WO2018168586A1 - ボルナウイルスベクター及びその利用 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a viral vector, a recombinant virus and its use for introducing a foreign gene into a cell.
- a method using a viral vector As a means for transporting foreign genes to living organisms or cells, a method using a viral vector is known. So far, vectors using retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, and Sendai viruses have been developed.
- gene therapy a gene introduction technique capable of introducing a gene only to a target cell is expected.
- gene therapy is considered to be effective in the treatment of nervous system diseases, so the development of a viral vector that can selectively introduce genes into nerve cells and that has high safety, stability, persistence, and gene transfer efficiency. Is desired.
- Bornavirus is a virus belonging to the order of Mononegavirales having genome of non-segmented single-strand minus-strand RNA, and has a characteristic that nerve cells are directed toward infection.
- the Bornaviridae (Bornaviridae) Bornavirus genus includes the Borna ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ disease virus (BDV) that infects mammals, as well as the Avian Bornavirus (ABV) that infects birds. has been.
- BDV is a virus that replicates in the cell nucleus, but its infection is non-cytotoxic and has a long-lasting infection characteristic, and also has a characteristic that the host range that can be infected is extremely wide (Non-patent Documents 1 and 2, etc.) .
- GFP green fluorescent protein
- Patent Document 1 includes (a) cDNA of a recombinant virus in which any foreign gene is inserted into the translation region of G gene of cDNA encoding Borna disease virus genome, (b) cDNA encoding ribozyme, and (c) Disclosed is a viral vector comprising a promoter sequence, wherein (b) is located upstream and downstream of (a), and (a) and (b) are located downstream of (c).
- Patent Document 2 includes (a) having at least N gene, X gene, P gene and L gene in the Borna disease virus genome in the same order as in the Borna disease virus genome, and the translation region of the P gene.
- a recombinant viral RNA cDNA having a sequence in which a foreign gene is inserted in an untranslated region linked downstream; (b) a DNA encoding a ribozyme; and (c) a promoter sequence, upstream of (a) and Disclosed is a viral vector characterized in that (b) is arranged downstream and (a) and (b) are arranged downstream of (c).
- the recombinant virus replication efficiency is high, the host range that can be infected is wide, the safety and exogenous gene introduction efficiency is high, the stability and durability are good, and it is selectively foreign to the central nervous system.
- a more excellent viral vector capable of introducing a sex gene has been desired.
- the present invention is safe because the range of infectable hosts is wide, the efficiency of exogenous gene introduction is high, the viral genome is not inserted into the host chromosome, and the exogenous genes can be expressed non-cytotoxically in the cell nucleus. It has good stability and persistence in cells, and can selectively introduce foreign genes into target cells (for example, cells of central nervous system such as cranial nervous system). Viral vectors that can efficiently produce recombinant viruses with low pathogenicity (high safety) because they do not spread to cells, recombinant viruses, methods for introducing foreign genes using the recombinant viruses, foreign gene introducing agents, etc. The purpose is to provide.
- the present inventors have conducted extensive research on the insertion of foreign genes in the BDV genome (RNA virus genome).
- a foreign gene is introduced into the BDV genome
- a G gene having a genotype different from that of the G gene in the BDV genome is inserted, that is, the avian Bornavirus (ABV) G gene together with the foreign gene.
- ABSV avian Bornavirus
- Non-Patent Document 3 a vector in which an exogenous gene is inserted into the G gene region has a low ability to produce a recombinant virus, and the infection of the recombinant virus produced from the vector into a cell is transient, so that the foreign The sex gene could not be expressed.
- Patent Document 2 a recombinant BDV vector in which a foreign gene is inserted into a non-translation region between the translation region of the P gene and the translation region of the M gene has been studied.
- Patent Document 2 a recombinant BDV vector in which a foreign gene is inserted into a non-translation region between the translation region of the P gene and the translation region of the M gene.
- the BDV vector has a higher virus production ability and higher recovery efficiency than the existing recombinant BDV vector, and the recombinant virus produced from the vector has been found to infect brain nerve cells with high efficiency. Since the target gene can be expressed for a long period of time, it was conceived that various foreign genes can be efficiently introduced into the target cell by using these genes.
- the BDV genome includes at least six proteins, namely, nuclear protein (N protein), X protein, phosphorylated protein (P protein), matrix protein (M protein), surface glycoprotein (G protein), and RNA-dependent RNA. Polymerase (L protein) is encoded.
- FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of a BDV genome.
- N, X, P, M, G, and L schematically show the ORF of each gene.
- the BDV genome has N, X, P, M, G, and L genes in this order from the 3 'end.
- G gene cDNA means a cDNA encoding the G gene.
- the present invention relates to the following items 1 to 15.
- Item 1 A viral vector comprising a cDNA of a recombinant viral RNA having a sequence in which the G gene in the Borna disease virus genome is disrupted and the G gene in the avian Borna virus genome is inserted.
- the gene (a) is a cDNA of a recombinant viral RNA in which the G gene in the Borna disease virus genome is disrupted and further has the sequence of the G gene in the avian Borna virus genome Item 2.
- Item 4. (A) cDNA of a recombinant virus in which an exogenous gene is inserted into the untranslated region between the P gene translation region and the M gene translation region of the cDNA encoding the Borna disease virus genome Item 5. The virus vector according to Item 2. Item 5.
- (A) cDNA encoding (b1) hammerhead ribozyme is arranged upstream of cDNA of recombinant viral RNA, and (b2) cDNA sequence encoding hepatitis delta virus ribozyme is arranged downstream of (a) Item 6.
- the viral vector according to any one of Items 2 to 5, wherein Item 7.
- the cDNA of the recombinant viral RNA includes restriction enzyme sites on the 3 ′ end side and 5 ′ end side of the foreign gene, respectively, and the translation region of the restriction enzyme site on the 3 ′ end side of the foreign gene and the P gene
- the M gene in the Borna disease virus genome in the same order as in the Borna disease virus genome or between the restriction enzyme site on the 5 ′ end side of the foreign gene and the translation region of the L gene.
- At least the base sequence cc is inserted between the sequence shown in No. 9 and at least the base sequence cca is inserted between the restriction enzyme site on the 5 ′ end side of the foreign gene and the sequence shown in SEQ ID No. 9.
- Item 8. A recombinant virus comprising RNA encoded by the viral vector according to any one of Items 1 to 7.
- Item 9. A plasmid or a group of plasmids expressing the N gene, P gene, L gene of the Borna disease virus genome and G gene of the avian Borna virus genome as a helper plasmid together with the viral vector according to any one of Items 1 to 7 in vitro
- a method for producing a recombinant virus comprising a step of introducing into a cell, and a step of culturing a cell into which the viral vector and helper plasmid have been introduced to produce a recombinant virus.
- a method for producing a recombinant virus comprising the steps of: introducing the virus vector and the helper plasmid into a cell by culturing the cell into which the virus vector and the helper plasmid are cultured. Item 11. Item 11. The method for producing a recombinant virus according to Item 9 or 10, wherein a plasmid expressing the M gene of the Borna disease virus genome is further introduced into cells in vitro as a helper plasmid.
- Item 12. A method for introducing an exogenous gene comprising the step of infecting a cell or animal with the recombinant virus according to Item 8 or the recombinant virus produced by the method according to any one of Items 9 to 11.
- Item 13. An exogenous gene introduction agent comprising the recombinant virus according to Item 8 or the recombinant virus produced by the method according to any one of Items 9 to 11.
- Item 14. An agent for introducing an exogenous gene into a brain nervous system cell, comprising the recombinant virus according to Item 8 or the recombinant virus produced by the method according to any one of Items 9 to 11.
- Item 15. An exogenous gene introduction kit comprising the virus vector according to any one of Items 1 to 7.
- Item 12 A method for introducing an exogenous gene into a brain nervous system cell, wherein the recombinant virus according to Item 8 or the recombinant virus produced by the method according to any one of Items 9 to 11 is administered to an animal. Use of the recombinant virus according to Item 8 or the recombinant virus produced by the method according to any one of Items 9 to 11 for producing an exogenous gene introduction agent. Use of the recombinant virus according to Item 8 or the recombinant virus produced by the method according to any one of Items 9 to 11 for producing an exogenous gene introduction agent into a brain nervous system cell. Item 12.
- the infectious host range is wide, the efficiency of exogenous gene introduction is high, the viral genome is not inserted into the host chromosome, it is safe, and the exogenous gene can be expressed non-cytotoxically in the cell nucleus. Therefore, the stability and persistence in the host cell is good, and the foreign gene can be selectively introduced into the target cell such as a cell of the cranial nervous system and is not transmitted to cells other than the target cell. Therefore, a virus vector and a recombinant virus that can produce a recombinant virus with low pathogenicity (high safety) with high productivity can be produced.
- a foreign gene can be selectively and efficiently introduced into a target cell such as a cranial nervous system cell, and the foreign gene can be continuously expressed in the cell.
- the recombinant virus produced from the viral vector of the present invention causes persistent infection in the nucleus of cells such as cranial nervous system cells, it is difficult to be attacked by host immunity and difficult to eliminate.
- the P protein possessed by the recombinant virus of the present invention has a function of inhibiting the host immunity response pathway, and activation of innate immunity does not occur in virus-infected cells.
- FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of the genome (wild type) of Borna disease virus.
- FIG. 2 (a) schematically shows an untranslated region (1875 to 1895 as base numbers of the BDV genome) between the ORF of the P gene and the ORF of the M gene in the cDNA of the wild-type BDV genome.
- B is a diagram schematically showing an example of a foreign gene insertion site in the virus vector of the present invention.
- 3 (a) and 3 (b) are diagrams schematically showing an example of the RNA sequence structure that is the basis of the virus vector of the present invention.
- 4 (a) and 4 (b) are diagrams schematically showing an example of the RNA sequence structure that is the basis of the virus vector of the present invention.
- FIG. 5 (a) and 5 (b) are diagrams schematically showing an example of the RNA sequence structure that is the basis of the virus vector of the present invention.
- FIG. 6 is a diagram showing an outline of a procedure for preparing plasmid p / mGFP ⁇ G.
- FIG. 7 is a diagram showing an outline of the procedure for preparing plasmid p / mGFP ⁇ G LL.
- FIG. 8 is a diagram (left diagram) showing a representative example of a microphotograph showing protein expression in cells infected with wild-type BDV and recombinant virus, respectively, and a diagram (right diagram) showing the number of GFP positive at that time. .
- the present invention relates to a bornavirus vector, and a recombinant viral RNA having a sequence in which the G gene in the Borna disease virus genome is disrupted and the G gene in the avian Bornavirus genome is inserted in the Borna disease virus genome.
- a recombinant viral RNA having a sequence in which the G gene in the Borna disease virus genome is disrupted and the G gene in the avian Bornavirus genome is inserted in the Borna disease virus genome.
- the viral vector of the present invention can be introduced with a foreign gene according to a known technique later, so that it does not matter whether or not the gene is introduced.
- Borna disease viruses include those in which various genes are arranged in various alignments.
- the present invention will be described below using Borna disease viruses suitable for the Borna virus vector of the present invention. To do.
- the present invention is not limited to this.
- Viral vector A preferred viral vector of the present invention comprises (a) a foreign gene in a sequence having at least N gene, X gene, P gene and L gene in the Borna disease virus genome in the same order as in the Borna disease virus genome.
- a recombinant viral RNA cDNA having the inserted sequence (b) a ribozyme-encoding DNA; and (c) a promoter sequence, wherein (b) is located upstream and downstream of (a), and (a ) And (b) are arranged downstream of (c), wherein the G gene in the Borna disease virus genome is disrupted while the sequence of the G gene in the avian Borna virus genome is It has one feature that it is inserted.
- Such a viral vector is described as the viral vector of embodiment A.
- the cDNA of the recombinant viral RNA of (a) is also simply referred to as “(a) cDNA of recombinant BDV genome”.
- the viral vector of aspect A may contain sequences other than the above (a), (b) and (c) as long as the effects of the present invention are exhibited.
- the cDNA of the recombinant BDV genome in embodiment A at least the N gene, the X gene, the P gene, and the L gene in the Borna disease virus genome (BDV genome) are arranged in the same order as in the BDV genome, and
- the G gene of the avian Bornavirus genome (ABV genome) having a genotype different from that of the foreign gene in the sequence in which the G gene in the BDV genome is disrupted (hereinafter also referred to as G ′ gene) Have an inserted sequence.
- the gene has been destroyed means that the gene does not usually exist in a form capable of encoding a protein (for example, G protein in the case of G gene).
- the gene can be destroyed by deleting a part of the gene, inserting another sequence into the gene, or replacing an amino acid in the gene with another amino acid. it can.
- the BDV genome in the present invention includes a bornavirus belonging to the family Bornaviridae, Bornavirus, Mammalian 1 bornavirus, or a mutant strain thereof, including the case of Aspect A. Good.
- Mammalian 1 bornavirus includes Borna disease virus 1 (Borna disease virus 1: BoDV-1), Borna disease virus 2 (Borna disease virus 2: BoDV-2), and the like.
- virus strains such as He80, H1766, StrainV, and huP2br, and mutant strains of No / 98, Bo / 04w, and HOT6 can be used.
- the ABV genome in the present invention may be any gene of Bornavirus or its mutant strain that infects birds belonging to the genus Bornaviridae Bornavirus, including the case of Aspect A.
- Avian bornaviruses are rich in genetic diversity, for example, parrot bornavirus 1 (Parrot bornavirus 1: PaBV-1), parrot bornavirus22 (Parrot bornavirus 2: PaBV-1) -2), Parrot Bornavirus 3 (Parrot bornavirus 3: PaBV-3), Parrot Bornavirus 4 (Parrot bornavirus 4: PaBV-4), Parrot Bornavirus 7 (Parrot bornavirus 7: PaBV-7), etc .; Parrot Bornavirus 5 (Parrot bornavirus 5: PaBV-5) etc.
- Bornavirus Pulittaciform 2 bornavirus
- Canary Bornavirus 1 Canary bornavirus 1: CnBV-1
- Canary Borna Virus 2 Canary bornavirus 2: CnBV-2
- Canary Bornavirus 3 Canary bornavirus 3: CnBV-3
- sseriform 2 bornavirus maple butterfly virus 1 (Estrildid finch bornavirus 1: EsBV-1), etc .
- waterbird 1bornavirus Waterbird 1 bornavirus 2 (Aquatic bird bornavirus 2: ABBV-2).
- Parrot Bornavirus 6 (Parrot bornavirus 6: PaBV-6), Parrot Bornavirus 8 (Parrot bornavirus 8: PaBV-8), Kimbara Bornavirus 1 (Munia bornavirus 1: MuBV-1), etc. be able to.
- the above-mentioned ABV is systematically classified as Parrots 2 Bornavirus, Sparrow 1 Bornavirus, Sparrow 2 Bornavirus, Waterbird 1 Bornavirus, Waterbird 2 Bornavirus as Clade2, and Parrot 1 Bornavirus as Clade3. (See Komorizono® R et al. Microbiol Immunol 60: 437-441 (2016)).
- these ABVs include, for example, PaBV-1, PaBV-2, PaBV-3, PaBV-4, PaBV-5, CnBV-1, CnBV-2, EsBV-1, ABBV-1, ABBV Virus strains such as -2, MuBV-1 and mutants thereof can be used.
- These genomic sequences can be obtained, for example, from the international base sequence database with the following accession numbers.
- PaBV-1 GU249595
- PaBV-2 EU781967
- PaBV-3 FJ169440
- PaBV-4 JN014948
- PaBV-7 JX065210
- PaBV-5 KR612223
- CnBV-1 KC464471
- CnBV-2 KC464478
- CnBV- 3 KC595273
- EsBV-1 KF680099
- ABBV-1 KF680099
- ABBV-2 KJ756399
- PaBV-6 FJ794743
- PaBV-8 KJ950625.
- the BDV genome and the ABV genome retain the function as a borna virus
- a part of these genome sequences may be substituted with other bases, deleted, or newly inserted bases.
- a part of the base sequence may be rearranged. Any of these derivatives can be used in the present invention.
- the part may be, for example, 1 to several (usually 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2) in terms of amino acid residues.
- the recombinant BDV genome in aspect A is a sequence in which at least the N gene, the X gene, the P gene, and the L gene are arranged in the same order as in the BDV genome and the G gene is disrupted in the BDV genome described above.
- the M gene in the BDV genome may be further arranged. In that case, the M genes are arranged in the same order as in the BDV genome.
- the G gene of the ABV genome in the present invention may be any gene as long as it has a genotype different from that of the G gene in the BDV genome before recombination, including the case in aspect A. It can be set accordingly.
- the ABV genome G gene includes ABV belonging to the genus Bornavirus of Clade2 and Clade3. The G gene can be used.
- the G gene of Parrot Bornavirus 2 (PaBV-2), the G gene of Parrot Bornavirus 4 (PaBV-4), the G gene of Parrot Bornavirus 5 (PaBV-5), and Kimbara Bornavirus 1 (MuBV -1) G gene etc. can be used individually by 1 type or in combination of 2 or more types.
- the G gene of the ABV genome retains its original function, a product obtained by fusing a part of the G gene in the BDV genome to the G gene (chimeric gene) can also be used.
- the insertion position of the G gene in the ABV genome is not particularly limited.
- the recombinant BDV genome is M in the BDV genome in the untranslated region linked downstream of the translation region of the P gene in the BDV genome.
- the genes are in the same order as the order in the BDV genome, the untranslated region linked downstream of the translated region of the M gene, the untranslated region linked downstream of the translated region of the L gene in the BDV genome, etc. Can be mentioned.
- the type and length of the exogenous gene in the present invention are not particularly limited, and a desired gene can be used according to the purpose.
- a desired gene can be used according to the purpose.
- cDNA of a gene encoding a protein or peptide cDNA encoding siRNA, short hairpin RNA (shRNA), microRNA (miRNA); cDNA encoding an RNA aptamer can be used.
- siRNA short hairpin RNA
- miRNA microRNA
- cDNA encoding an RNA aptamer can be used in the viral vector of the present invention.
- one or more foreign genes can be used in the viral vector of the present invention.
- the insertion site of the exogenous gene is not particularly limited.
- it is preferably inserted into the non-translation region linked downstream of the translation region of the P gene in the BDV genome.
- the recombinant BDV genome has M genes in the BDV genome in the same order as in the genome, the recombinant BDV genome is inserted into the untranslated region between the translated region of the P gene and the translated region of the M gene. Is preferred. Since the foreign gene is inserted at such a location, the recombinant virus productivity of the viral vector, that is, the replication efficiency of the recombinant virus produced from the viral vector can be further increased. Recombinant virus can be produced.
- a recombinant virus produced (replicated) from the viral vector can efficiently express a foreign gene when introduced into a cell. Accordingly, when the viral vector of the present invention is introduced into a cell, or when a cell is infected with recombinant BDV particles produced from the viral vector, any foreign gene is efficiently introduced into the cell. That is, the foreign gene is efficiently expressed in the cell. As shown in FIG.
- the BDV genome base numbers 1875 to 1895 ie, bases 1875 to 1895 of SEQ ID NO: 1
- Base numbers 1875 to 1882 and the start signal sequence of the M gene (base numbers 1875 to 1890 of SEQ ID NO: 1).
- the insertion site of the exogenous gene in the untranslated region between the translated region of the P gene and the translated region of the M gene is a P gene stop signal.
- a region not including the sequence and / or the start signal sequence of the M gene is preferable, and a region not including the stop signal sequence of the P gene and the start signal sequence of the M gene is more preferable.
- the cDNA sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
- the base number of SEQ ID NO: 1 is more preferably between 1890 and 1891.
- the G gene of the ABV genome and the insertion position of the foreign gene are within the same range, either the G gene of the ABV genome or the foreign gene may be upstream, and the G gene of the ABV genome It can be inserted in the order of gene and foreign gene, or in the order of foreign gene and G gene of ABV genome. When there are two or more foreign genes, they may be inserted separately or in the same location.
- restriction enzyme sites can be included on both sides or one side (preferably both sides). It is preferable to have a restriction enzyme site, since the foreign gene can be easily incorporated into the BDV genome sequence and the translation efficiency of the foreign gene into the protein is increased.
- the restriction enzyme sites that can be arranged on both sides or one side of the foreign gene include, for example, the Bst BI site, the Pac I site, the Sse8387 I site, and the Swa I for the 3 ′ end side of the foreign gene. Site, Kpn I site, etc., and Bst BI site is preferred. Examples of the 5 ′ terminal side of the foreign gene include Pac I site, Bst BI site, Sse8387 I site, Swa I site, Kpn I site, etc., and Pac I site is preferred.
- the cDNA of the recombinant BDV genome is composed of an exogenous gene (and restriction enzyme sites arranged on both sides or one side as required) and P. Between the gene ORF and between the exogenous gene (and restriction enzyme sites located on either side or one side as required) and the M gene ORF, respectively, It is preferred that there is a sequence containing the start signal sequence (taaaaaatcgaatca (SEQ ID NO: 9)). In the cDNA of the recombinant BDV genome in the present invention, for example, it is more preferable that an arbitrary foreign gene is inserted with the sequence as shown in FIG. FIG.
- FIG. 2 (b) shows a recombinant BDV genome cDNA containing the M gene as an example.
- a sequence comprising a stop signal sequence of the P gene and a start signal sequence of the M gene (SEQ ID NO: 9) downstream of the foreign gene. It is preferable to have.
- the stop signal sequence of the P gene and the start signal sequence of the M gene shown in FIG. 2B are the stop signal of the exogenous gene and the start signal of the L gene. Function as.
- FIG. 2 (b) shows a recombinant BDV genome cDNA containing the M gene as an example.
- FIG. 2 (b) shows an example in which a Bst BI site is inserted at the 3 ′ end side of the foreign gene and a Pac I site is inserted at the 5 ′ end side of the foreign gene.
- the restriction enzyme sites arranged on both sides are not limited to these.
- each gene in the recombinant BDV genome of aspect A can be set.
- the cDNA of such a recombinant BDV genome includes a cDNA encoding a sequence in which each gene is arranged as described above, an RNA cDNA having a sequence in which each gene is arranged as described above, and as described above.
- a recombinant viral RNA cDNA having a sequence in which each gene is arranged can be used.
- preferred embodiments of (a) recombinant BDV genome cDNA of embodiment A are schematically shown in FIGS.
- FIG. 3 (a) shows a sequence in which the G gene is destroyed (deleted) in the BDV genome, and the G ′ gene, exogenous in the untranslated region between the translated region of the P gene and the translated region of the M gene.
- FIG. 3 (b) shows an embodiment in which the M gene is disrupted (deleted) in embodiment 1-1 (embodiment 1-2).
- FIG. 4 (a) shows a sequence in which a G gene is destroyed (deleted) in the BDV genome, and a foreign gene (FIG. 4) is located in an untranslated region between the translated region of the P gene and the translated region of the M gene.
- GFP is a recombinant BDV genomic cDNA having a sequence in which the G ′ gene is inserted in the untranslated region linked downstream of the translated region of the M gene (embodiment 2-1).
- FIG. 4 (b) shows an embodiment in which the M gene is disrupted (deleted) in Embodiment 2-1. In this case, the foreign gene and the G ′ gene are present in the untranslated region linked downstream of the translated region of the P gene. Sequences inserted in this order are shown (Aspect 2-2).
