも1つの雌性器官または雌穂に顕著な異型を全く有さない、実施形態128のいずれか1つに記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック穀類植物が、トウモロコシ植物であり、前記非コードRNA分子が、内在性のGA20オキシダーゼ_3遺伝子及び/またはGA20オキシダーゼ_5遺伝子(複数可)を抑制標的とする、実施形態128のいずれか1つに記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記植物発現性プロモーターが、維管束プロモーターである、実施形態128に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記植物発現性プロモーターが、RTBVプロモーターである、実施形態128に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記植物発現性プロモーターが、構成的プロモーターである、実施形態128に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記植物発現性プロモーターが、葉プロモーターである、実施形態128に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物が、前記対照植物と比較して下記の追加の形質のうちの1つまたは複数を有する、実施形態128に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物:柄直径/茎直径の増加、耐倒伏性の改善、根の深化、葉面積の増加、樹冠閉鎖の早期化、気孔コンダクタンスの上昇、雌穂高の低下、葉の水分含量の増加、乾燥耐性の改善、窒素利用効率の改善、通常条件下または窒素もしくは水を制限するストレス条件下での葉におけるアントシアニンの含量及び面積の減少、雌穂重量の増加、収穫指数の増加、収量の増加、種子数の増加、種子重量の増加、ならびに多収性の増加。
内在性のGAオキシダーゼ遺伝子またはその付近に変異誘発手法によって導入された変異を含む穀類植物であって、前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子の発現レベルが、前記穀類植物において低減または除去され、前記穀類植物が、野生型対照植物と比較して低い草高を有する、前記穀類植物。
前記変異を含む前記穀類植物が、前記対照植物と比較して下記の追加の形質のうちの1つまたは複数を有する、実施形態141に記載の穀類植物:柄直径/茎直径の増加、耐倒伏性の改善、根の深化、葉面積の増加、樹冠閉鎖の早期化、気孔コンダクタンスの上昇、雌穂高の低下、葉の水分含量の増加、乾燥耐性の改善、窒素利用効率の改善、通常条件下または窒素もしくは水を制限するストレス条件下での葉におけるアントシアニンの含量及び面積の減少、雌穂重量の増加、収穫指数の増加、収量の増加、種子数の増加、種子重量の増加、ならびに多収性の増加。
前記穀類植物の高さが、前記対照植物と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態141に記載の穀類植物。
前記穀類植物の1つまたは複数の茎節間の柄直径または茎直径が、前記対照植物と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%大きい、実施形態141に記載の穀類植物。
前記穀類植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、前記対照植物の同一の節間組織と比較して低い、実施形態141に記載の穀類植物。
前記穀類植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、前記対照植物の同一の節間組織と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態141に記載の穀類植物。
前記穀類植物が、少なくとも1つの雌性器官または雌穂に顕著な異型を全く有さない、実施形態141に記載の穀類植物。
前記穀類植物が、トウモロコシ植物である、実施形態141に記載の穀類植物。
内在性のGAオキシダーゼ遺伝子の遺伝子座またはその付近に標的ゲノム編集手法を介して導入されたゲノム編集を含むトウモロコシ植物または穀類植物であって、前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子の発現レベルが、対照植物と比較して低減または除去され、前記編集された穀類植物が、前記対照植物と比較して低い草高を有する、前記トウモロコシ植物または穀類植物。
前記編集された植物が、前記対照植物と比較して下記の追加の形質のうちの1つまたは複数を有する、実施形態149に記載の編集されたトウモロコシ植物または穀類植物:柄直径/茎直径の増加、耐倒伏性の改善、根の深化、葉面積の増加、樹冠閉鎖の早期化、気孔コンダクタンスの上昇、雌穂高の低下、葉の水分含量の増加、乾燥耐性の改善、窒素利用効率の改善、通常条件下または窒素もしくは水を制限するストレス条件下での葉におけるアントシアニンの含量及び面積の減少、雌穂重量の増加、収穫指数の増加、収量の増加、種子数の増加、種子重量の増加、ならびに多収性の増加。
前記編集された植物の高さが、前記対照植物と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態149に記載の編集されたトウモロコシ植物または穀類植物。
前記編集された植物の1つまたは複数の茎節間の柄直径または茎直径が、前記対照植物と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%大きい、実施形態149に記載の編集されたトウモロコシ植物または穀類植物。
前記編集された植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、前記対照植物の同一の節間組織と比較して低い、実施形態149に記載の編集されたトウモロコシ植物または穀類植物。
前記編集された植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、前記対照植物の同一の節間組織と比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態149に記載の編集されたトウモロコシ植物または穀類植物。
前記編集された植物が、少なくとも1つの雌性器官または雌穂に顕著な異型を全く有さない、実施形態149に記載の編集されたトウモロコシ植物または穀類植物。
前記ゲノム編集が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ、TALE-エンドヌクレアーゼ(TALEN)、リコンビナーゼ、またはトランスポゼースを使用して導入される、実施形態149に記載の編集されたトウモロコシ植物または穀類植物。
前記ゲノム編集が、前記対照植物の前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子の配列と比較したときの、1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、または反転を含む、実施形態149に記載の編集されたトウモロコシ植物または穀類植物。
ガイドRNAを含む組成物であって、前記ガイドRNAが、穀類植物の内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に位置する標的DNA配列の少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、または少なくとも25の連続ヌクレオチドに対して少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の同一性または相補性を有するガイド配列を含む、前記組成物。
前記ガイドRNA分子が、配列番号34、配列番号35、もしくは配列番号38、またはそれに相補的な配列の少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、または少なくとも25の連続ヌクレオチドに対して少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有するガイド配列を含む、実施形態158に記載の組成物。
前記ガイドRNA分子が、配列番号87、配列番号91、配列番号95、配列番号98、配列番号105、配列番号109、配列番号113、配列番号117、配列番号122、配列番号126、配列番号130、もしくは配列番号137、またはそれに相補的な配列の少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、または少なくとも25の連続ヌクレオチドに対して少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有するガイド配列を含む、実施形態158に記載の組成物。
