JP7352237B2

JP7352237B2 - 腸内細菌叢中のアッカーマンシアを増やすためにアスタキサンチンを使用する方法及び医薬組成物

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Publication number: JP7352237B2
Application number: JP2018017002A
Authority: JP
Inventors: 裕二内藤; 和浩鎌田; 久美富永
Original assignee: KYOTO PREFECTURAL UNIVERSITY OF MEDICINE; Fuji Chemical Industries Co Ltd
Current assignee: KYOTO PREFECTURAL UNIVERSITY OF MEDICINE; Fuji Chemical Industries Co Ltd
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2023-09-28
Anticipated expiration: 2038-02-02
Also published as: US20210052516A1; US20190240168A1; US10894022B2; JP2019131527A; JP2022043349A

Description

本発明は、腸内細菌叢のアッカーマンシア属に属する細菌を改善する方法等に関する。

腸内細菌叢は生活環境等により変動し、健康状態等に大きな影響を与えているとされている。
例えば、過敏性腸症候群（irritable bowel syndrome:IBS）は検査を行っても炎症や潰瘍といった器質的な異常を認められないにも関わらず、下痢、便秘、腹痛などの症状が起こる消化管機能異常であり、機能性胃腸症の１つとされている。
発症機序に関しては、いまだ不明な点も多いが、中枢神経機能と消化管機能の関連としての心理的ストレスを背景とした腸脳相関と消化管知覚過敏が注目されている。
また、腸内細菌の中には肥満及びそれに伴う疾患に大きな影響を与えているものもある。
詳細は後述するが、上記の内容は腸内細菌アッカーマンシア・ムシニフィラが関与している報告がある。
本発明者らは、アスタキサンチンが腸内細菌叢にどのような影響を与えるか調査研究した結果、本発明に至った。

特許文献１には、アスタキサンチン及び／又はそのエステルを有効成分とする抗ストレス組成物を開示するが、腸内細菌叢への影響については何ら開示がない。

日本国特開平９－１２４４７０号公報

Shen W, Shen M, Zhao X, Zhu H, Yang Y, Lu S, Tan Y, Li G, Li M, Wang J, Hu F, Le S. 「Anti-obesity Effect of Capsaicin in Mice Fed with High-Fat Diet Is Associated with an Increase in Population of the Gut Bacterium Akkermansia muciniphila.」 Front Microbiol. 2017 Feb 23;8 Leal-Diaz AM, Noriega LG, Torre-Villalvazo I, Torres N, Aleman-Escondrillas G, Lopez-Romero P, Sanchez-Tapia M, Aguilar-Lopez M, Furuzawa-Carballeda J, Velazquez-Villegas LA, Avila-Nava A, Ordaz G, Gutierrez-Uribe JA, Serna-Saldivar SO, Tovar AR. 「Aguamiel concentrate from Agave salmiana and its extracted saponins attenuated obesity and hepatic steatosis and increased Akkermansia muciniphila in C57BL6 mice.」 Sci Rep. 2016 Sep 28;6:34242 Masumoto S, Terao A, Yamamoto Y, Mukai T, Miura T, Shoji T. 「Non-absorbable apple procyanidins prevent obesity associated with gut microbial and metabolomic changes.」 Sci Rep. 2016 Aug10;6:31208 Anhe FF, Roy D, Pilon G, Dudonne S, Matamoros S, Varin TV, Garofalo C, Moine Q, Desjardins Y, Levy E, Marette A. 「A polyphenol-rich cranberry extract protects from diet-induced obesity, insulin resistance and intestinal inflammation in association with increased Akkermansia spp. population in the gut microbiota of mice.」 Gut. 2015 Jun;64(6):872-83. Roopchand DE, Carmody RN, Kuhn P, Moskal K, Rojas-Silva P, Turnbaugh PJ, Raskin I. 「Dietary Polyphenols Promote Growth of the Gut Bacterium Akkermansia muciniphila and Attenuate High-Fat Diet-Induced Metabolic Syndrome.」 Diabetes. 2015 Aug;64(8):2847-58. Peng X, Zhang Z, Zhang N, Li S, Wei H. 「In vitro catabolism of quercetin by human fecal bacteria and the antioxidant capacity of its catabolites.」 Food Nutr Res. 2014 Apr 15;58. Noguchi N, Ohashi T, Shiratori T, Narui K, Hagiwara T, Ko M, Watanabe K, Miyahara T, Taira S, Moriyasu F, Sasatsu M. 「Association of tannase-producing Staphylococcus lugdunensis with colo cancer and characterization of a novel tannase gene.」 J Gastroenterol. 2007 May;42(5):346-51.

