CN116790605B - 一种抑制流感病毒的siRNA的突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种抑制流感病毒的siRNA的突变体及其应用，属于抑制流感病毒技术领域。为了解决siRNA受长度的限制，导致对抑制病毒没有效果的技术问题。本发明提供一种抑制流感病毒的siRNA的突变体，将SEQ ID NO.9所示的基因序列的第2、3、5、6或7位点碱基进行突变获得正义链突变体，反义链的序列根据基因互补原则与正义链互补。进一步完善抗流感病毒研究，同时也为流感病毒的防控提供新策略以及新思路。

Description

一种抑制流感病毒的siRNA的突变体及其应用

技术领域

本发明属于抑制流感病毒技术领域，具体涉及一种抑制流感病毒的siRNA的突变体及其应用。

背景技术

流感病毒是一种可造成大规模急性呼吸道传染病的重要病原，也是一种重要的人畜共患病毒。流感病毒具有极强的传播力，主要通过飞沫传播，也可通过患者口腔、鼻腔等黏膜接触后造成直接或间接的传播。

由于流感病毒的基质蛋白以及核蛋白表面抗原的种类不同，可分为A、B、C、D四种类型。其中，A型流感病毒（IAV）具有较强的抗原变异性和较广的感染宿主范围，并可引起人类和其他动物严重的呼吸道疾病，对人类和动物的生命健康以及畜牧业的经济效益具有严重的危害性。B型流感病毒（IBV）通常与IAV共同传播，IBV的感染大多发生在儿童和青少年中，多项研究表明，确诊的流感病毒中20%-30%是由IBV引起的。此外，一项对猪的血清学调查表明猪对IBV也易感。C型流感病毒（ICV）在健康成人中引起的症状较轻，但是在儿童，特别是2岁以下儿童中，可引起严重的下呼吸道感染并发症。D型流感病毒（IDV）目前发现主要感染猪、牛等，尚未发现其能够对人类造成感染。

流感病毒是一种重要的人畜共患病病毒，能够引起人类和动物严重的呼吸道感染，对人类的生命健康以及畜牧业的经济效益存在严重的危害。目前，控制流感病毒传播的方法，主要分为两方面，即疫苗预防和药物治疗。由于流感病毒亚型较多并存在较强的变异性，疫苗需要不断地进行更新但其预防效果仍有待完善，而流感病毒治疗药物金刚烷胺、奥司他韦等各自都存在一定的不足和局限性。因此，寻找新的、灵活的、有效的流感病毒治疗方法显得十分迫切和必要。

与金刚烷胺、奥司他韦、扎那米韦等传统抗流感病毒药物相比，新型siRNA药物在抗流感病毒应用上的优势更大，具有可设计性强、特异性强、反应快速等优点，最主要的是siRNA药物能够在不依赖宿主免疫功能的情况下对流感病毒形成有效的抑制作用，但是有效的siRNA药物有一定数量的碱基长度，想要减少siRNA的长度还要维持药效是很有难度的，一旦减少一个碱基，siRNA的药效就可能会丧失，需要解决siRNA受长度的限制的技术问题。

发明内容

本发明的目的是为了寻找一种替代抗病毒药物的siRNA药物，解决siRNA受长度的限制，导致对抑制病毒没有效果的技术问题。

本发明提供一种抑制流感病毒的siRNA的突变体，将SEQ ID NO.9所示的基因序列的第2、3、5、6或7位点碱基进行突变获得正义链突变体，反义链的序列根据基因互补原则与正义链互补。

