JP7306997B2 - 寄生虫性疾患の処置のための化合物および方法 - Google Patents
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Description
本願は、2017年3月20日に出願の米国仮特許出願第62/473,771号の優先権を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
マラリアは寄生原虫によって引き起こされる媒介性感染症であり、南北アメリカ、アジア、アフリカの一部を含む熱帯および亜熱帯地域に蔓延している。ヒトに感染し得る5つのマラリア原虫種(熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、三日熱マラリア原虫(P. vivax)、卵形マラリア原虫(P. ovale)、四日熱マラリア原虫(P. malariae)、およびサルマラリア原虫(P. knowlesi))のうち、最も重篤な形態の疾患は熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫によって引き起こされる。加えて、いくつかのマラリア原虫種はヒト以外の哺乳類に感染する。例えば、P.ベルゲイ(P. berghei)、P.チャバウディ(P. chabaudi)、P.ビンケイ(P. vinckei)、およびP.ヨエリ(P. yoelii)は特定のげっ歯類においてマラリアを引き起こすことがある。
上にまたは本明細書の他の箇所に記載するように、化合物、薬学的組成物、ならびに化合物を含む/用いるマラリアおよびクリプトスポリジウム症を含む寄生虫性疾患を処置するかまたは防止する方法が本明細書において開示される。
式中、「破線」の結合は単結合または二重結合であってもよく;
R1は置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリールであり;
R2は置換されていてもよいアルコキシ、シクロアルコキシまたはヘテロシクリルであり;
R3は水素または-CH2-Xであり;
R4およびR5は独立して水素、-X、または-CH2-Xであり、R4およびR5は一緒になって5員または6員の縮合環を形成してもよく、R4およびR5の少なくとも一方は水素ではなく;
R6およびR7は独立して水素またはRであり;かつ
z1~z8は独立してそれぞれ出現時にCHまたはNより選択され;ここで
-Xは独立してそれぞれ出現時に-OH、-OR、-S(O)R、-S(O)2R、-N(R)-S(O)2R、-S(O)2-N(R)(R)、-S(O)2-NHR、-N(R)-C(O)-Rまたは-N(R)(R)より選択され;かつ
Rは、独立してそれぞれ出現時に、置換されていてもよいC1~C12アルキルより選択される。-Xは独立してそれぞれ出現時に-OH、-NH2または-N(R)(R)より選択されていてもよい。いくつかの態様では、R4および/またはR5における-X基(R4および/またはR5が-CH2-Xである場合の-X基を含む)は-OH、NH2、または-N(R)(R)より選択されていてもよい。また、Rは独立してそれぞれ出現時にC1~4直鎖または分岐炭化水素より選択されていてもよい。
式中、「破線」の結合は単結合または二重結合であってもよく;
R1は置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリールであり;
R2は置換されていてもよいアルコキシ、シクロアルコキシまたはヘテロシクリルであり;
R3は水素または-CH2-Xであり;
R6およびR7は独立して水素またはRであり;かつ
z1~z8は独立してそれぞれ出現時にCHまたはNより選択され;ここで
-Xは独立してそれぞれ出現時に-OH、-OR、-S(O)R、-S(O)2R、-N(R)-S(O)2R、-S(O)2-N(R)(R)、-S(O)2-NHR、-N(R)-C(O)-Rまたは-N(R)(R)より選択され;かつ
Rは独立してそれぞれ出現時にC1~C12アルキルであるが;
但し、R6が水素である場合、R3は-CH2-N(R)(R)であり、「破線」の結合は二重結合である。いくつかの態様では、「破線」の結合は二重結合である。別の態様では、「破線」の結合は単結合である。-Xは独立してそれぞれ出現時に-OH、-NH2または-N(R)(R)より選択されていてもよい。また、Rは独立してそれぞれ出現時にC1~4直鎖または分岐炭化水素より選択されていてもよい。
式中、「破線」の結合は単結合または二重結合であってもよく;
R1は置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリールであり;
R2は置換されていてもよいアルコキシ、シクロアルコキシまたはヘテロシクリルであり;
R3は水素または-CH2-Xであり;
R4およびR5は独立して水素、-X、または-CH2-Xであり、R4およびR5は一緒になって5員または6員の縮合環を形成してもよく、R4およびR5の少なくとも一方は水素ではなく;
R6およびR7は独立して水素またはRであり;かつ
z1~z8は独立してそれぞれ出現時にCHまたはNより選択され;ここで
-Xは独立してそれぞれ出現時に-OH、-OR、-S(O)R、-S(O)2R、-N(R)-S(O)2R、-S(O)2-N(R)(R)、-S(O)2-NHR、-N(R)-C(O)-Rまたは-N(R)(R)より選択され;かつ
Rは、独立してそれぞれ出現時に、置換されていてもよいC1~C12アルキルより選択される。-Xは独立してそれぞれ出現時に-OH、-NH2または-N(R)(R)より選択されていてもよい。いくつかの態様では、R4および/またはR5における-X基(R4および/またはR5が-CH2-Xである場合の-X基を含む)は-OH、NH2、または-N(R)(R)より選択されていてもよい。また、Rは独立してそれぞれ出現時にC1~4直鎖または分岐炭化水素より選択されていてもよい。
式中、「破線」の結合は単結合または二重結合であってもよく;
R1は置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリールであり;
R2は置換されていてもよいアルコキシ、シクロアルコキシまたはヘテロシクリルであり;
R3は水素または-CH2-Xであり;
R6およびR7は独立して水素またはRであり;かつ
z1~z8は独立してそれぞれ出現時にCHまたはNより選択され;ここで
-Xは独立してそれぞれ出現時に-OH、-OR、-S(O)R、-S(O)2R、-N(R)-S(O)2R、-S(O)2-N(R)(R)、-S(O)2-NHR、-N(R)-C(O)-Rまたは-N(R)(R)より選択され;かつ
Rは独立してそれぞれ出現時にC1~C12アルキルであるが;
但し、R6が水素である場合、R3は-CH2-N(R)(R)であり、「破線」の結合は二重結合である。いくつかの態様では、「破線の結合は二重結合である。別の態様では、「破線」の結合は単結合である。-Xは独立してそれぞれ出現時に-OH、-NH2または-N(R)(R)より選択されていてもよい。また、Rは独立してそれぞれ出現時にC1~4直鎖または分岐炭化水素より選択されていてもよい。いくつかの態様では、化合物は有効量で薬学的組成物に存在する。例えば、化合物はマラリアの処置または予防のための有効量で存在してもよい。いくつかの態様では、化合物はクリプトスポリジウム属からの寄生虫によって引き起こされる疾患(例えば、クリプトスポリジウム症)の処置または予防のための有効量で存在してもよい。いくつかの態様では、薬学的組成物はマラリアおよびクリプトスポリジウム症の処置のために製剤化されていてもよい。
式(I)の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩:
式中、「破線」の結合は単結合または二重結合であってもよく;
R 1 は置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリールであり;
R 2 は置換されていてもよいアルコキシ、シクロアルコキシまたはヘテロシクリルであり;
R 3 は水素または-CH 2 -Xであり;
R 4 およびR 5 は独立して水素、-X、または-CH 2 -Xであり、R 4 およびR 5 は一緒になって5員または6員の縮合環を形成してもよく、R 4 およびR 5 の少なくとも一方は水素ではなく;
R 6 およびR 7 は独立して水素またはRであり;かつ