- FIG. 5A shows a sequence in which a G gene is destroyed (deleted) in the BDV genome, and an exogenous gene (FIG. 5) is located in an untranslated region between the translated region of the P gene and the translated region of the M gene.
- GFP is a cDNA of a recombinant BDV genome having a sequence in which the G ′ gene is inserted in the untranslated region linked downstream of the translated region of the L gene (Aspect 3-1).
- FIG. 5 (b) shows an embodiment in which the M gene is destroyed (deleted) in Embodiment 3-1 (Mode 3-2).
- the L gene is interrupted by the G gene.
- the G gene may be deleted in the recombinant BDV genome in the embodiment A, the intron of the L gene is also deleted.
- the translation region (ORF) of the L gene may be linked. Thereby, the replication ability of the recombinant virus, that is, the expression efficiency of the foreign gene in the cell is further improved. Further, by deleting the intron of the L gene, it becomes possible to insert a larger foreign gene.
- the intron of the L gene can be removed by a known method.
- the M gene is deleted in the recombinant BDV genome of aspect A
- the G gene and the M gene are deleted from the natural BDV genome, so that the recombinant virus produced from the viral vector Pathogenicity is further reduced and stability becomes higher.
- Recombinant BDV genome cDNA can be prepared based on the virus genome information.
- cDNA can be prepared from RNA genome using reverse transcriptase.
- RNA genome can be prepared from reverse transcriptase.
- it can also synthesize
- a method using known amplification means such as PCR can be mentioned.
- Operations such as PCR and primer preparation can be performed by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique).
- the ribozyme may be any sequence that can cleave any foreign gene transcribed from the cDNA of the recombinant virus (a).
- Examples of (b) include DNA such as cDNA encoding ribozymes such as hammerhead ribozyme (HamRz), hepatitis delta virus ribozyme (HDVRz), hairpin ribozyme, artificial ribozyme and the like.
- DNA such as cDNA which codes the modified ribozyme of the said ribozyme, can also be used.
- the modified ribozyme has a common sequence and 1 to several bases (for example, several, for example, 10, preferably 5, more preferably 3, more preferably 2) are substituted. And a polynucleotide comprising a deleted or added base sequence and functioning as a ribozyme.
- ribozyme in the present invention hammerhead ribozyme (HamRz) and hepatitis delta virus ribozyme (HDVRz) are preferable.
- a DNA encoding hamRz (preferably cDNA) is located upstream of the cDNA of the recombinant BDV genome, ie, at the 3 ′ end, and downstream of the (a), ie, 5 ′ end. More preferably, (b2) a DNA (preferably cDNA) sequence encoding HDVRz is arranged on the side. Thereby, the expression efficiency of the foreign gene in the cell is improved.
- the base sequence of HamRz is described in Yanai et al., Microbes and Infections 8 (2006) 1522-1529, Mercier et al., J. Virol. 76 (2002) 2024-2027 and Inoue et al., J. Virol. Methods 107 (2003) 229-236.
- the base sequence of HDVRz is described in Ferre-D'Amare, AR, Zhou, K. and Doudna, JA Crystal structure of a hepatitis delta virus ribozyme. Nature 395 (6702), 567-574 (1998).
- cDNA encoding the base sequence of HamRz and cDNA encoding the base sequence of HDVRz described in these documents can be used.
- HamRz 5'-UUGUAGCCGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUAUAGGAAAGGAAUUCCUAUAGUCAGCGCUACAACAAA-3 ' (SEQ ID NO: 2)
- HDVRz 5'-GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACACCAUUGCACUCCGGUGGCGAAUGGGAC-3 ' (SEQ ID NO: 3)
- RNA polymerase II type promoter sequences examples include RNA polymerase II type promoter sequences, RNA polymerase I type promoter sequences, and T7 polymerase type promoter sequences.
- the RNA polymerase II promoter sequence is preferable.
- the RNA polymerase II promoter examples include CMV promoter and CAGGS promoter. Of these, CAGGS promoter is preferable.
- Such a promoter sequence is, for example, JA Sawicki, RJ Morris, B. Monks, K. Sakai, J. Miyazaki, A composite CMV-IE enhancer / b-actin promoter is ubiquitously expressed in mouse cutaneous epithelium, Exp. 244 (1998) 367-369.
- the arrangement of (a), (b) and (c) in the virus vector of aspect A is as follows.
- (B) is arranged upstream and downstream of (a), and (a) and (b) are of (c).
- (b1) cDNA encoding a hammerhead ribozyme is located upstream of (a)
- (b2) hepatitis ⁇ is located downstream of (a).
- An embodiment in which a cDNA sequence encoding a viral ribozyme is arranged can be mentioned.
- positioned downstream of the promoter of (c) RNA polymerase II system is mentioned.
- a cDNA encoding a hammerhead ribozyme is disposed upstream of (a)
- (b2) a cDNA sequence encoding a hepatitis delta virus ribozyme is disposed downstream of (a)
- (a And (b1) are arranged downstream of the promoter of (c) RNA polymerase II system.
- the viral vector of the present invention includes SV40 virus replication origin / promoter other than the above (a), (b) and (c) A part or all of the region sequence can be included.
- the viral vector contains a part or all of the SV40 viral replication origin / promoter region sequence, the sequence is preferably located downstream of (a) and (b).
- a fragment consisting of 113 bases on the 5 ′ side in the SV40 replication origin / promoter region is suitable.
- SV40 virus replication origin / promoter region sequence (SEQ ID NO: 4) is, for example, DA Dean, BS Dean, S. Muller, LC Smith, Sequence requirements for plasmid nuclear import, Exp. Cell. Res. 253 (1999) 713- 722 etc.
- the viral vector of the present invention further encodes one or more factors advantageous for protein expression, such as an enhancer, an activator (for example, a trans-acting factor), a chaperone, and a processing protease, as long as the effects of the present invention are exhibited.
- factors advantageous for protein expression such as an enhancer, an activator (for example, a trans-acting factor), a chaperone, and a processing protease, as long as the effects of the present invention are exhibited.
- multiple nucleic acid sequences can also be included.
- the viral vector of the present invention may have any factor that is functional in the selected cell.
- the viral vector of the present invention may be linear DNA or circular DNA, but is preferably circular when introduced into a cell.
- the circular viral vector include the DNAs of (a), (b) and (c), which are essential sequences of the viral vector of aspect A, and the DNA of (d) contained as necessary.
- Examples include those arranged in a commercially available plasmid vector in the above-described predetermined order.
- a commercially available plasmid vector may be any plasmid vector as long as it is capable of self-replication in a cell into which a viral vector is introduced. Examples thereof include pBluescript SKII ( ⁇ ), pCAGGS, pCXN2, and pCDNA3.1.
- the production method of the viral vector of the present invention is not particularly limited, and a known genetic engineering technique may be used. Specifically, for example, in the case of the virus vector of embodiment A, in the method described in 2.2 Plasmid construction of “Materials and methods” of Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529, CAT Virus obtained by replacing the gene with the BDV genomic sequence and inserting the desired foreign gene into the untranslated region (untranslated region between the P gene and M gene) linked downstream of the P gene A viral vector (also referred to as a G gene-deficient BDV virus vector) is prepared by inserting a deletion mutation into the G gene by PCR or the like using the vector as a template.
- the self-replicating (persistent infection) virus vector of the present invention can be prepared by inserting the G gene of the ABV genome into a desired region of the obtained G gene-deficient BDV virus vector.
- a viral vector prepared by the above method for example, when the G gene of the ABV genome is inserted upstream of a foreign gene, (a) the cDNA of the P gene of the cDNA encoding the BDV genome is used as the cDNA of the recombinant viral RNA.
- Recombinant BDV genome cDNA (for example, schematically shown in FIG. 3 (a)), in which the AB gene G gene and foreign gene are inserted in this order into the untranslated region between the translated region and the translated region of the M gene.
- a recombinant virus cDNA having the structure described above.
- the intron portion of the L gene can be similarly removed by PCR.
- the M gene can also be prepared by deleting a G gene-deficient BDV viral vector as a template by PCR or the like (also referred to as a G gene or M gene-deficient BDV viral vector).
- the circular viral vector is used in the region other than (a) the cDNA region of the recombinant BDV genome, (c) the promoter sequence region, and other signal sequence regions necessary for protein expression.
- a linear viral vector can be prepared by appropriately selecting a restriction enzyme that cleaves at one site according to the type of the vector and cleaving the circular viral vector with the restriction enzyme.
- a method for introducing the foreign gene contained in the viral vector of the present invention into the target cell a method for introducing the viral vector into the target cell together with a helper plasmid described later, a recombinant virus produced from the viral vector is used as the target cell.
- a method using a recombinant virus produced from a viral vector is preferred.
- the recombinant virus produced from the viral vector of the present invention is a recombinant BDV having RNA encoded by the viral vector in place of the wild-type BDV genome.
- Recombinant virus A recombinant virus containing RNA encoded by the above-described viral vector is also one aspect of the present invention.
- it is a recombinant virus containing RNA encoded by a viral vector and, when the viral vector of embodiment A is used, BDV N protein, BDV P protein, BDV L protein, and ABV G protein.
- the recombinant virus of the present invention is a persistently-infected recombinant virus that contains the above-mentioned recombinant BDV genome and can continuously express a foreign gene after infection of cells.
- the recombinant virus may optionally have a BDV M protein.
- the recombinant virus of the present invention is, for example, a plasmid or plasmid group that expresses the BDV genome N gene, P gene, L gene, and ABV genome G gene as a helper plasmid together with the above-described virus vector in an in vitro cell. And a method comprising culturing cells into which the viral vector and helper plasmid have been introduced to produce a recombinant virus. Further, in the present invention, for example, if the above-mentioned recombinant BDV genome is produced as a recombinant virus using the virus vector of aspect A, each gene in the recombinant BDV genome is individually helper plasmid. May be introduced and produced.
- helper plasmid a plasmid or a group of plasmids expressing the N gene, P gene and L gene of the BDV genome and a plasmid expressing the G gene of the ABV genome can be used.
- a viral vector of the G gene-deficient BDV before incorporating the G gene of the ABV genome as the viral vector a plasmid or a group of plasmids expressing the N gene, the P gene and the L gene of the BDV genome and the ABV as a helper plasmid
- a method for producing a recombinant virus is also one aspect of the present invention.
- a recombinant virus can be produced in vitro.
- In vitro cells into which viral vectors and helper plasmids are introduced are usually cultured cells.
- a plasmid expressing the M gene of the BDV genome into the cells as a helper plasmid. That is, in the case of using a viral vector of G gene and M gene deficient BDV, a plasmid or a plasmid group expressing the N gene, P gene, L gene and ABV genome G gene of the BDV genome, or a BDV genome A plasmid expressing the M gene of the BDV genome together with a plasmid or a group of plasmids expressing the N gene, the P gene, and the L gene and a plasmid expressing the G gene of the ABV genome can be introduced into cells in vitro.
- the helper plasmid may be any plasmid that can express the N gene, the P gene, the L gene and the M gene of the BDV genome, and the G gene of the ABV genome. Two or more of these genes may be combined into one plasmid. These genes may be contained, and these genes may be contained in different plasmids. For example, as a plasmid for expressing the N gene, P gene, and L gene of the BDV genome, any one of the following plasmids (1) to (4) or a group of plasmids is preferably used. Moreover, as a plasmid for expressing the ABV genome G gene, the ABV genome G gene may be appropriately incorporated into one or more of the plasmids described in (1) to (4) below.
- the helper plasmid used in the present invention includes any one of the plasmids (group) of (1) to (3) and a set of plasmids expressing the G gene of the ABV genome, or any one of (1) to (3)
- Plasmid expressing N gene of BDV genome, plasmid expressing P gene of BDV genome and plasmid expressing L gene of BDV genome (2) Plasmid expressing N gene and P gene of BDV genome, and BDV Plasmid expressing L gene of genome (3) Plasmid expressing N gene and L gene of BDV genome, and plasmid expressing P gene of BDV genome (4) Expressing N gene, L gene and P gene of BDV genome Plasmid
- the helper plasmid expressing the M gene of the BDV genome is selected from the group consisting of the N gene of the BDV genome, the L gene, the P gene and the G gene of the ABV genome in addition to the plasmid expressing the M gene of the BDV genome.
- a plasmid that expresses one or more genes and the M gene of the BDV genome can also be used.
- the helper plasmid provides a viral protein necessary for the replication of the recombinant BDV genome, and an infectious recombinant virus can be produced by introducing the helper plasmid into the cell together with the viral vector.
- the virus vector used in the method for producing the recombinant virus of the present invention and the preferred embodiment thereof are the same as described above.
- the helper plasmid (s) in the present invention can express the N gene, P gene, L gene of the BDV genome and the G gene of the ABV genome in the cell when introduced into the cell together with the viral vector. If it is.
- a plasmid that expresses the N gene of the BDV genome is preferably a plasmid in which the cDNA of the N gene of the BDV genome is arranged downstream of the promoter sequence.
- a plasmid for expressing the P gene of the BDV genome a plasmid in which the cDNA of the P gene of the BDV genome is arranged downstream of the promoter sequence is preferable.
- a plasmid that expresses the L gene of the BDV genome it is preferable to use a plasmid in which the cDNA of the L gene of the BDV genome is arranged downstream of the promoter sequence.
- a plasmid for expressing the ABV genome G gene a plasmid in which the cDNA of the ABV genome G gene is arranged downstream of the promoter sequence is preferably used.
- a plasmid for expressing the M gene of the BDV genome it is preferable to use a plasmid in which the cDNA of the M gene of the BDV genome is arranged downstream of the promoter sequence.
- a plasmid for expressing two or more genes a plasmid in which cDNA of a desired gene is arranged in a desired order downstream of a promoter sequence can be used.
- the outer shell protein encoded by the outer shell gene is usually a transmembrane protein, and its amino acid sequence includes a region located outside the cell (extracellular sequence), a transmembrane region (transmembrane sequence), and It includes a region located within a cell (intracellular sequence).
- the G gene of the ABV genome preferably has an intracellular sequence, a transmembrane sequence and an extracellular sequence of the G protein of the ABV genome, but includes at least the intracellular sequence of the G protein of the ABV genome. Anything is acceptable.
- the helper plasmid expressing the G gene of the ABV genome may express other outer genes within a range not impairing the effects of the present invention.
- the envelope genes of all envelope viruses that use the host cell membrane as the outer shell such as vesicular stomatitis virus, rabies virus, measles virus, retrovirus, etc., as well as BDV or Kawari svornavirus (VSBV- A part of the G gene of 1) may be included.
- viruses having high directivity to epithelial cells, respiratory cells, etc. for example, measles virus, Sendai virus, vesicular stomatitis virus
- a helper plasmid that expresses the outer shell gene, which encodes the extracellular sequence and transmembrane sequence of the outer shell protein and the like, and the intracellular sequence of the ABV G protein.
- the N gene cDNA, P gene cDNA and L gene cDNA of the BDV genome can be prepared based on the sequence information of the N gene, P gene and L gene of the BDV genome.
- the cDNA of G gene of ABV genome can be prepared based on the sequence information of known outer gene in addition to the sequence information of G gene of ABV genome.
- the cDNA of the M gene of the BDV genome can be prepared based on the sequence information of the M gene of the BDV genome.
- cDNA can be prepared from RNA using sequence reverse transcriptase. Moreover, based on the sequence
- the G gene of the ABV genome is, for example, the following accession number: PaBV-1: GU249595, PaBV from the international nucleotide sequence database described above -2: EU781967, PaBV-3: FJ169440, PaBV-4: JN014948, PaBV-7: JX065210, PaBV-5: KR612223, CnBV-1: KC464471, CnBV-2: KC464478, CnBV-3: KC595273, EsBV-1 : KF680099, ABBV-1: KF680099, ABBV-2: KJ756399, PaBV-6: FJ794743, PaBV-8: KJ950625, respectively.
- RNA synthesized according to the above sequence can also be used. Furthermore, it is possible to obtain fragments by hybridization or PCR based on the amino acid sequences stored in the N, P, L and M proteins of the BDV genome or the G protein of the ABV genome. Furthermore, fragments can be obtained by degenerate RT-PCR using mixed primers designed based on the sequences of other known genes. The base sequence of the obtained fragment can be determined by a usual method. Furthermore, each gene in the present invention is such that, as long as the protein encoded by the gene retains the function originally possessed by the corresponding protein, a part of the base sequence is replaced, deleted, or newly based with another base.
- the part may be, for example, 1 to several (1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2) in terms of amino acid residues.
- N gene examples include a polymorphism having at least about 90%, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more sequence identity with the N gene of the BDV genome and having the function of an N protein.
- RNA encoding a peptide can also be used as the N gene of the BDV genome in the present invention.
- RNA encoding a polypeptide having a sequence identity of at least about 90%, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more with the L gene of the BDV genome and having the function of an L protein is also provided by the present invention. Can be used as the L gene of the BDV genome. RNA encoding a polypeptide having a sequence identity of at least about 90%, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more with the G gene of the ABV genome and having the function of a G protein is also included in the present invention. Can be used as the G gene of the ABV genome.
- RNA encoding a polypeptide having a sequence identity of at least about 90%, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more with the M gene of the BDV genome and having the function of an M protein is also included in the present invention. Can be used as the M gene of the BDV genome. Sequence identity is determined by CLUSTAL W, GCG program, GENETYX, BLAST search.
- viruses other than BDV such as vesicular stomatitis virus, rabies virus, measles virus, retrovirus, etc.
- vesicular stomatitis virus is GeneBank, No: J02428.1
- rabies virus is GeneBank, No: AB044824.1.
- a sequence encoding an extracellular sequence and a transmembrane sequence of the outer shell protein in these outer shell genes is used.
- the sequences coding for the extracellular and transmembrane sequences of the outer shell protein in the outer shell gene are Garry CE, Garry RF.
- RNA synthesized according to the above sequence can also be used.
- an RNA encoding a polypeptide having at least about 90%, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more sequence identity with such an outer shell gene and having the function of an outer shell protein. can also be used as a viral coat gene in the present invention.
- the circular helper plasmid is, for example, one or more factors that are advantageous for protein expression, such as an enhancer or activator in a form in which a promoter sequence, which is an essential sequence of the helper plasmid in the present invention, and a protein cDNA are arranged. It can also include one or more nucleic acid sequences encoding (eg trans-acting factors), chaperones, processing proteases. It may also have any factor that is functional in the selected cell.
- the helper plasmid is preferably constructed using a commercially available plasmid vector capable of self-replication in a cell into which the helper plasmid is introduced.
- Examples of commercially available plasmid vectors include pCAGGS, pCXN2, and pCDNA3.1. It is done.
- the promoter sequence in the helper plasmid is preferably an RNA polymerase II type promoter.
- helper plasmids can be prepared by a known genetic engineering technique.
- a plasmid that expresses the N gene of the BDV genome a plasmid that expresses the P gene of the BDV genome, and a plasmid that expresses the L gene of the BDV genome are the following: Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529 It can be produced by the method described in “Materialslasand methods”, 2.2 Plasmid construction.
- a plasmid expressing two or more genes for example, as a plasmid expressing the N gene and P gene of the BDV genome, specifically, a unique downstream of the N gene cDNA of the plasmid expressing the N gene of the BDV genome From the restriction enzyme sequence region, a restriction enzyme that does not cleave a signal sequence such as N gene cDNA or promoter can be selected as appropriate, and the P gene cDNA of the BDV genome can be inserted into the restriction enzyme site.
- a plasmid expressing the N gene and L gene of the BDV genome for example, from the unique restriction enzyme sequence region downstream of the cDNA of the N gene of the plasmid expressing the N gene of the BDV genome, such as a cDNA or a promoter of the N gene It can be prepared by appropriately selecting a restriction enzyme that does not cleave the signal sequence and inserting the cDNA of the L gene of the BDV genome into the restriction enzyme site.
- a sequence such as a promoter sequence that promotes the expression of the L gene or the P gene or an internal ribosome entry site It is also possible to insert.
- the plasmid expressing the G gene of the ABV genome is used in the preparation of a helper plasmid expressing the N gene, L gene or P gene of the BDV genome.
- the cDNA of the G gene of the ABV genome is used instead of the N gene cDNA of the BDV genome.
- the G gene of the ABV genome may be expressed in a plasmid that expresses the M gene of BDV.
- the plasmid is described in the instructions attached to pEF4 / myc-HisHA, B, and C (Invitrogen). It can be produced according to the method that has been described.
- a helper plasmid that encodes the extracellular sequence and transmembrane sequence of the outer shell protein of a virus other than ABV and expresses the outer shell gene encoding the intracellular sequence of the G protein of the ABV genome is, for example, a viral helper of a virus other than ABV.
- a sequence encoding an intracellular sequence of an ABV genome G protein is obtained by performing PCR using a plasmid expressing the outer shell gene as a template and using an appropriate primer. It can produce by substituting with.
- Such a helper plasmid may replace, for example, a gene sequence encoding the intracellular sequence of the G protein of BDV with a sequence encoding the intracellular sequence of the G protein of the ABV genome.
- the gene sequence encoding the sequence is, for example, the 3712-3747th sequence (the 3712-3747th base of SEQ ID NO: 1) in the BDV genome whose cDNA sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
- a vector composition containing the virus vector can be used.
- the vector composition may contain a helper plasmid in addition to the viral vector.
- the vector composition contains other components such as an appropriate buffer solution, phosphate buffered saline, cell culture standard solution, etc., depending on the introduction method and introduction target. May be.
- the content of the viral vector in the vector composition may be appropriately selected according to the infection method, the infection target, and the like, and includes, for example, a viral vector having a DNA concentration of about 0.25 to 2.0 ⁇ g / ⁇ L. It is preferable.
- each helper plasmid in the vector composition is preferably about 0.0125 to 0.125 ⁇ g per 1 ⁇ g of the virus vector.
- the method for introducing the viral vector and the helper plasmid into cells in vitro is not particularly limited, and for example, a method known per se using a commercially available transfection reagent can be employed.
- commercially available transfection reagents include, but are not limited to, FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics (registered trademark), Pleasanton, CA).
- FuGENE 6 transfection reagent FuGENE 6 transfection reagent
- an appropriate amount of a commercially available transfection reagent is added to a vector composition containing the above-mentioned amounts of virus vector and helper plasmid, buffer, etc., and this is usually about 1 ⁇ 10 3 per 1 ⁇ g of virus vector.
- Viral vectors and helper plasmids can be introduced into cells by adding to ⁇ 1 ⁇ 10 7 cells, preferably about 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 7 cells.
- the viral vector and helper plasmid may be introduced into the cell at the same time or may be introduced separately.
- the order of introduction when separately installed is not particularly limited.
- the cell into which the viral vector is introduced may be any mammalian cultured cell that can produce the recombinant virus of the present invention by introducing the viral vector, and examples thereof include human kidney-derived 293T cells and BHK cells. It is done.
- cells that constantly express the G gene of the ABV genome can be prepared by introducing the outer shell gene into cells such as 293T cells and BHK cells using various plasmids that express the desired outer shell gene.
