CN111778265B

CN111778265B - 玉米赤霉素氧化酶的突变基因、突变体、表达载体和应用

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Publication number: CN111778265B
Application number: CN202010675989.1A
Authority: CN
Inventors: 李毅丹; 郭嘉; 刘相国; 刘洋; 初卫国; 崔秀兰; 李辉; 肖博
Original assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-07-14
Filing date: 2020-07-14
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2040-07-14
Also published as: CN111778265A

Abstract

本发明适用于分子生物技术领域，提供了一种玉米赤霉素氧化酶的突变基因、突变体、表达载体和应用，该玉米赤霉素氧化酶的原始基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其突变基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。本发明实施例提供的玉米赤霉素氧化酶的突变基因，可用作为构建植物表达载体并转化至拟南芥等作物中，通过干旱胁迫处理前后观测转基因拟南芥的表型、存活率等生命状态，结果显示，该玉米赤霉素氧化酶的突变基因可降低拟南芥等植物的株高以及提高拟南芥等植物的耐旱性。

Description

玉米赤霉素氧化酶的突变基因、突变体、表达载体和应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，尤其涉及一种玉米赤霉素氧化酶的突变基因、突变体、表达载体和应用。

背景技术

作物经常会受到各种各样的非生物胁迫，例如干旱、盐、低温等，严重制约了作物的种植区域，甚至导致产量下降。玉米是重要的粮食和经济作物，虽然其已被证明是对环境最具适应性的作物之一，但玉米生长发育及产量依旧会受到多种非生物胁迫的影响。近年来我国玉米生产越来越严重的受到区域性、阶段性干旱的影响，轻则造成生产成本提高，重则造成玉米的产量和品质严重下降。

最新的研究则发现赤霉素代谢调控也直接参与了植物耐受干旱、低温、高盐、弱光等诸多非生物胁迫的响应和调控过程，通过对少数赤霉素代谢调控基因的遗传改良，可提高植物对非生物胁迫的耐受性。这些发现为研究玉米耐旱机制开拓了新思路。

ZmGA2ox6是玉米赤霉素合成途径中的一个GA2ox类负调控基因。GA2ox类基因的表达产物(GA 2-oxidases)可通过降解赤霉素及其前体物质，调控植物中赤霉素的含量，进而影响植物株型、产量、抗逆、抗病等诸多性状。GA2ox类基因参与植物耐受非生物胁迫响应的详细报道，始见于对拟南芥ddf1突变体的研究。盐胁迫条件下ddf1突变体中的AtGA2ox7基因发生了上调表达，导致了赤霉素水平的明显下降，进而通过降低植物生长速率、降低植物叶面积增长率等一系列生理反应，最终提高了植物在盐胁迫下的生存几率。在拟南芥中的研究还发现AtGA2ox6和AtGA2ox7以类似的方式分别参与到了水分胁迫和冷胁迫的响应过程中。在拟南芥中过表达水稻OsGA2ox5基因，也显著提高了拟南芥的耐盐性。另外，AtGA2ox3和AtGA2ox6也参与了拟南芥耐受低温胁迫的响应过程。