z 1 ~z 8 は独立してそれぞれ出現時にCHまたはNより選択され;ここで
-Xは独立してそれぞれ出現時に-OH、-OR、-S(O)R、-S(O) 2 R、-N(R)-S(O) 2 R、-S(O) 2 -N(R)(R)、-S(O) 2 -NHR、-N(R)-C(O)-Rまたは-N(R)(R)より選択され;かつ
Rは、独立してそれぞれ出現時に、置換されていてもよいC 1 ~C 12 アルキルより選択される。
[本発明1002]
式(II)の構造:
を有する、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
R 7 が水素である、本発明1001または1002の化合物。
[本発明1004]
式(IIb)の構造:
を有する、本発明1001の化合物。
[本発明1005]
式(IIa)の構造:
を有する、本発明1001の化合物。
[本発明1006]
R 4 およびR 5 が、-Xまたは-CH 2 -Xより選択される同じ官能基である、本発明1001~1005のいずれかの化合物。
[本発明1007]
R 5 が水素であり、R 4 が-Xまたは-(CH 2 )-Xである、本発明1001~1005のいずれかの化合物。
[本発明1008]
R 4 が水素であり、R 5 が-Xまたは-(CH 2 )-Xである、本発明1001~1005のいずれかの化合物。
[本発明1009]
R 4 またはR 5 の基-Xまたは-(CH 2 )-Xの-Xが、-OH、-NH 2 、または-N(R)(R)である、本発明1006~1008のいずれかの化合物。
[本発明1010]
R 4 およびR 5 が独立して-OHおよび-ORより選択され、R 4 およびR 5 が一緒になって6員の縮合環を形成する、本発明1001~1005のいずれかの化合物。
[本発明1011]
R 6 が、C 1~4 直鎖または分岐炭化水素である、本発明1001~1010のいずれかの化合物。
[本発明1012]
R 6 が水素である、本発明1001~1010のいずれかの化合物。
[本発明1013]
Rが独立してそれぞれ出現時にC 1~4 直鎖または分岐炭化水素である、本発明1001~1011のいずれかの化合物。
[本発明1014]
R 1 が、置換されていてもよいC 6 アリールまたはヘテロアリールである、本発明1001~1013のいずれかの化合物。
[本発明1015]
R 1 が、フェニル、フルオロフェニル、ジフルオロフェニル、またはピリジルである、本発明1001~1014のいずれかの化合物。
[本発明1016]
R 2 が、C 1~4 直鎖または分岐アルコキシである、本発明1001~1015のいずれかの化合物。
[本発明1017]
R 2 が、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、またはイソプロポキシである、本発明1001~1016のいずれかの化合物。
[本発明1018]
R 2 が、1つまたは複数のFで置換されたC 1~4 直鎖または分岐アルコキシである、本発明1001~1015のいずれかの化合物。
[本発明1019]
R 2 が、-OCF 3 、-OCHF 2 、または-OCH 2 Fである、本発明1001~1015のいずれかの化合物。
[本発明1020]
R 2 が、C 3~6 ヘテロシクリル(例えば、アジリジニル、オキシラニル、チイラニル、オキセタニル、アゼチドニル、チエタニル、ジアゼチジニル、ジオキセタニル、ジチエタニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリルなど)である、本発明1001~1015のいずれかの化合物。
[本発明1021]
R 2 がオキセタニルまたはアゼチジニルである、本発明1001~1015のいずれかの化合物。
[本発明1022]
R 2 がC 3~6 シクロアルコキシである、本発明1001~1015のいずれかの化合物。
[本発明1023]
R 2 がシクロプロポキシである、本発明1022の化合物。
[本発明1024]
z 1 ~z 4 の1つがNであり、残りがCHである、本発明1001または1006~1023のいずれかの化合物。
[本発明1025]
z 5 ~z 8 の1つがNであり、残りがCHである、本発明1001または1006~1024のいずれかの化合物。
[本発明1026]
z 1 およびz 4 がそれぞれNであり、z 3 およびz 2 がそれぞれCHである、本発明1001、1006~1023または1025のいずれかの化合物。
[本発明1027]
z 5 およびz 7 がそれぞれNであり、z 6 およびz 8 がそれぞれCHである、本発明1001、1006~1023、または1026のいずれかの化合物。
[本発明1028]
式(III)の構造を有する化合物:
式中、「破線」の結合は単結合または二重結合であってもよく;
R 1 は置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリールであり;
R 2 は置換されていてもよいアルコキシ、シクロアルコキシまたはヘテロシクリルであり;
R 3 は水素または-CH 2 -Xであり;
R 6 およびR 7 は独立して水素またはRであり;かつ
z 1 ~z 8 は独立してそれぞれ出現時にCHまたはNより選択され;ここで
-Xは独立してそれぞれ出現時に-OH、-OR、-S(O)R、-S(O) 2 R、-N(R)-S(O) 2 R、-S(O) 2 -N(R)(R)、-S(O) 2 -NHR、-N(R)-C(O)-Rまたは-N(R)(R)より選択され;かつ
Rは独立してそれぞれ出現時にC 1 ~C 12 アルキルであるが;
但し、R 6 が水素である場合、R 3 は-CH 2 -N(R)(R)であり、「破線」の結合は二重結合である。
[本発明1029]
式(IV)の構造:
を有する、本発明1028の化合物。
[本発明1030]
「破線」の結合が二重結合である、本発明1028または1029の化合物。
[本発明1031]
R 6 が、C 1~4 直鎖または分岐炭化水素である、本発明1028または1029の化合物。
[本発明1032]
R 1 が、置換されていてもよいC 6 アリールまたはヘテロアリールである、本発明1028~1031のいずれかの化合物。
[本発明1033]
R 1 が、フェニル、フルオロフェニル、ジフルオロフェニル、またはピリジルである、本発明1028~1032のいずれかの化合物。
[本発明1034]
R 2 が、C 1~4 直鎖または分岐アルコキシである、本発明1028~1033のいずれかの化合物。
[本発明1035]
R 2 が、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、またはイソプロポキシである、本発明1028~1023のいずれかの化合物。
[本発明1036]
R 2 がC 3~6 シクロアルコキシである、本発明1035の化合物。
[本発明1037]
R 2 がシクロプロポキシである、本発明1035の化合物。
[本発明1038]
R 2 が、1つまたは複数のFで置換されたC 1~4 直鎖または分岐アルコキシである、本発明1001~1015のいずれかの化合物。
[本発明1039]
R 2 が、-OCF 3 、-OCHF 2 、または-OCH 2 Fである、本発明1001~1015のいずれかの化合物。
[本発明1040]
R 2 が、C 3~6 ヘテロシクリル(例えば、アジリジニル、オキシラニル、チイラニル、オキセタニル、アゼチドニル、チエタニル、ジアゼチジニル、ジオキセタニル、ジチエタニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリルなど)である、本発明1001~1015のいずれかの化合物。
[本発明1041]
R 2 がオキセタニルである、本発明1001~1015のいずれかの化合物。
[本発明1042]
z 1 ~z 4 の1つがNであり、残りがCHである、本発明1028または1030~1037のいずれかの化合物。
[本発明1043]
z 5 ~z 8 の1つがNであり、残りがCHである、本発明1028または1030~1042のいずれかの化合物。
[本発明1044]
z 1 およびz 4 がそれぞれNであり、z 3 およびz 2 がそれぞれCHである、本発明1028、1030~1037または1043のいずれかの化合物。
[本発明1045]