- a plasmid that expresses the outer shell gene is usually produced by introducing the outer shell gene into the plasmid according to the method described in the instructions attached to the various expression plasmids.
- the plasmid for expressing such an outer shell gene the above-described helper plasmid for expressing the AB gene G gene can also be suitably used.
- cells that constantly express the BDV genome M gene and the ABV genome G gene are produced, for example, by introducing the gene into cells such as 293T cells and BHK cells by the same method.
- the culture conditions such as the medium for producing the recombinant virus, the culture temperature, and the culture time may be appropriately set depending on the cell type.
- the culture temperature is usually about 36 to 37 ° C. when 293T cells or BHK cells are used.
- the medium Dulbecco's modified Eagle medium is preferably used.
- the culture time is usually about 24 to 96 hours, preferably about 36 to 48 hours.
- recombinant virus containing RNA encoded by the viral vector and N protein, P protein, L protein of the BDV genome and G protein of the ABV genome is produced in the cells into which the viral vector has been introduced.
- a helper plasmid that expresses the M gene of the BDV genome is further used in the introduction of the viral vector, the RNA encoded by the viral vector, and the N protein, P protein, L protein of the BDV genome, and G protein of the ABV genome
- a recombinant virus containing the M protein of the BDV genome is produced.
- Recombinant virus is produced in the cells into which the virus vector has been introduced.
- the supernatant of the medium in which the cells are cultured is collected by centrifugation or the like, and the supernatant is used to infect cells with which the BDV genome is infectious, for example, It is confirmed by infecting monkey kidney-derived Vero cells, rat glial-derived C6 cells, human glial-derived OL cells, and the like. Confirmation that the recombinant virus has been produced may be carried out after performing a step of mixing and culturing the cells producing the recombinant virus described later with cells having a high growth rate.
- a recombinant virus can be confirmed by quantitative analysis of the expression of a foreign gene (such as GFP) in an infected cell. That the produced virus is a persistent infectious type is that the expression of a foreign gene (such as GFP) in an infected cell is quantitatively analyzed and the next generation of recombinant virus is contained in the culture supernatant. This is confirmed by examining the production of particles.
- the production of particles of the next generation recombinant virus in the culture supernatant means, for example, that the supernatant is recovered by centrifugation, etc., and this is further infected to other cells. This can be confirmed by examining the expression of a foreign gene derived from s.
- the cell producing the recombinant virus in order to efficiently propagate the recombinant virus (for example, it is preferable to perform a step of mixing and culturing 293T cells and BHK cells) with cells having a high growth rate.
- the infectious recombinant virus infects the cells having a high growth rate.
- the infected virus grows with the growth of the cells, so that the recombinant virus can be efficiently propagated.
- the cell having a high proliferation rate for example, Vero cell is suitable.
- the mixing ratio of the cells that have produced the recombinant virus and the cells having a high growth rate is, for example, usually about 0.1 to 10 cells having a high growth rate with respect to one cell that has produced the recombinant virus. Preferably about 0.2 to 2.
- Conditions for culturing cells with a high growth rate after mixed culture are not particularly limited.
- the culture temperature is usually about 36 to 37 ° C.
- Dulbecco's modified Eagle medium is usually used for 3 days.
- the culture is performed for about 5 weeks, preferably about 3 days to 3 weeks.
- a G gene-deficient BDV viral vector When a G gene-deficient BDV viral vector is used, it is preferable to use a cell that constantly expresses the outer shell gene with a helper plasmid that expresses the G gene of the ABV genome as a cell having a high growth rate. Such a cell can be prepared by introducing the gene into a cell such as a Vero cell using a plasmid that expresses the coat gene. Furthermore, when the G gene and M gene deficient BDV viral vectors are used, cells that constantly express the G gene of the ABV genome and the M gene of the BDV genome may be used as cells having a high growth rate. preferable.
- Such a cell can be prepared, for example, by introducing the gene into a Vero cell or the like using a plasmid that expresses the gene.
- a plasmid for expressing the gene is usually easily produced by introducing a desired gene into the plasmid according to the instructions attached to the various expression plasmids.
- the above-mentioned helper plasmid for expressing the AB gene G gene, the helper plasmid for expressing the BDV genome M gene, and the like can also be suitably used.
- the production method of the present invention it is preferable to carry out a step of purifying the recombinant virus after the cell is produced (and propagated). It does not specifically limit as a purification method, It can carry out by a publicly known method, What is necessary is just to select the purification method suitably according to the infection object of a recombinant virus.
- the recombinant virus is produced (and propagated) as described above, and then the culture cell supernatant producing the recombinant virus is recovered, Crush.
- Cell disruption can be performed using, for example, freezing and thawing, or an ultrasonic disrupter.
- cell disruption components are removed from the cell disruption solution. Examples of the method for removing the cell disruption component from the cell disruption solution include centrifugation (for example, at 4 ° C. and 800 g for about 10 minutes).
- a supernatant containing the recombinant virus can be obtained by passing through a filtration membrane having a pore size of 0.22 ⁇ m or 0.45 ⁇ m. This supernatant can be used when the cultured cells are infected with the recombinant virus. Moreover, the supernatant containing this recombinant virus can also be concentrated and used by a known technique.
- the supernatant containing the recombinant virus is highly converted into virus particles by ultracentrifugation using a concentration centrifuge using an ultracentrifuge. It is preferable to carry out purification.
- the purified virus particles are suspended in, for example, phosphate buffered saline, diluted, and then the animal is infected with an appropriate amount.
- Method for introducing a foreign gene By infecting a cell with the above recombinant virus, a foreign gene incorporated into the virus can be introduced into a cell or a living body.
- a method for introducing an exogenous gene comprising the step of infecting cells or animals in vitro with the above-described recombinant virus or the recombinant virus produced by the above-described method is also one aspect of the present invention.
- the animal infected with the recombinant virus is not particularly limited, and examples thereof include mammals, birds, reptiles and amphibians. Among them, mammals such as humans, monkeys, horses, dogs, cats, pigs, sheep, goats, rats, mice, rabbits and cows are preferable, rats, mice or humans are more preferable, and mice or humans are still more preferable.
- Such animal cells are preferred as the cells to be infected with the recombinant virus.
- BDV is preferably a mammalian nervous system cell, and more preferably a cerebral nervous system cell, because the nervous system cell is directed toward infection. Of these, rat, mouse or human nervous system cells are preferred.
- the cell may be a cultured cell or a living cell.
- mammalian cerebral nervous system cells include glial cells, cerebral cortex neurons, hippocampal neurons, cerebellar neurons, and midbrain neurons.
- cultured cells of mammalian brain neurons OL, C6, U373, N2a, N18, PC12, SK-N-SH cells and the like are suitable.
- Recombinant virus produced using a plasmid vector that expresses the outer shell gene of another virus as a helper plasmid that expresses the G gene-deficient BDV viral vector and the G gene of the ABV genome is a virus from which the outer shell gene is derived.
- the infection directionality according to the kind of is shown.
- a helper plasmid encodes the outer coat gene of a virus other than ABV (preferably, the extracellular sequence and transmembrane sequence of a coat protein of a virus other than ABV, and the intracellular sequence of the G protein of the ABV genome.
- the resulting recombinant virus can suitably infect cells in which the virus is directed against infection.
- the supernatant containing the recombinant virus obtained by the purification method described above is used as a culture medium such as Dulbecco's modified Eagle medium.
- a culture medium such as Dulbecco's modified Eagle medium.
- the MOI multiplicity of infection value
- the MOI is usually about 0.01 to 10 (amount that 0.01 to 10 virus particles infect one cell), preferably about 1 to 10 MOI.
- This diluted solution is used to infect cells with the recombinant virus.
- the virus particles highly purified as described above are suspended in, for example, phosphate buffered saline and diluted with the phosphate buffered saline. It is preferred to infect the animal with an appropriate amount after doing so.
- concentration of the recombinant virus in the diluted solution may be appropriately selected depending on the infection target. For example, if the target of infection is a mammalian neuron, the individual is inoculated with about 1 ⁇ 10 ⁇ 1 to 1 ⁇ 10 9 FFU of the virus titer (focus-forming unit (FFU)) of the diluted solution containing the recombinant virus. It is preferable to do.
- the virus titer when a diluted solution containing a recombinant virus is inoculated into a mouse or rat, the virus titer is preferably about 1 ⁇ 10 ⁇ 1 to 1 ⁇ 10 7 FFU.
- the virus titer When inoculating dogs, cats or humans, the virus titer is preferably about 10 to 1 ⁇ 10 8 FFU, and when inoculating cattle or horses, the virus titer is usually 1 ⁇ 10 5. ⁇ 1 ⁇ 10 12 FFU is preferable.
- the virus titer When inoculating a human, the virus titer is preferably about 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 9 FFU.
- an exogenous gene transfer agent described later can also be suitably used.
- a mammalian cerebral nervous system cell when a mammalian cerebral nervous system cell is infected with a recombinant virus, a method of inoculating a mammalian nasal cavity with a diluent containing the recombinant virus is preferable.
- a method of inoculating a mammalian nasal cavity with a diluent containing the recombinant virus is preferable.
- infecting cerebral nervous system cells in animal experiments such as mice and rats, it is possible to directly inoculate the animal brain with a diluent containing the recombinant virus.
- the diluted solution containing the above-mentioned concentration of the recombinant virus is usually inoculated in an amount of about 5 ⁇ L to 1 mL at a time for intranasal inoculation, and usually about 1 to 50 ⁇ L at a time for inoculation in the brain.
- the inoculation amount of the recombinant virus to the animal may be appropriately selected according to the body weight or the like of the animal.
- a mouse or rat when a mouse or rat is inoculated intranasally with a diluted solution containing the above-mentioned concentration of the recombinant virus, 1 Usually about 5 to 200 ⁇ L, preferably about 10 to 100 ⁇ L is inoculated per time.
- the diluted solution containing the recombinant virus When infecting a living cell other than a brain nerve cell with a recombinant virus, it is preferable to parenterally administer the diluted solution containing the recombinant virus.
- a method of inoculating a mammal into the abdominal cavity, blood vessel, muscle, or the like is preferable.
- the inoculation amount of the recombinant virus may be appropriately selected depending on the inoculation site and the like, and is not particularly limited.
- the virus titer of the diluted solution containing the recombinant virus is usually about 1 ⁇ 10 ⁇ 1 to 1 ⁇ 10 9 FFU, and the diluted solution containing the recombinant virus is usually about 5 per time for mice. Inoculate ⁇ 500 ⁇ L, preferably about 20-200 ⁇ L.
- An exogenous gene introduction agent (1) The above-described viral vector, (3) an exogenous gene introduction agent containing the above-described recombinant virus or the recombinant virus prepared by the above method are also one aspect of the present invention.
- a preferred embodiment is an exogenous gene transfer agent containing the above recombinant virus or the recombinant virus prepared by the above method.
- Such an exogenous gene introduction agent can be suitably used when infecting a recombinant virus with an in vitro cell or a living cell (animal) in the aforementioned exogenous gene introduction method.
- the present invention can be suitably used for introducing a foreign gene into an animal nervous system cell or the like. Among them, it is preferably used by introducing a foreign gene into a cerebral nervous system cell.
- One of the preferred embodiments of the exogenous gene introduction agent of the present invention is an exogenous gene introduction agent into a cranial nervous system cell containing the above recombinant virus or a recombinant virus produced by the above method.
- the cranial nervous system cells are preferably mammalian cerebral nervous system cells such as glial cells, cerebral cortex neurons, hippocampal neurons, cerebellar neurons, and midbrain neurons.
- the exogenous gene transfer agent of the present invention may further contain other drugs such as a therapeutic agent for neurological diseases, and may contain pharmaceutically acceptable components depending on the dosage form.
- a dosage form for parenteral administration is preferable. For example, injection, instillation, ointment, gel, cream, patch, spray, spray An injection is preferable.
- an aqueous injection As an injection for parenteral administration, either an aqueous injection or an oily injection may be used.
- an aqueous injection according to a known method, for example, after mixing the recombinant virus with a solution obtained by appropriately adding a pharmaceutically acceptable additive to an aqueous solvent (water for injection, purified water, etc.), a filter or the like It can be prepared by sterilizing by filtration and then filling into a sterile container.
- a aqueous solvent water for injection, purified water, etc.
- Examples of pharmaceutically acceptable additives include isotonic agents such as sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, glucose, propylene glycol; phosphate buffer, acetate buffer, Buffers such as borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer, glutamate buffer, epsilon aminocaproate buffer; methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, paraoxybenzoic acid Preservatives such as butyl, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, borax; thickeners such as hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol; Sodium bisulfate, sodium thiosulfate, sodium edetate, sodium citrate, ascorbic acid,
- solubilizers for example, alcohols such as ethanol; polyalcohols such as propylene glycol and polyethylene glycol; nonionic surfactants such as polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50, lysolecithin, and pluronic polyol You may mix
- proteins such as bovine serum albumin and keyhole limpet hemocyanin; polysaccharides such as aminodextran may be contained.
- sesame oil or soybean oil is used as the oily solvent, and benzyl benzoate or benzyl alcohol may be blended as a solubilizing agent.
- the prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule or vial.
- Liquid preparations such as injections can be stored after removing moisture by freezing or lyophilization.
- the freeze-dried preparation is used by adding distilled water for injection at the time of use and re-dissolving it.
- the amount of the recombinant virus contained in the exogenous gene transfer agent of the present invention varies depending on the formulation form or administration route of the exogenous gene transfer agent, but is usually in the range of about 0.0001 to 100 w / v% in the final preparation. It can be determined by appropriately selecting from.
- the administration method and dosage of the exogenous gene introduction agent are the same as the method in the above-described exogenous gene introduction method and the dosage of the recombinant virus.
- the exogenous gene transfer agent of the present invention is useful as a gene delivery composition for, for example, treatment of cranial nervous system diseases in animals, chronic liver diseases such as hepatitis C, antitumor drugs, vaccines and the like.
- the mammal described above is suitable for the administration target of the exogenous gene transfer agent of the present invention.
- the viral vector, recombinant virus and foreign gene introduction method of the present invention, and the foreign gene introduction agent can be applied to various fields as a gene introduction technique that does not affect the host chromosome. It is.
- the viral vector and recombinant virus of the present invention can be used as a gene delivery vector for treating cranial nervous system diseases in animals including humans. It can also be suitably used for vaccines against chronic liver diseases, tumors, infectious diseases and the like. Examples of the cranial nervous system diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis, schizophrenia, autism, and other functional psychiatric diseases.
- the recombinant virus of the present invention is useful for the treatment or prevention of such diseases.
- an exogenous gene in the viral vector of the present invention is a gene of an enzyme that degrades a protein causing a cranial nervous system disease
- a nucleic acid sequence having a function of suppressing the expression of the protein, or the like, produced from the viral vector By infecting brain neurons with the recombinant virus to be produced, the causative protein can be decomposed or the expression of the causative protein can be suppressed to prevent or treat the disease.
- a gene that encodes the substance in the brain is inserted into a viral vector, and a combination produced from the viral vector. By infecting brain neurons with the virus, the substance in the brain is produced, so that the disease can be prevented or treated.
- Treatment refers to not only completely curing the disease state, but also suppressing the progression and / or worsening of symptoms without complete cure, and stopping the progression of the disease state, or part or all of the disease state “Preventing” means to prevent, suppress, or delay the onset of a disease state, respectively, to improve the condition and lead to the direction of healing.
- the virus vector and recombinant virus of the present invention can also be used for treatment or prevention of viral encephalitis such as Japanese encephalitis.
- it can also be suitably used for cranial nervous system diseases of laboratory animals, companion animals or production animals such as BSE (bovine spongiform encephalopathy), rabies and the like.
- BSE bovine spongiform encephalopathy
- Examples of experimental animals include mice, rats, guinea pigs, rabbits, cats and dogs.
- companion animals include mice, rats, guinea pigs, rabbits, cats, and dogs.
- production animals include cattle, horses, pigs and sheep.
- the virus vector and the recombinant virus of the present invention can be used for visualization technology of nervous system cells in the field of neuroscience.
- the viral vector of the present invention is useful as an RNA viral vector capable of expressing a functional RNA molecule, and can also be applied to a technique for stably expressing functional RNA such as siRNA, miRNA, RNA aptamer.
- functional RNA such as siRNA, miRNA, RNA aptamer or the like
- these functional RNA molecules can be expressed in a desired cell.
- a single chain antibody (scFv) can be expressed in the brain.
- the virus vector or recombinant virus that specifically infects tumor cells is improved, and siRNA that suppresses drug genes and overexpressed genes into tumor cells is introduced. By doing so, it can also be used as an anti-tumor virus vector.
- a gene having neutralizing activity against HIV, influenza virus, etc. eg, HIV env, gag, etc .; influenza virus HA, NA gene, etc.
- recombinant viruses for recombinant vaccines for infectious diseases that follow the chronic course such as HCV, siRNA against the target virus genome is introduced, which is effective for the development of new treatments for infectious diseases using functional RNA. .
- virus vector and recombinant virus of the present invention by infecting the virus vector and recombinant virus of the present invention with stem cells derived from various cells, pluripotent stem cells such as iPS cells, and cancer stem cells, safe cells that can be used for the treatment of the aforementioned diseases A group can be acquired.
- kits of the present invention may appropriately include a helper plasmid, a cell into which an exogenous gene is introduced, a buffer solution, a medium and the like in addition to the viral vector.
- a preferred embodiment of the viral vector is as described above.
- the cell into which the foreign gene is introduced is preferably a nervous system cell such as a cerebral nervous system cell.
- the kit of the present invention can be suitably used for introducing an exogenous gene into a brain nervous system cell or the like, which has been technically difficult until now.
- Example 1 Preparation of plasmid pCAG-Fct Chloramphenicol acetyltransferase inserted into plasmid pCAG-HR-SV3 described in Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529
- a plasmid in which the region of (CAT) gene was replaced with the sequence of the genome of Borna disease virus He / 80 strain (SEQ ID NO: 1) was prepared as follows.
- a BDV minigenome vector derived from cytomegavirus (CMV)
- CMV cytomegavirus
- a chemically synthesized oligonucleotide (Briese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA) encoding hammerhead ribozyme (HamRz) 89 (1992) 11486-11489, and Le Mercier et al., J. Virol., 76 (2002) 2024-2027) and chemically synthesized oligonucleotides encoding the 5 'untranslated region (UTR) sequence of BDV (Cubitt, B., Oldstone, C. And de la Torre, JC, Sequence and genome organization of Borna disease virus.
- UTR 5 'untranslated region
- J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994)) are annealed, and vector pcDNA3 (Invitrogen, San (Diego, CA) between KpnI and XhoI sites.
- the obtained plasmid was cleaved at Eco47III and XbaI sites.
- BDV 3'UTR fused with hepatitis delta virus ribozyme (HdRz) and a cDNA clone encoding the genome of BDV He / 80 strain were inserted into this plasmid to obtain plasmid pc-HR.
- HdRz hepatitis delta virus ribozyme
- pCMV-HR was prepared by inserting the BglII and XbaI fragments of pc-HR between the BamHI and XbaI sites of pBluescript SKII ( ⁇ ) (Stratagene, La Jolla, CA).
- the BDV minigenomic vector pCAG-HR derived from CAG was obtained by subcloning the CAG promoter into pBluescript SKII (-) (Stratagene, La Jolla, CA) ( pBS-CAG).
- the CAG promoter is a hybrid promoter obtained by fusing a chicken ⁇ -actin promoter with a cytomegalovirus IE enhancer, and is described in Sawichi et al., “Exp.” Cell “Res.” 244 (1998) 367-369.
- a region spanning the HamRz and HdRz sequences of pCMV-HR was amplified by PCR and inserted between the SalI of pBS-CAG and the blunt end of the EcoRI site.
- SV3 region consisting of 113 bases on the 5 ′ side within the SV40 starting point / promoter was amplified from pEGFP-N1 (Clontech) by PCR (Clontech Laboratory, Inc., Palo Alto, CA). And inserted into the NotI site of pCAG-HR. This resulted in plasmid pCAG-Fct.
- BDV genomic plasmid (pCAG-Fct-P / M-GFP) in which GFP is inserted into the untranslated region between P gene and M gene A foreign gene insertion cassette is inserted into the untranslated region between P gene and M gene
- the plasmid pCAG-Fct-P / M was created by insertion.
- Primer 1 5-GGAATGCATTGACCCAACCGGTAGACCAGC-3 (SEQ ID NO: 5)
- Primer 2 5-AACATGTATTTCCTAATCGGGTCCTTGTATACGG-3 (SEQ ID NO: 6)
- Primer 3 5-ttcgaaGGTTGGttaattaaccataaaaaatcgaatcacc-3 (SEQ ID NO: 7)
- Primer 4 5-ttaattaaCCAACCttcgaaGGTGATTCGATTTTTTTATGG-3 (SEQ ID NO: 8)
- FIG. 6 shows an outline of the procedure for preparing p / mGFP ⁇ G, which is a plasmid encoding the G gene-deficient BDV virus.
- PCR (98 ° C 10 seconds, 55 ° C 5 seconds, 72 ° C 0.5 or 1 minute for 25 cycles) was performed using primers A1 and B1 and primers C1 and D1 with the sequence shown in Table 1 using p / mGFP as a template. (FIG. 6A).
- PCR (98 ° C., 10 seconds, 55 ° C., 5 seconds, 72 ° C., 1.5 minutes for 25 cycles) was performed again using both amplification products (1st PCR product) as a template and the primers A1 and D1 (FIG. 6).
- amplification product (2nd PCR product)
- the methionine of the G gene is mutated to threonine, and this is recombined with the vector p / mGFP using the restriction enzymes Bst1107I and NheI (FIG. 6 (c)).
- / MGFP ⁇ G was obtained.
- the L gene intron region that was no longer needed was removed and the L gene was directly linked (L linearize). Specifically, from the restriction enzyme site Bst1107I (2166 to 2171st nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) to the first half of exon of L gene and the second half of exon of L gene (NheI site (6158 to 6163rd of SEQ ID NO: 1) Each of the base sequence) was combined, and both were combined and incorporated into p / mGFP ⁇ G. An outline of this procedure is shown in FIG. First, PCR (98 ° C. 10 seconds, 55 ° C. 5 seconds, 72 ° C.
- the amplified product (2nd PCR product) has the intron part of the L gene deleted, and this was recombined with the vector p / mGFP ⁇ G using restriction enzymes Bst1107I and NheI to obtain p / mGFP ⁇ G LL. (FIG. 7 (c)).
- p / m PaBV4G GFP ⁇ G LL was prepared by inserting PaBV-4 G gene cDNA into the p / m tandem GFP ⁇ G LL insertion cassette.
- PCR (98 degrees 10 seconds, 55 degrees 5 seconds, 72 degrees 10 seconds, 30 cycles) was performed using the PaBV-4 G gene cDNA as a template and primers 5 and 6.
- the PCR product was recombined with p / m tandem GFP ⁇ G LL using AscI and AsiSI to obtain p / m PaBV4G GFP ⁇ G LL (FIG. 3 (a)).