本発明は、腸内細菌叢のバランスを改善すること、特にアッカーマンシア属に属する細菌を増やすことを目的とする。

本発明は、腸内細菌叢中のアッカーマンシア属に属する細菌、その中でも好ましくはアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）を増やすためにアスタキサンチン（Astaxanthin）を含有する組成物を摂取して使用する方法に特徴がある。

アスタキサンチンはカロテノイドの一種で、カロテノイドはカロテンとキサントフィルに分類されるが、アスタキサンチンはキサントフィルに属する。
ＩＵＰＡＣ名は、３，３’－ジヒドロキシ－β，βカロテン－４，４’ジオンであり、３及び３’位のヒドロキシ基の位置により（３Ｒ，３’Ｒ）体、（３Ｒ，３’Ｓ）体、（３Ｓ，３’Ｓ）体の三種が存在する。
また、共役二重結合のシス－トランスによる異性体を有し、遊離体，モノエステル体，ジエステル体として存在する。

アスタキサンチンは抗酸化活性を有することが知られ、吸収効率が低く、腸管内にて吸収される割合が約５％程度と低い。
このことから約９５％のアスタキサンチンは、吸収されずに腸管内に残存し、腸内細菌叢に直接的に作用することが推定される。

そこで詳細は後述するが、６週齢のWistarラットを使用してアスタキサンチン含有食を４週間摂取させた群と、通常食を４週間摂取させた群との腸内細菌叢を比較した結果、アスタキサンチン含有食を摂取させた群の方がAkkermansia属の細菌Akkermansia muciniphilaが約１１．７倍も増加していると推定される。

これまで報告されている論文を調査した結果、Capsaicin（非特許文献１），saponin（非特許文献２），Procyanidin（非特許文献３），Cranberry extract（非特許文献４），Concord grape（非特許文献５）等のポリフェノールがAkkermansia muciniphilaの増加効果を示すことが報告されていた。
しかし、ポリフェノール類は腸内菌で分解されることが報告されていることから腸内細菌叢の改善や安全性の面で問題があった（非特許文献６，７）。
また、Akkermansia muciniphilaを体内に持っているヒトの便を移植する便微生物移植法も考えられるが、個人差があり費用面でも現実的ではない。

後述する調査結果から、げっ歯類の血中アスタキサンチン濃度範囲は０を超え１７２０ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは０～８２０ｎｇ／ｍｌ（０を除く）であり、より好ましくは０～５５ｎｇ／ｍｌ（０を除く）であった。
ヒトでこのより好ましい血中濃度を得るには、１日あたり１～４０ｍｇのアスタキサンチンを摂取して使用するのが好ましい。
また、ヒトに１日あたり１～６０ｍｇのアスタキサンチンを摂取させると、その血中濃度は０を超え６００ｎｇ／ｍｌ以下の範囲であった。

