JP7369385B2 - サイトメトリーのための方法及びシステム - Google Patents
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Description
[001] 本出願は、2018年6月13日に出願された「METHODS AND SYSTEMS FOR CYTOMETRY」と題する米国仮特許出願第62/684,612号、2018年7月20日に出願された「METHODS AND SYSTEMS FOR CYTOMETRY」と題する米国仮特許出願第62/701,395号、2019年2月12日に出願された「METHODS AND SYSTEMS FOR CYTOMETRY」と題する米国仮特許出願第62/804,560号、及び2019年5月15日に出願された「METHODS AND SYSTEMS FOR CYTOMETRY」と題する米国仮特許出願第62/848,478,478号の利益を主張するものであり、これらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
[0016] 本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
[00175] 本開示は、開示の方法及びシステムを実施するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図13は、中央処理装置(CPU、本明細書では「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」とも呼ばれる)1305を含むコンピュータシステム1301を示し、中央処理装置は、シングルコア又はマルチコアプロセッサ、又は並列処理のための複数のプロセッサとすることができる。コンピュータシステム1301はまた、メモリ又はメモリ位置1310(例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ)、電子記憶装置1315(例えば、ハードディスク)、1つ又は複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース1320(例えば、ネットワークアダプタ)、並びにキャッシュ、他のメモリ、データストレージ及び/又は電子ディスプレイアダプタなどの周辺デバイス1325を含む。メモリ1310、記憶装置1315、インターフェース1320、及び周辺デバイス1325は、マザーボードなどの通信バス(実線)を介してCPU1305と通信する。記憶装置1315は、データを記憶するためのデータ記憶装置(又はデータリポジトリ)であり得る。コンピュータシステム1301は、通信インターフェース1320の助けを借りてコンピュータネットワーク(「ネットワーク」)1330に動作可能に結合することができる。ネットワーク1330は、インターネット、インターネット及び/又はエクストラネット、又はインターネットと通信するイントラネット及び/又はエクストラネットとすることができる。ネットワーク1330は、場合によっては、電気通信及び/又はデータネットワークである。ネットワーク1330は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる1つ又は複数のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク1330は、場合によってはコンピュータシステム1301の助けを借りて、コンピュータシステム1301に結合されたデバイスがクライアント又はサーバとして動作することを可能にし得るピアツーピアネットワークを実装することができる。
実施例1:材料及び方法
[00187] 本研究で使用した全ての光電子増倍管は、Hamamatsu Photonics Inc.から購入した。図2、3B及び3Cでは、PMT信号は、オシロスコープ(8ビット、1GHz、Tektronix)を使用して106オーム抵抗を使用して記録された。増幅器(H10723-210MOD2)を内蔵した10MHzの帯域幅を有するPMTを青色及び緑色信号の検出に使用し、電流増幅器(HCA-40M-100K-C,FEMTO)に接続された別のPMT(7422-40)を赤色信号の検出に使用した。
[00210] システム全体について、検出可能なフルオロフォアの最小数は、モデルフルオロフォアがフルオレセイン分子であり、PMTが単一光子を検出することができ、フルオロフォアが光飽和から遠く、ダイクロイックミラー及びバンドパスフィルタによる光損失が無視できるという仮定の下で、以下のように推定することができる。