- Primer 5 5'-AAAGGCGCGCCATGCTGCATTCAACGTATTCTCGTT-3 '(SEQ ID NO: 18)
- Primer 6 5'-AAAGCGATCGCTTATTCCGACCACCTTCCGAG-3 '(SEQ ID NO: 19)
- Helper Plasmids ie, a BDV genome N gene expression plasmid (pcN), a BDV genome P gene expression plasmid (pCXN2-P) and a BDV genome L gene expression plasmid (pcL) were prepared by the following procedure.
- pcN is a pHA-p40N plasmid (Kobayashi T, Watanabe M, Kamitani W, Zhang G, Tomonaga K and Ikuta K. Borna disease virus nucleoprotein requires both nuclear localization and export activities for viral nucleocytoplasmic shuttling. J. Virol. 75: 3404- 3412.
- pCXN2-P is expressed as pcD-P (Zhang G, Kobayashi T, Kamitani W, Komoto S, Yamashita M, Baba S, Yanai H, Ikuta K and Tomonaga K. Borna disease virus phosphoprotein represses p53-mediated transcriptional activity by interference with HMGB1. J. Virol. 77: 12243-12251. (2003)) pCXN2 (Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J 1991 Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.
- pcL was prepared by the method described in Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104. The nucleotide sequence of the recombinant plasmid was confirmed by DNA sequencing.
- recombinant virus p / m PaBV4G GFP ⁇ G LL and a helper plasmid (N gene expression plasmid, P gene expression plasmid and L gene expression plasmid; pcN, pCXN2-P and pcL, respectively) were prepared using FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics (Registered trademark), Pleasanton, CA) or Lipofectamine (registered trademark) 2000 (Invitrogen) was introduced into 293T cells.
- the amount of the viral vector used for the introduction was 1 to 10 ⁇ g of p / m PaBV4G GFP ⁇ G LL for 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 6 cells (293T cells), and pcN (0.125 To 0.5 ⁇ g), pCXN2-P (0.0125 to 0.05 ⁇ g), pcL (0.125 to 0.5 ⁇ g) at a ratio of helper plasmid.
- Viral vectors and helper plasmids were introduced into 293T cells using Lipofectamine (registered trademark) 2000 (Invitrogen). After the gene transfer, the cells were cultured at 37 ° C., and the cells were passaged 3 days after the gene transfer. At that time, after co-culture with Vero cells, the Vero cells were collected as PaBV-4G-expressing chimeric virus-infected Vero cells. .
- the spread of infection between cells after 48 hours, and the release of virus into the infected cell supernatant can be determined by indirect immunofluorescence antibody method or Western blot method or virus titer in the supernatant.
- virus production began to be observed 24 hours after infection.
- Example 2 Recovery of pseudotype virus Example 1 was performed using the p / mGFP ⁇ G LL and helper plasmid (N gene expression plasmid, P gene expression plasmid and L gene expression plasmid; pcN, pCXN2-P and pcL, respectively) prepared above.
- G gene-deficient recombinant BDV cells were obtained by reference. The obtained cells were seeded in a 10 cm petri dish (3.0 ⁇ 10 6 cells), and 10 ⁇ g of G protein expression plasmid was introduced using TransIT (registered trademark) -293 (TaKaRa).
- G proteins of Variegated squirrel bornavirus (VSBV), Parrot bornavirus 4 (PaBV-4), Parrot bornavirus 5 (PaBV-5), and Munia bornavirus 1 (MuBV-1) were used.
- Cells into which the plasmid was introduced were cultured at 37 ° C. in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing 10% fetal calf serum (FCS). After 48 hours, the cells were washed twice with DMEM, 1.2 mL of DMEM was added, and the petri dish was allowed to stand at ⁇ 80 ° C. for 1 hour. Freezing and thawing were performed twice at ⁇ 80 ° C. and room temperature, and the culture solution in the petri dish was collected. The collected culture solution was centrifuged at 3,000 rpm and 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was used as a pseudo-type virus solution.
- DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
- FCS fetal
- the pseudotype virus collected by the above method was inoculated into Vero cells.
- the left image of FIG. 8 shows an image obtained by observing the Vero cells with a fluorescence microscope 4 days after the inoculation.
- the right side of FIG. 8 is a graph showing the number of GFP positive (relative value) at this time.
- the recombinant virus produced from the viral vector of the present invention can express a foreign gene non-cytotoxicly and efficiently in the cell nucleus, and since the viral genome is RNA, it is inserted into the host chromosome. It is a safe vector.
- the viral vector of the present invention utilizes Borna disease virus, since Borna disease virus has an infection-directed property to nerve cells, it can be used to selectively introduce foreign genes into the brain nervous system. It is an excellent vector. Therefore, the present invention is useful because it can be used as a gene transfer technique that does not affect the host chromosome in various fields, for example, treatment and prevention of cranial nerve disease, visualization technique of nervous system cells in the brain neurochemistry region, etc. It is.
- the present invention can also be applied to stable expression vector technology for functional RNA such as siRNA, miRNA, RNA aptamer. Therefore, the present invention is useful in the fields of medicine, animal medicine, clinical trials, research, and the like.
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Abstract
(a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されているウイルスベクターであって、前記(a)がボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子の配列を更に有する組換えウイルスRNAのcDNAであることを特徴とするウイルスベクター。本発明は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野、例えば、脳神経系疾患治療及び予防、脳神経化学領域における神経系細胞の可視化技術等に好適に用いることができる。
Description
本発明は、外来性遺伝子を細胞に導入するためのウイルスベクター、組換えウイルス及びその利用に関する。
外来性遺伝子を生体又は細胞に運搬する手段として、ウイルスベクターを利用する方法が知られている。これまでに、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルスを利用するベクターが開発されている。
しかしながら、これらの既存のウイルスベクターでは、例えばDNAウイルスの場合には宿主染色体にウイルス遺伝子が組み込まれることにより宿主(例えば、ヒト)への病原性が発現するという問題点があった。また、ウイルスによっては感染可能な宿主域が狭く、特定の生物にしか適用できないという問題点や、外来性遺伝子のウイルスゲノムへの組込み部位により遺伝子導入効率に差があり、遺伝子導入効率が悪いという問題点があった。また、生体内での免疫応答によりウイルスが排除されたり、ウイルス遺伝子の変異やプロモーター効率の変化が生じたりすることから、安定性及び持続性が悪いという問題点もあった。
さらに、遺伝子治療等においては、目的とする細胞のみに遺伝子を導入することができる遺伝子導入技術が期待されている。特に、神経系疾患の治療には遺伝子治療が有効であると考えられるため、神経細胞に選択的に遺伝子を導入でき、しかも安全性、安定性、持続性及び遺伝子導入効率が高いウイルスベクターの開発が望まれている。
ボルナウイルスは、非分節の一本鎖マイナス鎖のRNAをゲノムとして持つモノネガウイルス目(Mononegavirales)に属するウイルスであり、神経細胞に感染指向性があるという特徴を有する。現在、ボルナウイルス科(Bornaviridae)ボルナウイルス属(Bornavirus)には、哺乳類に感染するボルナ病ウイルス(Borna disease virus:BDV)の他、鳥類に感染する鳥ボルナウイルス(Avian Bornavirus:ABV)等が同定されている。
BDVは細胞核で複製するウイルスであるが、その感染は非細胞障害性であり長期に持続感染するという特徴や、感染可能な宿主域が極めて広いという特徴も有する(非特許文献1及び2等)。
BDVを利用する外来性遺伝子の細胞への導入技術として、緑色蛍光蛋白質(GFP)の発現カセットをBDVゲノムの5’末端側の非翻訳領域に挿入し、この組換えウイルスを高活性のポリメラーゼと共にラットに感染させると、ラットの神経細胞においてGFP遺伝子が発現したことが報告されている(非特許文献3)。
特許文献1には、(a)ボルナ病ウイルスゲノムをコードするcDNAのG遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのcDNA、(b)リボザイムをコードするcDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されているウイルスベクターが開示されている。
また、特許文献2には、(a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されていることを特徴とするウイルスベクターが開示されている。
蛋白質 核酸 酵素、Vol.52、No.10、p.1168-1174(2007)
朝長啓造、「ボルナ病ウイルス感染と中枢神経系疾患」、最新医学・第60巻・第2号(2005年2月号別刷)、79-85頁
U. Schneider et al., Journal of Virology (2007) p.7293-7296
BDVを利用する上記技術によれば、中枢神経系の細胞に選択的に外来性遺伝子を挿入することができると考えられる。しかしながら、上記BDVを用いる技術においては、組換えウイルスの回収効率が高くないことや遺伝子の導入効率が未だ十分ではないなどの課題があり、遺伝子の導入効率をより高くするための改良の余地があった。従って、組換えウイルスの複製効率が高く、感染可能な宿主域が広く、安全性及び外来性遺伝子の導入効率が高く、安定性及び持続性が良好であり、しかも中枢神経系に選択的に外来性遺伝子を導入することができるウイルスベクターとして、更に優れるものが望まれていた。
本発明は、感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも目的細胞(例えば、脳神経系等の中枢神経系の細胞等)に選択的に外来性遺伝子を導入することができ、かつ目的細胞以外の細胞に伝播しないため病原性が低い(安全性が高い)組換えウイルスを効率よく産生できるウイルスベクター、組換えウイルス及び該組換えウイルスを利用する外来性遺伝子の導入方法、外来性遺伝子導入剤等を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明者らはBDVゲノム(RNAウイルスゲノム)における外来性遺伝子の挿入について鋭意研究を行った。その結果、BDVゲノムにおいて外来性遺伝子を導入する際に、BDVゲノムにおけるG遺伝子とは遺伝子型が異なるG遺伝子を挿入する、即ち、BDVゲノムに外来性遺伝子と共に鳥ボルナウイルス(ABV)のG遺伝子を導入したベクターを作製することで、得られる組換えウイルスの産生能及び回収率がより高い(該ベクターから産生される組換えウイルスの複製効率がより高い)ことを見出し、ひいては外来性遺伝子が効率よく発現されること、すなわち細胞に外来性遺伝子を非常に効率よく導入することができることを見出した。
これまで、既存の組換えBDVベクターにおいては、外来性遺伝子をG遺伝子領域(特許文献1)又はゲノムの5’末端領域(非特許文献3)に挿入して該遺伝子を発現させていた。しかしながら、外来性遺伝子をG遺伝子領域に挿入したベクターは、組換えウイルス産生能が低く、また、該ベクターから産生される組換えウイルスの細胞への感染は一過性であり、持続的に外来性遺伝子を発現できなかった。ゲノムの5’末端領域に外来性遺伝子を挿入した組換えBDVベクターは、遺伝子の導入効率が低かった。また、P遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えBDVベクターも検討されていた(特許文献2)が、該ベクターは組換えウイルス産生能が未だ十分ではなく、また、当該組換えウイルスの回収量も少ないことから、実用化には未だ問題があった。本発明者らは、BDVゲノムの配列に着目し、元来有するG遺伝子を破壊して、該G遺伝子とは遺伝子型が異なる別個なG遺伝子と共に外来性遺伝子を挿入することで、得られたBDVベクターは、既存の組換えBDVベクターよりウイルス産生能及びその回収効率も高いものであること、該ベクターから産生される組換えウイルスは、脳神経系細胞においても高効率に感染することを見出し、長期間目的遺伝子を発現することができることから、これらを用いると様々な外来性遺伝子を目的細胞に効率よく導入することができることに想到した。
なお、BDVゲノムには、少なくとも6つの蛋白質、すなわち核蛋白質(N蛋白質)、X蛋白質、リン酸化蛋白質(P蛋白質)、マトリックス蛋白質(M蛋白質)、表面糖蛋白質(G蛋白質)及びRNA依存性RNAポリメラーゼ(L蛋白質)がコードされている。図1は、BDVゲノムの構造を模式的に示す図である。図1において、N、X、P、M、G及びLは、それぞれの遺伝子のORFを模式的に示している。BDVゲノムは、図1に示すように、N、X、P、M、G及びLの各遺伝子を、3’末端からこの順に有する。本明細書中、G蛋白質、M蛋白質、N蛋白質、P蛋白質及びL蛋白質をコードするウイルスRNAを、それぞれG遺伝子、M遺伝子、N遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子という。また、例えば、「G遺伝子のcDNA」とは、G遺伝子をコードするcDNAを意味する。
すなわち、本発明は、以下の項1~項15に関する。
項1. ボルナ病ウイルスゲノムにおいて、該ボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAを含むことを特徴とするウイルスベクター。
項2. (a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されているウイルスベクターであって、前記(a)がボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子の配列を更に有する組換えウイルスRNAのcDNAであることを特徴とする、項1に記載のウイルスベクター。
項3. (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムにおけるM遺伝子が更に破壊された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである項2に記載のウイルスベクター。
項4. (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのcDNAである項2に記載のウイルスベクター。
項5. (c)プロモーター配列が、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列であることを特徴とする項2~4のいずれかに記載のウイルスベクター。
項6. (a)組換えウイルスRNAのcDNAの上流に(b1)ハンマーヘッドリボザイムをコードするcDNAが配置され、かつ、該(a)の下流に(b2)δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするcDNA配列が配置されていることを特徴とする項2~5のいずれかに記載のウイルスベクター。
項7. (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、外来性遺伝子の3’末端側及び5’末端側にそれぞれ制限酵素サイトを含み、外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトとP遺伝子の翻訳領域との間、及び前記外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトとL遺伝子の翻訳領域との間又はボルナ病ウイルスゲノムにおけるM遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する場合には前記外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトとM遺伝子の翻訳領域との間にそれぞれ、配列番号9に示す配列を含み、該外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトと配列番号9に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccが挿入され、かつ該外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトと配列番号9に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccaが挿入されている配列に基づくことを特徴とする項2~6のいずれかに記載のウイルスベクター。
項1. ボルナ病ウイルスゲノムにおいて、該ボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAを含むことを特徴とするウイルスベクター。
項2. (a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されているウイルスベクターであって、前記(a)がボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子の配列を更に有する組換えウイルスRNAのcDNAであることを特徴とする、項1に記載のウイルスベクター。
項3. (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムにおけるM遺伝子が更に破壊された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである項2に記載のウイルスベクター。
項4. (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのcDNAである項2に記載のウイルスベクター。
項5. (c)プロモーター配列が、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列であることを特徴とする項2~4のいずれかに記載のウイルスベクター。
項6. (a)組換えウイルスRNAのcDNAの上流に(b1)ハンマーヘッドリボザイムをコードするcDNAが配置され、かつ、該(a)の下流に(b2)δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするcDNA配列が配置されていることを特徴とする項2~5のいずれかに記載のウイルスベクター。
項7. (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、外来性遺伝子の3’末端側及び5’末端側にそれぞれ制限酵素サイトを含み、外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトとP遺伝子の翻訳領域との間、及び前記外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトとL遺伝子の翻訳領域との間又はボルナ病ウイルスゲノムにおけるM遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する場合には前記外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトとM遺伝子の翻訳領域との間にそれぞれ、配列番号9に示す配列を含み、該外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトと配列番号9に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccが挿入され、かつ該外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトと配列番号9に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccaが挿入されている配列に基づくことを特徴とする項2~6のいずれかに記載のウイルスベクター。
項8. 項1~7のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるRNAを含むことを特徴とする組換えウイルス。
項9. 項1~7のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのN遺伝子、P遺伝子、L遺伝子及び鳥ボルナウイルスゲノムのG遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
項10. 項1~7のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と鳥ボルナウイルスゲノムのG遺伝子を発現するプラスミドとをin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
項11. ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスゲノムのM遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する項9又は10に記載の組換えウイルスの作製方法。
項9. 項1~7のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのN遺伝子、P遺伝子、L遺伝子及び鳥ボルナウイルスゲノムのG遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
項10. 項1~7のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と鳥ボルナウイルスゲノムのG遺伝子を発現するプラスミドとをin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
項11. ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスゲノムのM遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する項9又は10に記載の組換えウイルスの作製方法。
項12. 項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを細胞又は動物に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
項13. 項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
項14. 項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
項15. 項1~7のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。
項13. 項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
項14. 項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
項15. 項1~7のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。
本発明はまた、以下の方法、使用等も包含する。
項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを動物に投与する脳神経系細胞への外来性遺伝子の導入方法。
項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
in vitroの細胞又は動物に外来性遺伝子を導入するための、項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するための、項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを動物に投与する脳神経系細胞への外来性遺伝子の導入方法。
項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
in vitroの細胞又は動物に外来性遺伝子を導入するための、項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するための、項8に記載の組換えウイルス、又は項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
本発明によれば、感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため宿主細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも脳神経系の細胞等の目的細胞に選択的に外来性遺伝子を導入することができ、かつ目的細胞以外の細胞には伝播しないため病原性が低い(安全性が高い)組換えウイルスを高い生産性で産生できるウイルスベクター及び組換えウイルスを作製することができる。また、本発明によれば、外来性遺伝子を脳神経系の細胞等の目的細胞に選択的にかつ効率よく導入することができ、該細胞において外来性遺伝子を持続的に発現させることができる。さらに、本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、脳神経系細胞等の細胞の核内で持続感染を起こすため、宿主免疫の攻撃を受け難く、排除が起こりにくい。また、本発明の組換えウイルスが持つP蛋白質には、宿主免疫の応答経路を阻害するという働きがあり、ウイルス感染細胞では自然免疫の活性化も起こらない。
本発明は、ボルナウイルスベクターに関するものであり、ボルナ病ウイルスゲノムにおいて、該ボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAを含むことを特徴とする。かかるウイルスベクターがあれば外来性遺伝子を効率よく導入することができるため、本発明のウイルスベクターとしては、後で公知技術に従って外来性遺伝子を導入することもできることから該遺伝子の導入有無は問わない。また、一般に、ボルナ病ウイルスには各種遺伝子が様々なアライメントで配置されたものが含まれるため、以下に便宜的に、本発明のボルナウイルスベクターに好適なボルナ病ウイルスを用いて本発明を説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
1.ウイルスベクター
本発明の好適なウイルスベクターは、(a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されているものであって、前記(a)がボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊される一方で、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子の配列が挿入されるものであることに一つの特徴を有する。かかるウイルスベクターのことを、態様Aのウイルスベクターと記載する。
以下、上記(a)の組換えウイルスRNAのcDNAを、単に「(a)組換えBDVゲノムのcDNA」ともいう。態様Aのウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、上記(a)、(b)及び(c)以外の配列を含んでもよい。
本発明の好適なウイルスベクターは、(a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されているものであって、前記(a)がボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊される一方で、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子の配列が挿入されるものであることに一つの特徴を有する。かかるウイルスベクターのことを、態様Aのウイルスベクターと記載する。
以下、上記(a)の組換えウイルスRNAのcDNAを、単に「(a)組換えBDVゲノムのcDNA」ともいう。態様Aのウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、上記(a)、(b)及び(c)以外の配列を含んでもよい。
(a)組換えBDVゲノムのcDNA
態様Aにおける(a)組換えBDVゲノムのcDNAは、ボルナ病ウイルスゲノム(BDVゲノム)における少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子が、該BDVゲノムにおける順序と同じ順序で配置され、かつ、該BDVゲノムにおけるG遺伝子が破壊された配列において、外来性遺伝子と前記G遺伝子とは異なる遺伝子型を有する鳥ボルナウイルスゲノム(ABVゲノム)のG遺伝子(以降、G’遺伝子と記載することもある)が挿入された配列を有する。
ここで、遺伝子が破壊されたとは、通常、該遺伝子が蛋白質(例えばG遺伝子であればG蛋白質)をコードすることができる形態では存在しないことを意味する。遺伝子の破壊は、その遺伝子全体を削除することの他、該遺伝子の一部の削除、該遺伝子に他の配列を挿入する、該遺伝子中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する等により行うことができる。
態様Aにおける(a)組換えBDVゲノムのcDNAは、ボルナ病ウイルスゲノム(BDVゲノム)における少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子が、該BDVゲノムにおける順序と同じ順序で配置され、かつ、該BDVゲノムにおけるG遺伝子が破壊された配列において、外来性遺伝子と前記G遺伝子とは異なる遺伝子型を有する鳥ボルナウイルスゲノム(ABVゲノム)のG遺伝子(以降、G’遺伝子と記載することもある)が挿入された配列を有する。
ここで、遺伝子が破壊されたとは、通常、該遺伝子が蛋白質(例えばG遺伝子であればG蛋白質)をコードすることができる形態では存在しないことを意味する。遺伝子の破壊は、その遺伝子全体を削除することの他、該遺伝子の一部の削除、該遺伝子に他の配列を挿入する、該遺伝子中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する等により行うことができる。
本発明におけるBDVゲノムとしては、態様Aにおける場合も含めて、ボルナウイルス科(Bornaviridae)ボルナウイルス属(Bornavirus)哺乳類1ボルナウイルス(Mammalian 1 bornavirus)に属するボルナウイルス又はその変異株の遺伝子であればよい。哺乳類1ボルナウイルス(Mammalian 1 bornavirus)には、ボルナ病ウイルス1(Borna disease virus 1:BoDV-1)、ボルナ病ウイルス2(Borna disease virus 2:BoDV-2)等が含まれる。具体的には、例えば、He80、H1766、StrainV、huP2br等のウイルス株や、No/98、Bo/04w、HOT6の変異株を用いることができる。これらのゲノム配列は、例えば、以下から入手可能である。
He80;GenBank Accession# L27077, Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C. Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994).
H1766;GenBank Accession# AJ311523, Pleschka,S., Staeheli,P., Kolodziejek,J., Richt,J.A., Nowotny,N. and Schwemmle,M. Conservation of coding potential and terminal sequences in four different isolates of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 82 (PT 11), 2681-2690 (2001).
Strain V;GenBank Accession# U04608, Briese,T., Schneemann,A., Lewis,A.J., Park,Y.S., Kim,S., Ludwig,H. and Lipkin,W.I. Genomic organization of Borna disease virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (10), 4362-4366 (1994).
huP2br;GenBank Accession# AB258389, Nakamura,Y., Takahashi,H., Shoya,Y., Nakaya,T., Watanabe,M., Tomonaga,K., Iwahashi,K., Ameno,K., Momiyama,N., Taniyama,H., Sata,T., Kurata,T., de la Torre,J.C., Ikuta,K. Isolation of Borna disease virus from human brain tissue, J. Virol 74 (2000) 4601-4611.
No/98;GenBank Accession# AJ311524, Nowotny,N. and Kolodziejek,J. Isolation and characterization of a new subtype of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 74, 5655-5658 (2000).
Bo/04w;GenBank Accession# AB246670, Watanabe,Y., Ibrahim,M.S., Hagiwara,K., Okamoto,M., Kamitani,W., Yanai,H., Ohtaki,N., Hayashi,Y., Taniyama,H., Ikuta,K. and Tomonaga,K. Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility. Microbes and Infection 9 (2007) 417-427.
He80;GenBank Accession# L27077, Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C. Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994).
H1766;GenBank Accession# AJ311523, Pleschka,S., Staeheli,P., Kolodziejek,J., Richt,J.A., Nowotny,N. and Schwemmle,M. Conservation of coding potential and terminal sequences in four different isolates of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 82 (PT 11), 2681-2690 (2001).