在对野生二粒小麦(Triticum turgidum ssp.Dicoccoides)的研究中，研究人员利用芯片技术分析了野生二粒小麦在干旱胁迫条件下的转录谱变化，发现根中的GA2ox类基因在干旱胁迫下发生了表达下调，而GID1基因则发生了表达上调。这一结果表明植物中可能存在的耐旱响应机制为，GA2ox类基因下调表达导致根中赤霉素降解减弱，从而赤霉素含量上升；同时，GID1基因表达上调，导致植物体内的GA-GID1复合体增加，使其对DELLAs的降解诱导作用增强，从而减弱DELLAs对生长的抑制作用，进而促进根的伸长以获得更多的水分，提高其耐旱性。在对水稻干旱胁迫下不同器官的转录谱分析也发现了与野生二粒小麦相似的结果。在干旱胁迫下，水稻根中的GA2ox基因表达显著下调。虽然没有同时检测到GID1基因的表达上调，但GA2ox基因参与植物耐旱响应则进一步得到了证实。该研究中还发现，与根中相反，干旱胁迫下水稻叶片中的GA2ox基因表达发生了显著的上调。在其他植物叶片或地上部分的研究中均得到了与水稻中相似的结果，即干旱会诱导GA2ox类基因表达上调。例如，面包果(Artocarpus altilis)的相关研究中，发现该植物中的全部4个GA2ox类基因，在干旱胁迫下均发生了显著的表达上调；又如，本课题组在玉米苗期叶片转录谱分析过程中，也发现了GA2ox类基因表达在干旱胁迫后显著上调；另外，在杨树中利用转基因方法过表达GA2ox基因，发现转基因后代材料的耐旱性也得到了显著的提高。上述结果表明，GA2ox类基因不但参与了植物耐旱响应，而且在不同组织器官中还存在着表达调控机制的差异。

由于GA2ox类基因的表达变化会影响赤霉素含量，所以大多数GA2ox类基因相关的遗传改良材料多会发生明显的植株形态变化，甚至植物的育性也会受到影响，这对GA2ox类基因的应用较为不利。但在2010年发现的一个水稻OsGA2ox6基因突变体，其过表达既获得了使植株半矮化的优良性状，又消除了OsGA2ox6过表达引起的植株不育等不良性状。而在2017年对OsGA2ox6基因不同位点的点突变研究中，过表达野生型OsGA2ox6基因的水稻完全矮化，而过表达含有A141E位点突变的OsGA2ox6基因的水稻则显示出半矮化性状，并且其耐旱性、抗病性和产量均有显著的提升。这表明在自然材料或突变群体中，存在着可利用的GA2ox类等位基因资源。目前，在玉米中还未见利用ZmGA2ox类基因及其等位基因提高植物抗旱性的报道。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种玉米赤霉素氧化酶的突变基因，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种玉米赤霉素氧化酶的突变基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。其中，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示的突变基因命名为ZmGA2ox6-E144A；核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示的突变基因命名为ZmGA2ox6-A145E。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述玉米赤霉素氧化酶的原始基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其命名为ZmGA2ox6，全长为1089b p，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

在此基础上，利用Fast Mutagenesis System对ZmGA2ox6基因进行定点突变，分别将431位的A突变为C，将434位的C突变为A，即可获得的序列分别命名为ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E的突变基因，其序列分别如SE Q ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种玉米赤霉素氧化酶的突变体，其是由上述的突变基因编码而得。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述玉米赤霉素氧化酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示，其由362个氨基酸组成，此蛋白属于2ODDs(2-oxoglutarate–dependent dioxygenases)家族，通过对玉米、水稻、高粱、拟南芥等不同物种中的2ODDs蛋白进行***进化分析，发现它们存在数个分支，表明了它们的功能可能各不相同。而ZmGA2ox6与SbGA2ox6(高粱)以及AtG A2ox8(拟南芥)的亲缘关系最近。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述突变体的氨基酸序列如序列表S EQID NO:5或SEQ ID NO:6所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种表达载体，其含有上述的突变基因。

在本发明的实施例中，提供了三种重组植物表达载体，其分别含有上述的ZmGA2ox6及其突变基因ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E。

具体的，可根据ZmGA2ox6及其突变基因ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E的ORF序列及中间载体pCHF3300多克隆位点的相关信息，设计引物时加入相应酶切位点以扩增ZmGA2ox6及其突变基因ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E。将经测序验证的、准确的ZmGA2ox6及其突变基因ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E用相应的限制性内切酶酶切，回收小片段(基因)。同时将表达载体pART-CAM以相同限制性内切酶酶切，回收大片段(载体)。In-fusion试剂盒将回收的大、小片段连接，分别重组为ZmGA2ox6基因、ZmGA2o x6-E144A基因、ZmGA2ox6-A145E基因的植物表达载体。之后将重组载体转化大肠杆菌、提取质粒进行PCR和酶切鉴定。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的突变基因在改良植物的株型中的应用。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述植物为拟南芥。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的突变基因在提高植物的耐旱性中的应用。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述植物为拟南芥。