[00217] 図2A~2Gは、運動ベースの圧縮蛍光イメージングの実証を示す。SIモード及びSDモードのための光学セットアップを、それぞれ図2A及び図2Bに示す。蛍光ビーズの凝集体を、電子並進ステージを用いて光学構造を横切ってガラスカバースリップ上で移動させた。図2(c)に示すように、SIモードの場合、ビーズが運動に応じて構造化照明を通過し、蛍光強度の時間波形が生成される。図2Dに示されるように、この取得された時間信号から、2D蛍光イメージがコンピュータ的に再構成される。図2Eに示すように、SDモードの場合、ビーズは均一な光によって照射される。次いで、ビーズの結合蛍光イメージは、構造化ピンホールアレイを通過し、時間波形の生成をもたらす。図2Fに示すように、この時間信号から、2D蛍光イメージがコンピュータ的に再構成される。図2Gは、アレイピクセルカメラを用いて得られた、同じ凝集ビーズの蛍光イメージを示す。
[00219] 図3A~3Dは、GCによる多色及びハイスループット蛍光細胞イメージングの実証を示す。図3Aは、多色運動ベースの圧縮蛍光イメージング(SDモード)のための光学セットアップを示す。このセットアップは、ダイクロイックミラーによって結合された励起光源として、コヒーレントな473nm波長の青色レーザ及びインコヒーレントな375nm波長のUV LEDを利用した(図7)。実験は、それぞれ赤色、緑色及び青色に蛍光染色された膜、細胞質及び核を有する培養MCF-7細胞を使用した。標識された細胞が電子並進ステージで移動すると、それらの結合イメージは光学エンコーダを通過し、時間波形を生成する。次いで、信号を、ダイクロイックミラーを使用して(i)赤色、(ii)緑色、及び(iii)青色の3色チャネルに分割し、異なるPMTによって最終的に記録し、代表的なトレースを図3Bに示す。図3Cに示されるように、各PMTについての時間信号から、標識された細胞の蛍光イメージを、それぞれ赤色(図3Cのパネル(i))、緑色(図3Cのパネル(ii))、及び青色(図3Cのパネル(iii))でコンピュータ的に復元した。図3Cのパネル(iv)は、図3Cのパネル(i)、(ii)、及び(iii)から組み合わされた擬似カラー多色イメージを示す。図3Cのパネル(iv)は、アレイピクセルカラーカメラを使用して取得された多色蛍光イメージを示す。10,000細胞/秒を超えるスループット速度で流れる細胞の多色サブミリ秒蛍光イメージングを図3Dに示す。実験では、488nm波長の青色レーザ及び405nm波長の紫色レーザが回折光学素子を通過して、細胞流に対するランダム構造化照明を生成した。図3Dのパネル(i)及び(ii)は、それぞれ細胞質及び核からの緑色及び青色蛍光信号を示す。各PMTについての時間信号から、標識された細胞の蛍光イメージを、それぞれ緑色(図3Dのパネル(iii))及び青色(図3Dのパネル(iv))でコンピュータ的に復元した。図3Dのパネル(v)は、再構成された多色蛍光イメージを示す。
[00223] 図4A~4Eは、圧縮信号の直接機械学習を介したGCによるハイスループットかつ高精度の蛍光イメージフリー「イメージング」サイトメトリーを示す。図4Aは、GCにおいて分類器モデルを訓練するための手順を示す。図4Aのパネル(i)は、異なるが形態学的に類似した細胞型(MCF-7及びMIA PaCa-2細胞)が蛍光標識されたことを示す。両方の細胞型について、細胞質はFGによって緑色に染色され、MCF-7細胞のみの膜はBV421-EpCAMによって青色に染色された。スケールバー=20μm。図4Aのパネル(ii)は、>10,000細胞/秒のスループット速度で、図3Dで使用される符号化光学構造を通して異なる細胞型を別々に流すことを示す。図4Aのパネル(iii)は、蛍光強度の時間変調信号からまとめて抽出された各細胞型の圧縮波形を示す。図4Aのパネル(iv)は、細胞分類器を構築するための訓練データセットとして使用された各細胞型で標識された波形のライブラリを示す。サポートベクターマシンモデルをこの研究で使用した。図4Bは、分類器モデルを試験するための手順を示す。図4Bのパネル(i)は、異なる型の細胞が、分析前に種々の濃度比で実験的に混合されたことを示す。図4Bのパネル(ii)は、同じスループット速度でエンコーダを通る細胞混合物の流れを示す。図4Bのパネル(iii)は、細胞型を分類するために、訓練されたモデルを波形に直接適用することを示す。図4Cのパネル(i)に示されるように、青色のプロットは、BV421の総強度を測定することによって取得されたもの(図4Cのパネル(ii)に詳細に示される)と比較した、FG強度の波形(図4Cのパネル(iv)に詳細に示される)に訓練されたSVMベースの分類を直接適用することによって推定された、各サンプル中のMCF-7細胞の濃度比である。赤色プロットは、SVMベースの分類の同じ手順を総FG強度に適用することによって推定されたMCF-7細胞の濃度比である:BV421の測定された総強度と比較して、訓練されたSVMベースの分類を(図4Cのパネル(iii)に詳細に示される)総FG強度に適用すること。