本発明において用いることのできるアスタキサンチンは特に限定されず、天然アスタキサンチンおよび合成アスタキサンチンの少なくともいずれかを用いることができる。
天然のアスタキサンチンとしては、例えば、ヘマトコッカスなどの藻類；ファフィアなどの酵母類；エビ、オキアミ、カニなどの甲殻類；イカ、タコなどの頭足類；種々の魚介類；アドニスなどの植物類；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｎ８１１０６、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓｓｐ．ＳＤ２１２、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＰＣ６などのバクテリア類；Ｇｏｒｄｏｎｉａｓｐ．ＫＡＮＭＯＮＫＡＺ－１１２９などの放線菌；Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｙｍｓｐ．ＫＨ１０５などのラビリンチュラ類；アスタキサンチン産生遺伝子組み換え生物体；などから得られるアスタキサンチンを挙げることができ、好ましくはヘマトコッカスなどの微細藻類から抽出されるアスタキサンチン、より好ましくはヘマトコッカス藻から抽出されるアスタキサンチンである。また、合成アスタキサンチンとしては、例えば、ＡｓｔａＳａｎａ（ＤＳＭ社）、ＬｕｃａｎｔｉｎＰｉｎｋ（登録商標）（ＢＡＳＦ社）などを挙げることができる。また、天然由来の他のカロテノイドを化学的に変換して得た合成アスタキサンチンとしては、例えば、ＡｓｔａＭａｒｉｎｅ（ＰＩＶＥＧ社）などを挙げることができる。
天然のアスタキサンチンが得られるヘマトコッカス藻としては、例えば、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、ヘマトコッカス・ラキュストリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｕｓｔｒｉｓ）、ヘマトコッカス・カペンシス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｃａｐｅｎｓｉｓ）、ヘマトコッカス・ドロエバゲンシス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｄｅｒｏｅｂａｋｅｎｓｉｓ）、ヘマトコッカス・ジンバビエンシス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｚｉｍｂａｂｗｉｅｎｓｉｓ）などを挙げることができる。

これらヘマトコッカス緑藻類を培養する方法としては、異種微生物の混入・繁殖がなく、その他の夾雑物の混入が少ない密閉型の培養方法が好ましく、そのような培養方法としては、例えば、一部解放型のドーム形状、円錐形状又は円筒形状の培養装置と装置内で移動自在のガス吐出装置を有する培養基（国際公開第１９９９／０５０３８４号パンフレット）を用いて培養する方法の他、ヘマトコッカス藻類に乾燥ストレスを加えて藻類のシスト化を誘発し、そのシスト化した藻類の培養物からアスタキサンチンを採取する方法（特開平８－１０３２８８号公報）、密閉型の培養装置に光源を入れ内部から光を照射して培養する方法、平板状の培養槽やチューブ型の培養層を用いる方法を挙げることができる。
また、本発明において用いることのできるアスタキサンチンおよび／またはアスタキサンチン含有組成物は、例えば、上述したヘマトコッカス藻を、必要に応じて、特開平５－０６８５８５号公報等に開示された方法に従い細胞壁を破砕して、アセトン、エーテル、クロロホルムおよびアルコール（エタノール、メタノール等）などの有機溶剤や、超臨界状態の二酸化炭素などの抽出溶媒・溶剤を加えて抽出したアスタキサンチンおよび／またはアスタキサンチン含有組成物であってもよく、その場合のアスタキサンチン含有組成物のアスタキサンチン含有量は、好ましくは３～４０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは３～１２％（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは５～１０％（ｗ／ｗ）である。
また、本発明において用いることのできるアスタキサンチンおよび／またはアスタキサンチン含有組成物として、市販品を挙げることができる。そのような市販品としては、例えば、ＡＳＴＯＴＳ－Ｓ、ＡＳＴＯＴＳ－１０Ｏ、ＡＳＴＯＴＳ－ＥＣＳ、ＡＳＴＰＴＳ－２．０ＰＷ、ＡＳＴＯＴＳ－３．０ＭＢなどのＡＳＴＯＴＳシリーズ（ＡＳＴＯＴＳはすべて登録商標；富士フイルム社）；アスタリールオイル５０Ｆ、アスタリールオイル５Ｆ、アスタリールパウダー２０Ｆ、水溶性アスタリール液、アスタリールＷＳ液、アスタリール１０ＷＳ液、アスタリールＡＣＴ、アスタビータｅ、アスタビータスポーツ、アスタメイトなどのアスタリール、アスタビータおよびアスタメイトシリーズ（すべて登録商標；アスタリール社、富士化学工業社）；ＢｉｏＡｓｔｉｎ（登録商標；サイアノテックコーポレーション社）；ＡｓｔａｚｉｎｅＴＭ（ＢＧＧＪａｐａｎ社）；アスタキサンチンパウダー１．５％、アスタキサンチンパウダー２．５％、アスタキサンチンオイル５％、アスタキサンチンオイル１０％（バイオアクティブズジャパン社）；アスタキサンチン（オリザ油化社）；サンアクティブＡＸ（登録商標）（太陽化学社）；ヘマトコッカスＷＳ３０（ヤエガキ発酵技研社）；ＡｓｔａＭａｒｉｎｅ（ＰＩＶＥＧ社）などを挙げることができる。