具体的，可以利用蘸花法分别将上述含有ZmGA2ox6、ZmGA2ox6-E144A、ZmGA2ox6-A145E基因的植物表达载体导入拟南芥，多代经卡那霉素筛选及分子鉴定，获得T₃代拟南芥转基因植株。对纯合的T₃代转基因拟南芥植株进行株型鉴定及耐旱性分析，结果表明，过表达植株株高明显变矮，耐旱性显著高于野生型。

本发明实施例提供的一种玉米赤霉素氧化酶的突变基因，可用作为构建植物表达载体并转化至拟南芥等作物中，通过干旱胁迫处理前后观测转基因拟南芥的表型、存活率等生命状态，结果显示，该玉米赤霉素氧化酶的突变基因可降低拟南芥等植物的株高以及提高拟南芥等植物的耐旱性。

附图说明

图1为玉米ZmGA2ox6与其他植物GA2ox氨基酸的多重序列比较图。其中：SbGA2ox6为高粱；AtGA2ox8为拟南芥。

图2为玉米ZmGA2ox类基因的***进化树分析示意图。其中：OsGA2ox类为水稻；AtGA2ox类为拟南芥。

图3为过表达ZmGA2ox6及其突变基因ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E的拟南芥材料的莲座叶发育情况。

图4为过表达ZmGA2ox6-A145E基因不同T₃代材料与野生型材料株高的对比图。

图5为过表达ZmGA2ox6-E144A基因T₃代材料经干旱胁迫后与野生型材料的对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

该实施例提供了一种玉米赤霉素氧化酶的原始基因ZmGA2ox6的克隆方法及其突变基因。

其中，玉米赤霉素氧化酶的原始基因ZmGA2ox6的克隆方法包括以下步骤：

S1、RNA的提取：培养玉米自交系B73至三叶期，使用康为世纪的超纯R NA提取试剂盒(CW0581)对叶片的总RNA进行提取。具体的如下：

S11、取新鲜玉米叶片在液氮中充分研磨，每40mg组织加入1mL TRIzo n试剂，充分混匀。

S12、混匀后的样品温和上下颠倒几次，室温放置5min，使样本充***解。

S13、加入200μL氯仿，盖好离心管盖，剧烈振荡15s，室温放置2min。

S14、置于4℃，12000rpm条件下离心10min，吸取上层水相550μL，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管中。

S15、在水相溶液中加入550μL的70％乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀。

S16、将上一步得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Colum nsRM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

S17、向吸附柱中加入700μL的Buffer RW1，12000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

S18、向吸附柱中加入500μL的Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

S19、重复步骤S18。

S110、12000rpm离心2min，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。

S111、将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入40μL的RNase-Free Water，室温放置1min，12000rpm离心1min，收集RN A溶液，-80℃保存RNA，防止降解。

S2、反转录：使用宝生物公司的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNAEraser(RR047A)对提取的RNA进行反转录。

其中，去gDNA反应体系如下表1：

表1

试剂	体积
		5×gDNA Eraser Buffer	2μL
gDNA Eraser	1μL
		Total RNA	1μg
RNase Free Water	up to 10μl

将按照表1混匀的预混液放入42℃孵育2min，随后置于4℃进行反转录反应5min。反转录反应采用SYBR Green qPCR法，具体反转录反应体系如下表2：

表2

试剂	体积
		表1的预混液	10μL
rime Soript RT Enzyme MixⅠ	1μL
		RT Primer Mix	1μL
5×Prime Soript Buffer 2	4μL
		RNase Free Water	4μL