Strain V;GenBank Accession# U04608, Briese,T., Schneemann,A., Lewis,A.J., Park,Y.S., Kim,S., Ludwig,H. and Lipkin,W.I. Genomic organization of Borna disease virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (10), 4362-4366 (1994).
huP2br;GenBank Accession# AB258389, Nakamura,Y., Takahashi,H., Shoya,Y., Nakaya,T., Watanabe,M., Tomonaga,K., Iwahashi,K., Ameno,K., Momiyama,N., Taniyama,H., Sata,T., Kurata,T., de la Torre,J.C., Ikuta,K. Isolation of Borna disease virus from human brain tissue, J. Virol 74 (2000) 4601-4611.
No/98;GenBank Accession# AJ311524, Nowotny,N. and Kolodziejek,J. Isolation and characterization of a new subtype of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 74, 5655-5658 (2000).
Bo/04w;GenBank Accession# AB246670, Watanabe,Y., Ibrahim,M.S., Hagiwara,K., Okamoto,M., Kamitani,W., Yanai,H., Ohtaki,N., Hayashi,Y., Taniyama,H., Ikuta,K. and Tomonaga,K. Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility. Microbes and Infection 9 (2007) 417-427.
また、本発明におけるABVゲノムとしては、態様Aにおける場合も含めて、ボルナウイルス科(Bornaviridae)ボルナウイルス属(Bornavirus)に属する鳥類に感染するボルナウイルス又はその変異株の遺伝子であればよい。鳥ボルナウイルスは遺伝的多様性に富んでおり、例えば、オウム目1ボルナウイルス(Psittaciform 1 bornavirus)としてオウムボルナウイルス1(Parrot bornavirus 1:PaBV-1)、オウムボルナウイルス2(Parrot bornavirus 2:PaBV-2)、オウムボルナウイルス3(Parrot bornavirus 3:PaBV-3)、オウムボルナウイルス4(Parrot bornavirus 4:PaBV-4)、オウムボルナウイルス7(Parrot bornavirus 7:PaBV-7)等;オウム目2ボルナウイルス(Psittaciform 2 bornavirus)としてオウムボルナウイルス5(Parrot bornavirus 5:PaBV-5)等;スズメ目1ボルナウイルス(Passeriform 1 bornavirus)としてカナリアボルナウイルス1(Canary bornavirus 1:CnBV-1)、カナリアボルナウイルス2(Canary bornavirus 2:CnBV-2)、カナリアボルナウイルス3(Canary bornavirus 3:CnBV-3)等;スズメ目2ボルナウイルス(Passeriform 2 bornavirus)としてカエデチョウボルナウイルス1(Estrildid finch bornavirus 1:EsBV-1)等;水鳥1ボルナウイルス(Waterbird 1 bornavirus)として水鳥ボルナウイルス1(Aquatic bird bornavirus 1:ABBV-1)、水鳥ボルナウイルス2(Aquatic bird bornavirus 2:ABBV-2)等が含まれる。また、前記以外に、オウムボルナウイルス6(Parrot bornavirus 6:PaBV-6)、オウムボルナウイルス8(Parrot bornavirus 8:PaBV-8)、キンバラボルナウイルス1(Munia bornavirus 1:MuBV-1)等を挙げることができる。前記したABVは、系統的には、オウム目2ボルナウイルス、スズメ目1ボルナウイルス、スズメ目2ボルナウイルス、水鳥1ボルナウイルス、水鳥2ボルナウイルスはClade2に、オウム目1ボルナウイルスはClade3に分類することもできる(Komorizono Rら. Microbiol Immunol 60:437-441 (2016)参照)。これらのABVとしては、具体的には、例えば、PaBV-1, PaBV-2, PaBV-3, PaBV-4, PaBV-5, CnBV-1, CnBV-2, EsBV-1, ABBV-1, ABBV-2, MuBV-1等のウイルス株や、これらの変異株を用いることができる。これらのゲノム配列は、例えば、国際塩基配列データベースから以下のアクセッション番号で入手可能である。PaBV-1:GU249595、PaBV-2:EU781967、PaBV-3:FJ169440、PaBV-4:JN014948、PaBV-7:JX065210、PaBV-5:KR612223、CnBV-1:KC464471、CnBV-2:KC464478、CnBV-3:KC595273、EsBV-1:KF680099、ABBV-1:KF680099、ABBV-2:KJ756399、PaBV-6:FJ794743、PaBV-8:KJ950625。
なお、BDVゲノム及びABVゲノムは、ボルナウイルスとしての機能が保持されている限り、これらのゲノム配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、1乃至数個(通常1~5個、好ましくは1~3個、さらに好ましくは1~2個)であってよい。
態様Aにおける組換えBDVゲノムは、前記したBDVゲノムにおいて、少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子が該BDVゲノムにおける順序と同じ順序で配置され、かつ、G遺伝子が破壊された配列に、ABVゲノムのG遺伝子と任意の外来性遺伝子が挿入されているのであれば、BDVゲノムにおけるM遺伝子が更に配置されたものであってもよい。その場合、前記M遺伝子はBDVゲノムにおける順序と同じ順序で配置される。
また、本発明におけるABVゲノムのG遺伝子としては、態様Aにおける場合も含めて、組換え前のBDVゲノムにおけるG遺伝子と遺伝子型が異なるものであればよく、組換え前のBDVゲノムの種類に応じて適宜設定することができる。具体的には、例えば、組換え前のBDVゲノムとしてボルナ病ウイルス1(BoDV-1)のゲノムを用いる場合には、ABVゲノムのG遺伝子としては、Clade2およびClade3のボルナウイルス属に属するABVのG遺伝子を使用できる。具体的には、オウムボルナウイルス2(PaBV-2)のG遺伝子、オウムボルナウイルス4(PaBV-4)のG遺伝子、オウムボルナウイルス5(PaBV-5)のG遺伝子、キンバラボルナウイルス1(MuBV-1)のG遺伝子などを1種単独で又は2種以上組み合わせて用いることができる。また、ABVゲノムのG遺伝子が本来の機能を保持しているのであれば、該G遺伝子にBDVゲノムにおけるG遺伝子の一部が融合したもの(キメラ遺伝子)も用いることができる。
ABVゲノムのG遺伝子の挿入箇所としては、特に限定されず、例えば、態様Aの場合、BDVゲノムにおけるP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内、組換えBDVゲノムがBDVゲノムにおけるM遺伝子を該BDVゲノムにおける順序と同じ順序で有する場合には、M遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内、BDVゲノムにおけるL遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内などが挙げられる。
本発明における外来性遺伝子は、その種類や長さは特に限定されず、目的に応じて所望の遺伝子を用いることができる。例えば、蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子のcDNA;siRNA、short hairpin RNA (shRNA)、microRNA (miRNA)をコードするcDNA;RNAアプタマーをコードするcDNA等を用いることができる。本発明のウイルスベクターにおいては、1又は2以上の外来性遺伝子を使用することができる。
外来性遺伝子の挿入箇所としては、特に限定されないが、例えば、態様Aの場合、BDVゲノムにおけるP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に挿入されることが好ましい。また、組換えBDVゲノムがBDVゲノムにおけるM遺伝子を該ゲノムにおける順序と同じ順序で有する場合には、P遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域内に挿入されることが好ましい。外来性遺伝子がこのような箇所に挿入されていることにより、ウイルスベクターの組換えウイルス生産性、すなわち該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスの複製効率をより高くすることができるため、効率よく組換えウイルスを産生することができる。また、該ウイルスベクターから産生(複製)される組換えウイルスは、細胞に導入した場合に外来性遺伝子を効率よく発現できるものとなる。従って、本発明のウイルスベクターを細胞に導入した際、又は該ウイルスベクターから産生される組換えBDV粒子を細胞に感染させた際に、任意の外来性遺伝子が効率よく細胞に導入される。すなわち、外来性遺伝子が細胞内において効率よく発現されることになる。図2(a)に示すように、野生型のBDVゲノムのcDNAにおいて、P遺伝子のORFの下流に連結する非翻訳領域(すなわちBDVゲノムにおけるP遺伝子とM遺伝子との間の非翻訳領域)(例えば、配列番号1にそのcDNA配列が示されるBDVゲノムの塩基の番号で1875~1895(すなわち配列番号1の1875~1895番の塩基))には、P遺伝子の停止シグナル配列(配列番号1の塩基の番号で1875~1882)及びM遺伝子の開始シグナル配列(配列番号1の塩基の番号で1875~1890)が存在する。P遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域(例えば、配列番号1の塩基の番号で1878~1892の間)における外来性遺伝子の挿入部位としては、P遺伝子の停止シグナル配列及び/又はM遺伝子の開始シグナル配列を含まない領域が好ましく、P遺伝子の停止シグナル配列及びM遺伝子の開始シグナル配列を含まない領域がより好ましく、例えば、配列番号1にそのcDNA配列が示されるBDVゲノムであれば、配列番号1の塩基の番号で1890と1891の間等が更に好ましい。なお、ABVゲノムのG遺伝子の挿入箇所と外来性遺伝子の挿入箇所が同じ範囲内となる場合には、ABVゲノムのG遺伝子と外来性遺伝子のいずれが上流にあってもよく、ABVゲノムのG遺伝子、外来性遺伝子の順に、あるいは、外来性遺伝子、ABVゲノムのG遺伝子の順に挿入されることができる。外来性遺伝子が2以上ある場合は、別々に挿入されても、同一箇所に挿入されてもよい。
また、外来性遺伝子の挿入においては、その両側又は片側(好ましくは、両側)に制限酵素サイトを含むことができる。制限酵素サイトを有すると、外来性遺伝子をBDVゲノムの配列中に容易に組み込みやすくなると共に、外来性遺伝子の蛋白質への翻訳効率が上昇するため好ましい。本発明において、外来性遺伝子の両側又は片側に配置することができる制限酵素サイトとしては、例えば、外来性遺伝子の3’末端側については、Bst BIサイト、Pac Iサイト、Sse8387 Iサイト、Swa Iサイト、Kpn Iサイト等が挙げられ、Bst BIサイトが好ましい。外来性遺伝子の5’末端側については、Pac Iサイト、Bst BIサイト、Sse8387 Iサイト、Swa Iサイト、Kpn Iサイト等が挙げられ、Pac Iサイトが好ましい。
また、態様Aにおける組換えBDVゲノムがM遺伝子を含む場合には、該組換えBDVゲノムのcDNAは、外来性遺伝子(及び必要に応じてその両側又は片側に配置される制限酵素サイト)とP遺伝子のORFとの間、及び外来性遺伝子(及び必要に応じてその両側又は片側に配置される制限酵素サイト)とM遺伝子のORFとの間にそれぞれ、P遺伝子の停止シグナル配列及びM遺伝子の開始シグナル配列(taaaaaaatcgaatca(配列番号9))を含む配列が存在することが好ましい。本発明における組換えBDVゲノムのcDNAにおいては、例えば、図2(b)にあるような配列で任意の外来性遺伝子が挿入されていることがより好ましい。図2(b)には、一例としてM遺伝子を含む組換えBDVゲノムのcDNAが示されている。M遺伝子が削除されている場合にも、図2(b)に示されるように、外来性遺伝子の下流にP遺伝子の停止シグナル配列及びM遺伝子の開始シグナル配列(配列番号9)を含む配列を有することが好ましい。M遺伝子が削除されている場合、図2(b)に示される外来性遺伝子の下流のP遺伝子の停止シグナル配列及びM遺伝子の開始シグナル配列は、外来性遺伝子の停止シグナル及びL遺伝子の開始シグナルとして機能する。なお、図2(b)では、一例として外来性遺伝子の3’末端側にBst BIサイト、外来性遺伝子の5’末端側にPac Iサイトをそれぞれ挿入した場合を示しているが、外来性遺伝子の両側に配置する制限酵素サイトは、これらに限定されるものではない。
かくして、態様Aの組換えBDVゲノムにおける各遺伝子の配置を設定することができる。
このような組換えBDVゲノムのcDNAとしては、前記したように各遺伝子が配置された配列をコードするcDNAの他、前記したように各遺伝子が配置された配列を有するRNAのcDNA、前記したように各遺伝子が配置された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAを用いることができる。以下に、態様Aの(a)組換えBDVゲノムのcDNAの好適態様を図3~5に模式的に示す。
図3(a)は、BDVゲノムにおいてG遺伝子が破壊(削除)された配列を有し、かつP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域にG’遺伝子、外来性遺伝子(図3中ではGFP)がこの順に挿入された配列を有する組換えBDVゲノムのcDNAである(態様1-1)。図3(b)は、態様1-1においてM遺伝子が破壊(削除)された態様を示す(態様1-2)。
図4(a)は、BDVゲノムにおいてG遺伝子が破壊(削除)された配列を有し、かつP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子(図4中ではGFP)が、M遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内にG’遺伝子が挿入された配列を有する組換えBDVゲノムのcDNAである(態様2-1)。図4(b)は、態様2-1においてM遺伝子が破壊(削除)された態様であり、この場合、P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域に外来性遺伝子、G’遺伝子がこの順に挿入された配列を示す(態様2-2)。
図5(a)は、BDVゲノムにおいてG遺伝子が破壊(削除)された配列を有し、かつP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子(図5中ではGFP)が、L遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内にG’遺伝子が挿入された配列を有する組換えBDVゲノムのcDNAである(態様3-1)。図5(b)は、態様3-1においてM遺伝子が破壊(削除)された態様を示す(態様3-2)。
なお、天然型BDVゲノムにおいては、L遺伝子はG遺伝子により分断されているが、態様Aにおける組換えBDVゲノムにおいてはG遺伝子が削除されることもあるため、L遺伝子のイントロンも削除されて、L遺伝子の翻訳領域(ORF)が連結されていてもよい。これにより、組換えウイルスの複製能力、すなわち細胞内での外来性遺伝子の発現効率がより向上する。また、L遺伝子のイントロンを削除することにより、より大きな外来性遺伝子を挿入することが可能となる。L遺伝子のイントロンの除去は、公知の方法により行うことができる。
また、態様Aの組換えBDVゲノムにおいてM遺伝子が削除されている場合には、天然型BDVゲノムからG遺伝子とM遺伝子が削除されることになるため、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスの病原性がより低減され、安定性がより高いものとなる。
組換えBDVゲノムのcDNAは、当該ウイルスゲノム情報に基づいて調製することができる。例えば、RNAゲノムから、逆転写酵素を使用してcDNAを調製することができる。また、所望の配列に基づいて、DNA合成機を用いて化学合成することもできる。あるいは、公知のPCR等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。PCR、プライマーの調製等の操作は、公知の遺伝子工学的手法(遺伝子操作技術)により行うことができる。
(b)リボザイムをコードするDNA
リボザイムとしては、(a)組換えウイルスのcDNAから転写された任意の外来性遺伝子を切断することができる配列のものであればよい。(b)としては、例えば、ハンマーヘッドリボザイム(HamRz)、δ型肝炎ウイルスリボザイム(HDVRz)、ヘアピンリボザイム、人工リボザイム等のリボザイムをコードするcDNA等のDNAが挙げられる。また、リボザイム活性を有する限り、上記リボザイムの改変型リボザイムをコードするcDNA等のDNAも使用することができる。改変型リボザイムとしては、共通配列を有し、1~数個(数個とは、例えば、10個、好ましくは5個、より好ましくは3個、更に好ましくは2個である)の塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列からなり、かつリボザイムとして機能するポリヌクレオチド等が挙げられる。中でも、本発明におけるリボザイムとしては、ハンマーヘッドリボザイム(HamRz)、δ型肝炎ウイルスリボザイム(HDVRz)が好ましい。また、(a)組換えBDVゲノムのcDNAの上流、すなわち3’末端側に(b1)HamRzをコードするDNA(好ましくはcDNA)が配置され、かつ、該(a)の下流、すなわち5’末端側に(b2)HDVRzをコードするDNA(好ましくはcDNA)配列が配置されていることがより好ましい。これにより、細胞における外来性遺伝子の発現効率が向上する。
リボザイムとしては、(a)組換えウイルスのcDNAから転写された任意の外来性遺伝子を切断することができる配列のものであればよい。(b)としては、例えば、ハンマーヘッドリボザイム(HamRz)、δ型肝炎ウイルスリボザイム(HDVRz)、ヘアピンリボザイム、人工リボザイム等のリボザイムをコードするcDNA等のDNAが挙げられる。また、リボザイム活性を有する限り、上記リボザイムの改変型リボザイムをコードするcDNA等のDNAも使用することができる。改変型リボザイムとしては、共通配列を有し、1~数個(数個とは、例えば、10個、好ましくは5個、より好ましくは3個、更に好ましくは2個である)の塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列からなり、かつリボザイムとして機能するポリヌクレオチド等が挙げられる。中でも、本発明におけるリボザイムとしては、ハンマーヘッドリボザイム(HamRz)、δ型肝炎ウイルスリボザイム(HDVRz)が好ましい。また、(a)組換えBDVゲノムのcDNAの上流、すなわち3’末端側に(b1)HamRzをコードするDNA(好ましくはcDNA)が配置され、かつ、該(a)の下流、すなわち5’末端側に(b2)HDVRzをコードするDNA(好ましくはcDNA)配列が配置されていることがより好ましい。これにより、細胞における外来性遺伝子の発現効率が向上する。
HamRzの塩基配列は、Yanai et al., Microbes and Infections 8 (2006) 1522-1529、Mercier et al., J. Virol. 76 (2002) 2024-2027及びInoue et al., J. Virol. Methods 107 (2003) 229-236等に記載されている。
HDVRzの塩基配列は、Ferre-D'Amare,A.R., Zhou,K. and Doudna,J.A. Crystal structure of a hepatitis delta virus ribozyme. Nature 395 (6702), 567-574 (1998)等に記載されている。
本発明においては、これらの文献に記載されているHamRzの塩基配列をコードするcDNA及びHDVRzの塩基配列をコードするcDNAを用いることができる。本発明における好ましいHamRzの塩基配列及びHDVRzの塩基配列を以下に示す。
HamRz:
5’-UUGUAGCCGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUAUAGGAAAGGAAUUCCUAUAGUCAGCGCUACAACAAA-3’
(配列番号2)
HDVRz:
5’-GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACACCAUUGCACUCCGGUGGCGAAUGGGAC-3’
(配列番号3)
HDVRzの塩基配列は、Ferre-D'Amare,A.R., Zhou,K. and Doudna,J.A. Crystal structure of a hepatitis delta virus ribozyme. Nature 395 (6702), 567-574 (1998)等に記載されている。
本発明においては、これらの文献に記載されているHamRzの塩基配列をコードするcDNA及びHDVRzの塩基配列をコードするcDNAを用いることができる。本発明における好ましいHamRzの塩基配列及びHDVRzの塩基配列を以下に示す。
HamRz:
5’-UUGUAGCCGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUAUAGGAAAGGAAUUCCUAUAGUCAGCGCUACAACAAA-3’
(配列番号2)
HDVRz:
5’-GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACACCAUUGCACUCCGGUGGCGAAUGGGAC-3’
(配列番号3)
(c)プロモーター配列
本発明における(c)プロモーター配列としては、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列、RNAポリメラーゼI系のプロモーター配列、T7ポリメラーゼ系のプロモーター配列が挙げられる。中でもRNAポリメラーゼII系のプロモーター配列が好ましい。RNAポリメラーゼII系のプロモーターとしては、CMVプロモーター、CAGGSプロモーターが挙げられる。中でも、CAGGSプロモーターが好ましい。このようなプロモーター配列は、例えば、J.A. Sawicki, R.J. Morris, B. Monks, K. Sakai, J. Miyazaki, A composite CMV-IE enhancer/b-actin promoter is ubiquitously expressed in mouse cutaneous epithelium, Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。
本発明における(c)プロモーター配列としては、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列、RNAポリメラーゼI系のプロモーター配列、T7ポリメラーゼ系のプロモーター配列が挙げられる。中でもRNAポリメラーゼII系のプロモーター配列が好ましい。RNAポリメラーゼII系のプロモーターとしては、CMVプロモーター、CAGGSプロモーターが挙げられる。中でも、CAGGSプロモーターが好ましい。このようなプロモーター配列は、例えば、J.A. Sawicki, R.J. Morris, B. Monks, K. Sakai, J. Miyazaki, A composite CMV-IE enhancer/b-actin promoter is ubiquitously expressed in mouse cutaneous epithelium, Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。
態様Aのウイルスベクターにおける(a)、(b)及び(c)の配置としては、(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されていれば特に限定はないが、好ましい態様としては、(a)の上流に(b1)ハンマーヘッドリボザイムをコードするcDNAが配置され、(a)の下流に(b2)δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするcDNA配列が配置されている態様が挙げられる。また、(a)及び(b)が(c)RNAポリメラーゼII系のプロモーターの下流に配置されている態様が挙げられる。またさらに、(a)の上流に(b1)ハンマーヘッドリボザイムをコードするcDNAが配置され、(a)の下流に(b2)δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするcDNA配列が配置され、かつ、(a)及び(b1)が(c)RNAポリメラーゼII系のプロモーターの下流に配置されている態様が挙げられる。
(d)その他の塩基配列
本発明のウイルスベクターは、態様Aの場合も含めて、前記(a)、(b)及び(c)以外に、その他の塩基配列として、SV40ウイルス複製開始点/プロモーター領域配列の一部又は全部の配列を含むことができる。また、ウイルスベクターがSV40ウイルス複製開始点/プロモーター領域配列の一部又は全部の配列を含む場合には、該配列は(a)及び(b)の下流に配置されていることが好ましい。SV40ウイルスDNAの複製開始点/プロモーター領域配列の一部としては、SV40複製開始点/プロモーター領域内の5’側の113塩基からなる断片が好適である。
SV40ウイルス複製開始点/プロモーター領域配列(配列番号4)は、例えば、D.A. Dean, B.S. Dean, S. Muller, L.C. Smith, Sequence requirements for plasmid nuclear import, Exp. Cell. Res. 253 (1999) 713-722等に記載されている。
本発明のウイルスベクターは、態様Aの場合も含めて、前記(a)、(b)及び(c)以外に、その他の塩基配列として、SV40ウイルス複製開始点/プロモーター領域配列の一部又は全部の配列を含むことができる。また、ウイルスベクターがSV40ウイルス複製開始点/プロモーター領域配列の一部又は全部の配列を含む場合には、該配列は(a)及び(b)の下流に配置されていることが好ましい。SV40ウイルスDNAの複製開始点/プロモーター領域配列の一部としては、SV40複製開始点/プロモーター領域内の5’側の113塩基からなる断片が好適である。
SV40ウイルス複製開始点/プロモーター領域配列(配列番号4)は、例えば、D.A. Dean, B.S. Dean, S. Muller, L.C. Smith, Sequence requirements for plasmid nuclear import, Exp. Cell. Res. 253 (1999) 713-722等に記載されている。
本発明のウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、さらに、蛋白質の発現に有利である1又は複数の因子、例えば、エンハンサー、アクティベーター(例えばトランス作用因子)、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする1又は複数の核酸配列も含み得る。また、本発明のウイルスベクターは、選択された細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。
本発明のウイルスベクターは、線状DNAであっても環状DNAであってもよいが、細胞に導入する際には環状であることが好ましい。環状のウイルスベクターとしては、例えば、態様Aのウイルスベクターの必須の配列である上記(a)、(b)及び(c)のDNA、並びに必要に応じて含まれる上記(d)のDNAが、上述した所定の順番で、市販のプラスミドベクター中に配置されているもの等が挙げられる。市販のプラスミドベクターとしては、ウイルスベクターを導入する細胞内で自己複製可能なものであればよく、例えば、pBluescript SKII(-)、pCAGGS、pCXN2、pCDNA3.1等が挙げられる。
2.ウイルスベクターの作製方法
本発明のウイルスベクターの作製方法としては特に限定されず、自体公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。具体的には、例えば、態様Aのウイルスベクターの場合、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法において、CAT遺伝子をBDVのゲノム配列に置き換え、さらにP遺伝子の下流に連結する非翻訳領域(P遺伝子とM遺伝子との間の非翻訳領域)内に目的とする外来性遺伝子を挿入して得られたウイルスベクターを鋳型にして、PCR等によりG遺伝子に欠損変異等を挿入することで、G遺伝子が欠損したウイルスベクター(G遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターともいう)を作製する。ついで、得られたG遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターの所望の領域に、ABVゲノムのG遺伝子を挿入することによって、本発明の自己複製型(持続感染型)のウイルスベクターを作製することができる。上記方法により作製されるウイルスベクターとしては、例えば、ABVゲノムのG遺伝子を外来性遺伝子の上流に挿入した場合、(a)組換えウイルスRNAのcDNAとして、BDVゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に、ABVゲノムのG遺伝子と外来性遺伝子をこの順に挿入した組換えBDVゲノムのcDNA(例えば、図3(a)に模式的に示される構造を有する組換えウイルスのcDNA)を有するものである。なお、G遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターの作製において、好ましくは、L遺伝子のイントロン部分も同様にPCRにより削りとることができる。また、M遺伝子についても、同様に、G遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターを鋳型にPCR等により欠損させて作製することができる(G遺伝子及びM遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターともいう)。