70個のサンプルを様々な濃度比について測定し、各サンプルはランダムに混合した細胞の700回の試験を含んだ。イメージフリーGCの結果(図4Cのパネル(i)に青色のプロットで示される)は、y=xからの0.046の小さい二乗平均平方根誤差(RMSE)、及び約5000個の細胞にわたる0.971の受信者動作特性(ROC、図4Dに示される)曲線下面積(AUC)を明らかにするが、これらの細胞の形態はヒトの眼に類似しているように見える。ROC曲線上の各点は、訓練されたSVMモデルからのスコアに適用される閾値に対応し、ヒストグラム中の赤色及び青色は、BV421の強度に従って標識される。対照的に、図4Cのパネル(i)の赤色プロットは、0.289の大きなRMSD及び0.596の不良なROC-AUCを有する劣った分類結果を示す。図4Eに示すように、末梢血単核細胞(PBMC)の複合混合物に対してモデル癌(MCF-7)細胞を分類する際に、超高速イメージフリーGCは、AUC~0.998の高い値を記録し、実際の使用におけるそのロバストで正確な性能を確認した。
[00228] 図5A~5Cは、機械学習ベースの蛍光「イメージング」活性化細胞選別機(FiCS)の実証を示す。図5Aの左パネルに示されるように、マイクロ流体デバイスは、3つの機能的部位を含み得る。細胞のフローストリームは、最初に3D流体力学的流れ集束によって集束され、次いでランダム構造化光照明を受け、最後に選別領域に到達した。選別動作時に、チタン酸ジルコン酸鉛(PZT)アクチュエータが入力電圧によって駆動され、標的細胞を収集出口に選別するために流体を接合部に向かって横方向に変位させるように曲げられた。図5Aの右パネルに示されるように、細胞のリアルタイム分類及び選択的単離のために、PMTで測定されたアナログ信号をデジタル化し、次いで、訓練されたSVMベースの分類器が実装されたFPGAで分析した。分類結果がポジティブであった場合、FPGAは時間遅延パルスを送出し、その結果、PZTデバイスを作動させた。実験は、~3,000細胞/秒のスループット速度で実施した。全てのMIA PaCa-2、MCF-7、及びPBMC細胞の細胞質を、FGを用いて緑色で標識した。(図5Bに示す)中のMCF-7細胞の膜及び(図5Cに示す)中のMIA PaCa-2細胞の細胞質を、それぞれBV421結合EpCAM抗体及び抗パンサイトケラチン一次/AF405結合二次抗体を用いて青色で標識した。
[00235] 図6は、SIモードにおける及びSDモードにおけるビーズの蛍光イメージングにおいて使用される光学エンコーダパターンH(x、y)の取得を示す。図6の左下の部分は、(図6の右上の部分に示されるような)エンコーダH(x、y)の正確な強度分布を推定するために使用される光学セットアップを示す。同一の擬似ランダムホールアレイを有するクロム層で作製されたフォトマスクを、SIモード及びSDモードに関するサンプルの前(図6に示す平面1)及び後(図6に示す平面2)のいずれかの結合イメージ面にそれぞれ配置した。作製したホールは、一辺が8μmの正方形であり、800×9,600μm2の矩形領域にわたってランダムに広がっており、充填率は~1%であった。光学構造のスパース性(充填率)は、GCの測定プロセスを実験ノイズに対してロバストにするように設計された(38,39)。これら8μmのホールは、回折及び幾何学的収縮後のサンプル面における約1μmのスポットに対応し、GCベースのイメージングの空間分解能を規定する。各光学部品に起因する色収差に由来する誤差を最小限に抑えるために、蛍光ポリマーの薄いフィルムをサンプル面に配置し、そのパターン化された発光を記録した。
[00241] 図9A~9Fは、流体力学的集束強度を制御することの、イメージフリーGCによる分類の性能に対する効果を示す。図9Aに示されるフローセル(Hamamatsu Photonics K.K.,Japan)の幾何学的形状は、外側流体による内側流体の流体力学的3次元(3D)流れ集束をもたらし、流れる細胞が集束した状態に保たれることを可能にし、示されるようなイメージにおけるそれらの位置の制御を可能にする。さらに、デバイスは、図9Bに示されるように、内側流体と外側流体との間の流量比を変化させることによって、集束強度の制御を可能にする。すなわち、1つの型の細胞を緩く集束した状態で流すと、強く集束した状態と比較して、より多様で一般化された時間波形が生成される。以下のような集束強度の様々な組合せを包括的に調査した後、高度に一般化され、ロバストで、感度の高い分類器モデルの構築を可能にする流体条件の組合せを使用した:モデルを訓練するために緩い集束条件ときつい集束条件を組み合わせ、モデルを試験するためにきつい集束条件を使用した。