RNAガイド型エンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態158に記載の組成物。
前記RNAガイド型エンドヌクレアーゼが、前記ガイドRNA分子の存在下で、前記穀類植物のゲノムにおける標的DNA配列またはその付近に二本鎖切断またはニックを生じさせる、実施形態161に記載の組成物。
前記RNAガイド型エンドヌクレアーゼが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx12、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、アルゴノート、及びRNAガイド型エンドヌクレアーゼ活性を有するそれらの任意の相同体または改変バージョンからなる群から選択される、実施形態161に記載の組成物。
少なくとも1つの相同配列またはホモロジーアームを含む組換えDNAドナーテンプレートをさらに含み、前記少なくとも1つの相同配列またはホモロジーアームが、標的DNA配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有し、前記標的DNA配列が、トウモロコシ植物または穀類植物の前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に位置するゲノム配列である、実施形態158に記載の組成物。
非コードガイドRNA分子をコードする転写可能なDNA配列を含む組換えDNAコンストラクトであって、前記ガイドRNA分子が、トウモロコシ植物または穀類植物の内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に位置する標的DNA配列の少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、または少なくとも25の連続ヌクレオチドに対して少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有するガイド配列を含む、前記組換えDNAコンストラクト。
前記ガイドRNAが、配列番号34、配列番号35、もしくは配列番号38、またはそれに相補的な配列の少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、または少なくとも25の連続ヌクレオチドに対して少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有するガイド配列を含む、実施形態165に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記ガイドRNA分子が、配列番号87、配列番号91、配列番号95、配列番号98、配列番号105、配列番号109、配列番号113、配列番号117、配列番号122、配列番号126、配列番号130、もしくは配列番号137、またはそれに相補的な配列の少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、または少なくとも25の連続ヌクレオチドに対して少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有するガイド配列を含む、実施形態165に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記転写可能なDNA配列が、植物発現性プロモーターに機能可能なように連結される、実施形態165に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記ガイドRNA分子が、CRISPR RNA(crRNA)または単鎖ガイドRNA(sgRNA)である、実施形態165に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記穀類植物のゲノムに存在するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列であって、前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に位置する前記標的DNA配列の直ぐ隣に位置する前記PAM配列に相補的な配列を前記ガイドRNAが含む、実施形態165に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記PAM配列が、古典的な5’-NGG-3’配列を含む、実施形態165のいずれか1つに記載の組換えDNAコンストラクト。
前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子が、配列番号9、配列番号12、または配列番号15に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するタンパク質をコードする、実施形態165に記載の組換えDNAコンストラクト。
実施形態165に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、DNA分子。
実施形態165に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、形質転換ベクター。
実施形態165に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、細菌細胞。
実施形態165に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、トウモロコシまたは穀類の植物、植物部分、または植物細胞。
実施形態165に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、組成物。
RNAガイド型エンドヌクレアーゼをさらに含む、実施形態177に記載の組成物。
前記RNAガイド型エンドヌクレアーゼが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、アルゴノート、及びRNAガイド型エンドヌクレアーゼ活性を有するそれらの相同体または改変バージョンからなる群から選択される、実施形態177に記載の組成物。
前記RNAガイド型エンドヌクレアーゼをコードする第2の転写可能なDNA配列を含む第2の組換えDNAコンストラクトをさらに含む、実施形態177に記載の組成物。
前記組換えDNAコンストラクト及び前記第2の組換えDNAコンストラクトを含むDNA分子またはベクターを含む、実施形態177に記載の組成物。
第1のDNA分子またはベクターと、第2のDNA分子またはベクターと、を含み、前記第1のDNA分子またはベクターが、前記ガイドRNA分子をコードする前記組換えDNAコンストラクトを含み、前記第2のDNA分子またはベクターが、前記RNAガイド型エンドヌクレアーゼをコードする前記第2の組換えDNAコンストラクトを含む、実施形態177に記載の組成物。
少なくとも1つの相同配列またはホモロジーアームを含む組換えDNAドナーテンプレートをさらに含み、前記少なくとも1つの相同配列またはホモロジーアームが、標的DNA配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有し、前記標的DNA配列が、トウモロコシ植物または穀類植物の内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に位置するゲノム配列である、実施形態177に記載の組成物。
少なくとも1つの相同配列を含む組換えDNAドナーテンプレートであって、前記少なくとも1つの相同配列が、標的DNA配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有し、前記標的DNA配列が、トウモロコシ植物または穀類植物の内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に位置するゲノム配列である、前記組換えDNAドナーテンプレート。
前記少なくとも1つの相同配列が、前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に位置する前記標的DNA配列の相補鎖と比較して少なくとも1つの変異を含む、実施形態184に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
前記少なくとも1つの変異が、前記標的DNA配列の相補鎖と比較したときの、1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、または反転を含む、実施形態185に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
前記少なくとも1つの相同配列が、配列番号34、配列番号35、もしくは配列番号38、またはそれに相補的な配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の同一性または相補性を有する、実施形態184に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