进一步地，所述突变体为以下任意一种：

（1）将SEQ ID NO .9所示基因序列中的第2位G碱基突变为C碱基作为正义链；反义链的序列如SEQ ID NO.16所示；

（2）将SEQ ID NO .9所示基因序列中的第3位A碱基突变为U碱基作为正义链；反义链的序列如SEQ ID NO.18所示；

（3）将SEQ ID NO .9所示基因序列中的第5位U碱基突变为A碱基作为正义链；反义链的序列如SEQ ID NO.22所示；

（4）将SEQ ID NO .9所示基因序列中的第6位C碱基突变为G碱基作为正义链；反义链的序列如SEQ ID NO.24所示；

（5）将SEQ ID NO .9所示基因序列中的第7位C碱基突变为G碱基作为正义链；反义链的序列如SEQ ID NO.26所示。

进一步地，所述流感病毒为A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒或D型流感病毒。

本发明提供一种治疗流感的药物，所述药物的活性成分如上述的抑制流感病毒的siRNA的突变体。

本发明提供一种上述的抑制流感病毒的siRNA的突变体在制备预防或治疗流感病毒感染的药物中的应用。

本发明提供一种含有上述的编码抑制流感病毒的siRNA的突变体的重组载体。

本发明提供一种含有上述的编码抑制流感病毒的siRNA的突变体的载体重组微生物细胞。

进一步地，所述微生物细胞是A549细胞。

本发明提供上述的重组微生物细胞在制备预防或治疗流感疾病的疫苗中的应用。

有益效果：将SEQ ID NO.9所示的基因序列的第2、3、5、6或7位点碱基进行突变获得正义链突变体，反义链的序列根据基因互补原则与正义链互补获得，该特异siRNA（SEQID NO.9所示的基因序列）对流感病毒发挥抑制作用的siRNA short-2（该特异siRNA5’端截短2bp后的siRNA序列）；siRNA short-3（该特异siRNA5’端截短3bp后的siRNA序列，）的siRNA第2、3、5、6、7位替换后该长度的siRNA序列又恢复了原始长度即SEQ ID NO.9的siRNA对流感病毒的抑制作用。

附图说明

图1为特异siRNA表达AASDHPPT作用的结果图；其中，（A）PCR检测该特异siRNA对AASDHPPT蛋白干扰效率的结果图；（B）Western Blot检测该特异siRNA对AASDHPPT蛋白干扰效率的结果图；（C）该特异siRNA对细胞活力的影响的结果图；

图2为特异siRNA抑制流感病毒WSN（A型流感病毒A/WSN/33）复制的结果图；其中，（A）转染特异siRNA对流感病毒WSN在细胞中增殖的影响的结果图；（B）转染特异siRNA对流感病毒NP蛋白合成的影响的结果图；

图3为转染该特异siRNA对流感病毒蛋白的表达作用的结果图；

图4为特异siRNA抑制流感病毒vRNP复合体入核结果图；

图5为特异siRNA对VSV（水疱性口炎病毒）复制影响的结果图；其中，（A）WesternBlot检测转染该特异siRNA对VSV的影响的结果图；（B）倒置荧光显微镜观察转染该特异siRNA对VSV的影响的结果图；

图6为特异siRNA在不同细胞上对流感病毒的影响的结果图；其中，（A）WesternBlot检测转染该特异siRNA在293T细胞上对流感病毒NP蛋白的影响的结果图；（B）蚀斑实验检测转染该特异siRNA在293T细胞上对流感病毒WSN复制的影响的结果图；（C）WesternBlot检测转染该特异siRNA在CEF细胞上对流感病毒NP蛋白的影响的结果图；（D）蚀斑实验检测转染该特异siRNA在CEF细胞上对流感病毒WSN复制的影响的结果图；

图7为特异siRNA对其他亚型流感病毒复制的影响结果图；（A）特异siRNA对H5N1亚型流感病毒复制的影响的结果图；（B）特异siRNA对H7N9亚型流感病毒复制的影响的结果图；

图8为特异siRNA序列比对的结果图；

图9为特异siRNA在AGO2敲除细胞系中的作用的结果图；其中，（A）蛋白水平验证AGO2被敲除的结果图；（B）基因水平验证AGO2被敲除的结果图；（C）特异siRNA在AGO2敲除细胞中不影响流感病毒WSN复制的结果图；

图10为FAM荧光标记特异siRNA负链对流感病毒抑制作用的结果图；其中，（A）蚀斑实验检测转染反义链荧光标记该特异siRNA对病毒复制的影响的结果图；（B）Western Blot检测转染反义链荧光标记该特异siRNA对NP的影响的结果图；（C）激光共聚焦检测转染反义链荧光标记该特异siRNA对NP入核的影响的结果图；

图11为FAM荧光标记特异siRNA正义链对流感病毒抑制作用的结果图；其中，（A）蚀斑实验检测转染正义链荧光标记该特异siRNA对病毒复制的影响的结果图；（B）WesternBlot检测转染正义链荧光标记该特异siRNA对NP的影响的结果图；（C）激光共聚焦检测转染正义链荧光标记该特异siRNA对NP蛋白入核的影响的结果图；

图12为特异siRNA长度对其功能影响的结果图；其中，（A）Western Blot检测转染截短后特异siRNA对NP的影响的结果图；（B）蚀斑实验检测转染截短后特异siRNA对病毒复制的影响的结果图；

图13为特异siRNA碱基对其功能影响的结果图；其中，（A）第1、4、8、9、10、11、12、13、14、15、16位点碱基突变后该siRNA对流感病毒复制的影响的结果图；（B）第2、3、5、6、7位点突变后该siRNA对流感病毒复制的影响的结果图。