z 5 およびz 7 がそれぞれNであり、z 6 およびz 8 がそれぞれCHである、本発明1028、1030~1037、または1044のいずれかの化合物。
[本発明1046]
化合物E1~E38からなる群より選択される、本発明1001または1028の化合物。
[本発明1047]
薬学的に許容される賦形剤および本発明1001~1046のいずれかの化合物を含む、薬学的組成物。
[本発明1048]
化合物が有効量で存在する、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1049]
獣医学的組成物として製剤化された、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1050]
化合物が、マラリアを処置するための有効量で存在する、本発明1047~1049のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1051]
化合物が、クリプトスポリジウム属からの寄生虫によって引き起こされる疾患を処置するための治療有効量で存在する、本発明1047~1049のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1052]
疾患がクリプトスポリジウム症である、本発明1051の薬学的組成物。
[本発明1053]
有効量の本発明1001~1046のいずれかの化合物を対象に投与する工程
を含む、対象における寄生虫性疾患の処置または予防の方法。
[本発明1054]
寄生虫性疾患がマラリアである、本発明1053の方法。
[本発明1055]
マラリアが薬剤耐性マラリアである、本発明1053の方法。
[本発明1056]
薬剤耐性マラリアが、クロロキン、キニーネ、プリメタミン、スルファドキシン、メフロキン、アルテムエーテル、ルメファントリン、アルテスネイト、アモジアキン、ジヒドロアルテミシニン、ピペラキン、プログアニル、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、アルテミシニン、アトバコン、またはそれらの任意の組み合わせに耐性である、本発明1055の方法。
[本発明1057]
マラリアが肝臓期マラリアである、本発明1053の方法。
[本発明1058]
対象の肝臓がマラリア病原性の寄生虫に感染しており、処置がそれらの肝臓からの感染の拡大を防止する、本発明1057の方法。
[本発明1059]
マラリアが血液期マラリアである、本発明1053の方法。
[本発明1060]
マラリアが伝播期マラリアである、本発明1053の方法。
[本発明1061]
マラリアが、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、三日熱マラリア原虫(P. vivax)、卵形マラリア原虫(P. ovale)、四日熱マラリア原虫(P. malariae)、サルマラリア原虫(P. knowlesi)、P.ベルゲイ(P. berghei)、P.チャバウディ(P. chabaudi)、P.ビンケイ(P. vinckei)、またはP.ヨエリ(P. yoelii)より選択される蚊種において媒介される、本発明1053の方法。
[本発明1062]
蚊種が熱帯熱マラリア原虫である、本発明1061の方法。
[本発明1063]
寄生虫性疾患がクリプトスポリジウム症である、本発明1053の方法。
[本発明1064]
クリプトスポリジウム症がC.パルブム(C. parvum)によって媒介される、本発明1063の方法。
[本発明1065]
対象がヒトである、本発明1053の方法。
[本発明1066]
対象がヒトではない、本発明1053の方法。
[本発明1067]
対象が、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、トカゲ、ヤモリ、ウシ、子ウシ、ヒツジ、子ヒツジ、ウマ、子ウマ、ブタ、または子ブタである、本発明1066の方法。
[本発明1068]
本発明1047~1052のいずれかの薬学的組成物を対象に投与する工程
を含む、対象における寄生虫性疾患の処置または予防の方法。
[本発明1069]
寄生虫性疾患がマラリアである、本発明1068の方法。
[本発明1070]
マラリアが薬剤耐性マラリアである、本発明1068の方法。
[本発明1071]
薬剤耐性マラリアが、クロロキン、キニーネ、プリメタミン、スルファドキシン、メフロキン、アルテムエーテル、ルメファントリン、アルテスネイト、アモジアキン、ジヒドロアルテミシニン、ピペラキン、プログアニル、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、アルテミシニン、アトバコン、またはそれらの任意の組み合わせに耐性である、本発明1070の方法。
[本発明1072]
マラリアが肝臓期マラリアである、本発明1068の方法。
[本発明1073]
対象の肝臓がマラリア病原性の寄生虫に感染しており、処置がそれらの肝臓からの感染の拡大を防止する、本発明1072の方法。
[本発明1074]
マラリアが血液期マラリアである、本発明1068の方法。
[本発明1075]
マラリアが伝播期マラリアである、本発明1068の方法。
[本発明1076]
マラリアが、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、サルマラリア原虫、P.ベルゲイ、P.チャバウディ、P.ビンケイ、またはP.ヨエリより選択される蚊種において媒介される、本発明1068の方法。
[本発明1077]
蚊種が熱帯熱マラリア原虫である、本発明1068の方法。
[本発明1078]
寄生虫性疾患がクリプトスポリジウム症である、本発明1068の方法。
[本発明1079]
クリプトスポリジウム症がC.パルブムによって媒介される、本発明1078の方法。
[本発明1080]
対象がヒトである、本発明1068の方法。
[本発明1081]
対象がヒトではない、本発明1068の方法。
[本発明1082]
対象が、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、トカゲ、ヤモリ、ウシ、子ウシ、ヒツジ、子ヒツジ、ウマ、子ウマ、ブタ、または子ブタである、本発明1081の方法。
発明のこれらおよび他の局面は、発明を実施するために企図される単なる様々な形態である例示の以下の詳細な説明から当業者には明らかであろう。理解されるように、発明は、発明から逸脱しない追加の異なる自明な局面が可能である。したがって、明細書は本質的に例示であり限定ではない。
定義
本明細書において採用される用語は特定の態様を説明する目的のためにあり、限定することを意図していないと理解されたい。さらに、本明細書において記載のものと類似または均等なあらゆる方法および材料が本開示の実施または試験において用いられ得るが、好ましい方法および材料をこれより記載する。
開示はこれらの形態のすべて含む。
本開示はマラリアの処置に有用な新規な化合物および薬学的組成物を提供する。開示はこれらの化合物および組成物を用いる方法も提供する。
本明細書において記載の化合物は本明細書において提供される方法で有用であり、任意の特定の理論に拘束されるものではないが、マラリアを引き起こす寄生原生動物(例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、および/またはサルマラリア原虫)および/またはクリプトスポリジウム症を引き起こす寄生原生動物(例えば、C.パルブム、C.ホミニス、C.カニス、C.フェリス、C.メレアグリジス、およびC.ムリス)の成長を阻害するかまたはそれを殺す能力を通じて望ましい効果を発揮すると考えられる。いくつかの態様では、処置は肝臓からのマラリア原虫および/またはクリプトスポリジウム原虫感染の拡大を防止すること、全身性疾患を防止すること、マラリアの症候期を防止すること、感染の確立を防止すること、および/またはさらなる伝播(例えば、蚊への)を防止することなどの原因予防を含む。いくつかの態様では、マラリアの処置は治癒を達成することを意図した処置(例えば、三日熱マラリア原虫または四日熱マラリア原虫の)、例えば、根治処置(すなわち、肝臓からヒプノゾイトを消滅させること)を指す。様々な例では、方法は肝臓からの、マラリアを引き起こす寄生虫の感染の広がりを防止する工程を含む。いくつかの態様では、クリプトスポリジウム症の処置は対象の感染部位(例えば、肝臓、腸、気道など)を超えたクリプトスポリジウムの拡大の防止などの原因予防を含む。
1.製剤