前記少なくとも1つの相同配列が、配列番号87、配列番号91、配列番号95、配列番号98、配列番号105、配列番号109、配列番号113、配列番号117、配列番号122、配列番号126、配列番号130、もしくは配列番号137、またはそれに相補的な配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の同一性または相補性を有する、実施形態184に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
第1のホモロジーアーム及び第2のホモロジーアームを含む2つのホモロジーアームを含む組換えDNAドナーテンプレートであって、前記第1のホモロジーアームが、第1の隣接DNA配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有する配列を含み、前記第2のホモロジーアームが、第2の隣接DNA配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有する配列を含み、前記第1の隣接DNA配列及び前記第2の隣接DNA配列が、トウモロコシ植物または穀類植物の内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に位置するゲノム配列である、前記組換えDNAドナーテンプレート。
前記第1のホモロジーアームと前記第2のホモロジーアームとの間に位置する挿入配列をさらに含む、実施形態189に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
前記挿入配列が、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000のヌクレオチドを含む、実施形態189に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
それぞれのホモロジーアームが、配列番号34、配列番号35、もしくは配列番号38、またはそれに相補的な配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の同一性または相補性を有する、実施形態189に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
それぞれのホモロジーアームが、配列番号87、配列番号91、配列番号95、配列番号98、配列番号105、配列番号109、配列番号113、配列番号117、配列番号122、配列番号126、配列番号130、もしくは配列番号137、またはそれに相補的な配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の同一性または相補性を有する、実施形態189に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
前記単子葉植物または穀類植物のゲノムに存在し、前記第1の隣接DNA配列と前記第2の隣接DNA配列との間に位置する1つまたは複数のヌクレオチドが、前記組換えDNAドナーテンプレート分子における前記第1のホモロジーアームと前記第2のホモロジーアームとの間に存在しない、実施形態189に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
前記単子葉植物または穀類植物のゲノムに存在し、前記第1の隣接DNA配列と前記第2の隣接DNA配列との間に位置する少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000ヌクレオチドが、前記組換えDNAドナーテンプレート分子における前記第1のホモロジーアームと前記第2のホモロジーアームとの間に存在しない、実施形態194に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
実施形態189に記載の組換えDNAドナーテンプレートを含む、DNA分子またはベクター。
実施形態189に記載の組換えDNAドナーテンプレートを含む、細菌細胞または宿主細胞。
実施形態189に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、トウモロコシまたは穀類の植物、植物部分、または植物細胞。
トウモロコシ植物または穀類植物の内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に位置する標的部位に結合し、前記標的部位に二本鎖切断またはニックを生じさせる、操作された部位特異的ヌクレアーゼ。
前記部位特異的ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼである、実施形態199に記載の操作された部位特異的ヌクレアーゼ。
前記操作されたメガヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼが、I-CreI、I-CeuI、I-MsoI、I-SceI、I-AniI、及びI-DmoIからなる群から選択される骨格または基本酵素を含む、実施形態200に記載の操作された部位特異的ヌクレアーゼ。
前記部位特異的ヌクレアーゼが、DNA結合ドメイン及び切断ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)である、実施形態199に記載の操作された部位特異的ヌクレアーゼ。
前記切断ドメインが、FokIヌクレアーゼドメインである、実施形態202に記載の操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ。
前記部位特異的ヌクレアーゼが、DNA結合ドメイン及び切断ドメインを含む転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)である、実施形態199に記載の操作された部位特異的ヌクレアーゼ。
前記切断ドメインが、PvuIIヌクレアーゼドメイン、MutHヌクレアーゼドメイン、TevIヌクレアーゼドメイン、FokIヌクレアーゼドメイン、AlwIヌクレアーゼドメイン、MlyIヌクレアーゼドメイン、SbfIヌクレアーゼドメイン、SdaIヌクレアーゼドメイン、StsIヌクレアーゼドメイン、CleDORFヌクレアーゼドメイン、Clo051ヌクレアーゼドメイン、及びPept071ヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、実施形態204に記載の操作されたTALEN。
前記部位特異的ヌクレアーゼが結合する前記標的部位が、配列番号34、配列番号35、もしくは配列番号38、またはそれに相補的な配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の同一性または相補性を有する、実施形態199に記載の操作された部位特異的ヌクレアーゼ。
前記部位特異的ヌクレアーゼが結合する前記標的部位が、配列番号87、配列番号91、配列番号95、配列番号98、配列番号105、配列番号109、配列番号113、配列番号117、配列番号122、配列番号126、配列番号130、もしくは配列番号137、またはそれに相補的な配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の同一性または相補性を有する、実施形態199に記載の操作された部位特異的ヌクレアーゼ。
部位特異的ヌクレアーゼをコードする導入遺伝子を含む組換えDNAコンストラクトであって、前記部位特異的ヌクレアーゼが、単子葉植物または穀類植物の内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に位置する標的部位に結合し、前記標的部位に二本鎖切断またはニックを生じさせる、前記組換えDNAコンストラクト。
前記導入遺伝子が、植物発現性プロモーターに機能可能なように連結される、実施形態208に記載の組換えDNAコンストラクト。
前記部位特異的ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼもしくはホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)である、実施形態208に記載の組換えDNAコンストラクト。
実施形態208に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、DNA分子またはベクター。
実施形態208に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、細菌細胞または宿主細胞。
実施形態208に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、トウモロコシまたは穀類の植物、植物部分、または植物細胞。