摂取方法としては、サプリメント，健康食品，栄養機能食品等に添加して、また飲料に添加してもよい。
さらには錠剤，カプセル剤，顆粒剤，細粒剤，液剤等の各種医薬組成物として投与してもよい。

このようにAstaxanthinを含有する組成物を摂取することで腸内細菌叢中のAkkermansia （muciniphila）が増加するように作用し、例えば、過敏性腸症候群（irritable bowel syndrome:IBS）の症状の改善や、肥満を改善又は予防するのに使用できる。
よって、Astaxanthin含有組成物は、これらの症状を改善又は予防するための医薬組成物としても有用である。

腸内細菌叢の比較結果を示す。体重増加量の比較調査結果を示す。げっ歯類とヒトとの血中アスタキサンチン濃度比較を示す。（ａ）はアスタキサンチン連続摂取によるヒト血中アスタキサンチン濃度変化をグラフに示し、（ｂ）は測定データを示す。

６週齢のWistarラットを使用し、０．０２％のアスタキサンチンを含有する食を摂取させた群（Ａｓｘ群）と、通常食を摂取させた群（Control群）とを比較調査した。
それぞれ４週間摂取させた後に、Salineもしくは副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＨ）の経静脈投与を行った。
投与３時間後、犠死させた盲腸内容物の腸内細菌叢を解析比較した結果を図１のグラフに示す。
解析方法としては、盲腸内容物のＤＮＡを抽出し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ３－Ｖ４領域を増幅し、シーケシングを行った。

図１に示したグラフから、Control群と比較してＡｓｘ群において、増加した菌種は、Akkermansia属の細菌であって、約１１．７倍に増加した。
減少したのは、Clostridia（５８．２％→４７．６％）と、Lactobacillus（１０．９％→５．９％）であった。
また、Ａｓｘ群は、ＣＲＨ投与により誘発された腸管蠕動運動の亢進が軽減されていた。
このことから、アスタキサンチン含有組成物を摂取すると、腸内細菌叢中のAkkermansia属に属するAkkermansia muciniphilaの割合を約１０倍以上に増加させる作用があると推定される。

図２の表にラット（げっ歯類）の日齢（ＰＮＤ）と体重変化であって通常食からなるControl群とアスタキサンチン含有食からなるＡｓｘ群との体重の変化量を示す。（ｂ）はＰＮＤ７２，７６の平均体重と平均増加量を示す。
Ａｓｘ群の方が明らかに体重の増加が少ない結果となっている。
このことは、肥満の改善、予防に有効であると推定される。