[00245] 図10A~10Dは、イメージフリーGCの分類及びイメージフリーGCのワークフローのBV421-EpCAMベースの検証を示す。時間的に変調された緑色蛍光強度を分類する際のイメージフリーGCの性能を評価するために、同じ細胞の全青色蛍光(BV421-EpCAM)強度を定量した。図10Aは、MCF-7細胞のみの全青色蛍光強度のヒストグラムを示し、図10Bは、MIA PaCa-2細胞のみの全青色蛍光強度のヒストグラムを示す。図10Cは、細胞混合物の例のデータセットについての強度ヒストグラムを示し、これは、図4Dにおける単一のドットに対応する。図4A~4Eにおける実験の全体を通して、BV421-EpCAMの全蛍光強度を使用して、2,500をMIA PaCa-2細胞を区別するための上部ゲーティング閾値として使用し、4,000を、MCF7細胞を区別するための下部ゲーティング閾値として使用した。このゲーティングによって排除された細胞は、全集団のわずか0.7%であり、無視できると考えられた。BV421の全強度の明確な分布とは対照的に、同じサンプル細胞についてのFGの全蛍光強度のヒストグラムは、図10Dに示されるように、区別できない分布を示す。
[00247] 図11は、広範囲の濃度比にわたるSVMベースの分類の一貫した精度の確認を示す。
単純な線形適合を計算して、モデルが広範囲の濃度比にわたってその精度を一貫して保持することを実証した。図11において、GCによってMCF-7を区別する真陽性率及び偽陽性率をそれぞれα及びβとして示すと、BV421の強度の測定についての結果に対するGCについての結果は、以下のように推定され得る。
n=αm+β(1-m)
ここで、mはBV421の測定により推定されたMCF-7の濃度比であり、nはGC分類により取得されたものである。量α及びβは、MCF-7及びMIA PaCa-2の純粋な溶液についてのDAPI測定に対するGC分類結果を比較することによって計算した。計算されたα及びβは、図4Dに示されるフィッティングに対して0.949及び0.068である。これは、異なる濃度比について、プロットとフィットとの間の一貫して良好な一致を実証する。図4Aのパネル(i)に示されるように、MIA PaCa-2及びMCF-7細胞の緑色蛍光細胞質イメージ間のサイズ及び真円度などの明らかに異なる形態学的特徴を見出すことは、肉眼では困難である。
[00248] 図12A~12Dは、機械学習ベースの蛍光「イメージング」活性化オンチップ細胞選別システム(FiCS)を示す。図12A~12Cは、GCシステムと組み合わせてFiCSを可能にした機能的マイクロ流体デバイスを示す。図12Aに示す細胞選別チップは、標準的なソフトリソグラフィー技術を用いて作製した。チャネルの特徴を、SU-8フォトレジストモールドによってフォトリソグラフィーでパターニングし、ポリジメチルシロキサン(PDMS)に転写した。PDMSチャネルを、酸素プラズマ活性化結合によってガラス基板上に固定した。サンプル及びシース注入の両方を、シリンジポンプ(Harvard Apparatus Pump11 Elite Syringe Pump)によって、それぞれ約10μL/分及び400μL/分の一定流量で駆動した。顕微鏡イメージとして図12Bに示されるチップ設計(28)は、光学測定部位の前の3D流体力学的流れ集束によって、狭い細胞ストリームにサンプル流れが集束されることを可能にした。顕微鏡イメージとして図12Cに示されるチップ設計(29)は、分類に基づく選択的細胞選別を可能にした。この選別部位で、圧電PZTアクチュエータを、メインのフローストリームに対して垂直に走るチャネルを通して接合部に接続した。選別部位に入る標的細胞は、PZTアクチュエータの曲げ作用によって駆動される変位流体によって収集出口に偏向された。圧電アクチュエータの直径は20mmであり、固有共振周波数は約6.5kHzである。図12B及び図12Cにおけるスケールバーは50μmである。
[00252] 本明細書に記載のシステム及び方法は、標識フリー選別を実施するために使用することができる。そのような標識フリー選別は、圧縮感知によってマイクロ流体チャネル内の高速で流れる細胞の位相情報を取得することによって達成され得る。これは、細胞が本明細書に記載の構造化照明を通過するときに、検出器(単一ピクセルPMT又は本明細書に記載の任意の他の検出器など)を用いて透過スペックルパターンの変調波形を測定することによって行うことができる。位相回復イメージング技術と比較して、この方法は、イメージを再生成するために必要なスペックルパターン全体の一部のみを取得することができる。それでもなお、高精度で細胞を分類することは十分であり得、取得前のこの光学次元の低減は、高速かつリアルタイムの分類及び選別を可能にし得る。
[00258] 図17Aは、人工多能性幹細胞(iPSC)を生存、初期アポトーシス、又は死として分類するためのヨウ化プロピジウム(PI)及びアネキシンVの蛍光強度の散布図の例を示す。図17Aに示されるように、青色、赤色、及び緑色領域内の集団は、それぞれ、生細胞、死細胞、及び初期アポトーシス細胞として標識される。