少なくとも1つのホモロジーアームと、挿入配列とを含む組換えDNAドナーテンプレートであって、前記少なくとも1つのホモロジーアームが、トウモロコシ植物または穀類植物のゲノムDNA配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有し、前記挿入配列が、非コードRNA分子をコードする転写可能なDNA配列を含む組換えDNAコンストラクトを含み、前記非コードRNA分子が、単子葉または穀類の植物または植物細胞の1つまたは複数の内在性のGA20オキシダーゼ遺伝子またはGA3オキシダーゼ遺伝子を抑制標的とし、前記転写可能なDNA配列が、植物発現性プロモーターに機能可能なように連結される、前記組換えDNAドナーテンプレート。
前記少なくとも1つのホモロジーアームが、第1のホモロジーアーム及び第2のホモロジーアームを含む2つのホモロジーアームを含み、前記第1のホモロジーアームが、第1の隣接DNA配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有する配列を含み、前記第2のホモロジーアームが、第2の隣接DNA配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有する配列を含み、前記第1の隣接DNA配列及び前記第2の隣接DNA配列が、単子葉植物または穀類植物の同一のゲノム遺伝子座またはその付近に位置するゲノム配列であり、前記挿入配列が、前記第1のホモロジーアームと前記第2のホモロジーアームとの間に位置し、非コードRNA分子をコードする転写可能なDNA配列を含む組換えDNAコンストラクトを含む、実施形態214に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
前記転写可能なDNA配列が、植物発現性プロモーターに機能可能なように連結される、実施形態215に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
前記非コードRNA分子が、配列番号9、配列番号12、配列番号15、配列番号30、または配列番号33に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するGAオキシダーゼタンパク質をコードするmRNA分子の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含む、実施形態215に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
前記非コードRNA分子が、配列番号86、配列番号90、配列番号94、配列番号97、配列番号101、配列番号104、配列番号108、配列番号112、配列番号116、配列番号118、配列番号121、配列番号125、配列番号129、配列番号133、または配列番号136に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の同一性を有するGAオキシダーゼタンパク質をコードするmRNA分子の少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、または少なくとも27の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%の相補性を有する配列を含む、実施形態215に記載の組換えDNAドナーテンプレート。
実施形態214に記載の組換えDNAドナーテンプレートを含む、組成物。
実施形態214に記載の組換えDNAドナーテンプレートを含む、細菌細胞または宿主細胞。
実施形態214に記載の組換えDNAドナーテンプレートの前記挿入配列を含む、トウモロコシまたは穀類のトランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分、またはトランスジェニック植物細胞。
前記トランスジェニック植物が、対照植物と比較して下記の形質のうちの1つまたは複数を有する、実施形態214に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物:草高の低下、柄直径/茎直径の増加、耐倒伏性の改善、根の深化、葉面積の増加、樹冠閉鎖の早期化、気孔コンダクタンスの上昇、雌穂高の低下、葉の水分含量の増加、乾燥耐性の改善、窒素利用効率の改善、通常条件下または窒素もしくは水を制限するストレス条件下での葉におけるアントシアニンの含量及び面積の減少、雌穂重量の増加、収穫指数の増加、収量の増加、種子数の増加、種子重量の増加、及び/または多収性の増加。
前記トランスジェニック植物が、草高の低下及び/または耐倒伏性の改善を有する、実施形態222に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の高さが、対照植物と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、または少なくとも40%低い、実施形態222に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
前記トランスジェニック植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、対照植物の同一の節間組織と比較して低い、実施形態222に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物。
トランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物の作出方法であって、(a)実施形態215に記載の組換えDNAドナーテンプレートでの、外植体の少なくとも1つの細胞の形質転換と、(b)前記形質転換された外植体からの、前記トランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物の再生または発育と、を含み、前記トランスジェニックトウモロコシ植物またはトランスジェニック穀類植物が、前記組換えDNAドナーテンプレートの前記挿入配列を含む、前記方法。
前記単子葉植物または穀類植物が、Agrobacterium介在性の形質転換、または微粒子銃を介して形質転換される、実施形態226に記載の方法。
内在性のGAオキシダーゼ遺伝子またはその付近にゲノム編集を有するトウモロコシ植物または穀類植物の作出方法であって、(a)前記トウモロコシ植物または穀類植物の外植体の少なくとも1つの細胞への、部位特異的ヌクレアーゼの導入、または前記部位特異的ヌクレアーゼをコードする導入遺伝子を含む組換えDNA分子の導入であって、前記部位特異的ヌクレアーゼが、前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に位置する標的部位に結合し、前記標的部位に二本鎖切断またはニックを生じさせる前記導入と、(b)前記編集された単子葉植物または穀類植物の前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子またはその付近に前記ゲノム編集を含む前記少なくとも1つの外植体細胞からの、編集されたトウモロコシ植物または穀類植物の再生または発育と、を含む、前記方法。
前記導入段階(a)が、少なくとも1つの相同配列またはホモロジーアームを含むDNAドナーテンプレートの導入をさらに含み、前記少なくとも1つの相同配列またはホモロジーアームが、標的DNA配列の少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも2500、または少なくとも5000の連続ヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも99%、または100%の相補性を有し、前記標的DNA配列が、前記単子葉植物または穀類植物の前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に位置するゲノム配列である、実施形態228に記載の方法。
(c)前記編集されたトウモロコシ植物または穀類植物の選択をさらに含む、実施形態228に記載の方法。
前記選択段階(c)が、前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子の遺伝子座が編集されたかどうかを、分子アッセイを使用して決定することを含む、実施形態230に記載の方法。
前記選択段階(c)が、前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子が編集されたかどうかを植物表現型の観測によって決定することを含む、実施形態230に記載の方法。
前記植物表現型が、対照植物と比較したときの草高の低下である、実施形態231に記載の方法。
前記導入段階(a)によって、前記内在性のGAオキシダーゼ遺伝子のゲノム遺伝子座またはその付近に少なくとも1つの変異が創出され、前記変異が、対照植物のゲノムDNA配列と比較したときの、1つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、または反転を含む、実施形態228に記載の方法。