将表2的整个反转录反应体系放入PCR仪中，程序设置37℃，15min；85℃，5s。

S3、ZmGA2ox6基因ORF全长的扩增：

根据NCBI公布的玉米ZmGA2ox6的ORF基因序列，运用生物信息学软件Primer 5.0遵循引物设计原则，设计该基因的特异性克隆引物，如下所示：

FP：5’-ATGCGTTACGTAGCTGCCACTCC-3’(如序列表SEQ ID NO:7所示)；

RP：5’-TTAGGCGGGCCGTGATTGAGGGG-3’(如序列表SEQ ID NO:8所示)。

以上述反转录得到的cDNA为模板，使用高保真耐热DNA聚合酶PrimeST AR GXLDNA polymerase克隆ZmGA2ox6，反应体系见表3，反应程序见表4。注：若cDNA浓度太低，可适当增加cDNA的用量。若第一次PCR的目的条带过浅，可用其回收产物继续进行同样步骤的PCR，反应体系见表3，反应程序见表4：

表3

表4

S4、ZmGA2ox6的DNA片段回收及其点突变：

使用生工的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对ZmGA2ox6目的片段进行回收，具体如下：

S41、电泳后切取含有ZmGA2ox6目的片段的胶块，称重，置于1.5mL离心管中。根据胶块的重量，每100mg左右的凝胶对应加入300μL Buffer B2。

S42、将离心管放入50℃金属浴10min，在此期间可数次颠倒离心管使融化的液体和未融化的胶块混匀，加速溶化。

S43、将所得溶液置于吸附柱中并以8000rpm离心30s。如果溶液的总体积大于750μL，每次加入750μL，多次重复操作。

S44、向吸附柱中加入300μL Buffer B2，转速设定为9000rpm，离心30s，然后倒出废液。

S45、向吸附柱中加入500μL Buffer B2，设置转速为9000rpm，离心时间30s。倒掉废液。再重复一次。

S46、把空的吸附柱和收集管一起放入离心机中，在9000rpm条件下离心60s。取一个新的1.5mL的离心管，将吸附柱放入其中，晾置10min。

S47、在吸附膜中央加入30μL TE buffer或ddH₂O，室温静置2min，在9000rpm条件下离心60s。将该步骤中所得到的DNA溶液放在-20℃的冰箱中保存或用于后续试验。

S48、以回收的DNA为模板，利用全式金公司的Fast Mutagenesis System试剂盒进行定点突变。分别将431位的A突变为C，将434位的C突变为A。获得的序列分别命名为ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，并在此使用生工的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E目的片段进行回收。

S5、ZmGA2ox6，ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E分别连接入pMD18-T Vector：

使用TaKaRa的DNA A-Tailing Kit以及pMD18-T Vector Cloning Kit将目的片段与pMD18-T载体进行连接，获得重组载体用于基因测序。

S51、对三种目的片段胶回收DNA片段的3’末端进行加“A”反应。

(1)在200μL离心管中配制如下连接反应体系如下表5：

表5

(2)将上述表5中的连接反应体系混匀后，置于72℃反应20min。

(3)反应结束后，再置于冰中静置2min，得到A-Tailing化的DNA片段。

S52、对上述A-Tailing化的DNA片段与pMD18-T载体进行连接。其中，p MD18-T连接反应体系如下表6：

表6

组分	体积
		pMD18-T Vector	1μL
A-Tailing DNA	4μL
		Solution I	5μL

其反应程序为：16℃反应1h。

S6、Top10大肠杆菌感受态转化及PCR检测：

S61、将50μL的TOP10大肠杆菌感受态置于冰上融化。

S62、用移液枪吸取上述步骤S5得到的连接产物5μL，加到50μL的TOP10大肠杆菌感受态中。

S63、冰浴30min后，42℃热激90s，冰浴5min。随后加入800μL的LB液体培养基。

S64、37℃震荡培养1h，8000rpm离心5min。弃掉上清液，在离心管中留有大约50μL培养基。用移液枪吹打混匀后，将其涂布于含有相应抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温，倒置培养14h。