具体实施方式

文献1-3是记载本发明中涉及到病毒：

1.Wang G#, Zhao Y#, Zhou Y#, Jiang L, Liang L, Kong F, Yan Y, Wang X,Wang Y, Wen X, Zeng X, Tian G, Deng G, Shi J, Liu L, Chen H*, Li C*. 2022.PIAS1-mediated SUMOylation of influenza A virus PB2 restricts viralreplication and virulence. PLoS Pathogens, 18(4):e1010446. 记载A/WSN/33（H1N1）、A/Anhui/2/2005（H5N1）和A/Anhui/1/2013（H7N9）；

2.Wang X, Jiang L, Wang G, Shi W, Hu Y, Wang B, Zeng X, Tian G, DengG, Shi J, Liu L, Li C*, Chen H*. 2022. Influenza A virus use of BinCARD1 tofacilitate the binding of viral NP to importin α7 is counteracted by TBK1-p62axis-mediated autophagy. Cellular&Molecular Mol Immunology 19(10):1168-1184.记载A/WSN/33（H1N1）、A/Anhui/2/2005（H5N1）和A/Anhui/1/2013（H7N9）；

3.Wang G, Jiang L, Wang J, Zhang J, Kong F, Li Q, Yan Y, Huang S,Zhao Y, Liang L, Li J, Sun N, Hu Y, Shi W, Deng G, Chen P, Liu L, Zeng X,Tian G, Bu Z, Chen H, Li C*. 2020. The G Protein-Coupled Receptor FFAR2Promotes Internalization during Influenza A Virus Entry. Journal of Virology94: e01707-19.记载A/WSN/33（H1N1）、A/Anhui/2/2005（H5N1）。

VSV为水疱性口炎病毒；WSN为A型流感病毒A/WSN/33（H1N1）。

实施例1. 特异siRNA有效抑制流感病毒复制

1.合成特定目的RNA序列的siRNA及对照Scrambled siRNA（表1）。

2.将合成好的siRNA包装管于高速离心机中离心，10000 rpm离心2 min。按照终浓度20 pmol/μL向siRNA包装管中加入相应体积的RNase Free H₂O，吹吸混匀，并将其分装于1.5mL RNase Free EP管中保存于-40℃冰箱以备后续使用。将siRNA与RNAiMAX试剂按照1：2的比例加入到含Opti-MEM溶液的1.5 mL RNase Free EP管，吹吸混匀，静置25 min。在此期间，用预热好的胰酶消化细胞并收集到15 mL离心管中，于1800 rpm离心2 min。将离心好的细胞，弃掉上清，并用1mL培养基重悬，按照1：1.5（A549细胞）或1：3（293T细胞）的比例加入到12孔细胞培养板内，再向12孔细胞培养板中加入100μL静置好的混合液体，摇匀后将其放置于37℃细胞培养箱中培养36 h-48 h后即可开展后续实验。

表1 siRNA序列

病毒蚀斑滴定实验：该实验开始前需要收集不同实验组的A/WSN/33 （H1N1）病毒感染细胞后24 h、48 h的上清并于-80℃保存，以及配置2×MEM溶液。首先将MDCK细胞按照一定比例均匀铺在12孔板内，待孔内细胞长满后，方可进行病毒噬斑滴定实验。其次，将配置好的2×MEM溶液用高压灭菌ddH₂O稀释成1×MEM溶液，把收集好的24 h、48 h上清样品用1×MEM溶液按照10倍倍比进行稀释，24 h上清样品稀释4个梯度，48 h上清样品稀释5个梯度，稀释后，将稀释好的样品放置于冰盒内。然后，将之前铺好的MDCK细胞板取出，倒掉其中的培养基，并用1×MEM溶液滤洗两遍，吸净残余液体弃掉后加入100 μL稀释好的病毒上清样品，慢慢摇晃均匀后放置于37℃温箱感染1 h，每隔15 min摇晃一次。在此期间，将配置好的2%低熔点胶（按照2%的比例将sea plaque试剂加入到高压灭菌ddH₂O中）放置于微波炉中煮沸后，放置于室温冷却降温，再将其放置于55℃水浴锅中保存。病毒感染快结束时，将2×MEM和2%低熔点胶按照1：1的比例混匀，并向均匀液体中加入0.5 μg/mL的TPCK胰酶，并放置于37℃水浴锅中保存。待病毒感染结束后，吸净病毒液弃掉，每孔加入1 mL含TPCK胰酶的2%低熔点胶，静置20 min-30 min，待孔内低熔点胶凝固后，将12孔板倒扣放置于37℃细胞培养箱培养。培养48 h后，取出12孔板，用***溶液常温固定8 h。固定后，用流水冲掉***溶液和底部凝胶，倒扣晾干。最后，对12孔板内蚀斑进行计数并按照MOI=PFU*V/细胞个数公式计算病毒滴度。2×MEM按照如下配比进行配制。