次に、げっ歯類の血中のアスタキサンチン濃度について調査した。
ここでアスタキサンチンの血中濃度は、血清又は血漿中の濃度をいう。
調査方法としては、マウスおよびラットに０．０２％のアスタキサンチン含有食を約１カ月間摂取させたのちに採血し、血清又は血漿を得た。
血中アスタキサンチン濃度をＨＰＬＣにより測定した。
分析方法としては下記のとおり行った。
＜サンプル処理＞
得られた血清または血漿試料１００μｌに、５０μｇ／ｍｌのButylhydroxytolueneを含むエタノール溶液５００μｌ、１００ｎｇ／ｍｌの内部標準（trans-β-Apo-8’-carotenal）を含むアセトン溶液１００μｌを加え、ボルテックスミキサーで１５秒間激しく撹拌した。
さらにヘキサン５ｍｌを添加したのち、ボルテックスミキサーで１５秒間激しく撹拌を３回行い、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
遠心分離後の上清４ｍｌを回収し、０．４５μｍメンブレンでろ過した。
このろ液を遠心エバポレーターで濃縮したのち、アセトン１５０μｌで再溶解したものを逆相系ＨＰＬＣに供した。
一方、２μｇ／ｍｌのアスタキサンチン標準試薬（Astaxanthin、ALEXIS BIOCHEMICALS、460-031-M250）アセトン溶液１ｍｌと、８００ｎｇ／ｍｌの内部標準アセトン溶液２．５ｍｌを合わせて２０．０ｍｌにアセトンでメスアップして調整した標準溶液を、同じく逆相系ＨＰＬＣに供して、得られたピーク面積比の比較によりアスタキサンチン濃度を求めた。
＜ＨＰＬＣ条件＞
ＨＰＬＣは島津ＬＣ２０Ａシリーズ（ポンプ：LC-20AD、デガッサ：DGU-20A5R、オートサンプラー：SIL-20AC、カラムオーブン：CTO-20AC、検出器：SPD-20AV、システムコントローラー：CBM-20A）を用いた。
分析カラムは、YMC-Carotenoid（４．６×２５０ｍｍ、粒径５μｍ）を用いた。移動相はＡ液にメタノール、Ｂ液にTert-Butyl methyl ether、Ｃ液に１％リン酸水溶液を用い、開始時にＡ液とＢ液の混合比が８１％：１５％、１５分でＢ液が３０％、２３分で８０％となるようにグラジエント溶出を行い、２７分までＢ液８０％の組成を維持したのち、２７．１分に開始時の混合比に戻し、３５分まで開始時の組成で溶出した。
Ｃ液は常に４%の組成とした。
カラムオーブンは２５℃で、ＵＶ／ＶＩＳ検出器により検出波長４７０ｎｍで測定を行った。
流量は１ｍｌ／ｍｉｎで行った。
その結果を図３に示す。
マウスまたはラットに、０．０２％のアスタキサンチン含有食を約１カ月摂取させると、血中アスタキサンチン濃度は０を超え１７２０ｎｇ／ｍｌ以下の範囲であった。

次に、ヒトの血中のアスタキサンチン濃度について調査した。
ここでアスタキサンチンの血中濃度は、血清又は血漿中の濃度をいう。
血中アスタキサンチン濃度をＨＰＬＣにより測定した。
分析方法としては下記のとおり行った。
＜サンプル処理＞
得られた血清または血漿試料１００μｌに、５０μｇ/ｍｌのButylhydroxytolueneを含むエタノール溶液５００μｌ、１００ｎｇ／ｍｌの内部標準（Ethyl 8’-apo-beta-caroten-8’oate、Carote Nature、1010）アセトン溶液１００μｌ、蒸留水５００μｌを加え、ボルテックスミキサーで１５秒間激しく撹拌した。
さらにヘキサン５ｍｌを添加したのち、ボルテックスミキサーで１５秒間激しく撹拌を３回行い、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
遠心分離後の上清４ｍｌを回収し、０．４５μｍメンブレンフィルターでろ過した。
このろ液を遠心エバポレーターで濃縮したのち、アセトン１５０μｌで再溶解したものを逆相系ＨＰＬＣに供した。
一方、１００ｎｇ／ｍｌのアスタキサンチン標準試薬（Astaxanthin、ALEXIS BIOCHEMICALS、460-031-M250）アセトン溶液１００ｍｌに、１０μｇ／ｍｌの内部標準(Ethyl 8’-apo-beta-caroten-8’oate)アセトン溶液１ｍｌを合せて調整した標準溶液を、同じく逆相系ＨＰＬＣに供して得られたピーク面積比の比較によりアスタキサンチン濃度を求めた。
＜ＨＰＬＣ条件＞
ＨＰＬＣは島津ＬＣ２０Ａシリーズ（ポンプ：LC-20AD、デガッサ：DGU-20A5R、オートサンプラー：SIL-20AC、カラムオーブン：CTO-20AC、検出器：SPD-20AV、システムコントローラー：CBM-20A）を用いた。
分析カラムは、YMC-Carotenoid（４．６×２５０ｍｍ、粒径５μｍ）を用いた。
移動相はＡ液にメタノール、Ｂ液にTert-Butyl Methyl ether、Ｃ液に１％リン酸水溶液を用い、開始時にＡ液とＢ液の混合比が９３％：５％、４分でＢ液が１６％、７分で２２．５％、２５．６分で４８．７５％、３３．２分で９０％となるようにグラジェント溶出を行い、４１．５分までＢ液９０％の組成を維持したのち、４１．７分に開始時の混合比に戻し、５３．４分まで開始時の組成で溶出した。
Ｃ液は常に２％の組成とした。
カラムオーブンは１６℃で、ＵＶ／ＶＩＳ検出器により検出波長４７０ｎｍで測定を行った。
流量は１ｍｌ／ｍｉｎで行った。