本明細書において記載の方法における使用向けに化合物を薬学的または獣医学的組成物として製剤化し得る。選択される製剤は処置される対象、投与の様式、および所望の処置の種類(例えば、防止、予防、または治療)に応じて異なり得る。製剤化技術の概要はRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (2005);およびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkに見出され、これらのぞれそれは参照により本明細書に組み入れられる。例示的な投与経路および製剤を下に記載する。
化合物および組成物は任意で1つまたは複数の他の薬剤と共にキットに包装し得る(下を参照されたい)。キットの非限定例は、例えば、2つ以上の丸剤、丸剤と粉末、バイアル内の坐剤と液体、または2つの局所クリームを含有するものを含む。キットは、粉末形態を再構成するためのバイアル、注射用シリンジ、カスタマイズされたIV送達システム、または吸入器などの、対象への単位用量の投与に役立つ任意の要素を含み得る。加えて、単位用量キットは組成物の調製および投与のための指示書を含み得る。キットは対象1人のための単回使用単位用量、特定の対象のための複数回使用(一定用量であるか、または治療の進行に応じて個々の化合物の効力が異なる場合がある)として製造され得るか、またはキットは複数の対象への投与に好適な複数の用量を含み得る(「バルク包装」)。キットの構成要素はカートン、ブリスターパック、ボトル、およびチューブに集め得る。
化合物の用量は投与の様式、対象の年齢および体重、ならびに処置される対象の状態などの多くの要因に応じて異なり、最終的には担当する医師または獣医によって決定されるであろう。担当する医師または獣医によって決定されるこのような化合物の量は本明細書においておよびクレームにおいて「治療有効量」と呼ばれる。例えば、本明細書において開示する化合物の用量は典型的には1日あたり約1~約1000mgの範囲である。好ましくは、治療有効量は1日あたり約1mg~約500mgの量である。
化合物および薬学的組成物は併用療法において製剤化され採用され得る、すなわち、化合物および薬学的組成物は1つまたは複数の他の所望の治療剤または医療法と同時に、その前に、またはその後に製剤化されるかまたは投与され得る。併用レジメンにおいて採用する治療(治療剤または方法)の特定の組み合わせでは、所望の治療剤および/または方法の適合性ならびに達成すべき所望の治療効果が考慮されるであろう。採用される治療は同じ障害に対して所望の効果を達成する場合があること、または異なる効果(例えば、任意の有害作用の制御)を達成する場合があることも理解されるであろう。
材料および方法
反応はすべてN2またはアルゴン雰囲気下で行った。すべての試薬および溶媒を業者から購入し受領したまま用いるか、または脚注の参考文献に従って合成した。NMRスペクトルはBruker300(300MHz 1H、75MHz 13C)およびBruker400(400MHz 1H、100MHz 13C)分光計に記録した。プロトンの化学シフトはNMR溶媒を基準としたppm(6)で報告される。データは次のように報告する:化学シフト、多重度(br=ブロード、s=一重線、d=二重線、t=三重線、q=四重線、p=五重線、m=多重線、結合定数(Hz);積分)。特に明記しない限り、NMRデータは25℃で収集した。Teledyne Isco Combiflash Rfで40~60pirnシリカゲル(60Åメッシュ)を用いてフラッシュクロマトグラフィーを実施した。純度分析のために、すべての実施例で210nmのUV吸光度によって純度を測定し、ポジティブエレクトロスプレーイオン化によりSQ質量分析計で同定した。次の方法を用いた:タンデム液体クロマトグラフィー/質量分析(LCMS)はWaters 2795分離モジュールおよび3100質量検出器で実施した。移動相Aは0.01%ギ酸水溶液で構成された一方、移動相Bは0.01%ギ酸アセトニトリル溶液で構成された。1.75mL/minで2.5、5、または7.5分にわたって5%から95%まで移動相Bの勾配をかけた。Agilent Poroshell 120 EC-C18、2.7mM、3.0×30mmカラムを用い、カラム温度を40℃に維持した。2.1mLの試料溶液を注入した。分析TLCはEM Reagent 0.25mmシリカゲル60-Fプレート上で実施した。可視化はUV光および過マンガン酸カリウム(KMnO4)水溶液染色に続いて加熱をして達成した。Agilent 6230飛行時間型質量分析計で(M+H)+として正確な質量測定値を得た。化合物の純度および同定もUPLC-MSによって決定した。純度は210nmでのUV吸光度で測定した。ポジティブおよびネガティブエレクトロスプレーイオン化によってSQ質量分析計で同定した。移動相Aは0.1%水酸化アンモニウムまたは0.05%トリフルオロ酢酸水溶液で構成した一方、移動相Bは0.1%水酸化アンモニウムまたは0.06%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液で構成した。0.9mL/minで2.65分かけて5%から95%まで移動相Bの勾配をかけた。Acquity BEH C18、1.7um、2.1×50mmカラムを用い、カラム温度を65℃に維持した。化合物を1mg/mLの名目濃度でDMSOに溶解し、この溶液を1.0μL注入した。キラル分離はSFC-MSによって実施した。Berger G600超臨界流体クロマトグラフをポジティブAPCIモードで動作するWaters ZQシングル四重極質量分析計と組み合わせた。20%イソプロパノールで変性した液化CO2を用いて、40℃に維持した4.6×100mm Chiralpak AD-Hカラムで4.0mL/minにて5.0分間アイソクラチック分離を実施した。化合物は1mg/mLの名目濃度でメタノールに溶解し、この溶液を10μL注入した。下の合成例は特に限定するものではなく、本発明の化合物を合成するための他の方法が当業者には周知である。
下の合成例全体を通じて様々な略称が採用されており、当業者には周知である。表2は実施例および対応する参考文献全体を通じて用いられる略語の様々な例を説明している。
DCM(27.00mL)中の(8R,9R,10S,Z)-10-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-9-(4-ブロモフェニル)-6-((2-ニトロフェニル)スルホニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカ-3-エン(2.00g、2.66mmol)(Journal of Organic Chemistry (2012), 77(17), 7187-7211; WO 2015070204)の溶液にTFA(3.03g、26.60mmol、1.97mL)を加えた。混合物を15℃で20時間撹拌した。NaHCO3溶液(100mL)の添加によって反応混合物をクエンチし、次いでDCM180mL(3×60mL)で抽出した。合わせた有機層を[NaSO4]で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル:DCM=1:1からDCM:MeOH=10:1)で精製して、中間体1(1.47g、粗製)を黒色の固形物として得た。反応生成物の存在はNMRおよびLCMSによって確認した。
脱気してN2でパージしたTHF(5mL)中のトリフェニルホスフィン(1.52g、5.78mmol)の混合物にアゾジカルボン酸ジイソプロピル(1.17g、5.78mmol、1.12mL)を加えた。N2雰囲気下0℃で撹拌したこの混合物に、脱気してN2でパージしたTHF(5mL)中の中間体1(1.47g、2.89mmol、1.00eq)とイソインドリン-1,3-ジオン(637.81mg、4.34mmol、1.50eq)の混合物を加えた。混合物を16℃で18時間N2雰囲気下で撹拌した。H2O(20mL)の添加によって反応混合物をクエンチし、次いでDCM(3×20mL)で抽出した。合わせた有機層を[Na2SO4]で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル:酢酸エチル= 5:1~2:1)で精製し、NMRおよびLCMSによって確認されるように中間体2(1.26g、1.98mmol、収率68.39%)を褐色の固形物として得た。