10xMEM100 ml

Sodium Bicarbonate（7.5%）30 ml

50×MEM Amino Acids20 ml

MEM Vitamin10 ml

Glutamin10 ml

PenStrep10 ml

HEPES10 ml

BSA10 ml

ddH₂OTo 500 ml。

细胞活力测定实验：将不同组中的siRNA转入到A549细胞中，吹吸混匀。每孔吸取100 μL混合液体加入到96孔板内（每个实验组做3个重复），于37℃细胞培养箱培养48 h。培养结束后，避光条件下每孔加入100 μL细胞活力检测试剂，于40 rpm摇床常温避光孵育2min。随后用GLOMAX^TM96 microplate luminometer仪器检测细胞活力值，将结果导出保存，并按照公式进行进一步计算。

病毒感染实验：

实验前需配制病毒维持液，感染A549细胞时病毒维持液是TPCK胰酶浓度为0.125μg/mL的Opti-MEM混合液，感染293T细胞时病毒维持液是TPCK胰酶浓度为0.05μg/mL的Opti-MEM混合液。根据实验设计，将12孔细胞培养板内的细胞用病毒维持液滤洗两遍，吸净残余液体，每孔中加入100μL含1x10⁴（MOI=0.01）或5x10⁶个病毒粒子（MOI=5）的病毒液，于细胞培养箱中感染1h，每隔10min摇晃一次细胞板。待感染结束后，将细胞板取出，弃掉其中的病毒液，并向孔内加入1mL的病毒维持液后，于细胞培养箱中培养。

实验效果：1.特异siRNA显著下调AASDHPPT蛋白的表达并不影响细胞活力

1.将表1中的特异siRNA片段（实验组）与对照Scrambled siRNA（对照组）分别转染至A549细胞中，每组转染的量是30pmol，每个组中重复转染三份，转染后36 h裂解细胞，提取其RNA并反转录获得cDNA，进而进行荧光定量PCR（引物序列见下表2）检测AASDHPPT的表达水平，结果如图1显示该特异siRNA能将AASDHPPT的表达水平降低至3.166%。此外，将转染后的细胞裂解进行Western Blot检测。

表2 荧光定量引物

实验结果表明该特异siRNA在基因和在蛋白水平均能有效降低AASDHPPT的表达。同时，也验证了该siRNA能够有效降低AASDHPPT的表达但不影响细胞活性。

2.特异siRNA显著抑制流感病毒的复制：为确定该特异siRNA对流感病毒的影响，将表1中的特异siRNA（实验组）与对照Scrambled siRNA（对照组）分别转染至A549细胞中，每组转染的量是30pmol，每个组中重复转染三组，获得转染后的细胞，36 h后分别感染A/WSN/33 （H1N1） （MOI=0.01）病毒，并于24 h、48 h收集细胞上清，进行病毒蚀斑滴定实验。

病毒蚀斑滴定结果表明该特异siRNA（实验组）对H1N1亚型流感病毒的复制具有显著的抑制作用，在病毒感染后24h和48 h抑制倍数分别约为450倍600倍（图2中的A）。同时，为了加以验证该特异siRNA对H1N1亚型流感病毒的抑制作用，我们又检测了该特异siRNA对病毒NP蛋白表达的影响，于感染后2 h、4 h、6 h、8 h裂解细胞并进行Western Blot检测（图2中的B）,NP蛋白表达量均呈现明显降低。

3.特异siRNA抑制流感病毒蛋白的表达：在已经确定该特异siRNA对流感病毒的NP蛋白表达存在显著抑制作用的基础上，为了明确该特异siRNA对流感病毒其他蛋白表达水平的影响。将表1中特异siRNA通过外源转染技术转入A549细胞后，转染的量是30pmol，重复转染三组，以MOI=5感染WSN病毒，并于感染后0 h、3 h、6 h、9 h裂解细胞样品，检测流感病毒PB1、PB2、M2、NS1、HA、PA蛋白的表达情况。

实验结果表明，该siRNA转入A549细胞后对流感病毒的蛋白表达均存在抑制作用（图3）。

4.特异siRNA抑制流感病毒vRNP复合体入核：流感病毒的复制过程包括吸附、内吞、膜融合、脱衣壳、入核、转录、复制以及装配与释放等过程。为了确定该特异siRNA对流感病毒生命周期的影响，首先将表1中的siRNA通过外源转染技术转入A549细胞内，转染的量是30pmol，重复转染三组，以MOI=5感染WSN病毒，并于感染后2 h、4 h、6 h、8 h固定样品，通过激光共聚焦显微镜观察实验组和对照组NP蛋白在A549细胞中的定位差异。