[00266] 図18Aは、機械学習分類器を訓練するために使用される神経前駆細胞(NPC)及びiPSCの混合物についてのカルセインAM及びrBC2LCN-635強度の散布図の例を示す。青色領域及び赤色領域内の集団を、それぞれNPC及びiPSCと標識した。
[00271] 図19Aは、T細胞のfab FITC強度のヒストグラムの例を示す。赤色閾値線の右側の細胞をCAR T細胞と標識した。閾値は陰性対照サンプルによって決定した。
[00278] 本開示のシステム及び方法は、混合流体(血液、尿、涙、唾液、胸水、脳脊髄液、又は本明細書に記載される任意の他の流体等)中の特定の細胞型(疾患細胞等)を検出又は選別するために使用されてもよい。システム及び方法は、種々の従来の実験室試験において必要とされ得るような、フルオロフォアによる標識又は抗体による免疫染色を必要とせずに、そのような特定の細胞型の検出又は選別を可能にし得る。
[00292] 本開示のシステム及び方法は、異なるタイプの粒子が、本開示の検出器が感度を有する領域内に同時に存在する場合であっても、異なるタイプの粒子を区別するために適用され得る。2つ以上の粒子がそのような領域に同時に位置する場合、検出器によって検出される信号に重複が生じ得る。本明細書に記載されるシステム及び方法は、線形方程式に関して表現されることができるため、そのようなイベントは、領域内の全ての他の粒子から独立した各粒子に起因する信号の合計として表され得る。
Claims (20)
- 複数の標識フリー細胞から1つ又は複数の標的細胞を処理するための方法であって、
(a)構造化照明を生成するために光源からの光をパターン化された光学構造を通して方向付けし、フローセルのチャネル上へ前記構造化照明を集束させて、前記構造化照明が、前記チャネルから検出器へ向かう透過スペックルパターンを生成するステップと;
(b)前記構造化照明が集束した前記フローセルの前記チャネルを通して前記複数の標識フリー細胞のうちの少なくとも1つの標識フリー細胞を通過させるステップであって、前記構造化照明が集束した前記フローセルの前記チャネルを前記少なくとも1つの標識フリー細胞が通過するとき、前記透過スペックルパターンが変調されて、変調透過スペックルパターンを生成する、ステップと;
(c)前記検出器を用いて前記変調透過スペックルパターンの少なくとも一部を収集するステップと;
(d)前記変調透過スペックルパターンの前記少なくとも一部を1つ又は複数の時間波形に変換するステップであって、前記少なくとも1つの標識フリー細胞が前記構造化照明を通過するときに、前記1つ又は複数の時間波形が、前記変調透過スペックルパターンによって付与された1つ又は複数の強度分布を含む、ステップと;
(e)前記1つ又は複数の時間波形に1つ又は複数の機械学習分類器を適用して、前記複数の細胞から前記1つ又は複数の標的細胞を直接識別するステップと、
(f)前記1つ又は複数の標的細胞を前記複数の標識フリー細胞から分離又は単離して、それによって、前記複数の標識フリー細胞の標識フリー選別を可能にするステップと、を含む、方法。 - 前記1つ又は複数の機械学習分類器が、1つ又は複数の染色した細胞に関連する波形を使用して訓練される、請求項1に記載の方法。
- 前記標的細胞が、1つ又は複数の癌細胞又は循環腫瘍細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的細胞が、1つ又は複数の治療用細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的細胞が、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞から分化した細胞、胚性幹細胞から分化した細胞、遺伝子操作された細胞、血液細胞、赤血球、白血球、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、キメラ抗原受容体T細胞、キメラ抗原受容体ナチュラルキラー細胞、癌細胞、及び芽細胞から成る群から選択される1つ又は複数のメンバーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の標的細胞が、好中球、好酸球、好塩基球、単球及びリンパ球からなる群から選択される1つ又は複数の白血球を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の標的細胞の機能、タイプ又は特徴に基づいて前記1つ又は複数の標的細胞を分類するステップをさらに含み、前記機能、タイプ又は特徴が、前記1つ又は複数の標的細胞の生存性、発現状態、純度、分化、未分化、グルコースレベル又は解糖レベルに対応する、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の機械学習分類器が、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、人工ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、深層学習、超深層学習、勾配ブースティング、アダブースティング、決定木、線形回帰、又はロジスティック回帰を用いて作成される、請求項4に記載の方法。