アセトン/水(15.00mL)中の中間体2(1.26g、1.98mmol)の溶液にN-メチルモルホリンN-オキシド(463.09mg、3.95mmol、417.20μL)次いでOsO4(5.02mg、19.76μmol、1.03μL)を加えた。混合物を15℃で1.5時間撹拌した。反応混合物を[Na2SO4]で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル= 3/1~0:1)で精製し、LCMSおよびNMRによって確認されるように中間体3(1.11g、1.65mmol、収率83.48%)を白色の固形物として得た。
DCM(10.00mL)中の中間体3(880.00mg、1.31mmol)と2,2-ジメトキシプロパン(272.97mg、2.62mmol、321.14μL)との溶液にTsOH(225.66mg、1.31mmol)を加えた。混合物を15℃で撹拌した。20時間後、反応混合物を減圧下で濃縮し残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=1:1)で精製して、NMRおよびLCMSによって確認されるように、シスジオール、中間体4a(極性がより低い、53.00mg、74.48μmol、収率5.68%)を白色の固形物としておよび中間体4b(極性がより高い、260.00mg、365.38μmol、収率27.88%)を白色の固体としてそれぞれ得た。
エタノール(5.00 mL)中の中間体4b(360.00mg、505.92μmol)の溶液にヒドラジン水和物(37.99mg、758.88μmol、36.88μL)を加えた。70℃で1.5時間撹拌した後、反応混合物をセライトでろ過し、減圧下で濃縮して、NMRおよびLCMSによって確認されるように、中間体5(239.00mg、411.02μmol、収率81.24%)を黄色の固形物として得た。
DCM(500μL)中の中間体5(239.00mg、411.02μmol)とホルムアルデヒド(200.47mg、2.47mmol、183.92μL)との溶液にMgSO4(494.74mg、4.11mmol)および酢酸(49.36mg、822.04μmol、47.01μL)を加えた。20分後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(60.32mg、1.23mmol)を加え、混合物を15℃で23時間撹拌した。反応混合物をセライトでろ過し減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)で精製して、LCMSによって確認されるように、中間体6(210.00mg、344.53μmol、収率83.82%)を黄色の油状物として得た。
CH3CN(2.00mL)中の中間体6(210.00mg、344.53μmol)の溶液にベンゼンチオール(17.08mg、155.04μmol、15.82μL)を加え、次いでCs2CO3(224.51mg、689.06μmol)を加えた。混合物を40℃で1.5時間N2雰囲気下で撹拌した。H2O(5mL)の添加によって反応混合物をクエンチし、DCM15mL(3×5mL)で抽出した。合わせた有機層を[Na2SO4]で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)で精製して、NMRおよびLCMSによって確認されるように、中間体7(72.00mg、169.66μmol、収率49.24%)を黄色の油状物として得た。
DCM(2.00mL)中の中間体7(48.00mg、113.11μmol)の溶液にN2雰囲気下でTEA(5.72mg、56.55μmol、7.84μL)および1-(シクロプロポキシ)-4-イソシアナト-ベンゼン(23.78mg、135.73μmol)を加えた。15℃で22時間撹拌した後、H2O(5mL)の添加によって反応混合物をクエンチし、次いでDCM15mL(3×5mL)で抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)で精製して、LCMSによって確認されるように、中間体8(29.40mg、49.04μmol、収率43.35%)を淡色の油状物として得た。
N2雰囲気下のCH3CN(1.00mL)中の中間体8(29.00mg、48.37μmol)の溶液に、TEA(97.89mg、967.38μmol、134.09μL)およびエチニルベンゼン(24.70mg、241.84μmol、26.56μL)およびXPhos Pd G3(6.14mg、7.26μmol)を加えた。70℃で1時間撹拌した後、H2O(4mL)の添加によって反応混合物をクエンチし、次いでDCM15mL(3×5mL)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、LCMSによって確認されるように、中間体9(30.00mg)を淡色の油状物として得た。
CH3CN(500.00μL)中の中間体9(20.00mg、32.22μmol)の溶液に1M HCl(500.00μL)を加えた。15℃で18時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製し、化合物E1(8.20mg、14.12μmol、収率43.83%)を黄色の固形物として得た。
CH3CN(2.00mL)および1M HCl(2.00mL)中の中間体4a(170.00mg、238.90μmol)の溶液を20℃で18時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)で精製して、NMRによって確認されるように、中間体10(140.00mg、208.49μmol、収率87.27%)を白色の固形物として得た。
DCM(4.00mL)中の中間体10(125.00mg、186.15μmol)の溶液にN2雰囲気下0℃でテトラフルオロホウ酸トリメチルオキソニウム(137.67mg、930.75μmol)およびN1,N1,N8,N8-テトラメチルナフタレン-1,8-ジアミン(239.36mg、1.12mmol)を加えた。RT(15℃)で18時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、酢酸エチル)で精製して、NMRによって確認されるように、中間体11(100.00mg、142.94μmol、収率76.79%)を白色の固形物として得た。
エタノール(3.00mL)中の中間体11(100.00mg、142.94μmol)の溶液にN2H4.H2O(10.73mg、214.42μmol、10.42μL)を加えた。70℃で1時間撹拌した後、反応混合物をセライトでろ過し、減圧下で濃縮して、NMRによって確認されるように粗中間体12(87.00mg)を黄色の固形物として得た。
DCM(2.00mL)中の中間体12(87.00mg、152.77μmol)の溶液にHCHO(27.53mg、916.64μmol、25.25μL)、MgSO4(183.89mg、1.53mmol)、NaBH(OAc)3(97.14mg、458.32μmol)およびAcOH(18.35mg、305.55μmol、17.47μL)を加えた。15℃で3時間撹拌した後、反応混合物をセライトでろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)で精製して中間体13(46.00mg、76.98μmol、収率50.39%)を黄色の油状物として得た。
CH3CN(2.00mL)中の中間体13(46.00mg、76.98μmol)の溶液にベンゼンチオール(12.72mg、115.48μmol、11.78μL)およびCs2CO3(50.17mg、153.97μmol)を加えた。N2雰囲気下40℃で1.5時間撹拌した後、H2O(2mL)の添加によって反応混合物をクエンチしDCM15mL(3×5mL)で抽出した。合わせた有機層を[Na2SO4]で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)で精製して、LCMSで確認されるように、中間体14(17.00mg、41.23μmol、収率53.55%)を白色の油状物として得た。