2000mm未満、1950mm未満、1900mm未満、1850mm未満、1800mm未満、1750mm未満、1700mm未満、1650mm未満、1600mm未満、1550mm未満、1500mm未満、1450mm未満、1400mm未満、1350mm未満、1300mm未満、1250mm未満、1200mm未満、1150mm未満、1100mm未満、1050mm未満、または1000mm未満の草高と、(i)18mm超、18.5mm超、19mm超、19.5mm超、20mm超、20.5mm超、21mm超、21.5mm超、もしくは22mm超の平均茎直径もしくは平均柄直径、(ii)野生型対照植物と比較して改善した耐倒伏性、または(iii)野生型対照植物と比較して改善した乾燥耐性、のいずれかと、を有する、改変されたトウモロコシ植物。
前記トウモロコシ植物が、野生型対照植物と比較して下記の形質のうちの1つまたは複数を有する、実施形態235に記載の改変されたトウモロコシ植物:柄直径/茎直径の増加、耐倒伏性の改善、根の深化、葉面積の増加、樹冠閉鎖の早期化、気孔コンダクタンスの上昇、雌穂高の低下、葉の水分含量の増加、乾燥耐性の改善、窒素利用効率の改善、通常条件下または窒素もしくは水を制限するストレス条件下での葉におけるアントシアニンの含量及び面積の減少、雌穂重量の増加、収穫指数の増加、収量の増加、種子数の増加、種子重量の増加、及び/または多収性の増加。
前記トウモロコシ植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照植物の同一の節間組織と比較して低い、実施形態235に記載の改変されたトウモロコシ植物。
野生型対照植物と比較して低下した草高と、(i)野生型対照植物と比較して直径が増加した茎もしくは柄、(ii)野生型対照植物と比較して改善した耐倒伏性、または(iii)野生型対照植物と比較して改善した乾燥耐性と、を有する、改変された穀類植物。
前記穀類植物の茎または柄における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照植物と比較して低い、実施形態238に記載の改変された穀類植物。
植物の維管束組織における発現を誘起することが知られるイネツングロ桿菌状ウイルス(RTBV)プロモーター(配列番号65)の制御下にmiRNAの標的指向性配列(配列番号40)をコードする配列(配列番号39)を含む転写可能なDNA配列を含む発現コンストラクトを有する形質転換ベクターで、Agrobacterium介在性の形質転換を介して自殖トウモロコシ植物系統の形質転換を実施した。このコンストラクトがコードするmiRNAは、トウモロコシ植物のGA20オキシダーゼ_3遺伝子及びGA20オキシダーゼ_5遺伝子を抑制標的とするRNA配列を含むものである。このコンストラクトを用いて形質転換イベントをいくつか生じさせ、こうした形質転換体の草高が非トランスジェニック野生型対照植物と比較して低下したかを決定するために形質転換体を温室で試験した。図1において確認できるように、野生型(WT)対照植物と比較して、抑制コンストラクトを発現するトランスジェニック植物において草高が有意に低下し、この有意な低下は、いくつかの形質転換イベント(イベント1~8を参照のこと)を通じて一貫して観測された。それぞれの形質転換イベントについての草高を、それぞれのイベントにつき約10の植物の平均値として計算し、対照植物の高さの平均値と比較した。それぞれのイベント及び対照植物について標準誤差を計算した。計算した標準誤差は、エラーバーとして図1に示される。さらに、こうした形質転換体のそれぞれにおける雌穂の発育は、正常であると思われた。
実施例1に記載のGA20オキシダーゼ抑制コンストラクトを保有する雑種トウモロコシ植物もまた、圃場条件下で生育すると、野生型対照植物と比較して草高が低下することが示された。GA20オキシダーゼ抑制要素を発現するトランスジェニック雑種トウモロコシ植物の平均草高を10の小区画で計算し、32の小区画における(非トランスジェニック)野生型対照雑種トウモロコシ植物の平均草高と比較した。トランスジェニック及び非トランスジェニック対照について約6つの植物を各小区画に含めたが、区画当たりの実際の植物数は、出芽して雌穂を有する植物へと発育した植物の数に応じて異なり得る。図2Aにおいて確認できるように、野生型雑種トウモロコシ植物(対照)と比較して、抑制コンストラクトを発現するトランスジェニック雑種植物(SUP-GA20ox雑種)では平均草高の有意な低下が観測された。トランスジェニック雑種及び対照植物について標準誤差を計算した。計算した標準誤差は、エラーバーとして図2Aに示される。GA20オキシダーゼ抑制要素を発現するトランスジェニック雑種植物(右)の隣に雑種対照植物(左)を並べた画像が図2Bにさらに示される。
実施例1に記載のGA20オキシダーゼ抑制コンストラクトを保有する雑種トウモロコシ植物は、圃場条件下で生育すると、野生型対照植物と比較して茎直径が増加することも示された。茎直径は、一次雌穂の下の第2の節間で測定した。GA20オキシダーゼ抑制要素を発現するトランスジェニック雑種トウモロコシ植物の平均茎直径を8つの小区画で計算し、8つの小区画における(非トランスジェニック)野生型対照雑種トウモロコシ植物の平均茎直径と比較した。各小区画には約6つの植物を含めた。図3Aにおいて確認できるように、野生型雑種トウモロコシ植物(対照)と比較して、抑制コンストラクトを発現するトランスジェニック雑種植物(SUP-GA20ox雑種)では平均茎直径の有意な増加が観測された。トランスジェニック雑種及び対照植物について標準誤差を計算した。計算した標準誤差は、エラーバーとして図3Aに示される。雑種対照植物(対照;左)に由来する柄の横断面を、GA20オキシダーゼ抑制要素を発現するトランスジェニック雑種植物(SUP_GA20ox;右)に由来する柄の横断面の隣に並べて示した画像が図3Bにさらに示される。
実施例1に記載のGA20オキシダーゼ抑制コンストラクトを保有する雑種トウモロコシ植物は、圃場条件下で生育すると、野生型対照植物と比較して新鮮雌穂重量が増加することも示された。GA20オキシダーゼ抑制要素を発現するトランスジェニック雑種トウモロコシ植物の区画当たりの平均新鮮雌穂重量を24の小区画で計算し、8つの小区画における(非トランスジェニック)雑種トウモロコシ対照植物の平均新鮮雌穂重量と比較した。この場合も先と同様に、各小区画には約6つの植物を含めた。図4において確認できるように、野生型雑種トウモロコシ植物(対照)と比較して、抑制コンストラクトを発現するトランスジェニック雑種植物(SUP-GA20ox雑種)では、区画当たりの平均新鮮雌穂重量の増加が観測され、雌穂及び穀粒の発育は正常であると思われた。トランスジェニック雑種植物及び対照植物についてこの実験の標準偏差を計算した。計算した標準偏差は、エラーバーとして図4に示される。図5に示されるように、風害も併せて受けた別の圃場試験場所においても同様の結果が得られた。
圃場試験場所において開花前の雑種トウモロコシ植物に風害を与えたところ、野生型雑種対照植物と比較して、実施例1に記載のGA20オキシダーゼ抑制コンストラクトを発現する植物では耐倒伏性が増加していることが示された。野生型(非トランスジェニック)雑種対照植物では、この強風イベントを受けて視覚的に倒伏が生じたが、GA20オキシダーゼ抑制要素を発現するトランスジェニック雑種トウモロコシ植物は、隣接する圃場場所において倒伏害に抵抗性を示した。GA20オキシダーゼ抑制コンストラクトを発現する雑種トウモロコシ植物による耐倒伏性の効果を評価するために、2つの圃場試験場所に倒伏害を与え、これらの場所を通じて、トランスジェニックGA20オキシダーゼ抑制雑種トウモロコシ植物の区画当たりの平均新鮮雌穂重量を野生型雑種対照植物の平均新鮮雌穂重量と比較した。これらの2つの試験から収集したデータによって、GA20オキシダーゼ抑制コンストラクトを発現する雑種植物と比較して、雑種対照植物の平均新鮮雌穂重量が2つの試験でそれぞれ約57%及び約81%減少したことが示された。
実施例1に記載のGA20オキシダーゼ抑制コンストラクトを保有する雑種トウモロコシ植物は、圃場条件下で生育すると、野生型対照植物と比較して収穫指数が増加することがさらに示された。GA20オキシダーゼ抑制要素を発現するトランスジェニック雑種トウモロコシ植物の収穫指数を、8つの小区画で生育した植物から決定し、非トランスジェニック雑種トウモロコシ対照植物と比較した。各小区画には約6つの植物を含めた。図6において確認できるように、野生型雑種トウモロコシ植物(対照)と比較して、抑制コンストラクトを発現するトランスジェニック雑種植物(SUP-GA20ox雑種)では収穫指数の有意な増加が観測された。トランスジェニック雑種及び対照植物について標準誤差を計算した。計算した標準誤差は、エラーバーとして図6に示される。