S65、挑取单菌落于800μL含有相应抗生素的LB液体培养基中，将离心管放入摇床，37℃，180rpm，振荡培养10h左右。

S66、使用Ex Taq酶对菌液进行PCR分子检测。对PCR结果为阳性的菌液进行扩摇，并在菌液中加15％甘油，送华大基因公司进行测序，原菌液于-80℃冰箱保存。

实施例2

该实施例提供了两种玉米赤霉素氧化酶的突变体，分别是由上述的突变基因ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E编码而得，其对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

另外，利用ZmGA2ox6基因编码玉米赤霉素氧化酶，其开放阅读框有1089bp的核苷酸，编码362个氨基酸，得到的玉米赤霉素氧化酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。

利用TMHMM Server v.2.0在线网站，对该蛋白的跨膜区域进行初步预测，结果发现在该蛋白中未出现跨膜结构域，初步推测ZmGA2ox6为非跨膜蛋白。

如图1和图2所示，玉米赤霉素氧化酶ZmGA2ox6蛋白属于2ODDs(2-ox oglutarate–dependent dioxygenases)家族，通过对玉米、水稻、高粱、拟南芥等不同物种中的2ODDs蛋白进行***进化分析，发现它们存在数个分支，表明了它们的功能可能各不相同。而ZmGA2ox6与SbGA2ox6(高粱)以及AtGA2ox8(拟南芥)的亲缘关系最近。相关研究已经证明L-S-W-S-E-A motif为影响C20-GA2ox类基因与底物GA12/GA53结合的重要结构域。因此，对ZmGA2ox6中的潜在功能位点进行了点突变(E144A和A145E)。

实施例3

该实施例提供了三种重组植物表达载体，其分别含有上述的ZmGA2ox6及其突变基因ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E。重组植物表达载体的构建方法如下：

S1、根据中间载体多克隆位点处相应序列，引物设计时加入相应酶切位点。

S2、把经过高保真酶扩增出的基因，通过回收、加A、连接T载体、转化、PCR酶切鉴定、测序等一系列步骤，确定表达基因的正确性，有完整的开放阅读框、无错配、无移码。

S3、把测序正确的基因利用其设计的酶切位点酶切，回收小片段(基因)。

具体的，选限制性核酸内切酶Psp XI和XbaⅠ，将测序正确的目的片段从中间载体上切下，酶切体系如表7、表8所示。由于两个酶的酶切温度不同，因此先使用其中一种酶进行酶切，随后将酶切产物进行回收后，使用另一种酶进行酶切。Psp XI酶切体系如下表7，反应程序为：30℃水浴1h。

表7

组分	体积
		Psp XI	2.5μL
10×T Buffer	5μL
		0.1％BSA	5μL
DNA or vector	20μL
		灭菌水	17.5μL

XbaⅠ酶切体系如下表8，反应程序为：37℃水浴1h。

表8

S4、把表达载体pCAMBIA-3301以上述两种相同限制性内切酶切，回收大片段(载体)。

S5、把回收的大片段与小片段进行连接，然后转化大肠杆菌感受态、提取质粒进行PCR和酶切鉴定。具体的，将从中间载体上酶切的目的小片段(ZmG A2ox6、ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E)和pCAMBIA-3301载体大片段于16℃连接3h，得到对应的重组植物表达载体，其中，连接体系如表9所示。

表9

组分	体积
		目的小片段	5.5μL
载体大片段	2.5μL
		10×T4 ligase buffer	1μL
T4 DNA ligase	1μL

实施例4

该实施例提供了转ZmGA2ox6，ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E基因拟南芥的获得及分子检测，其是利用蘸花法对基因进行拟南芥转化，具体如下：

S1、将开花的拟南芥倒置使花蕾朝下，侵入农杆菌菌液中2min。

S2、将转化后的拟南芥植株平放，盖好保鲜膜，低光强度下生长24h后置于正常光照条件下培养生长，一周后同上再侵染一次。

S3、转化后植株可正常地开花生长，待角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子。

S4、收获的部分T₀代种子经卡那霉素筛选，PCR鉴定，获得T₁代转基因植株，经过两次加代，获得T₃代拟南芥植株，可用于后续的表型筛选。

实施例5

该实施例提供了T₃代转ZmGA2ox6，ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E基因拟南芥的干旱胁迫处理与长势测定：