本発明のウイルスベクターの作製方法としては特に限定されず、自体公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。具体的には、例えば、態様Aのウイルスベクターの場合、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法において、CAT遺伝子をBDVのゲノム配列に置き換え、さらにP遺伝子の下流に連結する非翻訳領域(P遺伝子とM遺伝子との間の非翻訳領域)内に目的とする外来性遺伝子を挿入して得られたウイルスベクターを鋳型にして、PCR等によりG遺伝子に欠損変異等を挿入することで、G遺伝子が欠損したウイルスベクター(G遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターともいう)を作製する。ついで、得られたG遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターの所望の領域に、ABVゲノムのG遺伝子を挿入することによって、本発明の自己複製型(持続感染型)のウイルスベクターを作製することができる。上記方法により作製されるウイルスベクターとしては、例えば、ABVゲノムのG遺伝子を外来性遺伝子の上流に挿入した場合、(a)組換えウイルスRNAのcDNAとして、BDVゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に、ABVゲノムのG遺伝子と外来性遺伝子をこの順に挿入した組換えBDVゲノムのcDNA(例えば、図3(a)に模式的に示される構造を有する組換えウイルスのcDNA)を有するものである。なお、G遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターの作製において、好ましくは、L遺伝子のイントロン部分も同様にPCRにより削りとることができる。また、M遺伝子についても、同様に、G遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターを鋳型にPCR等により欠損させて作製することができる(G遺伝子及びM遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターともいう)。
ウイルスベクターが線状の場合には、上記環状のウイルスベクターを、(a)組換えBDVゲノムのcDNA領域、(c)プロモーター配列の領域、及びその他蛋白質発現に必要なシグナル配列領域以外の領域で1箇所切断する制限酵素を該ベクターの種類にあわせて適宜選択し、該制限酵素により環状のウイルスベクターを切断することにより線状のウイルスベクターを作製することができる。
本発明のウイルスベクターに含まれる外来性遺伝子を目的細胞に導入する方法としては、該ウイルスベクターを後述するヘルパープラスミドと共に目的細胞に導入する方法、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを目的細胞に感染させる方法があるが、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを用いる方法が好ましい。本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、野生型BDVゲノムの代わりに上記ウイルスベクターにコードされるRNAを有する組換え型BDVである。
3.組換えウイルス
上記ウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルスも、本発明の1つである。好ましくは、ウイルスベクターにコードされるRNA、並びに態様Aのウイルスベクターを用いた場合はBDVのN蛋白質、BDVのP蛋白質、BDVのL蛋白質及びABVのG蛋白質を含む組換えウイルスである。本発明の組換えウイルスは、上記組換えBDVゲノムを含むことにより、細胞に感染後、持続的に外来性遺伝子を発現することができる持続感染型の組換えウイルスである。組換えウイルスは、所望によりBDVのM蛋白質を有していてもよい。
上記ウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルスも、本発明の1つである。好ましくは、ウイルスベクターにコードされるRNA、並びに態様Aのウイルスベクターを用いた場合はBDVのN蛋白質、BDVのP蛋白質、BDVのL蛋白質及びABVのG蛋白質を含む組換えウイルスである。本発明の組換えウイルスは、上記組換えBDVゲノムを含むことにより、細胞に感染後、持続的に外来性遺伝子を発現することができる持続感染型の組換えウイルスである。組換えウイルスは、所望によりBDVのM蛋白質を有していてもよい。
本発明の組換えウイルスは、例えば、上記ウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、例えば、BDVゲノムのN遺伝子、P遺伝子、L遺伝子及びABVゲノムのG遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含む方法により作製することができる。また、本発明においては、例えば、態様Aのウイルスベクターを用いて組換えウイルスとして上記した組換えBDVゲノムを含むものが産生されるのであれば、組換えBDVゲノムにおける各遺伝子を個別にヘルパープラスミドにより導入して産生してもよい。例えば、ヘルパープラスミドとして、BDVゲノムのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と共に、ABVゲノムのG遺伝子を発現するプラスミドを用いることができる。すなわち、上記ウイルスベクターとして、ABVゲノムのG遺伝子を組み入れる前のG遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、BDVゲノムのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群とABVゲノムのG遺伝子を発現するプラスミドとをin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含む方法により作製することができる。このような組換えウイルスの作製方法も、本発明の1つである。このような方法により、in vitroで組換えウイルスを産生することができる。ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入するin vitroの細胞は、通常、培養細胞である。
また、態様AのウイルスベクターにおいてG遺伝子及びM遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターを用いる場合には、ヘルパープラスミドとして、更に、BDVゲノムのM遺伝子を発現するプラスミドを細胞に導入することが好ましい。すなわち、G遺伝子及びM遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターを用いる場合には、上記BDVゲノムのN遺伝子、P遺伝子、L遺伝子及びABVゲノムのG遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と共に、あるいは、BDVゲノムのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群とABVゲノムのG遺伝子を発現するプラスミドと共に、BDVゲノムのM遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入することができる。
ヘルパープラスミドは、BDVゲノムのN遺伝子、P遺伝子、L遺伝子及びM遺伝子、並びにABVゲノムのG遺伝子それぞれを発現することができるものであればよく、これらの遺伝子の2つ以上が1つのプラスミドに含まれていてもよく、これらの遺伝子がそれぞれ別のプラスミドに含まれていてもよい。例えば、BDVゲノムのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミドとしては、下記(1)~(4)のいずれかのプラスミド又はプラスミド群等が好適に用いられる。また、ABVゲノムのG遺伝子を発現するプラスミドとしては、下記(1)~(4)において各項の1又は2以上のプラスミドにABVゲノムのG遺伝子が適宜組み込まれたものであっても、ABVゲノムのG遺伝子を個別に発現するプラスミドであってもよい。本発明で用いられるヘルパープラスミドとしては、(1)~(3)のいずれかのプラスミド(群)とABVゲノムのG遺伝子を発現するプラスミドのセット、あるいは(1)~(3)に記載のいずれかのプラスミドにABVゲノムのG遺伝子が組み込まれたプラスミドを含む(1)~(3)のいずれかのプラスミド(群)が好ましい。
(1)BDVゲノムのN遺伝子を発現するプラスミド、BDVゲノムのP遺伝子を発現するプラスミド及びBDVゲノムのL遺伝子を発現するプラスミド
(2)BDVゲノムのN遺伝子及びP遺伝子を発現するプラスミド、並びにBDVゲノムのL遺伝子を発現するプラスミド
(3)BDVゲノムのN遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド、並びにBDVゲノムのP遺伝子を発現するプラスミド
(4)BDVゲノムのN遺伝子、L遺伝子及びP遺伝子を発現するプラスミド
(1)BDVゲノムのN遺伝子を発現するプラスミド、BDVゲノムのP遺伝子を発現するプラスミド及びBDVゲノムのL遺伝子を発現するプラスミド
(2)BDVゲノムのN遺伝子及びP遺伝子を発現するプラスミド、並びにBDVゲノムのL遺伝子を発現するプラスミド
(3)BDVゲノムのN遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド、並びにBDVゲノムのP遺伝子を発現するプラスミド
(4)BDVゲノムのN遺伝子、L遺伝子及びP遺伝子を発現するプラスミド
また、BDVゲノムのM遺伝子を発現するヘルパープラスミドとしては、BDVゲノムのM遺伝子を発現するプラスミドの他、BDVゲノムのN遺伝子、L遺伝子、P遺伝子及びABVゲノムのG遺伝子からなる群より選択される1種以上の遺伝子とBDVゲノムのM遺伝子を発現するプラスミドを用いることもできる。
ヘルパープラスミドは、組換えBDVゲノムの複製に必要なウイルス蛋白質を提供するものであり、ウイルスベクターと共にヘルパープラスミドを細胞に導入することにより、感染性のある組換えウイルスを産生することができる。また、本発明の組換えウイルスの作製方法に用いられるウイルスベクター及びその好ましい態様としては、上述したのと同様である。
本発明におけるヘルパープラスミド(群)は、上記ウイルスベクターと共に細胞に導入された際に、該細胞内でBDVゲノムのN遺伝子、P遺伝子、L遺伝子及びABVゲノムのG遺伝子を発現することができるものであればよい。例えば、BDVゲノムのN遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にBDVゲノムのN遺伝子のcDNAが配置されたプラスミドが好ましい。BDVゲノムのP遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にBDVゲノムのP遺伝子のcDNAが配置されたプラスミドが好ましい。BDVゲノムのL遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にBDVゲノムのL遺伝子のcDNAが配置されたプラスミドを用いることが好ましい。ABVゲノムのG遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にABVゲノムのG遺伝子のcDNAが配置されたプラスミドを用いることが好ましい。BDVゲノムのM遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にBDVゲノムのM遺伝子のcDNAが配置されたプラスミドを用いることが好ましい。また、2以上の遺伝子を発現するプラスミドは、プロモーター配列の下流に所望の遺伝子のcDNAを所望の順で配置されたプラスミドを用いることができる。
また、外殻遺伝子にコードされる外殻蛋白質は、通常膜貫通型蛋白質であり、そのアミノ酸配列中に、細胞外に位置する領域(細胞外配列)、細胞膜貫通領域(細胞膜貫通配列)、及び細胞内に位置する領域(細胞内配列)を含む。本発明においては、ABVゲノムのG遺伝子としては、ABVゲノムのG蛋白質の細胞内配列、細胞膜貫通配列及び細胞外配列を有するものが好ましいが、少なくとも、ABVゲノムのG蛋白質の細胞内配列を含むものであればよい。細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする外殻遺伝子をヘルパープラスミドに用いると、遺伝子が由来するウイルスの種類により、産生されるウイルスの細胞指向性を変化させることができる。よって、本発明においては、ABVゲノムのG遺伝子を発現するヘルパープラスミドは、本発明の効果を損なわない範囲内で、その他の外殻遺伝子を発現するものであってもよい。具体的には、例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス等の宿主細胞膜を外殻として利用する全てのエンベロープウイルスの外殻遺伝子の他、BDVもしくはカワリリスボルナウイルス(VSBV-1)のG遺伝子の一部が含まれていてもよい。また、例えば、上皮系、呼吸器系細胞等に組換えウイルスを感染させる場合には、上皮系、呼吸器系細胞等への指向性が高いウイルス(例えば麻疹ウイルス、センダイウイルス、水疱性口内炎ウイルス等)の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつABVのG蛋白質の細胞内配列をコードする、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いることが好ましい。
BDVゲノムのN遺伝子のcDNA、P遺伝子のcDNA及びL遺伝子のcDNAは、BDVゲノムのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子それぞれの配列情報に基づいて調製することができる。ABVゲノムのG遺伝子のcDNAは、ABVゲノムのG遺伝子の配列情報の他、公知の外殻遺伝子の配列情報に基づいて調製することができる。BDVゲノムのM遺伝子のcDNAは、BDVゲノムのM遺伝子の配列情報に基づいて調製することができる。例えば、RNAから、配列逆転写酵素を使用してcDNAを調製することができる。また、RNAの配列に基づき、DNA合成機を用いて化学合成することができる。
BDVゲノムのN遺伝子、P遺伝子、L遺伝子及びM遺伝子としては、例えば、上述したCubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C. Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994)に記載されている配列の遺伝子を、ABVゲノムのG遺伝子としては、例えば、上述した国際塩基配列データベースから以下のアクセッション番号:PaBV-1:GU249595、PaBV-2:EU781967、PaBV-3:FJ169440、PaBV-4:JN014948、PaBV-7:JX065210、PaBV-5:KR612223、CnBV-1:KC464471、CnBV-2:KC464478、CnBV-3:KC595273、EsBV-1:KF680099、ABBV-1:KF680099、ABBV-2:KJ756399、PaBV-6:FJ794743、PaBV-8:KJ950625に記載されている配列の遺伝子をそれぞれ用いることができる。また、これらの遺伝子として、上記の配列に従って合成したRNAを使用することもできる。さらに、BDVゲノムのN、P、L及びM蛋白質、あるいはABVゲノムのG蛋白質それぞれで保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション、PCR法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知の各遺伝子の配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートRT-PCRによって断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法により塩基配列を決定することができる。さらに、本発明における各遺伝子は該遺伝子にコードされる蛋白質が、それぞれ該当する蛋白質が元来有する機能を保持している限り、塩基配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、1乃至数個(1~5個、好ましくは1~3個、さらに好ましくは1~2個)であってよい。
このようなN遺伝子として、例えば、BDVゲノムのN遺伝子と少なくとも約90%、好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつN蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするRNAも、本発明におけるBDVゲノムのN遺伝子として使用できる。また、BDVゲノムのP遺伝子と少なくとも約90%、好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつP蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするRNAも、本発明におけるBDVゲノムのP遺伝子として使用できる。BDVゲノムのL遺伝子と少なくとも約90%、好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつL蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするRNAも、本発明におけるBDVゲノムのL遺伝子として使用できる。ABVゲノムのG遺伝子と少なくとも約90%、好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつG蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするRNAも、本発明におけるABVゲノムのG遺伝子として使用できる。BDVゲノムのM遺伝子と少なくとも約90%、好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつM蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするRNAも、本発明におけるBDVゲノムのM遺伝子として使用できる。配列同一性は、CLUSTAL W ,GCG program, GENETYX,BLAST searchにより決定される。
水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス等のBDV以外のウイルスの外殻遺伝子として、例えば、水疱性口内炎ウイルスはGeneBank,No:J02428.1、狂犬病ウイルスはGeneBank,No:AB044824.1に記載されている配列の遺伝子等を用いることができる。好ましくは、これらの外殻遺伝子中の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする配列を用いる。外殻遺伝子中の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする配列は、Garry CE, Garry RF. Proteomics computational analyses suggest that the bornavirus glycoprotein is a class III viral fusion protein (γ penetrene). Virol J. 145(6), Sep-18(2009)等に記載されている。また、これらの遺伝子として、上記の配列に従って合成したRNAを使用することもできる。さらに、このような外殻遺伝子と少なくとも約90%、好ましくは約95%以上、より好ましくは約98%以上の配列同一性を有し、かつ外殻蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするRNAも、本発明におけるウイルスの外殻遺伝子として使用できる。
ヘルパープラスミドは、細胞に導入する際には線状であっても問題はないが、環状であることが好ましい。環状のヘルパープラスミドは、例えば、本発明におけるヘルパープラスミドの必須の配列であるプロモーター配列及び蛋白質のcDNAが配置された形態で、蛋白質の発現に有利である1又は複数の因子、例えば、エンハンサー、アクティベーター(例えばトランス作用因子)、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする1又は複数の核酸配列も含み得る。また、選択された細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。ヘルパープラスミドは、該ヘルパープラスミドを導入する細胞内で自己複製可能な市販のプラスミドベクターを使用して構築するのが好ましく、市販のプラスミドベクターとしては、例えば、pCAGGS、pCXN2、pCDNA3.1等が挙げられる。ヘルパープラスミドにおけるプロモーター配列は、RNAポリメラーゼII系のプロモーターが好ましい。
これらのヘルパープラスミドは、自体公知の遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、BDVゲノムのN遺伝子を発現するプラスミド、BDVゲノムのP遺伝子を発現するプラスミド及びBDVゲノムのL遺伝子を発現するプラスミドは、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法により作製することができる。
2以上の遺伝子を発現するプラスミドとして、例えば、BDVゲノムのN遺伝子及びP遺伝子を発現するプラスミドとしては、具体的には、BDVゲノムのN遺伝子を発現するプラスミドのN遺伝子のcDNAの下流のユニークな制限酵素配列領域から、N遺伝子のcDNAやプロモーターなどのシグナル配列を切断しない制限酵素を適宜選択し、その制限酵素サイトにBDVゲノムのP遺伝子のcDNAを挿入することで作製することができる。BDVゲノムのN遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミドとしては、例えば、BDVゲノムのN遺伝子を発現するプラスミドのN遺伝子のcDNAの下流のユニークな制限酵素配列領域から、N遺伝子のcDNAやプロモーターなどのシグナル配列を切断しない制限酵素を適宜選択し、その制限酵素サイトにBDVゲノムのL遺伝子のcDNAを挿入することで作製することができる。ただし、N遺伝子のcDNA領域とL遺伝子又はP遺伝子のcDNAが挿入された領域との間の領域にL遺伝子又はP遺伝子の発現を促進するようなプロモーター配列や配列内部リボソーム進入部位などの配列を挿入することも可能である。
ABVゲノムのG遺伝子を発現するプラスミドは、BDVゲノムのN遺伝子、L遺伝子又はP遺伝子を発現するヘルパープラスミドの作製において、例えば、BDVゲノムのN遺伝子のcDNAの代わりにABVゲノムのG遺伝子のcDNAを用いることによって作製することができる。また、BDVのM遺伝子を発現するプラスミドにABVゲノムのG遺伝子を発現させてもよく、当該プラスミドは、例えば、pEF4/myc-His A、B,and C(Invitrogen)に添付の説明書に記載されている方法に従って作製することができる。
ABV以外のウイルスの外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつABVゲノムのG蛋白質の細胞内配列をコードする外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドは、例えば、ABV以外のウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを鋳型に、適当なプライマーを用いてPCRを行なって、任意のウイルス外殻遺伝子の細胞内配列をコードする配列をABVゲノムのG蛋白質の細胞内配列をコードする配列で置換することにより作製することができる。このようなヘルパープラスミドは、例えば、BDVのG蛋白質の細胞内配列をコードする遺伝子配列をABVゲノムのG蛋白質の細胞内配列をコードする配列で置換してもよく、BDVのG蛋白質の細胞内配列をコードする遺伝子配列としては、例えば配列番号1にそのcDNA配列が示されるBDVゲノムでは3712~3747番目の配列(配列番号1の3712~3747番目の塩基)である。
上記のウイルスベクターを細胞に導入する際は、例えば、該ウイルスベクターを含むベクター組成物を用いることができる。ベクター組成物は、ウイルスベクター以外にヘルパープラスミドを含んでいてもよい。ベクター組成物は、ウイルスベクター及びヘルパープラスミド以外にも、導入方法及び導入対象等に応じて、その他の成分、例えば、適当な緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養標準液等を含んでいてもよい。
ベクター組成物中の上記ウイルスベクターの含有量としては、感染方法及び感染対象等に応じて適宜選択すればよいが、例えば、DNA濃度として約0.25~2.0μg/μLのウイルスベクターを含むことが好ましい。
ベクター組成物中の例えば、各ヘルパープラスミドの含有量としては、上記ウイルスベクター1μgに対して約0.0125~0.125μgとすることが好ましい。
上記ウイルスベクター及びヘルパープラスミドをin vitroで細胞に導入する方法としては特に限定されず、例えば、市販のトランスフェクション試薬を用いる自体公知の方法を採用することができる。市販のトランスフェクション試薬としては、例えば、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics(登録商標)、Pleasanton、CA)等が挙げられるが特に限定されない。具体的には、例えば、上記量のウイルスベクター及びヘルパープラスミド、並びに緩衝液等を含むベクター組成物に、市販のトランスフェクション試薬を適量加え、これをウイルスベクター1μgに対して通常約1×103~1×107個、好ましくは約1×104~1×107個の細胞に加えることによりウイルスベクター及びヘルパープラスミドを該細胞に導入することができる。なお、ウイルスベクター及びヘルパープラスミドは、同時に細胞に導入してもよく、別々に導入してもよい。別々に導入する際の導入順序は、特に限定されない。
ウイルスベクターを導入する細胞としては、ウイルスベクターの導入により本発明における組換えウイルスを産生することができる哺乳類の培養細胞等であればよいが、例えば、ヒト腎臓由来の293T細胞、BHK細胞が挙げられる。
G遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターを用いる場合には、ABVゲノムのG遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、293T細胞、BHK細胞等の細胞に、所望の外殻遺伝子を発現する各種プラスミドを用いて、該外殻遺伝子を導入することにより作製することができる。外殻遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に記載された方法に従って、該プラスミド内に該外殻遺伝子を導入することにより製造される。このような外殻遺伝子を発現するプラスミドとして、上述したABVゲノムのG遺伝子を発現するヘルパープラスミドも好適に用いることができる。また、G遺伝子及びM遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターを用いる場合には、BDVゲノムのM遺伝子及びABVゲノムのG遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、293T細胞、BHK細胞等の細胞に同様の方法で前記遺伝子を導入することにより製造される。
次いで、ウイルスベクターを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる。組換えウイルスを産生させるための培地、培養温度及び培養時間等の培養条件は、細胞の種類により適宜設定すればよい。培養温度は、293T細胞又はBHK細胞を用いる場合は、通常約36~37℃とする。培地は、ダルベッコ変法イーグル培地を用いることが好ましい。培養時間は、通常約24~96時間、好ましくは約36~48時間とする。
上記培養により、ウイルスベクターを導入した細胞においてウイルスベクターにコードされるRNA、並びにBDVゲノムのN蛋白質、P蛋白質、L蛋白質及びABVゲノムのG蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。ウイルスベクターの導入において、さらにBDVゲノムのM遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いた場合には、ウイルスベクターにコードされるRNA、並びにBDVゲノムのN蛋白質、P蛋白質、L蛋白質及びABVゲノムのG蛋白質に加えて、BDVゲノムのM蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。
ウイルスベクターを導入した細胞において組換えウイルスが産生されたことは、例えば、細胞を培養した培地の上澄みを遠心分離などにより回収し、該上澄みを用いてBDVゲノムが感染性を有する細胞、例えば、サル腎由来Vero細胞、ラットグリア由来C6細胞、ヒトグリア由来OL細胞などに感染をさせることで確認される。組換えウイルスが産生されたことの確認は、後述する組換えウイルスを産生した細胞を増殖速度が速い細胞と混合培養する工程を行なった後行ってもよい。
例えば、組換えウイルスであることは、感染した細胞内での外来性遺伝子(例えばGFPなど)の発現を定量解析することで確認できる。産生されたウイルスが持続性感染型であることは、感染した細胞内での外来性遺伝子(例えばGFPなど)の発現を定量解析すると共に、その培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることを調べることにより確認される。培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることは、例えば、その上清を遠心分離などにより回収し、これをさらに他の細胞へ感染させ、該細胞において組換えウイルスに由来する外来性遺伝子が発現することを調べることで確認できる。
例えば、組換えウイルスであることは、感染した細胞内での外来性遺伝子(例えばGFPなど)の発現を定量解析することで確認できる。産生されたウイルスが持続性感染型であることは、感染した細胞内での外来性遺伝子(例えばGFPなど)の発現を定量解析すると共に、その培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることを調べることにより確認される。培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることは、例えば、その上清を遠心分離などにより回収し、これをさらに他の細胞へ感染させ、該細胞において組換えウイルスに由来する外来性遺伝子が発現することを調べることで確認できる。