- 前記複数の標識フリー細胞は、イメージ再構成なしで選別される、請求項1に記載の方法。
- 前記検出器が単一ピクセル検出器を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の標的細胞の1つ又は複数のイメージを再構成するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のイメージの各イメージは、異なる波長又は波長範囲に対応する、請求項11に記載の方法。
- 1つ又は複数のイメージを再構成するステップが、2段階反復収縮/閾値化(TwIST)手順を適用するステップを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記複数の標識フリー細胞の形態に基づいて、前記複数の標識フリー細胞を1つ又は複数のグループの選別された細胞に選別するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の標識フリー細胞から前記1つ又は複数の標的細胞を分離又は単離するステップが、少なくとも10細胞/秒の速度で生じる、請求項1に記載の方法。
- (c)が、前記分離又は単離された前記1つ又は複数の標的細胞のうちの1つ又は複数を、収集された細胞の1つ又は複数のグループへ収集して、濃縮された細胞混合物を生成するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- (c)に続いて、1つ又は複数の標的細胞を1つ又は複数のアッセイに供するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記パターン化された光学構造が、規則的なパターン化された光学構造、無秩序なパターン化された光学構造、非周期的なパターン化された光学構造、ランダムに若しくは擬似ランダムにパターン化された光学構造、又は、静的光学構造を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記パターン化された光学構造が、異なる光学特性を有する複数の領域を含み、前記光学特性が、透過率、吸収率、又は反射率のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。
- 複数の標識フリー細胞から1つ又は複数の標的細胞を処理するためのシステムであって、複数の標識フリー粒子を方向付けるように構成された流体フローセルと;前記流体フローセルの少なくとも一部と感知通信する検出器と;前記検出器に動作可能に結合された1つ又は複数のコンピュータプロセッサと;を含み、前記1つ又は複数のコンピュータプロセッサが個々に又はまとめて:
(a)構造化照明を生成するために構造化光学パターンを通して光源からの光をパターン化された光学構造を通して方向付けし、前記フローセルのチャネル上へ前記構造化照明を集束させて、前記構造化照明が、前記チャネルから前記検出器へ向かう透過スペックルパターンを生成し、
(b)前記構造化照明が集束した前記フローセルの前記チャネルを通して前記複数の標識フリー細胞のうちの少なくとも1つの標識フリー細胞を通過させ、前記構造化照明が集束した前記フローセルの前記チャネルを前記少なくとも1つの標識フリー細胞が通過するとき、前記透過スペックルパターンが変調されて、変調透過スペックルパターンを生成し、
(c)前記検出器を用いて前記変調透過スペックルパターンの少なくとも一部を収集し、
(d)前記変調透過スペックルパターンの前記少なくとも一部を1つ又は複数の時間波形に変換し、前記少なくとも1つの標識フリー細胞が前記構造化照明を通過するときに、前記1つ又は複数の時間波形が、前記変調透過スペックルパターンによって付与された1つ又は複数の強度分布を含み、
(e)前記1つ又は複数の時間波形に1つ又は複数の機械学習分類器を適用して、前記複数の標識フリー細胞から前記1つ又は複数の標的細胞を直接識別し、
(f)前記1つ又は複数の標的細胞を前記複数の標識フリー細胞から分離又は単離して、前記標的細胞の標識フリー選別を可能にする、
ように構成された、システム。
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