实验结果表明，在感染2 h时，对照组的NP蛋白已经进入细胞核，而转染该特异siRNA实验组的NP仍然被阻滞在细胞核外（图4），表明该特异siRNA影响流感病毒vRNP复合体入核过程或者入核之前的阶段，具体阶段待进一步研究。

特异siRNA对VSV-GFP复制无影响：为确定该特异siRNA对其它单股负链RNA病毒是否存在抑制作用，选用VSV-GFP（单股负链RNA病毒且内吞后进入细胞）作为代表毒株进行验证。通过倒置荧光显微镜对比表1中的转染该特异siRNA（实验组）和对照Scrambled siRNA（对照组） 转染293T细胞，每组转染的量是30pmol，重复转染三组，而后感染VSV-GFP病毒后12 h后观察GFP荧光强度，发现实验组与对照组荧光强度无明显差异。结果表明该特异siRNA对VSV-GFP的复制无显著影响（图5）。

6.特异siRNA在不同细胞系上对流感病毒的作用：为确定该特异siRNA在其他细胞上对流感病毒是否存在显著的抑制作用，将表1中特异siRNA（实验组）与对照ScrambledsiRNA（对照组）转染至293T细胞和CEF细胞中，每组转染的量是30pmol，重复转染三组，待36h后，感染WSN病毒，于感染后2 h、4 h、6 h、8 h裂解细胞进行Western Blot实验，同时吸取感染病毒24 h和48 h细胞上清液进行病毒蚀斑滴定实验。

实验结果表明，该特异siRNA在293T细胞上对流感病毒的抑制作用急剧减弱，抑制倍数下降到约为15倍（图6中的A，图6中的B），在CEF细胞上对流感病毒的复制未检测到明显的抑制作用（图6中的C，图6中的D）。

7.特异siRNA对不同亚型流感病毒复制的影响：该特异siRNA对WSN（H1N1）的复制有显著的抑制作用，为确定该特异siRNA对流感病毒的调控作用是否具有广谱性，选用A/Anhui/2/2005（H5N1）和A/Anhui/1/2013（H7N9）这两株具有高致病性的流感毒株作为其他亚型流感病毒代表毒株。将表1中特异siRNA（实验组）与对照Scrambled siRNA（对照组）转染至A549细胞中，每组转染的量是30pmol，重复转染三组，36 h后以MOI=0.1感染AH05（H5N1）以及AH13 （H7N9）病毒，并于24 h、48 h后收取细胞上清液进行病毒蚀斑滴定实验。该评估相关实验均在生物安全3级实验室内完成。

结果表明，该特异siRNA对AH05 （H5N1）以及AH13 （H7N9）病毒均存在显著的抑制作用，抑制倍数分别为病毒感染后24 h为400倍（H5N1），145倍（H7N9）；在病毒感染后48小时分别达到330倍（H5N1），400倍（H7N9），即该特异siRNA在调控不同亚型流感病毒复制上的抑制作用具有广谱性（图7）。

将siRNA序列通过BLAST比对，找到表1中的特异siRNA序列所靶向的目的蛋白为AASDHPPT，比对结果见图8。随后以该特异siRNA靶向的AASDHPPT蛋白为基础展开研究，但经过多次反复验证后发现该特异siRNA对流感病毒功能抑制作用的发挥独立于AASDHPPT蛋白，即只有这一条降低AASDHPPT蛋白表达的siRNA对流感病毒具有显著的抑制作用，而其他能够降低AASDHPPT蛋白表达的siRNA以及AASDHPPT蛋白敲除细胞系均不能够对流感病毒起到等同于该特异siRNA的抑制效果，为了进一步排除AASDHPPT的影响，构建了AASDHPPT过表达细胞系，结果表明该细胞系同样对流感病毒复制无明显影响。之后，从该特异siRNA本身对流感病毒发挥抑制作用机制角度进行深入探究分析。在本研究中，首先明确了该特异siRNA对流感病毒的抑制作用，同时发现其对流感病毒多种病毒蛋白的表达均存在明显抑制作用且显著抑制NP蛋白的入核进程。其次，评估了该特异siRNA对VSV-GFP的影响，发现其对VSV-GFP的复制无明显影响。同时，评估了该特异siRNA在不同细胞上对流感病毒复制的抑制作用，发现其在293T细胞上对流感病毒复制的抑制作用显著下降，抑制倍数为15倍左右，在CEF细胞上对流感病毒的复制未检测到明显的影响。