DCM(2.00mL)中の中間体14(17.00mg、41.23μmol)の溶液にTEA(2.09mg、20.61μmol、2.86μL)および1-イソシアナト-4-メトキシ-ベンゼン(6.15 mg、41.23μmol、5.30μL)を加えた。N2雰囲気下15℃で2.5時間混合物を撹拌した後、H2O(5mL)の添加によって反応混合物をクエンチし、次いでDCM15mL(3×5mL)で抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(DCM:MeOH=10:1)で精製して、LCMSによって確認されるように、中間体15(33.00mg、粗製)を透明の油状物として得た。
アセトニトリル(2.00mL)中の中間体15(33.00mg、58.77μmol)の溶液にN2雰囲気下でTEA(118.94mg、1.18mmol、162.93μL)およびXPhos Pd G3(7.46mg、8.82μmol)を加えた。70℃で1時間撹拌した後、H2O(2mL)の添加によって反応混合物をクエンチし、次いでDCM15mL(3×5mL)で抽出した。合わせた有機層を[Na2SO4]で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)に続いて分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製し、4.4mg、7.55μmol、収率12.85%を白色の固形物として得た。構造はLCMSおよびNMRによって確認した。
DCM(40.00mL)中のN-(((2R,3R,4S)-3-(4-ブロモフェニル)-4-((トリチルオキシ)メチル)アゼチジン-2-イル)メチル)-2-ニトロベンゼンスルホンアミド(WO2015070204)(1.20g、1.72mmol)と(1-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)-4-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸(S)-tert-ブチル(US20150266867)(911.52mg、2.06mmol)との溶液にMgSO4(2.07g、17.20mmol)およびNaBH(OAc)3(729.07mg、3.44mmol)を加えた。15℃で2時間撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液(15mL)の添加によって反応混合物をクエンチしDCM(2×5mL)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=20:1~3:1)で精製して中間体16(2.00g)を白色の固形物として得た。
THF(6mL)中の中間体16(500.00mg、444.74μmol)の溶液にTBAF(174.42mg、667.11μmol)を15℃で加えた。15℃で1時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM:MeOH=100:1~20:1)によって精製して、中間体17(300.00mg、338.65μmol、収率76.15%)を白色の固形物として得た。
DCM(16.00mL)中の中間体17(800.00mg、903.08μmol)の溶液にTMSOTf(602.15mg、2.71mmol、489.55μL)および2,6-ルチジン(387.06mg、3.61mmol、420.72μL、4eq)を加えた。15℃で16時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM:MeOH=1:0~20:1)によって精製して、中間体18(700mg、粗製)を白色の固形物(TEA含有)として得た。
DCM(15.00mL)中の中間体18(700.00mg、890.88μmol)の溶液にHCHO(86.77mg、1.07mmol、79.61μL、純度37%)、MgSO4(1.07g、8.91mmol)、次いでNaBH(OAc)3(377.63mg、1.78mmol)を少量づつ加えた。15℃で1時間撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液(100mL)の添加によって反応混合物をクエンチしDCM(2×30mL)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM:MeOH =1:0~15:1)によって精製して、中間体19(500mg、614.40μmol、収率68.97%)を白色の固形物として得た。
0℃のTHF(19ml)中のトリフェニルホスフィン(1g、3.76mmol)の溶液にアゾジカルボン酸ジイソプロピル(0.72mL、3.76mmol)をゆっくりと加えた。次いでこの混合物を0℃のTHF(75mL)中の中間体19(500mg、614.40μmol)の溶液に加えた。15℃で4時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM:MeOH=20:1)によって精製して中間体20(200.00mg、251.33μmol、収率40.91%)を白色の固形物として得た。
アセトニトリル(3.00mL)中の中間体20(150.00mg、188.49μmol)の溶液にCs2CO3(368.49mg、1.13mmol)およびベンゼンチオール(83.07mg、753.96μmol、76.92μL)を加えた。40℃で16時間撹拌した後、水(15mL)の添加によって反応混合物をクエンチし酢酸エチル(2X5mL)で抽出した。合わせた有機層をブライン(2×5mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)によって精製して、中間体21(90.00mg、147.39μmol、収率78.20%)を白色の固形物として取得し直接用いた。
DCM(3.00mL)中の中間体21(90.00mg、147.39μmol)の溶液に1-イソシアナト-4-メトキシ-ベンゼン(26.38mg、176.87μmol)を加えた。15℃で1時間撹拌した後、水(15mL)の添加によって反応混合物をクエンチしDCM(2×5mL)で抽出した。合わせた有機層をブライン(2×10mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=20:1)によって精製して、中間体22(90.00mg、118.46μmol、収率80.37%)を白色の固形物として得た。
アセトニトリル(1mL)中の中間体22(64.00mg、84.24μmol)とエチニルベンゼン(25.81mg、252.71μmol)との溶液にXPhos Pd G3(7.13mg、8.42μmol)およびCs2CO3(54.89mg、168.47μmol)を加えた。70℃で2時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(酢酸エチル:メタノール=10:1)によって精製して、中間体23(47.00mg、60.18μmol、収率71.44%)を褐色の固形物として得た。
DCM(1mL)中の中間体23(40.00mg、51.22μmol)の溶液にTFA(58.40mg、512.17μmol、37.92μL)を加えた。25℃で12時間撹拌した後、反応混合物を飽和NaHCO3でクエンチしDCM(3×5mL)で抽出して有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製し、化合物E3(21.70mg、40.28μmol、収率78.6%)を白色の固形物として得た。HRMS(ESI):C33H38N4O3[M+H]+の計算値539.29、測定値539.30
アセトニトリル(6mL)中の(8R,9R,10S,Z)-10-((ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)メチル)-9-(4-ブロモフェニル)-6-((2-ニトロフェニル)スルホニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカ-3-エンおよびベンゼンチオール(132.09mg、1.20mmol、122.31μL)の溶液に25℃のCs2CO3(260.41mg、799.25μmol)を加えた。50℃で12時間撹拌した後、反応混合物をH2O(5mL)でクエンチしDCM(10mL)で抽出して有機相を得た。有機相を濃縮し分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して中間体24(450mg、795.70μmol、収率99.56%)を白色の固形物として得た。