GA20オキシダーゼ抑制要素(実施例1に示される)を発現する雑種トウモロコシ植物についての平均穀物収量推定値は、圃場の16の小区画(区画当たり約6つの植物を含む)から計算した。GA20オキシダーゼを抑制するこうしたトランスジェニック雑種トウモロコシ植物について計算した平均穀物収量推定値は、トウモロコシ雑種対照植物を上回って約15%増加していた(図7)。穀物収量推定値は、雌穂形質指標に基づく予測収量の一般的な推定値を与える指標である。穀物収量推定値は、小区画に対して手作業で収穫された雌穂から得られるものであり、単位は、kg/ha(bu/acの代わり)である。穀物収量推定値(kg/ha)は、(単位面積当たりの穀粒数(穀粒/m2)x単一穀粒重量(mg)x15.5%/100)という式によって計算される。
GA20オキシダーゼ抑制要素(実施例1に示される)を発現する雑種トウモロコシ植物では、非トランスジェニック雑種対照植物と比較して多収性及び二次雌穂が増加することも小区画実験で示された。多収性スコアは、圃場におけるトランスジェニック雑種トウモロコシ植物の10の小区画(区画当たり約6つの植物を含む)から決定した。図8に示されるように、GA20オキシダーゼを抑制するトランスジェニック雑種トウモロコシ植物の平均多収性スコアは3であった一方で、対照植物の平均多収性スコアは1であった。多収性スコアを決定するために、R1発育期における二次雌穂の発育について植物をアッセイした。下記の尺度に基づいて植物の評価付けを行った:1=二次雌穂の形成がほとんど生じないか、または全く生じない。2=二次雌穂で絹糸が顕著である。3=雌穂の葉鞘から発育した二次雌穂が出現している。4=一次雌穂と同様に二次雌穂が良好に発育している。収穫期の終わりには、少なくともいくつかの二次雌穂が産生し、穀粒が正常に発育したことがさらに示された。
実施例1に記載のGA20オキシダーゼ抑制コンストラクトを形質転換して市販の雌性トウモロコシ自殖系統に導入し、多くの形質転換イベントを創出した。形質転換した植物を生育させ、自家交雑によって十分な種子を増やした後、さまざまな市販の雄性トウモロコシ自殖系統と交雑させることで雑種トウモロコシ植物を作出した。雄性-雌性雑種の作出に使用される異なる雄性自殖系統はそれぞれ、テスターと呼ばれる。次に、異なるテスターとの雑種トウモロコシ植物を、標準的な農学的慣例(SAP)に従って圃場の広域エーカーで生育させた。SAPの植え付け密度では、作条間隔を30インチとしてエーカー当たりの植物数を34,000とした。
表4.SAP条件下及びHD条件下におけるトランスジェニック植物と対照との広域エーカーでの収量差異
表5.SAP下及びUHD下でのトランスジェニック植物と対照植物との間の形質差異。
表6.SAP下及びUHD下でのトランスジェニック植物と対照植物との間の雌穂形質差異。
この実施例は、自動化温室(AGH)または圃場(記載のとおり)において、実施例1に記載のGA20オキシダーゼ抑制コンストラクトを有するトランスジェニックトウモロコシ植物の、水及び窒素のストレス応答が対照と比較して増進したことを示す。AGHにおいて植物の表現型を自動でアッセイするための装置及び方法は、例えば、米国特許公開第2011/0135161号に開示されており、当該文献は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
表7.AGHでの5つの生育条件の説明。
表8.温室における通常条件下及びストレス条件下のトランスジェニック植物と対照植物とを、植え付けから21日経過した時点で比較したもの。
通常条件下及び乾燥条件下での葉における気孔コンダクタンス及び光合成のレベルを温室においても測定した。この実験については、実施例1由来のGA20オキシダーゼ抑制コンストラクトを含むトランスジェニック植物、及び野生型対照植物を、十分な水(1日当たり水1500ml)を与える処理、または水制限/長期乾燥(1日当たり水1000ml)処理に供した。野生型対照植物の20の反復検体、及びGA20オキシダーゼ抑制コンストラクトについてはイベント当たり10の反復検体(合計2つのイベント)を、十分な水を与える処理に供すと共に、野生型対照植物の140の反復検体、及びGA20オキシダーゼ抑制コンストラクトについてはイベント当たり70の反復検体(合計2つのイベント)を、水制限/長期乾燥処理に供した。温室では実験植物の外周付近に適切な高さの境界用植物(野生型植物については雑種のもの、及びトランスジェニック植物については自殖のもの)を設置することで遮光作用を標準化した。日周の気孔コンダクタンス及び光合成の測定値は、製造者の説明に従い、午前及び午後にLI-COR(登録商標)デバイスを用いてV12期に取得した。図12Aに示されるように、トランスジェニック植物については水を十分に与える条件下と乾燥条件下との両方において毎日の両方の時点で気孔コンダクタンスが一貫して上昇していることが明らかとなった。トランスジェニック植物では、乾燥条件下で葉巻の減少も観測された。図12Bにさらに示されるように、乾燥条件に応じて光合成速度がより高く観測され、この光合成速度は、特に乾燥条件下で午後に光合成速度が低下した対照植物とは異なり、午後に太陽光が増加しても、その増加に対して有意に応答することはなかった。
表10.トランスジェニック植物と対照との温室での生殖形質の比較。
表11.バーミキュライト培地におけるV3時点のトランスジェニック植物と対照との温室での根の形質比較。
表13.異なるプロモーターの制御下にある、GA20オキシダーゼに対するmiRNA抑制コンストラクトを含むR0トランスジェニック植物の知見のまとめ。
表14.異なるGAオキシダーゼ遺伝子を標的とするmiRNA抑制コンストラクトを含むR0トランスジェニック植物の知見のまとめ。
表15.GA20オキシダーゼ_3遺伝子及びGAオキシダーゼ_5遺伝子を編集標的とするガイドRNA(gRNA)。
GA20オキシダーゼ_3遺伝子及びGA20オキシダーゼ_5遺伝子を標的とする抑制コンストラクトを用いることで、トランスジェニック植物におけるGA20オキシダーゼの転写物レベルがどのように影響を受けたかを決定するために、温室で生育したトランスジェニック植物のさまざまな部分から、異なる栄養生長段階(V3、V8、及びV14)に組織全体を採取し、GA20オキシダーゼ遺伝子のそれぞれのmRNA転写物レベルをTaqMan(登録商標)アッセイを使用して分析した。こうした実験については、Zymo Research(商標)から入手したDirect-Zol RNA抽出キットを使用して全RNAを抽出し、Turbo(商標)DNaseで処理することでゲノムDNAの混入を低減した。その後、RNAの逆転写を行うことで二本鎖cDNAを生成した。遺伝子特異的プライマー及びFAM標識TaqMan(登録商標)プローブをBio-Rad(登録商標)CFX96リアルタイムシステムで用いて逆転写定量的PCRを実施した。組織特異的な標準物質を使用して品質管理指標を計算し、qPCRの効率、及び逆転写を受けなかった全RNAを決定することで、残留ゲノムDNAの混入を把握した。正規化遺伝子に対する目的遺伝子のサイクル閾値の間の差異によって、それぞれの組織におけるそれぞれの遺伝子転写物の相対量を決定した。この相対量は、1つの正規化遺伝子(18S)を使用するか、または2つの正規化遺伝子(18S及びELF1A)の幾何平均を使用して計算した。
表16.GA20オキシダーゼ抑制コンストラクトを発現する、温室のトランスジェニックトウモロコシ植物の組織におけるGAホルモンレベルの変化。
Claims (64)
- 非コードRNA分子をコードする転写可能なDNA配列を含む組換えDNAコンストラクトであって、前記非コードRNA分子が、
(a)トウモロコシ植物または植物細胞の第一の内在性のGAオキシダーゼタンパク質をコードする第一のmRNA分子の少なくとも19の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%の相補性を有し、前記第一の内在性のGAオキシダーゼタンパク質が、配列番号9に対して少なくとも95%の同一性を有し、かつ
(b)トウモロコシ植物または植物細胞の第二の内在性のGAオキシダーゼタンパク質をコードする第二のmRNA分子の少なくとも19の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%の相補性を有し、前記第二の内在性のGAオキシダーゼタンパク質が、配列番号15に対して少なくとも95%の同一性を有する、
標的配列を含み、
前記転写可能なDNA配列が、維管束プロモーターに機能可能なように連結され、