本発明の作製方法においては、上記のように細胞にウイルスベクター等を導入して組換えウイルスを産生させた後、効率よく組換えウイルスを増殖させるために、該組換えウイルスを産生した細胞(例えば、293T細胞、BHK細胞)を増殖速度が速い細胞と混合培養する工程を行なうことが好ましい。組換えウイルスを産生した細胞を増殖速度が速い細胞と混合培養することにより、感染性を持つ組換えウイルスは増殖速度が速い細胞に感染する。該増殖速度が速い細胞を培養すると、細胞の増殖と共に感染したウイルスも増殖するため、組換えウイルスを効率よく増殖させることができる。増殖速度が速い細胞としては、例えば、Vero細胞等が好適である。組換えウイルスを産生した細胞と、増殖速度の速い細胞との混合比率としては、例えば、組換えウイルスを産生した細胞1個に対して増殖速度の速い細胞を通常0.1~10個程度、好ましくは0.2~2個程度とする。混合培養後、増殖速度が速い細胞を培養させる条件としては特に限定されず、例えば、Vero細胞を用いる場合には、培養温度を通常約36~37℃とし、ダルベッコ変法イーグル培地で通常3日~5週間程度、好ましくは3日~3週間程度培養を行なう。
G遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターを用いた場合には、増殖速度が速い細胞として、ABVゲノムのG遺伝子を発現するヘルパープラスミドにより外殻遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、Vero細胞等の細胞に、外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いて、該遺伝子を導入することにより作製することができる。さらに、G遺伝子及びM遺伝子欠損型BDVのウイルスベクターを用いた場合には、増殖速度が速い細胞として、ABVゲノムのG遺伝子とBDVゲノムのM遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、Vero細胞等に、前記遺伝子を発現するプラスミドを用いて該遺伝子を導入することにより作製することができる。前記遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に従って、該プラスミド内に所望の遺伝子をそれぞれ導入することにより容易に製造される。このようなプラスミドとしては、上述したABVゲノムのG遺伝子を発現するヘルパープラスミド、BDVゲノムのM遺伝子を発現するヘルパープラスミド等も好適に用いることができる。
本発明の作製方法においては、細胞に組換えウイルスを産生(及び増殖)させた後、該組換えウイルスを精製する工程を行うことが好ましい。精製方法としては特に限定されず、自体公知の方法によって行うことができ、組換えウイルスの感染対象に応じて精製方法を適宜選択すればよい。
例えば、組換えウイルスを培養細胞に感染させる場合には、上記のように組換えウイルスを産生(及び増殖)させた後、該組換えウイルスを産生させた培養細胞上清を回収し、細胞を破砕する。細胞の破砕は、例えば、凍結及び融解、又は超音波破砕機を用いて行うことができる。次いで、細胞破砕液から細胞の破砕成分を取り除く。細胞破砕液から細胞の破砕成分を取り除く方法としては、遠心分離(例えば、4℃、800gで10分間程度)等が挙げられる。細胞の破砕成分を取り除いた後に、0.22μm又は0.45μmのポアサイズを有する濾過膜を通すことにより組換えウイルスを含む上澄みを得ることができる。培養細胞に組換えウイルスを感染させる際は、この上澄みを用いることができる。また、この組換えウイルスを含む上澄みを公知の手法により濃縮して用いることもできる。
生体細胞(動物個体中の細胞)に組換えウイルスを感染させる場合には、この組換えウイルスを含む上清を、超遠心機を用いて濃度勾配による超遠心を行なうことによりウイルス粒子へと高度の精製を行うことが好ましい。精製を行ったウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、希釈を行った後に適量を動物へ感染させる。
生体細胞(動物個体中の細胞)に組換えウイルスを感染させる場合には、この組換えウイルスを含む上清を、超遠心機を用いて濃度勾配による超遠心を行なうことによりウイルス粒子へと高度の精製を行うことが好ましい。精製を行ったウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、希釈を行った後に適量を動物へ感染させる。
4.外来性遺伝子の導入方法
上記組換えウイルスを細胞に感染させることにより、該ウイルスに組み込まれた外来性遺伝子を細胞や生体に導入することができる。このような、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスをin vitroの細胞又は動物に感染させる工程を含む外来性遺伝子の導入方法も本発明の1つである。
上記組換えウイルスを細胞に感染させることにより、該ウイルスに組み込まれた外来性遺伝子を細胞や生体に導入することができる。このような、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスをin vitroの細胞又は動物に感染させる工程を含む外来性遺伝子の導入方法も本発明の1つである。
組換えウイルスを感染させる動物としては特に限定されず、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類等が挙げられる。中でも、ヒト、サル、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、ネズミ、ウサギ、ウシ等の哺乳類が好ましく、ラット、マウス又はヒトがより好ましく、マウス又はヒトが更に好ましい。組換えウイルスを感染させる細胞としては、このような動物の細胞が好ましい。また、BDVは神経系細胞に感染指向性があることから、哺乳類の神経系細胞が好ましく、中でも、脳神経系細胞がより好ましい。中でも、ラット、マウス又はヒトの神経系細胞が好ましい。細胞は、培養細胞であってもよく、生体細胞であってもよい。哺乳類の脳神経系細胞としては、グリア細胞、大脳皮質の神経細胞、海馬神経細胞、小脳神経細胞、中脳神経細胞胞等が挙げられる。哺乳類の脳神経細胞の培養細胞としては、OL、C6、U373、N2a、N18、PC12、SK-N-SH細胞等が好適である。
G遺伝子欠損型BDVのウイルスベクター及びABVゲノムのG遺伝子を発現するヘルパープラスミドとして他のウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いて産生された組換えウイルスは、該外殻遺伝子が由来するウイルスの種類に応じた感染指向性を示す。例えば、ヘルパープラスミドにおいてABV以外のウイルスの外殻遺伝子(好ましくは、ABV以外のウイルスの外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつABVゲノムのG蛋白質の細胞内配列をコードする外殻遺伝子)を使用した場合、得られる組換えウイルスは、該ウイルスが感染指向性を示す細胞に好適に感染させることができるものである。
組換えウイルスをin vitroで細胞に感染させる方法としては、例えば、培養細胞に感染させる場合には、上記精製方法により得られた組換えウイルスを含む上清をダルベッコ変法イーグル培地等の培養培地又はリン酸緩衝生理食塩水等により段階希釈して希釈液を作製することが好ましい。希釈液中の組換えウイルスの濃度としては、ウイルスを感染させる細胞の種類等により適宜選択すればよいが、例えば、哺乳類の神経細胞等であれば、通常MOI(multiplicity of infection、感染価)約0.01~10(細胞1個に対してウイルス粒子0.01から10個が感染する量)、好ましくはMOI約1~10となるようにする。この希釈液を用いて、組換えウイルスを細胞に感染させる。
組換えウイルスを生体細胞(動物)に感染させる際には、上記のように高度に精製されたウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、該リン酸緩衝生理食塩水により希釈を行った後に適量を動物へ感染させることが好ましい。希釈液中の組換えウイルスの濃度は、感染対象により適宜選択すればよい。例えば、感染対象が哺乳類の神経細胞であれば、組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価(focus-forming unit (FFU))を約1×10-1~1×109FFUとして個体に接種することが好ましい。また、組換えウイルスを含む希釈液は、マウス又はラットに接種する際には、ウイルス力価を通常約1×10-1~1×107FFUとすることが好ましい。イヌ又はネコ、ヒトに接種する際には、ウイルス力価を通常約10~1×108FFUとすることが好ましく、ウシ又はウマに接種する際には、ウイルス力価を通常1×105~1×1012FFUとすることが好ましい。ヒトに接種する際には、ウイルス力価を通常約1×105~1×109FFUとすることが好ましい。また、組換えウイルスを生体細胞に感染させる際には、後述する外来性遺伝子導入剤も好適に用いることができる。
例えば、哺乳類の脳神経系細胞に組換えウイルスを感染させる場合には、上記組換えウイルスを含む希釈液を哺乳類の鼻腔に接種する方法が好適である。また、マウスやラット等の動物実験において脳神経系細胞に感染させる場合には、動物の脳内に組換えウイルスを含む希釈液を直接接種することもできる。
組換えウイルスの接種量としては、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液を、鼻腔内接種では1回につき通常約5μL~1mL、脳内接種では1回につき通常約1~50μL接種する。組換えウイルスの動物への接種量は、動物の体重等に応じて適宜選択すればよく、例えば、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液をマウス又はラットに鼻腔内接種する場合には、1回につき通常約5~200μL、好ましくは約10~100μL接種する。
組換えウイルスの接種量としては、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液を、鼻腔内接種では1回につき通常約5μL~1mL、脳内接種では1回につき通常約1~50μL接種する。組換えウイルスの動物への接種量は、動物の体重等に応じて適宜選択すればよく、例えば、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液をマウス又はラットに鼻腔内接種する場合には、1回につき通常約5~200μL、好ましくは約10~100μL接種する。
脳神経細胞以外の生体細胞に組換えウイルスを感染させる場合には、上記組換えウイルスを含む希釈液を非経口投与することが好ましい。例えば、哺乳類の腹腔内、血管内、筋肉内等に接種する方法等が好適である。
組換えウイルスの接種量としては、接種部位等により適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、通常、組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価を約1×10-1~1×109FFUとして、この組換えウイルスを含む希釈液を、マウスであれば1回につき通常約5~500μL、好ましくは約20~200μL接種する。
組換えウイルスの接種量としては、接種部位等により適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、通常、組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価を約1×10-1~1×109FFUとして、この組換えウイルスを含む希釈液を、マウスであれば1回につき通常約5~500μL、好ましくは約20~200μL接種する。
5.外来性遺伝子導入剤
(1)上記ウイルスベクター、(3)上記組換えウイルス又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤も、本発明の1つである。好ましい態様としては、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤である。このような外来性遺伝子導入剤は、上述した外来性遺伝子の導入方法において、組換えウイルスをin vitroの細胞又は生体細胞(動物)に感染させる際に好適に用いることができるものである。本発明は、動物の神経系細胞等に外来性遺伝子を導入するのに好適に用いることができる。中でも、脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するのにより好適に用いられる。
(1)上記ウイルスベクター、(3)上記組換えウイルス又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤も、本発明の1つである。好ましい態様としては、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤である。このような外来性遺伝子導入剤は、上述した外来性遺伝子の導入方法において、組換えウイルスをin vitroの細胞又は生体細胞(動物)に感染させる際に好適に用いることができるものである。本発明は、動物の神経系細胞等に外来性遺伝子を導入するのに好適に用いることができる。中でも、脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するのにより好適に用いられる。
本発明の外来性遺伝子導入剤の好ましい態様の1つは、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤である。脳神経系細胞としては、哺乳類の脳神経系細胞が好ましく、例えば、グリア細胞、大脳皮質の神経細胞、海馬神経細胞、小脳神経細胞、中脳神経細胞等が挙げられる。本発明の外来性遺伝子導入剤は、さらに、神経疾患治療剤等の他の薬剤等を含んでいてもよく、剤型に応じて医薬上許容される成分を含んでいてもよい。本発明の外来性遺伝子導入剤の剤型としては、非経口投与のための剤型が好ましく、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤、噴霧剤、スプレー剤等が挙げられるが、注射剤が好ましい。
非経口投与のための注射剤としては、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒(注射用水、精製水等)に、医薬上許容される添加剤を適宜添加した溶液に、組換えウイルスを混合した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。医薬上許容される添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤;リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤;パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤;ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤;亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤;塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のpH調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール;プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール;ポリソルベート80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油50、リゾレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。また、例えば、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の蛋白質;アミノデキストラン等のポリサッカライド等を含有してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
本発明の外来性遺伝子導入剤に含まれる組換えウイルスの量は、外来性遺伝子導入剤の製剤形態又は投与経路によって異なるが、通常、最終製剤中に約0.0001~100w/v%の範囲から適宜選択して決定することができる。外来性遺伝子導入剤の投与方法及び投与量は、上述した外来性遺伝子の導入方法における方法及び組換えウイルスの投与量と同様である。本発明の外来性遺伝子導入剤は、例えば、動物の脳神経系疾患治療、C型肝炎等の慢性肝疾患、抗腫瘍薬及びワクチン等のための遺伝子デリバリー用組成物として有用である。本発明の外来性遺伝子導入剤の投与対象は、上述した哺乳動物が好適である。
6.ウイルスベクターの利用
本発明のウイルスベクター、組換えウイルス及び外来性遺伝子の導入方法、並びに外来性遺伝子導入剤は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野に応用することができるものである。
例えば、本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、ヒトを含む動物の脳神経系疾患治療のための遺伝子デリバリーベクターとして使用することができる。また、慢性肝疾患、腫瘍、感染症等に対するワクチン等にも好適に使用することができる。
脳神経系疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、統合失調症、自閉症、その他の機能性精神疾患等が挙げられる。本発明の組換えウイルスは、このような疾患の治療又は予防に有用である。例えば、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子として、脳神経系疾患の原因となる蛋白質を分解する酵素の遺伝子、該蛋白質の発現を抑制する機能を有する核酸配列等を使用すると、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該原因蛋白質を分解又は該原因蛋白質の発現を抑制して該疾患を予防又は治療することができる。また、脳内物質(例えば、セロトニン、ドーパミン、ソマトスタチン、ネプリライシン等)の分泌低下により発症する疾患においては、該脳内物質をコードする遺伝子をウイルスベクターに挿入し、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該脳内物質が産生されるため、該疾患を予防又は治療することができる。
なお、「治療」とは、病態を完全に治癒させることの他、完全に治癒しなくても症状の進展及び/又は悪化を抑制し、病態の進行をとどめること、又は病態の一部若しくは全部を改善して治癒の方向へ導くことを、「予防」とは病態の発症を防ぐこと、抑制すること又は遅延させることを、それぞれ意味するものとする。
本発明のウイルスベクター、組換えウイルス及び外来性遺伝子の導入方法、並びに外来性遺伝子導入剤は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野に応用することができるものである。
例えば、本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、ヒトを含む動物の脳神経系疾患治療のための遺伝子デリバリーベクターとして使用することができる。また、慢性肝疾患、腫瘍、感染症等に対するワクチン等にも好適に使用することができる。
脳神経系疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、統合失調症、自閉症、その他の機能性精神疾患等が挙げられる。本発明の組換えウイルスは、このような疾患の治療又は予防に有用である。例えば、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子として、脳神経系疾患の原因となる蛋白質を分解する酵素の遺伝子、該蛋白質の発現を抑制する機能を有する核酸配列等を使用すると、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該原因蛋白質を分解又は該原因蛋白質の発現を抑制して該疾患を予防又は治療することができる。また、脳内物質(例えば、セロトニン、ドーパミン、ソマトスタチン、ネプリライシン等)の分泌低下により発症する疾患においては、該脳内物質をコードする遺伝子をウイルスベクターに挿入し、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該脳内物質が産生されるため、該疾患を予防又は治療することができる。
なお、「治療」とは、病態を完全に治癒させることの他、完全に治癒しなくても症状の進展及び/又は悪化を抑制し、病態の進行をとどめること、又は病態の一部若しくは全部を改善して治癒の方向へ導くことを、「予防」とは病態の発症を防ぐこと、抑制すること又は遅延させることを、それぞれ意味するものとする。
本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、日本脳炎等のウイルス性脳炎の治療又は予防にも使用できる。また、実験動物、伴侶動物又は生産動物の脳神経系疾患、例えば、BSE(牛海綿状脳症)、狂犬病等にも好適に使用できる。実験動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ等が挙げられる。伴侶動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ等が挙げられる。生産動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等が挙げられる。
本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、脳神経科学領域における神経系細胞の可視化技術に使用することができる。さらに、本発明のウイルスベクターは、機能性RNA分子を発現できるRNAウイルスベクターとしても有用であり、siRNA、miRNA、RNAアプタマー等の機能性RNAの安定発現ベクター技術に応用することもできる。例えば、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子としてsiRNA、miRNA、RNAアプタマー等の機能性RNAをコードする配列を用いると、所望の細胞においてこれらの機能性RNA分子を発現させることができる。本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスを用いると、脳内において一本鎖抗体(scFv)を発現させることもできる。
また外殻蛋白質を他のウイルス由来のものにすることで、腫瘍細胞に特異的に感染するウイルスベクター又は組換えウイルスに改良し、腫瘍細胞に薬剤遺伝子や過剰に発現した遺伝子を抑えるsiRNAを導入すること等で、抗腫瘍ウイルスベクターとしても利用可能である。さらに、外来性遺伝子としてHIV、インフルエンザウイルス等に対する中和活性をもつ遺伝子(例えば、HIVのenv、gag等;インフルエンザウイルスのHA、NA遺伝子等)等を導入することで、本発明のウイルスベクター又は組換えウイルスを組換えワクチンに利用することも可能である。そして、HCV等の慢性経過をたどる感染症に対しては、標的となるウイルスのゲノムに対するsiRNAを導入することで、機能性RNAを利用した感染症に対する新たな治療法の開発にも有効である。
また、本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスを、様々な細胞由来の幹細胞、iPS細胞などの多能性幹細胞、そして癌幹細胞に感染させることにより、前記した疾患の治療に利用可能な安全な細胞集団を取得することができる。
上記ウイルスベクターを含有する外来性遺伝子導入用キットも、本発明の1つである。
本発明のキットは、ウイルスベクター以外に、ヘルパープラスミド、外来性遺伝子を導入する細胞、緩衝液、培地等を適宜含んでもよい。ウイルスベクターの好ましい態様は、上述した通りである。外来性遺伝子を導入する細胞は、脳神経系細胞等の神経系細胞等が好ましい。本発明のキットは、これまで技術的に困難であった脳神経系細胞等への外来性遺伝子の導入に好適に用いることができるものである。
本発明のキットは、ウイルスベクター以外に、ヘルパープラスミド、外来性遺伝子を導入する細胞、緩衝液、培地等を適宜含んでもよい。ウイルスベクターの好ましい態様は、上述した通りである。外来性遺伝子を導入する細胞は、脳神経系細胞等の神経系細胞等が好ましい。本発明のキットは、これまで技術的に困難であった脳神経系細胞等への外来性遺伝子の導入に好適に用いることができるものである。
以下、実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
<実施例1>
1.プラスミドpCAG-Fctの作製
Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529に記載されているプラスミドpCAG-HR-SV3を基に、その中に挿入されているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子の領域をボルナ病ウイルスのHe/80株のゲノムの配列(配列番号1)に置き換えたプラスミドを以下のようにして作製した。
1.プラスミドpCAG-Fctの作製
Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529に記載されているプラスミドpCAG-HR-SV3を基に、その中に挿入されているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子の領域をボルナ病ウイルスのHe/80株のゲノムの配列(配列番号1)に置き換えたプラスミドを以下のようにして作製した。
サイトメガウイルス(CMV)由来のBDVミニゲノムベクター(pCMV-HR)を得るために、ハンマーヘッドリボザイム(HamRz)をコードする化学合成オリゴヌクレオチド(Briese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (1992) 11486-11489、及びLe Mercier et al., J. Virol., 76 (2002) 2024-2027)及びBDVの5’非翻訳領域(UTR)配列をコードする化学合成オリゴヌクレオチド(Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C., Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994))をアニールし、ベクターpcDNA3(Invitrogen社、San Diego, CA)のKpnIとXhoIサイトの間に連結した。得られたプラスミドをEco47III及びXbaIサイトで切断した。このプラスミドに、δ型肝炎ウイルスリボザイム(HdRz)と融合させたBDVの3’UTRと、BDV He/80株のゲノムをコードするcDNAクローンを挿入してプラスミドpc-HRを得た。なお、HdRzと融合させたBDVの3’UTRは、プラスミドphuPol I-MG(Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104)から増幅した。最後に、pc-HRのBglII及びXbaI断片をpBluescript SKII(-)(Stratagene, La Jolla, CA)のBamHIとXbaIサイトの間に挿入することによって、pCMV-HRを作製した。
CAG(Chicken β-actin promoterとCMV enhancerとの複合体)由来のBDVミニゲノムベクターpCAG-HRは、CAGプロモーターをpBluescript SKII(-)(Stratagene, La Jolla, CA)にサブクローニングすることによって得た(pBS-CAG)。CAGプロモーターは、サイトメガロウイルスIEエンハンサーにニワトリβ-アクチンプロモーターが融合してなるハイブリッドプロモーターであり、Sawichi et al., Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。pCMV-HRのHamRzとHdRzの配列にまたがる領域をPCRによって増幅し、pBS-CAGのSalIとEcoRIサイトの平滑末端との間に挿入した。
次に、SV40開始点/プロモーター内の5’側の113塩基からなる断片(SV3領域)を、PCR(Clontech Laboratory, Inc., Palo Alto, CA)によってpEGFP-N1(Clontech社製)から増幅し、pCAG-HRのNotIサイトに挿入した。これにより、プラスミドpCAG-Fctを得た。
2.P遺伝子とM遺伝子との間の非翻訳領域にGFPを挿入したBDVゲノムプラスミド(pCAG-Fct-P/M-GFP)の作製
P遺伝子とM遺伝子の間の非翻訳領域に外来遺伝子挿入カセットを挿入し、プラスミドpCAG-Fct-P/Mを作製した。
A)上記1で作製したpCAG-Fct(ボルナウイルスのHe80株のcDNA(配列番号1)がクローニングされているプラスミド)を鋳型に、EcoT22IからBst1107Iサイトまでの領域をプライマー1及び4、並びにプライマー2及び3を用いてそれぞれPCRで増幅した。その後、両方のPCR産物を0.5μLずつ混合し、プライマー1及び2にて再度増幅し、P-M遺伝子間にBstBIサイト及びPacIサイトを有する外来遺伝子挿入カセットを作製した。
B)A)のPCR産物をEcoT22I及びBst1107Iを用いてpCAG-Fctへと組込み、pCAG-Fct-P/Mを完成させた。
C)BstBIとPacIを用いてGFPを挿入し、プラスミドpCAG-Fct-P/M-GFPを完成させた。
(プライマー)
プライマー1:5-GGAATGCATTGACCCAACCGGTAGACCAGC-3(配列番号5)
プライマー2:5-AACATGTATTTCCTAATCGGGTCCTTGTATACGG-3(配列番号6)
プライマー3:5-ttcgaaGGTTGGttaattaaccataaaaaaatcgaatcacc-3(配列番号7)
プライマー4:5-ttaattaaCCAACCttcgaaGGTGATTCGATTTTTTTATGG-3(配列番号8)
P遺伝子とM遺伝子の間の非翻訳領域に外来遺伝子挿入カセットを挿入し、プラスミドpCAG-Fct-P/Mを作製した。
A)上記1で作製したpCAG-Fct(ボルナウイルスのHe80株のcDNA(配列番号1)がクローニングされているプラスミド)を鋳型に、EcoT22IからBst1107Iサイトまでの領域をプライマー1及び4、並びにプライマー2及び3を用いてそれぞれPCRで増幅した。その後、両方のPCR産物を0.5μLずつ混合し、プライマー1及び2にて再度増幅し、P-M遺伝子間にBstBIサイト及びPacIサイトを有する外来遺伝子挿入カセットを作製した。
B)A)のPCR産物をEcoT22I及びBst1107Iを用いてpCAG-Fctへと組込み、pCAG-Fct-P/Mを完成させた。
C)BstBIとPacIを用いてGFPを挿入し、プラスミドpCAG-Fct-P/M-GFPを完成させた。
(プライマー)
プライマー1:5-GGAATGCATTGACCCAACCGGTAGACCAGC-3(配列番号5)