図３にげっ歯類とヒトとの血中アスタキサンチン濃度の結果を示す。
ヒトの血中アスタキサンチン濃度は１日のアスタキサンチンの摂取量は、１～６０ｍｇの範囲にて、連続摂取１か月後に採血し得られた血清又は血漿において調査した。
ヒトに、１日あたり１～６０ｍｇのアスタキサンチンを摂取させると、血中アスタキサンチン濃度は０を超え６００ｎｇ／ｍｌ以下の範囲であった。
げっ歯類とヒトでは、ある程度の対応が認められ、上記Wistarラットでのアスタキサンチンの投与によるAkkermansia muciniphilaの増大作用は、ヒトでも認められるものと推定される。

次に、アスタキサンチンを長期間摂取することにより血中（血漿中）のアスタキサンチン濃度がどのように変化するのかを確認するためのヒト試験を行った。
調査方法としては下記のように行った。
１．被験者
２０歳以上５０歳未満の健常な日本人男女１０名
２．試験食と摂取
被験者は、１粒あたりヘマトコッカス藻抽出物６０ｍｇ（アスタキサンチンフリー体として６ｍｇ）と食用油脂２７０ｍｇを含むカプセルを４２日間、朝食３０分後に１日２粒（アスタキサンチンフリー体として１２ｍｇ／日）を水とともに摂取した。
３．採血およびアスタキサンチン定量
カプセル摂取開始から１日後、６日後、１３日後、２０日後、２７日後、３４日後および４２日後に採血を行い、血漿を得た。
血漿中のアスタキサンチン濃度を前記に示した分析方法（ＨＰＬＣ）により測定した。
＜結果＞
アスタキサンチンを長期間摂取することによるヒト血中（血漿中）のアスタキサンチン濃度変化の推移結果を図４に示す。
図４に示すように、１粒あたりヘマトコッカス藻抽出物６０ｍｇ（アスタキサンチンフリー体として６ｍｇ）と食用油脂２７０ｍｇを含有する食品を４２日間、１日２粒ずつ摂取した場合は、概ね摂取開始から６日を経過したところで、ヒト血中（血漿中）アスタキサンチン濃度が約２００ｎｇ／ｍｌの値となる辺りからプラトーとなっていることが分かる。これらの結果から、少なくともアスタキサンチン含有食品を摂取し続けている限り、ヒト血中（血漿中）アスタキサンチン濃度は低下しないことが明らかとなった。

本発明は腸内細菌叢中のAkkermansia属に属する細菌を増やすのにアスタキサンチンが有効であり、いろいろな方法でこのアスタキサンチンを摂取でき、医薬組成物としても有用である。

Claims

腸内細菌叢中のAkkermansia muciniphila菌の割合を増大させるとともに、Clostridia属菌とLactobacillus属菌の割合を減少させて腸内細菌叢を改善するためのAstaxanthin含有のヒト用経口組成物。
血中のAstaxanthin濃度が０を超え、６００ｎｇ／ｍｌ以下になるようにした請求項１に記載の経口組成物。
Astaxanthinの１日あたりの摂取量が１～４０ｍｇである請求項１又は２記載の経口組成物。
前記経口組成物がサプリメントである請求項１～３のいずれか一項に記載のAstaxanthin含有の経口組成物。