前記非コードRNA分子が、組換えDNAコンストラクトを含むトランスジェニックトウモロコシ植物で発現される場合、対照の植物と比較して、前記トランスジェニックトウモロコシ植物の少なくとも1つの組織で、前記第一のmRNA分子及び前記第二のmRNA分子の発現レベルを低下させる、前記組換えDNAコンストラクト。 - 前記非コードRNA分子の標的配列が、配列番号7、8、13、及び14からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列の少なくとも19の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%の相補性を有する、請求項1に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 前記非コードRNA分子の標的配列が、(i)第一のmRNA分子の少なくとも19の連続ヌクレオチドに対して100%の相補性を有し、及び/または(ii)第二のmRNA分子の少なくとも19の連続ヌクレオチドに対して100%の相補性を有する、請求項1又は2に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 前記非コードRNA分子の標的配列が、(i)配列番号7もしくは配列番号8の少なくとも19の連続ヌクレオチドに対して100%の相補性を有し、及び/または(ii)配列番号13もしくは配列番号14の少なくとも19の連続ヌクレオチドに対して100%の相補性を有する、請求項1から3のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 前記維管束プロモーターが、下記のもののうちの1つを含む、請求項1から4のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト:スクロース合成酵素プロモーター、スクローストランスポータープロモーター、Sh1プロモーター、ツユクサ黄斑ウイルス(CoYMV)プロモーター、コムギ矮化ジェミニウイルス(WDV)長鎖遺伝子間領域(LIR)プロモーター、トウモロコシ縞葉枯病ジェミニウイルス(MSV)コートタンパク質(CP)プロモーター、イネ黄色条斑1(YS1)様プロモーター、またはイネ黄色条斑2(OsYSL2)プロモーター。
- 前記転写可能なDNA配列がコードする前記非コードRNA分子が、植物細胞においてプロセシングまたは切断を受けることで成熟miRNAまたは成熟siRNAを形成する前駆体miRNAまたは前駆体siRNAである、請求項1から5のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 前記非コードRNA分子の標的配列が、(i)第一のmRNA分子の少なくとも21の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%の相補性を有し、及び/または(ii)第二のmRNA分子の少なくとも21の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%の相補性を有する、請求項1から6のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 前記非コードRNA分子が、(i)配列番号7もしくは配列番号8の少なくとも21の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%の相補性を有し、及び/または(ii)配列番号13もしくは配列番号14の少なくとも21の連続ヌクレオチドに対して少なくとも90%の相補性を有する、請求項1から6のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 前記非コードRNA分子の標的配列が、(i)第一のmRNA分子の少なくとも21の連続ヌクレオチドに対して100%の相補性を有し、及び/または(ii)第二のmRNA分子の少なくとも21の連続ヌクレオチドに対して100%の相補性を有する、請求項1から6のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 前記非コードRNA分子が、(i)配列番号7もしくは配列番号8の少なくとも21の連続ヌクレオチドに対して100%の相補性を有し、及び/または(ii)配列番号13もしくは配列番号14の少なくとも21の連続ヌクレオチドに対して100%の相補性を有する、請求項1から6のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト。
- (i)第一の内在性のGA20オキシダーゼタンパク質が、配列番号9に対して少なくとも99%の同一性を有し、及び/または(ii)第二の内在性のGA20オキシダーゼタンパク質が、配列番号15に対して少なくとも99%の同一性を有する、請求項1から10のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト。
- (i)第一の内在性のGA20オキシダーゼタンパク質が、配列番号9に対して100%の同一性を有し、及び/または(ii)第二の内在性のGA20オキシダーゼタンパク質が、配列番号15に対して100%の同一性を有する、請求項1から10のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 前記維管束プロモーターが、イネツングロ桿菌状ウイルス(RTBV)プロモーターである、請求項1から4、もしくは6から12のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 前記RTBVプロモーターが、配列番号65もしくは配列番号66、またはその機能性部分のうちの1つまたは複数に対して少なくとも90%の同一性を有するDNA配列を含む、請求項13に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 前記RTBVプロモーターが、配列番号65もしくは配列番号66のうちの1つまたは複数に対して100%の同一性を有するDNA配列を含む、請求項13に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 前記維管束プロモーターが、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、および配列番号71からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項5に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 前記非コードRNA分子が、前記トランスジェニックトウモロコシ植物で発現される場合、対照の植物と比較して、前記トランスジェニックトウモロコシ植物で第一及び第二の内在性のGAオキシダーゼタンパク質の発現を下方制御する、請求項1から16のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、DNA分子。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、形質転換ベクター。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、トランスジェニックトウモロコシ植物、植物部分、または植物細胞。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物が、野生型対照トウモロコシ植物と比較して下記の形質のうちの1つまたは複数を有する、請求項20に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物:低い植物高、柄直径/茎直径の増加、耐倒伏性の改善、茎の折損の減少、根の深化、葉面積の増加、樹冠閉鎖の早期化、気孔コンダクタンスの上昇、雌穂高の低下、葉の水分含量の増加、乾燥耐性の改善、窒素利用効率の改善、通常条件下または窒素もしくは水を制限するストレス条件下での葉におけるアントシアニンの含量及び面積の減少、雌穂重量の増加、収穫指数の増加、収量の増加、種子数の増加、種子重量の増加、及び/または多収性の増加。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物が、対照植物と比較して低い草高を有する、請求項20又は21に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物の高さが、対照トウモロコシ植物と比較して少なくとも10%低い、請求項20又は21に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物の高さが、対照トウモロコシ植物と比較して少なくとも20%低い、請求項20又は21に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物の高さが、対照トウモロコシ植物と比較して少なくとも30%低い、請求項20又は21に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物の高さが、対照トウモロコシ植物と比較して少なくとも40%低い、請求項20又は21に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物が、対照植物と比較して、より深化した根を有する、請求項20又は21に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物の1つまたは複数の茎節間の柄直径または茎直径が、対照植物の同一の1つまたは複数の節間の柄直径または茎直径と比較して大きい、請求項