プライマー2:5-AACATGTATTTCCTAATCGGGTCCTTGTATACGG-3(配列番号6)
プライマー3:5-ttcgaaGGTTGGttaattaaccataaaaaaatcgaatcacc-3(配列番号7)
プライマー4:5-ttaattaaCCAACCttcgaaGGTGATTCGATTTTTTTATGG-3(配列番号8)
3.G遺伝子を欠損させたBDVゲノムプラスミド(p/mGFP ΔG LL)の作製
上記で作製したpCAG-Fct-P/M-GFPを元に、ウイルス膜糖蛋白質であるG遺伝子をPCRを用いた点変異導入により欠損させた。具体的な方法として、G遺伝子に存在する2つのメチオニンをコードする配列(ゲノム番号(すなわち配列番号1の塩基)2236-2238、及び2248-2250)をスレオニン(ATG→ACG)へと置換した。図6に、G遺伝子欠損型BDVウイルスをコードするプラスミドであるp/mGFP ΔGの作製手順の概略を示す。先ずp/mGFPを鋳型に表1に示す配列のプライマーA1及びB1、並びにプライマーC1及びD1を用いてPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5又は1分を25サイクル)を行った(図6(a))。
上記で作製したpCAG-Fct-P/M-GFPを元に、ウイルス膜糖蛋白質であるG遺伝子をPCRを用いた点変異導入により欠損させた。具体的な方法として、G遺伝子に存在する2つのメチオニンをコードする配列(ゲノム番号(すなわち配列番号1の塩基)2236-2238、及び2248-2250)をスレオニン(ATG→ACG)へと置換した。図6に、G遺伝子欠損型BDVウイルスをコードするプラスミドであるp/mGFP ΔGの作製手順の概略を示す。先ずp/mGFPを鋳型に表1に示す配列のプライマーA1及びB1、並びにプライマーC1及びD1を用いてPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5又は1分を25サイクル)を行った(図6(a))。
次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型に、上記のプライマーA1及びD1を用いて再びPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 1.5分を25サイクル)を行った(図6(b))。増幅産物(2ndPCR産物)はG遺伝子のメチオニンがスレオニンへと変異しており、これを制限酵素Bst1107I及びNheIを用いて、ベクターであるp/mGFPと組換えて(図6(c))、p/mGFP ΔGを得た。
さらに、不要になったL遺伝子イントロン領域(本来この部分はG遺伝子の領域)を削りL遺伝子を直結した(L linearize)。具体的な方法として、制限酵素サイトBst1107I(配列番号1の2166~2171番目の塩基配列)からL遺伝子のエクソン前半部までとL遺伝子のエクソン後半部(NheIサイト(配列番号1の6158~6163番目の塩基配列)まで)をそれぞれ増幅し両者を結合させてp/mGFP ΔGに組込んだ。この手順の概略を、図7に示す。先ず、表1に示すプライマーA1及びE1、並びに及びプライマーF1及びD1を用いてp/mGFP ΔGを鋳型にPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5分を25サイクル)を行った(図7(a))。次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型にプライマーA1及びD1を用いてPCR(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 1分を25サイクル)を行った(図7(b))。増幅産物(2ndPCR産物)は、L遺伝子のイントロン部分が削除されており、これを制限酵素Bst1107I及びNheIを用いて、ベクターであるp/mGFP ΔGと組換えて、p/mGFP ΔG LLを得た(図7(c))。
4.AVBのG遺伝子を挿入させたBDVゲノムプラスミド(p/m PaBV4G GFP ΔG LL)の作製
上記で作製したp/mGFP ΔG LLを元に、P遺伝子とGFP遺伝子の間に、S3とT2の配列と、外来遺伝子挿入カセットとしてSse8387IとAscI、AsiSI、SwaIサイトを挿入したp/m tandem GFP ΔG LLを作製した。
S3:5-TAAAAAAATCGAATCA-3(配列番号16)
T2:5-TAAAAAAA-3(配列番号17)
上記で作製したp/mGFP ΔG LLを元に、P遺伝子とGFP遺伝子の間に、S3とT2の配列と、外来遺伝子挿入カセットとしてSse8387IとAscI、AsiSI、SwaIサイトを挿入したp/m tandem GFP ΔG LLを作製した。
S3:5-TAAAAAAATCGAATCA-3(配列番号16)
T2:5-TAAAAAAA-3(配列番号17)
次にp/m tandem GFP ΔG LLの挿入カセットに、PaBV-4のG遺伝子のcDNAを挿入したp/m PaBV4G GFP ΔG LLを作製した。PaBV-4のG遺伝子のcDNAを鋳型にプライマー5及び6を用いてPCR(98度 10秒、55度 5秒、72度 10秒、30サイクル)をおこなった。PCR産物をAscI及びAsiSIを用いてp/m tandem GFP ΔG LLと組換えて、p/m PaBV4G GFP ΔG LLを得た(図3(a))。
プライマー5:5’-AAAGGCGCGCCATGCTGCATTCAACGTATTCTCGTT-3’(配列番号18)
プライマー6:5’-AAAGCGATCGCTTATTCCGACCACCTTCCGAG-3’ (配列番号19)
プライマー5:5’-AAAGGCGCGCCATGCTGCATTCAACGTATTCTCGTT-3’(配列番号18)
プライマー6:5’-AAAGCGATCGCTTATTCCGACCACCTTCCGAG-3’ (配列番号19)
5.ヘルパープラスミドの作製
ヘルパープラスミド、すなわちBDVゲノムのN遺伝子発現プラスミド(pcN)、BDVゲノムのP遺伝子発現プラスミド(pCXN2-P)及びBDVゲノムのL遺伝子発現プラスミド(pcL)を以下の手順で作製した。
pcNは、pHA-p40Nプラスミド(Kobayashi T, Watanabe M, Kamitani W, Zhang G, Tomonaga K and Ikuta K. Borna disease virus nucleoprotein requires both nuclear localization and export activities for viral nucleocytoplasmic shuttling. J. Virol. 75:3404-3412. (2001))からN遺伝子領域をPCRで増幅し、pBS-CAG(上述)へと挿入することで作製した。
pCXN2-Pは、pcD-P(Zhang G, Kobayashi T, Kamitani W, Komoto S, Yamashita M, Baba S, Yanai H, Ikuta K and Tomonaga K. Borna disease virus phosphoprotein represses p53-mediated transcriptional activity by interference with HMGB1. J. Virol. 77:12243-12251. (2003))からゲル抽出した断片をpCXN2(Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J 1991 Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-199)のEcoRIとXhoIサイトの間に挿入することによって作製した。
pcLについては、Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104に記載されている方法で作製した。組換えプラスミドのヌクレオチド配列は、DNAシークエンスによって確認した。
ヘルパープラスミド、すなわちBDVゲノムのN遺伝子発現プラスミド(pcN)、BDVゲノムのP遺伝子発現プラスミド(pCXN2-P)及びBDVゲノムのL遺伝子発現プラスミド(pcL)を以下の手順で作製した。
pcNは、pHA-p40Nプラスミド(Kobayashi T, Watanabe M, Kamitani W, Zhang G, Tomonaga K and Ikuta K. Borna disease virus nucleoprotein requires both nuclear localization and export activities for viral nucleocytoplasmic shuttling. J. Virol. 75:3404-3412. (2001))からN遺伝子領域をPCRで増幅し、pBS-CAG(上述)へと挿入することで作製した。
pCXN2-Pは、pcD-P(Zhang G, Kobayashi T, Kamitani W, Komoto S, Yamashita M, Baba S, Yanai H, Ikuta K and Tomonaga K. Borna disease virus phosphoprotein represses p53-mediated transcriptional activity by interference with HMGB1. J. Virol. 77:12243-12251. (2003))からゲル抽出した断片をpCXN2(Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J 1991 Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-199)のEcoRIとXhoIサイトの間に挿入することによって作製した。
pcLについては、Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104に記載されている方法で作製した。組換えプラスミドのヌクレオチド配列は、DNAシークエンスによって確認した。
6.組換えウイルスの作製
p/m PaBV4G GFP ΔG LL及びヘルパープラスミド(N遺伝子発現プラスミド、P遺伝子発現プラスミド及びL遺伝子発現プラスミド;それぞれpcN、pCXN2-P及びpcL)を、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics(登録商標)、Pleasanton、CA)又はLipofectamine(登録商標)2000(Invitrogen社)を用いて293T細胞に導入した。導入に使用したウイルスベクター等の量としては、1×104~1×106の細胞(293T細胞)に対して、p/m PaBV4G GFP ΔG LLを1~4μg使用し、pcN(0.125~0.5μg)、pCXN2-P(0.0125~0.05μg)、pcL(0.125~0.5μg)の割合でヘルパープラスミドを加えた。
p/m PaBV4G GFP ΔG LL及びヘルパープラスミド(N遺伝子発現プラスミド、P遺伝子発現プラスミド及びL遺伝子発現プラスミド;それぞれpcN、pCXN2-P及びpcL)を、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics(登録商標)、Pleasanton、CA)又はLipofectamine(登録商標)2000(Invitrogen社)を用いて293T細胞に導入した。導入に使用したウイルスベクター等の量としては、1×104~1×106の細胞(293T細胞)に対して、p/m PaBV4G GFP ΔG LLを1~4μg使用し、pcN(0.125~0.5μg)、pCXN2-P(0.0125~0.05μg)、pcL(0.125~0.5μg)の割合でヘルパープラスミドを加えた。
ウイルスベクター及びヘルパープラスミドをLipofectamine(商標登録)2000(Invitrogen社)を用いて293T細胞へ導入した。遺伝子導入後、37℃で培養し、遺伝子導入3日後に細胞を継代し、その際にVero細胞と共培養を行った後、該Vero細胞をPaBV-4G発現キメラウイルス感染Vero細胞として回収した。
培養細胞への感染後、48時間以降における細胞間での感染の広がり、並びに感染細胞上清中へのウイルスの放出を、間接免疫蛍光抗体法又はウェスタンブロット法又は上清中のウイルス力価をVero細胞へ継代することにより調べたところ、感染後24時間後よりウイルスの産生が観察され始めることが確認された。
<実施例2>
シュードタイプウイルスの回収
上記で作製したp/mGFP ΔG LL及びヘルパープラスミド(N遺伝子発現プラスミド、P遺伝子発現プラスミド及びL遺伝子発現プラスミド;それぞれpcN、pCXN2-P及びpcL)を用いて、実施例1を参照にしてG遺伝子欠損組換えBDV細胞を取得した。得られた細胞を10cmシャーレに播種し(3.0×106cells)、10 μgのG蛋白質発現プラスミドをTransIT(登録商標)-293 (TaKaRa)を用いて導入した。G蛋白質発現プラスミドには、Variegated squirrel bornavirus(VSBV)、Parrot bornavirus 4(PaBV-4)、Parrot bornavirus 5(PaBV-5)、Munia bornavirus 1(MuBV-1)のG蛋白質を用いた。プラスミドを導入した細胞を、37℃でウシ胎児血清(FCS)を10%含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で培養した。48時間後に細胞をDMEMで2回洗浄した後、1.2 mLのDMEMを加え、シャーレを-80℃に一時間静置した。-80℃と室温での凍結融解を2度おこない、シャーレ中の培養液を回収した。回収した培養液を3,000 rpm、4℃で5分間遠心し、上清をシュードタイプウイルス溶液として用いた。
シュードタイプウイルスの回収
上記で作製したp/mGFP ΔG LL及びヘルパープラスミド(N遺伝子発現プラスミド、P遺伝子発現プラスミド及びL遺伝子発現プラスミド;それぞれpcN、pCXN2-P及びpcL)を用いて、実施例1を参照にしてG遺伝子欠損組換えBDV細胞を取得した。得られた細胞を10cmシャーレに播種し(3.0×106cells)、10 μgのG蛋白質発現プラスミドをTransIT(登録商標)-293 (TaKaRa)を用いて導入した。G蛋白質発現プラスミドには、Variegated squirrel bornavirus(VSBV)、Parrot bornavirus 4(PaBV-4)、Parrot bornavirus 5(PaBV-5)、Munia bornavirus 1(MuBV-1)のG蛋白質を用いた。プラスミドを導入した細胞を、37℃でウシ胎児血清(FCS)を10%含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で培養した。48時間後に細胞をDMEMで2回洗浄した後、1.2 mLのDMEMを加え、シャーレを-80℃に一時間静置した。-80℃と室温での凍結融解を2度おこない、シャーレ中の培養液を回収した。回収した培養液を3,000 rpm、4℃で5分間遠心し、上清をシュードタイプウイルス溶液として用いた。
上記の方法で回収したシュードタイプウイルスをVero細胞へ接種した。接種後4日で該Vero細胞を蛍光顕微鏡で観察した像が図8左図である。この時のGFP陽性数(相対値)をグラフにしたのが図8右図である。
本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、細胞核で非細胞障害的にかつ効率的に外来性遺伝子を発現できるものであり、また、ウイルスゲノムがRNAであることから宿主染色体に挿入されることがなく安全なベクターである。さらに、本発明のウイルスベクターはボルナ病ウイルスを利用するものであるが、ボルナ病ウイルスは神経細胞に感染指向性があることから外来性遺伝子を脳神経系に選択的に導入することができる特異性に優れたベクターである。このため、本発明は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野、例えば、脳神経系疾患治療及び予防、脳神経化学領域における神経系細胞の可視化技術等に使用することができるため有用である。さらに、siRNA、miRNA、RNAアプタマー等の機能性RNAの安定発現ベクター技術に応用することもできる。従って、本発明は、医療、動物医療、治験、研究等の分野において有用である。
Claims (15)
- ボルナ病ウイルスゲノムにおいて、該ボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAを含むことを特徴とするウイルスベクター。
- (a)ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する配列に、外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、(b)リボザイムをコードするDNA及び(c)プロモーター配列を含み、該(a)の上流及び下流に(b)が配置され、かつ(a)及び(b)が(c)の下流に配置されているウイルスベクターであって、前記(a)がボルナ病ウイルスゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、かつ、鳥ボルナウイルスゲノムにおけるG遺伝子の配列を更に有する組換えウイルスRNAのcDNAであることを特徴とする、請求項1記載のウイルスベクター。
- (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムにおけるM遺伝子が更に破壊された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである請求項2に記載のウイルスベクター。
- (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのcDNAである請求項2に記載のウイルスベクター。
- (c)プロモーター配列が、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列であることを特徴とする請求項2~4のいずれかに記載のウイルスベクター。
- (a)組換えウイルスRNAのcDNAの上流に(b1)ハンマーヘッドリボザイムをコードするcDNAが配置され、かつ、該(a)の下流に(b2)δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするcDNA配列が配置されていることを特徴とする請求項2~5のいずれかに記載のウイルスベクター。
- (a)組換えウイルスRNAのcDNAが、外来性遺伝子の3’末端側及び5’末端側にそれぞれ制限酵素サイトを含み、外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトとP遺伝子の翻訳領域との間、及び前記外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトとL遺伝子の翻訳領域との間又はボルナ病ウイルスゲノムにおけるM遺伝子を該ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する場合には前記外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトとM遺伝子の翻訳領域との間にそれぞれ、配列番号9に示す配列を含み、該外来性遺伝子の3’末端側の制限酵素サイトと配列番号9に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccが挿入され、かつ該外来性遺伝子の5’末端側の制限酵素サイトと配列番号9に示す配列との間に少なくとも塩基配列ccaが挿入されている配列に基づくことを特徴とする請求項2~6のいずれかに記載のウイルスベクター。
- 請求項1~7のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるRNAを含むことを特徴とする組換えウイルス。
- 請求項1~7のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのN遺伝子、P遺伝子、L遺伝子及び鳥ボルナウイルスゲノムのG遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
- 請求項1~7のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとして、ボルナ病ウイルスゲノムのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と鳥ボルナウイルスゲノムのG遺伝子を発現するプラスミドとをin vitroの細胞に導入する工程、ならびに該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
- ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスゲノムのM遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する請求項9又は10に記載の組換えウイルスの作製方法。
- 請求項8に記載の組換えウイルス、又は請求項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを細胞又は動物に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
- 請求項8に記載の組換えウイルス、又は請求項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
- 請求項8に記載の組換えウイルス、又は請求項9~11のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
- 請求項1~7のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。
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Citations (4)
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---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (28)
Title |
---|
"GenBank", Database accession no. AB044824.1 |
BRIESE ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U. S. A., vol. 89, 1992, pages 11486 - 11489 |
BRIESE, T.SCHNEEMANN, A.LEWIS, A. J.PARK, Y. S.KIM, S.LUDWIG, H.LIPKIN, W. I.: "Genomic organization of Borna disease virus", PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 91, no. 10, 1994, pages 4362 - 4366, XP002003352, doi:10.1073/pnas.91.10.4362 |
CUBITT, B.OLDSTONE, C.DE LA TORRE, J. C.: "Sequence and genome organization of Borna disease virus", J. VIROL., vol. 68, no. 3, 1994, pages 1382 - 1396 |
D. A. DEANB. S. DEANS. MULLERL. C. SMITH: "Sequence requirements for plasmid nuclear import", EXP. CELL. RES., vol. 253, 1999, pages 713 - 722 |
FERRE-D'AMARE, A. R.ZHOU, K.DOUDNA, J. A.: "Crystal structure of a hepatitis δ virus ribozyme", NATURE, vol. 395, no. 6702, 1998, pages 567 - 574 |
FUJINO, K. ET AL.: "Generation of a non- transmissive Borna disease virus vector lacking both matrix and glycoprotein genes", MICROBIOL IMMUNOL, vol. 61, September 2017 (2017-09-01), pages 380 - 386, XP055557615 * |
GARRY RF: "Proteomics computational analyses suggest that the bornavirus glycoprotein is a class III viral fusion protein (y penetrene", VIROL J., vol. 145, no. 6, 18 September 2009 (2009-09-18) |
INOUE ET AL., J. VIROL. METHODS, vol. 107, 2003, pages 229 - 236 |
J. A. SAWICKIR. J. MORRISB. MONKSK. SAKAIJ. MIYAZAKI: "A composite CMV-IE enhancer/b-actin promoter is ubiquitously expressed in mouse cutaneous epithelium", EXP. CELL RES., vol. 244, 1998, pages 367 - 369, XP002446693, doi:10.1006/excr.1998.4175 |
KEIZO TOMONAGA, BORNA BYO UIRUSU KANSEN TO CHUSUSHINKEI SHIKKAN, SAISHIN IGAKU, vol. 60, no. 2, February 2005 (2005-02-01), pages 79 - 85 |
KOBAYASHI TWATANABE MKAMITANI WZHANG GTOMONAGA KIKUTA K: "Borna disease virus nucleoprotein requires both nuclear localization and export activities for viral nucleocytoplasmic shuttling", J. VIROL., vol. 75, 2001, pages 3404 - 3412 |
KOMORIZONO R. ET AL., MICROBIOL IMMUNOL, vol. 60, 2016, pages 437 - 441 |
LE MERCIER ET AL., J. VIROL., vol. 76, 2002, pages 2024 - 2027 |
NAKAMURA, Y.TAKAHASHI, H.SHOYA, Y.NAKAYA, T.WATANABE, M.TOMONAGA, K.IWAHASHI, K.AMENO, K.MOMIYAMA, N.TANIYAMA, H.: "Isolation of Borna disease virus from human brain tissue", J. VIROL, vol. 74, 2000, pages 4601 - 4611 |
NIWA HYAMAMURA KMIYAZAKI J: "Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector", GENE, vol. 108, 1991, pages 193 - 199 |
NOWOTNY, N.KOLODZIEJEK, J.: "Isolation and characterization of a new subtype of Borna disease virus", J. GEN. VIROL., vol. 74, 2000, pages 5655 - 5658, XP001182110, doi:10.1128/JVI.74.12.5655-5658.2000 |
PEREZ ET AL., J. GEN. VIROL., vol. 84, 2003, pages 3099 - 3104 |
PLESCHKA, S.STAEHELI, P.KOLODZIEJEK, J.RICHT, J. A.NOWOTNY, N.SCHWEMMLE, M.: "Conservation of coding potential and terminal sequences in four different isolates of Borna disease virus", J. GEN. VIROL., vol. 82, 2001, pages 2681 - 2690, XP001182111 |
PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 52, no. 10, 2007, pages 1168 - 1174 |
SAWICHI ET AL., EXP. CELL RES., vol. 244, 1998, pages 367 - 369 |
See also references of EP3597759A4 |
U. SCHNEIDER ET AL., JOURNAL OF VIROLOGY, 2007, pages 7293 - 7296 |
WATANABE, Y.IBRAHIM, M. S.HAGIWARA, K.OKAMOTO, M.KAMITANI, W.YANAI, H.OHTAKI, N.HAYASHI, Y.TANIYAMA, H.IKUTA, K.: "Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility", MICROBES AND INFECTION, vol. 9, 2007, pages 417 - 427, XP005934786 |
YANAI ET AL., MICROBES AND INFECTION, vol. 8, 2006, pages 1522 - 1529 |
YANAI ET AL., MICROBES AND INFECTIONS, vol. 8, 2006, pages 1522 - 1529 |
YANAI ET AL.: "Materials and methods", MICROBES AND INFECTION, vol. 8, 2006, pages 1522 - 1529 |
ZHANG GKOBAYASHI TKAMITANI WKOMOTO SYAMASHITA MBABA SYANAI HIKUTA KTOMONAGA K: "Borna disease virus phosphoprotein represses p53-mediated transcriptional activity by interference with HMGB1", J. VIROL., vol. 77, 2003, pages 12243 - 12251 |
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