DCM(2mL)中の中間体24(400mg、707.29μmol)とEt3N(196.08μL、1.41mmol)との溶液に0℃の1-イソシアナト-4-メトキシ-ベンゼン(116.04mg、778.02μmol)を滴下した。25℃で5時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体25(400mg、559.68μmol、収率79.13%)を白色の固形物として得た。
DCM(1mL)中の中間体25(360.00mg、503.71μmol)の溶液に0℃のTFA(3mL、5037μmol)を滴下した。25℃で1時間撹拌した後、反応混合物を飽和NaHCO3(3mL)でクエンチしDCM(5mL)で抽出して有機相を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濃縮し、分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:2)で精製して、中間体26(210mg、444.57μmol、収率88.26%)を白色の固形物として得た。
THF(2mL)中の中間体26(210.00mg、444.57μmol)とイソインドリン-1,3-ジオン(71.95mg、489.03μmol)とPPh3(233.21mg、889.13μmol)との溶液に25℃のDIAD(179.79mg、889.13μmol)を滴下した。25℃で5時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体27(200mg、332.51μmol、収率74.79%)を薄褐色の固形物として得た。
MeOH(1mL)中の中間体27(60.00mg、99.75μmol)の溶液に2-アミノエタノール(60.33μL、997.52μmol)を滴下した。25℃で3時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=12:1)によって精製して、中間体28(33.00mg、70.01μmol、収率70.18%)を白色の固形物として得た。
DCM(2mL)中の中間体28(23.00mg、48.79μmol)の撹拌溶液に25℃のNaBH(OAc)3(51.70mg、243.96μmol)を加えた。25℃で2時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=12:1)によって精製して、中間体29(20mg、40.04μmol、収率82%)を白色の固形物として得た。
アセトニトリル(1mL)中の中間体29(20.00mg、40.04μmol)とエチニルベンゼン(12.27mg、120.13μmol、13.19μL)との溶液にXPhos Pd G3(3.39mg、4.00μmol)およびCs2CO3(26.09mg、80.09μmol)を加えた。70℃で2時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(0.04%HCl/アセトニトリル/H2O系)によって精製して、(3Z,8R,9S,10S)-10-[(ジメチルアミノ)メチル]-N-(4-メトキシフェニル)-9-[4-(2-フェニルエチニル)フェニル]-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカ-3-エン-6-カルボキサミド(2.00mg、3.84μmol、収率9.59%)を白色の固形物として得た。C32H33N4O[M+H]+のHRMS(ESI)計算値489.27、測定値520.10
アセトン/H2O=10:1(1mL)中の中間体27(60mg、99.75μmol)の撹拌溶液にNMO(17.53mg、149.62μmol)およびOsO4(2.54mg、9.98μmol)を室温で加えた。25℃で2時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:5)によって精製して、中間体30a(極性がより低い)(25mg、39.34μmol、収率39.44%)を薄褐色の固形物として、および中間体30b(極性がより高い)(25mg、39.34μmol、収率39.44%)を薄褐色の固形物として得た。
中間体30a
中間体30b
MeOH(2mL)中の中間体30a(120mg、188.83μmol)の撹拌溶液に2-アミノエタノール(115.34mg、1.89mmol)を加えた。25℃で2時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=8:1)によって精製して、中間体31a(70mg、138.50μmol、収率73.35%)を白色の固形物として得た。
DCM(2mL)中の31a(70.00mg、138.50μmol)の撹拌溶液にHCHO(112.41mg、1.39mmol、103.13μL、37%溶液)およびMgSO4(166.72mg、1.39mmol)を加えた。25℃で0.5時間撹拌した後、さらにNaBH(OAc)3(146.77mg、692.52μmol)を加えた。さらに1.5時間後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=5:1)によって精製して、中間体32a(60mg、112.47μmol、収率81%)を薄褐色の固形物として得た。
アセトニトリル(1mL)中の中間体32a(20.00mg、40.04μmol)とエチニルベンゼン(12.27mg、120.13μmol, 13.19μL)との溶液にXPhos Pd G3(3.39mg、4.00μmol、0.10eq)およびCs2CO3(26.09mg、80.09μmol)を加えた。70℃で2時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製し、(3S,4R,8R,9S,10S)-10-((ジメチルアミノ)メチル)-3,4-ジヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-9-(4-(フェニルエチニル)フェニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド(2.00mg、3.84μmol、収率9.59%)を白色の固形物として得た。C33H38N4O4[M+H]+のHRMS(ESI)計算値554.29、測定値554.20
MeOH(2mL)中の中間体30b(30mg、47.21μmol)の撹拌溶液に25℃の2-アミノエタノール(28.84mg、472.10μmol)を加えた。25℃で2時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=8:1)によって精製して、中間体31b(20mg、39.57μmol、収率83.82%)を白色の固形物として得た。
DCM(2mL)中の中間体31a(10mg、19.79μmol)の撹拌溶液に25℃のHCHO(16.06mg、197.90μmol、14.73μL、37%溶液)およびMgSO4(23.82mg、197.90μmol)を加えた。25℃で0.5時間撹拌した後、さらにNaBH(OAc)3(20.97mg、98.95μmol)を加えた。25℃で1.5時間撹拌した後、さらに反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=5:1)によって精製して、中間体32b(10mg、18.75μmol、収率47.36%)を薄褐色の固形物として得た。
アセトニトリル(1mL)中の中間体32b(10mg、18.75μmol)とエチニルベンゼン(5.74mg、56.24μmol、6.18μL)との溶液にXPhos Pd G3(1.59mg、1.87μmol)およびCs2CO3(12.22mg、37.49μmol)を加えた。70℃で2時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(0.04%HCl/ACN/H2O系)によって精製して、(3R,4S,8R,9S,10S)-10-((ジメチルアミノ)メチル)-3,4-ジヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-9-(4-(フェニルエチニル)フェニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド(2mg、3.61μmol、収率19.23%)を白色の固形物として得た。C33H38N4O4[M+H]+のHRMS(ESI)計算値554.29、測定値554.2