综上所述明确了表1中特异siRNA对流感病毒复制和多种病毒蛋白的抑制作用，同时评估了其对不同病毒株的影响以及其在不同细胞上对流感病毒复制的影响。

实施例2.特异siRNA对流感病毒产生抑制作用的序列特征

siRNA干扰实验：根据实验室前期研究发现以及实验内容设计并合成特定的目标RNA序列的siRNA及对照Scrambled siRNA（表3）。

将合成好的siRNA包装管于高速离心机中离心，10000 rpm离心2 min。按照终浓度20 pmol/μL向siRNA包装管中加入相应体积的RNase Free H₂O，吹吸混匀，并将其分装于1.5 mL RNase Free EP管中保存于-40℃冰箱以备后续使用。将siRNA与RNAiMAX试剂按照1：2的比例加入到含Opti-MEM溶液的1.5 mL RNase Free EP管，吹吸混匀，静置25 min。在此期间，用预热好的胰酶消化细胞并收集到15 mL离心管中，于1800 rpm离心2 min。将离心好的细胞，弃掉上清，并用1mL培养基重悬，按照1：1.5（A549细胞）或1：3（293T细胞）的比例加入到12孔细胞培养板内，再向12孔细胞培养板中加入100μL静置好的混合液体，摇匀后将其放置于37℃细胞培养箱中培养36 h-48 h后即可开展后续实验。

表3siRNA序列

SiRNA序列的最后有“TT”碱基是保护碱基。

AGO2敲除细胞系的构建：

（1）首先设计针对AGO2蛋白不同外显子的sgRNA（表3），并配置如下体系：

10x T4 DNA Ligase Buffer1 μL

T4 PNK（1000 units/mL）1 μL

AGO2 sgRNA F（100 μm）1 μL

AGO2 sgRNA R（100 μm）1 μL

ddH₂OTo 10 μL

反应程序：37℃ 30 min，95℃ 5 min，再进行每分钟5℃的梯度降温至25℃

（2）其次酶切PX458载体，选用BbsI内切酶，配制如下体系：

PX458 pSpCas91 μL

10X FastDigest Buffer2 μL

FastDigest BbsI （20000 units/mL）1 μL

FastAP1 μL

ddH₂OTo 10 μL

按照反应程序反应：37℃ 30 min。并将反应后的体系胶回收。

（3）最后将酶切PX458载体与退火后的sgRNA连接，配制如下体系：

酶切好的PX458载体 （100 ng/μL）1 μL

稀释后sgRNA（50倍比稀释）2 μL

10XT4 DNA Ligase Buffer1 μL

T4 DNA Ligase400,000 units/ml1 μL

ddH₂OTo 10 μL

按照反应程序反应：16℃ 6 h。

（4）将连接好的载体进行转化，摇菌，小提，测序，将阳性结果进行中提。

（5）将阳性质粒电转入A549细胞中，电转后，于37℃细胞培养箱中培育8 h后换液，并于24 h小时后进行单细胞分选，分选后的单个细胞，不断扩大培养。同时对分选后的细胞在蛋白和基因水平上进行敲除验证。

表4 AGO2敲除所用引物

实验效果：1.特异siRNA发挥作用方式为siRNA经典途径

双链siRNA发挥作用都需要结合到含有AGO2蛋白的Dicer复合体上，由Dicer复合体将双链siRNA解旋成为单链，再进而对目的mRNA进行靶向裂解。因此，为了验证该特异siRNA发挥作用是否通过siRNA发挥作用的经典途径，靶向裂解目的mRNA。本研究通过构建敲除AGO2的A549细胞系，确定在缺失AGO2的情况下，该特异siRNA是否仍能发挥对流感病毒的抑制作用。

将表1中特异siRNA（实验组）与对照Scrambled siRNA（对照组）转染至AGO2的敲除细胞系中，按照AGO2敲除细胞系的构建的方法，每组转染三个重复。在外源转染后的36 h，以MOI=0.01感染WSN病毒，并于感染后24 h、48 h收集细胞上清进行病毒蚀斑滴定实验。

结果如图9所示，当敲除AGO2蛋白后，再外源转染该特异siRNA则其几乎失去对流感病毒的复制作用，即该特异siRNA发挥对流感病毒的抑制作用是需要AGO2蛋白的存在的，也是siRNA发挥作用的经典途径。