分别随机播种拟南芥野生型与实施例4得到的转基因拟南芥种子，再移入22℃光照条件下培养。观察萌发情况并统计萌发率，实验重复三次。实验结果如附图3～5所示。

从图3和4可以看出，过表达ZmGA2ox6基因的拟南芥后代材料的植株形态受到了严重的影响，莲座叶变小，严重矮化；而过表达ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E的两份材料则表型未受到较为严重的影响，莲座叶与野生型相比稍小，可正常发育结实，株高出现半矮化表型；其说明ZmGA2ox6基因的过表达显著的影响了GA的生物合成，进而影响了拟南芥的表型；而ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E由于对关键位点进行了改造，其产物的催化效力降低，使其对GA合成前体物质的分解作用减弱，对GA的生物合成抑制作用降低，因此产生了半矮化性状。

另外，从附图5可以看出，过表达ZmGA2ox6-E144A的材料干旱胁迫25天后复水的存活率达到约90％；而过表达ZmGA2ox6-A145E材料的复水后的存活率也达到约75％，显著高于对照材料复水后25％左右的存活率。表明本发明的转基因拟南芥植株的耐旱性相对较高，过表达ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E基因可以提高拟南芥的耐旱性，其耐旱性明显高于非转基因拟南芥材料。

综上所述，本发明从玉米中得到一个赤霉素氧化酶基因ZmGA2ox6，并根据其蛋白结构，对其关键结构域上的特定位点进行了突变，获得了点突变基因Zm GA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E。通过农杆菌介导的转化方法，将分别含有ZmGA2ox6，ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E的植物表达载体成功转化拟南芥，获得了纯合的T₃代转基因拟南芥植株。结果显示，几种转基因拟南芥的植株形态发生了明显的改变。说明ZmGA2ox6及其点突变基因能够改变拟南芥的株型。其中，两个点突变基因ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E的过表达能够导致半矮化的性状出现。在干旱胁迫下，转基因拟南芥，特别是转ZmG A2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E基因材料，显示出更高的存活率。说明玉米赤霉素氧化酶ZmGA2ox6基因的两个点突变基因ZmGA2ox6-E144A和ZmGA2ox6-A145E的过表达能显著提高拟南芥的耐旱性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 吉林省农业科学院

<120> 玉米赤霉素氧化酶的突变基因、突变体、表达载体和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcgttacg tagctgccac tccgaccatg ccgtcccttg tcgcggagag cgccgccgaa 60