20から27のいずれか1項に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物の1つまたは複数の茎節間の柄直径または茎直径が、野生型対照トウモロコシ植物の同一の1つまたは複数の茎節間の柄直径または茎直径と比較して少なくとも5%大きい、請求項20から27のいずれか1項に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物の雌穂の下の第1の節間、第2の節間、第3の節間、及び/または第4の節間のうちの1つまたは複数の柄直径または茎直径が、野生型対照トウモロコシ植物の同一の節間と比較して少なくとも5%大きい、請求項20から27のいずれか1項に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照トウモロコシ植物の同一の節間組織と比較して低い、請求項20から30のいずれか1項に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物の茎または柄の少なくとも1つの節間組織における1つまたは複数の活性型GAのレベルが、野生型対照トウモロコシ植物の同一の節間組織と比較して少なくとも5%低い、請求項20から30のいずれか1項に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物が、少なくとも1つの雌性器官または雌穂に顕著な異型を全く有さない、請求項20から32のいずれか1項に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 前記組換えDNAコンストラクトが、前記トランスジェニックトウモロコシ植物、植物部分、または植物細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項20から33のいずれか1項に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物、植物部分、または植物細胞。
- トランスジェニックトウモロコシ植物の作出方法であって、
(a)請求項1から17のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト、請求項18に記載のDNA分子又は請求項19に記載の形質転換ベクターで、トウモロコシ外植体の少なくとも1つの細胞を形質転換して、形質転換されたトウモロコシ外植体を生成する工程と、
(b)前記形質転換されたトウモロコシ外植体から、前記トランスジェニックトウモロコシ植物を再生する、または発育させる工程と、
を含み、
トランスジェニックトウモロコシ植物が前記組換えDNAコンストラクトを含む、前記方法。 - 前記組換えDNAコンストラクトが、前記トランスジェニックトウモロコシ植物のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項35に記載の方法。
- 前記トウモロコシ外植体の少なくとも1つの細胞が、Agrobacterium介在性の形質転換、Rhizobium介在性の形質転換、または微粒子銃を介して形質転換される、請求項35又は36に記載の方法。
- 前記トウモロコシ外植体の少なくとも1つの細胞が、前記トウモロコシ外植体の少なくとも1つの細胞のゲノムへの前記組換えDNAコンストラクトの部位特異的組込みにより形質転換される、請求項35から37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えDNAコンストラクトの部位特異的組込みが、部位特異的ヌクレアーゼの使用を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、天然のメガヌクレアーゼ、TALE-エンドヌクレアーゼ、及びRNAガイド型エンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項39に記載の方法。
- 前記組換えDNAコンストラクトの部位特異的組込みが、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイドRNAの使用を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記RNAガイド型エンドヌクレアーゼが、Cas9及びCpf1からなる群より選択される、請求項40又は41に記載の方法。
- 前記RNAガイド型エンドヌクレアーゼが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、ならびにそれらの相同体または改変バージョンからなる群より選択される、請求項40又は41に記載の方法。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクト、請求項18に記載のDNA分子又は請求項19に記載の形質転換ベクターで、トウモロコシ外植体の少なくとも1つの細胞を形質転換する工程を含む、トランスジェニックトウモロコシ外植体を生成する方法。
- 前記組換えDNAコンストラクトが、トランスジェニックトウモロコシ外植体のゲノムに安定に組み込まれる、請求項44に記載の方法。
- 前記トウモロコシ外植体の少なくとも1つの細胞が、微粒子銃を介した形質転換を介して形質転換される、請求項44又は45に記載の方法。
- 前記トウモロコシ外植体の少なくとも1つの細胞が、Agrobacterium介在性の形質転換又はRhizobium介在性の形質転換を介して形質転換される、請求項44又は45に記載の方法。
- トウモロコシ外植体の少なくとも1つの細胞が、前記外植体の少なくとも1つの細胞のゲノムへの前記組換えDNAコンストラクトの部位特異的組込みにより形質転換される、請求項44又は45に記載の方法。
- 前記組換えDNAコンストラクトの部位特異的組込みが、部位特異的ヌクレアーゼの使用を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、操作されているメガヌクレアーゼ、天然のメガヌクレアーゼ、TALE-エンドヌクレアーゼ、及びRNAガイド型エンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項49に記載の方法。
- 前記組換えDNAコンストラクトの部位特異的組込みが、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ及び少なくとも1つのガイドRNAの使用を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記RNAガイド型エンドヌクレアーゼが、Cas9及びCpf1からなる群より選択される、請求項50又は51に記載の方法。
- 前記RNAガイド型エンドヌクレアーゼが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、及びCasYからなる群より選択される、請求項50又は51に記載の方法。
- 請求項20から34のいずれか1項に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物から作成され、前記組換えDNAコンストラクトを含む、改変された植物産物。
- 請求項20から34のいずれか1項に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物部分から作成され、前記組換えDNAコンストラクトを含む、改変された植物産物。
- 請求項20から34のいずれか1項に記載のトランスジェニックトウモロコシ植物細胞から作成され、前記組換えDNAコンストラクトを含む、改変された植物産物。
- 前記トランスジェニックトウモロコシ植物部分が種子である、請求項55に記載の改変された植物産物。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、改変された植物産物。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、組成物。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、生存不可能なトウモロコシ植物部分。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、再生不可能なトウモロコシ植物部分。
- 生存不可能な、又は再生不可能なトウモロコシ植物部分、ならびに請求項1から17のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、改変された植物産物。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、改変されたトウモロコシプロトプラスト。
- 請求項1から17のいずれか1項に記載の組換えDNAコンストラクトを含む、改変されたトウモロコシ種子。
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