2.特异siRNA反义链标记荧光不会影响其对流感病毒的抑制作用：为了明晰该特异siRNA进入细胞中的动态过程，采用羧基荧光素（FAM）标记。先将FAM荧光标记于特异siRNA的反义链（UUCGGGUAAGGAUUCGAUGTT），观察该特异siRNA进入细胞的动态过程，同时对FAM荧光标记后的特异siRNA是否会对病毒复制产生影响进行验证。将新合成的siRNA（FAM-UUCGGGUAAGGAUUCGAUGTT和CAUCGAAUCCUUACCCGAATT）实验组与表1中的对照ScrambledsiRNA（对照组）转染至A549细胞中，每组转染的量是30pmol，每个组中重复转染三次，待36h后，感染WSN病毒，收集24 h、48 h细胞上清液进行蚀斑滴定实验。实验结果表明，将荧光标记于反义链5’端时该特异siRNA对流感病毒的抑制作用无影响（图10中的A）。进行WesternBlot实验，于感染H1N1病毒后2 h、4 h、6 h、8 h后裂解细胞，收取样品，实验结果表明，将荧光标记于反义链5’端时对该特异siRNA对流感病毒NP蛋白表达量无明显影响（图10中的B）。同时，通过激光共聚焦实验观察荧光标记于反义链5’端时该特异siRNA对vRNP入核的影响不改变，实验结果表明，荧光标记于反义链5’端时该特异siRNA对vRNP入核的影响不改变（图10中的C）。

3.特异siRNA正义链标记荧光影响其对流感病毒的抑制作用：同样，将FAM荧光标记于特异siRNA正义链（ CAUCGAAUCCUUACCCGAATT），观察其进入细胞的动态过程以及确定荧光标记该特异siRNA对流感病毒的抑制作用影响，将荧光标记于特异siRNA正义链的5’端。将新合成的siRNA（FAM-CAUCGAAUCCUUACCCGAATT和UUCGGGUAAGGAUUCGAUGTT）实验组与表1中的对照Scrambled siRNA（对照组）转染至A549细胞中，每组转染的量是30pmol，每个组中重复转染三组，待36 h后，感染WSN病毒，收集24 h、48 h细胞上清液进行病毒蚀斑滴定实验。

实验结果表明，将荧光标记于正义链5’端时会消除该特异siRNA对流感病毒的抑制作用（图11中的A）。进行Western Blot实验，于感染病毒后2 h、4 h、6 h、8 h后裂解细胞，收取样品，实验结果表明，将荧光标记于正义链5’端时对该特异siRNA对流感病毒NP蛋白的表达量无明显影响（图11中的B）。同时，通过激光共聚焦实验观察荧光标记于正义链5’端时该特异siRNA对vRNP入核有无影响，实验结果表明，荧光标记于正义链5’端时该特异siRNA对vRNP入核无影响（图11中的C）。

实施例3.截断的特异siRNA在抑制流感病毒中的应用

确定特异siRNA对流感病毒发挥抑制作用最短长度：为确定该特异siRNA自身碱基长度对流感病毒发挥抑制作用的影响，将原始的特异siRNA（表3中特异siRNA-sense和特异siRNA-antisense）从5’端或3’端每次截短1bp。首先，将从5’端截短1bp后的新siRNA（表3中特异siRNA short-1-sense和特异siRNA short-1-antisense）与对照Scrambled siRNA转染至A549细胞中，每组转染的量是30pmol，每个组中重复转染三次，待36 h后，感染WSN病毒，于感染病毒后2 h、4 h、6 h、8 h裂解细胞进行Western Blot实验，同时吸取感染病毒后24 h和48 h细胞上清液进行病毒蚀斑滴定实验。依次将特异siRNA从5’端截短2bp（特异siRNAshort-2-sense和特异siRNA short-2-antisense）、3bp（特异siRNA short-3-sense和特异siRNA short-3-antisense），将原始的特异siRNA从5’端截短2bp，3’端截短1bp（特异siRNA short-4-sense和特异siRNA short-4-antisense），siRNA序列重复上述实验操作。实验结果如图12表明，截短后的新siRNA序列（siRNA short-1和siRNA short-2）依然具有与原始的siRNA对流感病毒相当的抑制作用，实验结果表明，截短后的siRNA short-1和siRNA short-2的新siRNA序列依然具有与原始的特异siRNA对流感病毒相当的抑制作用，siRNA short-1在病毒感染24h和48h后检测抑制病毒生长的倍数分别约为190倍和510倍，siRNA short-2在病毒感染24h和48h后的抑制倍数约为140倍和480倍，截短后的新siRNA序列（siRNA short-3和siRNA short-4）对流感病毒无抑制作用。即若保持对流感病毒存在抑制作用，从5’端最多可去掉两个碱基。其次，从siRNA short-2（从5’端截短保持抑制作用的最短长度）siRNA的3’端每次截短1bp。将从3’端依次截短1bp后的新siRNA与对照ScrambledsiRNA转染至A549细胞中，待36 h后，感染病毒，于感染病毒后2 h、4 h、6 h、8 h裂解细胞进行Western Blot实验，同时吸取感染病毒24 h和48 h细胞上清液进行噬斑滴定实验。实验结果表明，siRNA short-2（从5’端截短2bp的siRNA）的3’端截短1bp后对流感病毒即无抑制作用。综上所述，该特异siRNA对流感病毒发挥抑制作用的最短长度为siRNA short-2，即从5’端去掉2个bp后。