ccgcctctgg tggacagcta cctggagctg ctccggcgcg gcggcggcgg cggcggcatt 120

gcggcggcga ccgagggctg cgtgcaggag cgcgagctgc ccttgatcga cctgacgtgc 180

ctgcagggca gcgcgggcga ggcggcgagg acgacgtgcg cggacgccat ggcgagggcg 240

gcctcggagt ggggcttttt ccaggtgacc gggcacggcg tgagccgggc gctgttggag 300

cggctgcggg cggagcaggc gcggctgttc cggctgccgt tcgaaaccaa ggccaaggcc 360

gggcttctca acggctccta ccgctggggc gcccccacgg ccacgtcgct ccgccacctc 420

tcgtggtcgg aggcgttcca cgtcccgctc gccagcatct ccggcactgc ctgcgacttc 480

ggagagctca gctccttgag ggacgtggtg caggaggtgg cggacgcgat gtcgcgggtg 540

gccaagaccg tggcggtggc gctggcgggg agccttctgg gccacgacga ggcggcggcg 600

ttcccggcgg ggtgcggcga gaccacctgc tacctgcggc tcaatcggta cccggcgtgc 660

ccgttcgcgg cgaacacctt cgggctggtg ccccacacgg acagcgactt cctgacggtg 720

ctgtcccagg accaggtcgg gggcctgcag ctcatgacgg acgccggctg ggtggccgtc 780

aagccccgcc ccgacgcgct catcgtcaac atcggcgatc tgtttcaggc ctggagcaac 840

aacctgtaca agagcgtgga gcacaaggtg gtggccaacg ccgcggcgga gcgcttctcg 900

gcggcctact tcctgtgccc gtcctacgac tcgctcgtcg gcacgtgcgg cgagccgtca 960

ccgtacagag acttcacctt cggggagtac aggaggaagg tgcaggagga cgtcaagagg 1020

accggaagaa agattgggct ccccaacttt ctcaaacacc ggccaccccc tcaatcacgg 1080

cccgcctaa 1089

<210> 2

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcgttacg tagctgccac tccgaccatg ccgtcccttg tcgcggagag cgccgccgaa 60

ccgcctctgg tggacagcta cctggagctg ctccggcgcg gcggcggcgg cggcggcatt 120

gcggcggcga ccgagggctg cgtgcaggag cgcgagctgc ccttgatcga cctgacgtgc 180

ctgcagggca gcgcgggcga ggcggcgagg acgacgtgcg cggacgccat ggcgagggcg 240

gcctcggagt ggggcttttt ccaggtgacc gggcacggcg tgagccgggc gctgttggag 300

cggctgcggg cggagcaggc gcggctgttc cggctgccgt tcgaaaccaa ggccaaggcc 360

gggcttctca acggctccta ccgctggggc gcccccacgg ccacgtcgct ccgccacctc 420

tcgtggtcgg cggcgttcca cgtcccgctc gccagcatct ccggcactgc ctgcgacttc 480

ggagagctca gctccttgag ggacgtggtg caggaggtgg cggacgcgat gtcgcgggtg 540

gccaagaccg tggcggtggc gctggcgggg agccttctgg gccacgacga ggcggcggcg 600

ttcccggcgg ggtgcggcga gaccacctgc tacctgcggc tcaatcggta cccggcgtgc 660

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aacctgtaca agagcgtgga gcacaaggtg gtggccaacg ccgcggcgga gcgcttctcg 900

gcggcctact tcctgtgccc gtcctacgac tcgctcgtcg gcacgtgcgg cgagccgtca 960

ccgtacagag acttcacctt cggggagtac aggaggaagg tgcaggagga cgtcaagagg 1020

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cccgcctaa 1089

<210> 3

<211> 1089

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<400> 3

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<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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1 5 10 15

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Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ile Ala Ala Ala Thr Glu Gly Cys Val

35 40 45

Gln Glu Arg Glu Leu Pro Leu Ile Asp Leu Thr Cys Leu Gln Gly Ser

50 55 60

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Ala Leu Leu Glu Arg Leu Arg Ala Glu Gln Ala Arg Leu Phe Arg Leu

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210 215 220

Asn Thr Phe Gly Leu Val Pro His Thr Asp Ser Asp Phe Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Ser Gln Asp Gln Val Gly Gly Leu Gln Leu Met Thr Asp Ala Gly

245 250 255

Trp Val Ala Val Lys Pro Arg Pro Asp Ala Leu Ile Val Asn Ile Gly

260 265 270

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275 280 285

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Pro Tyr Arg Asp Phe Thr Phe Gly Glu Tyr Arg Arg Lys Val Gln Glu

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<210> 5

<211> 362

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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1 5 10 15

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165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

Asn Thr Phe Gly Leu Val Pro His Thr Asp Ser Asp Phe Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Ser Gln Asp Gln Val Gly Gly Leu Gln Leu Met Thr Asp Ala Gly

245 250 255

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260 265 270

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1 5 10 15

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<210> 7

<211> 23

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<400> 7

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<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttaggcgggc cgtgattgag ggg 23

Claims

1.一种玉米赤霉素氧化酶的突变基因，其特征在于，所述突变基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

2.一种玉米赤霉素氧化酶的突变体，其特征在于，所述突变体是由如权利要求1所述的突变基因编码而得。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求1所述的突变基因。

4.一种如权利要求1所述的突变基因在提高植物的耐旱性中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。