特异siRNA对流感病毒发挥抑制作用的关键碱基：为确定该特异siRNA对流感病毒发挥抑制作用的重要碱基，采用单个碱基替换的方法，将上一步中获得的对流感病毒无抑制作用的长度为siRNA short-3从5’端依次进行单个碱基互补替换，将替换后的新siRNA序列与对照Scrambled siRNA转染至A549细胞中，每组转染的量是30pmol，每个组中重复转染三次，待36h后，以MOI=0.01感染WSN病毒，同时吸取感染病毒24 h和48 h后细胞上清液进行病毒蚀斑滴定实验。结果如图13所示，进行单个碱基互补替换的16条siRNA中，第1（特异siRNA mutation-1-sense）、4（特异siRNA mutation-4-sense）、8（特异siRNA mutation-8-sense）、9（特异siRNA mutation-9-sense）、10（特异siRNA mutation-10-sense）、11（特异siRNA mutation-11-sense）、12（特异siRNA mutation-12-sense）、13（特异siRNAmutation-13-sense）、14（特异siRNA mutation-14-sense）、15（特异siRNA mutation-15-sense）、16（特异siRNA mutation-16-sense）位点碱基进行单个互补替换之后，蚀斑滴定实验中空斑数目仍然与siRNAshort-3 siRNA个数大致相同，而与原始siRNA个数不同。然而，第2（特异siRNA mutation-2-sense）、3（特异siRNA mutation-3-sense）、5（特异siRNAmutation-5-sense）、6（特异siRNA mutation-6-sense）、7（特异siRNA mutation-7-sense）位点碱基进行单个互补替换之后，蚀斑滴定实验中空斑数目仍然与原始siRNA个数大致相同。实验结果表明，siRNAshort-3第2、3、5、6、7位点突变后会恢复其对流感病毒的抑制作用，抑制效果与原始的特异siRNA（表3中特异siRNA-sense和特异siRNA-antisense）基本相同。综上，将SEQ ID NO.9所示的基因序列的第2、3、5、6或7位点碱基进行突变获得正义链突变体，反义链的序列根据基因互补原则与正义链互补获得，该特异siRNA（SEQ ID NO.9所示的基因序列）对流感病毒发挥抑制作用的最短序列是siRNA short-2（该特异siRNA5’端截短2bp后的siRNA序列）；siRNA short-3（该特异siRNA5’端截短3bp后的siRNA序列）的siRNA第2、3、5、6、7位替换后该长度的siRNA序列又恢复了原始长度即特异siRNA-sense的siRNA对流感病毒的抑制作用。

Claims (7)

1.一种抑制流感病毒的siRNA的突变体，其特征在于，将SEQ ID NO.9所示的基因序列的第2、3、5、6或7位点碱基进行突变获得正义链突变体，反义链的序列根据基因互补原则与正义链互补；

所述突变体为以下任意一种：

（1）将SEQ ID NO .9所示基因序列中的第2位G碱基突变为C碱基作为正义链；反义链的序列如SEQ ID NO.16所示；

（2）将SEQ ID NO .9所示基因序列中的第3位A碱基突变为U碱基作为正义链；反义链的序列如SEQ ID NO.18所示；

（3）将SEQ ID NO .9所示基因序列中的第5位U碱基突变为A碱基作为正义链；反义链的序列如SEQ ID NO.22所示；

（4）将SEQ ID NO .9所示基因序列中的第6位C碱基突变为G碱基作为正义链；反义链的序列如SEQ ID NO.24所示；

（5）将SEQ ID NO .9所示基因序列中的第7位C碱基突变为G碱基作为正义链；反义链的序列如SEQ ID NO.26所示。

2.根据权利要求1所述的抑制流感病毒的siRNA的突变体，其特征在于，所述流感病毒为A型流感病毒。

3.一种治疗流感的药物，其特征在于，所述药物的活性成分是权利要求1或2所述的抑制流感病毒的siRNA的突变体。

4.权利要求1所述的抑制流感病毒的siRNA的突变体在制备预防或治疗流感病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述流感病毒为A型流感病毒。

5.一种含有权利要求1所述的抑制流感病毒的siRNA的突变体的重组载体。

6.一种含有权利要求1所述的抑制流感病毒的siRNA的突变体的载体重组微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为A549细胞。

7.权利要求6所述的重组微生物细胞在制备预防或治疗流感疾病的疫苗中的应用，其特征在于，所述流感病毒为A型流感病毒。