中間体(「Int.」)32aまたは32bのいずれかから開始して表3に記載されたアルキンおよび特定されたアルデヒド(示されている場合)と共に実施例6に従って以下の実施例化合物(E7~E9)を調製した。
DCM(1.00mL)中の中間体31a(100.00mg、197.86μmol)、アセトン(68.95mg、1.19mmol、87.28μL)、AcOH(11.88mg、197.86μmol、11.31μL)およびMgSO4(238.16mg、1.98mmol)の溶液にNaBH(OAc)3(125.80mg、593.58μmol)を加えた。20℃で12時間撹拌した後、反応混合物をセライトでろ過し、減圧下で濃縮して、粗中間体33a(116.00mg)を薄黄褐色の固形物として得た。
DCM(1.00mL)中の中間体33a(116.00mg、211.88μmol)、ホルムアルデヒド(103.08mg、1.27mmol、94.57μL)、MgSO4(255.04mg、2.12mmol)およびAcOH(12.72mg、211.88μmol、12.11μL)の溶液にNaBH(OAc)3(134.72mg、635.64μmol)を加えた。20℃で2時間撹拌した後、反応混合物をセライトでろ過し、減圧下で濃縮して、粗中間体34b(138.00mg、粗製)を暗黄色の固形物として得た。
CH3CN(1.00mL)中の中間体34a(30.00mg、53.43μmol)とエチニルベンゼン(10.91mg、106.86μmol、11.73μL)との溶液にEt3N(16.22mg、160.29μmol、22.22μL)およびXPhos Pd G3 (4.52mg、5.34μmol)を加えた。70℃で2時間撹拌した後、反応混合物をセライトでろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得、これを分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製し、(3S,4R,8R,9S,10S)-3,4-ジヒドロキシ-10-[[イソプロピル(メチル)アミノ]メチル]-N-(4-メトキシフェニル)-9-[4-(2-フェニルエチニル)フェニル]-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド(11.20mg、17.81μmol、収率33.34%、ギ酸塩)を薄黄色の固形物として得た。
実施例E11は中間体31bで開始して実施例10に記載の合成を用いて調製した。
CH3CN(1.00mL)中の中間体32a(54.00mg、101.23μmol)とエチニルトリメチルシラン(29.83mg、303.69μmol、42.01μL)との溶液にCs2CO3(131.93mg、404.92μmol)およびXPhos Pd G3(8.57mg、10.12μmol)を加えた。N2雰囲気下70℃で2時間撹拌した後、反応混合物をセライトでろ過し、減圧下で濃縮して、粗生成物2(78.00mg、粗製)を暗黄色の固形物として得た。
CH3CN(500μL)中の(3R,4S,8R,9S,10S)-10-[(ジメチルアミノ)メチル]-9-(4-エチニルフェニル)-3,4-ジヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド(中間体35a)(21.60mg、45.13μmol)および1-ブロモ-2,3-ジフルオロベンゼン(8.71mg、45.13μmol、5.06μL)の溶液にCs2CO3(29.41mg、90.26μmol)およびXPhos Pd G3(3.82mg、4.51μmol)を加えた。N2雰囲気下40℃で1時間撹拌した後、残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=8:1)によって精製して触媒を除去し、次いで分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)によって精製して、(3S,4R,8R,9S,10S)-9-[4-[2-(2,3-diフルオロフェニル)エチニル]フェニル]-10-[(ジメチルアミノ)メチル]-3,4-ジヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド(2.00mg、3.14μmol、収率6.96%、ギ酸塩)を白色の固形物として得た。
CH3CN(1.00mL)中の(3R,4S,8R,9S,10S)-9-(4-ブロモフェニル)-10-[(ジメチルアミノ)メチル]-3,4-ジヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド(中間体32b)(40.00mg、74.98μmol)およびエチニル(トリメチル)シラン(22.09mg、224.95μmol、31.12μL)の溶液にCs2CO3(97.72mg、299.93μmol)およびXPhos Pd G3(6.35mg、7.50μmol)を加えた。70℃で1時間N2雰囲気で撹拌した後、反応混合物をセライトでろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得、これを分取TLC(DCM:MeOH=10:1、Rf=0.2)によって精製して、中間体36b(30.00mg、62.69μmol、収率83.60%)を薄黄色の固形物として得た。
2,2-ジメトキシプロパン(500μL)およびDCM(500μL)中の中間体36b(30.00mg、62.69μmol)の溶液にTsOH(1.08mg、6.27μmol)を加えた。20℃で1時間撹拌した後、反応物を濃縮し分取TLC(DCM:MeOH=10:1)によって精製して、中間体37b(20.00mg、38.56μmol、収率61.51%)を黄色の油状物として得た。
CH3CN(500μL)中の中間体37b(20.00mg、38.56μmol)と1-ブロモ-2,3-ジフルオロ-ベンゼン(22.33mg、115.68μmol、12.98μL)との溶液にCs2CO3(50.25mg、154.24μmol)およびXPhos Pd G3(3.26mg、3.86μmol)を加えた。N2雰囲気下70℃で1時間撹拌した後、反応混合物を分取TLC(DCM:MeOH=10:1)によって精製して、中間体38b(15.00mg、23.78μmol、収率61.68%)を黄色の油状物として得た。
CH3CN(500.00μL)中の中間体38b(15.00mg、23.78μmol、1.00eq)の混合物に1M HCl(500.00μL)を加えた。15℃で12時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得、これを分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)によって精製して、(3S,4R,8R,9S,10S)-9-(4-((2,3-ジフルオロフェニル)エチニル)フェニル)-10-((ジメチルアミノ)メチル)-3,4-ジヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド(11.00mg、17.28μmol、収率72.65%、ギ酸塩)を白色の固形物として得た。
DCE(1.00mL)中の中間体32a(30.00mg、56.24μmol)、NaOH(15.00mg、112.48μmol、180.30μL、30%m/v)とTBAB(3.63mg、11.25μmol)との混合物を55℃で12時間撹拌した。LC-MSは、約40%の反応物1が残存していることを示した。所望の中間体MSによる新しいピークが1つ検出された。反応混合物を10mLのDCMで希釈し、15mLのH2O*5で洗浄した。次いで3mLのブライン*2で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得、これを分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)によって精製して中間体39(10.00mg、17.87μmol、収率31.78%)を無色の油状物として得た。
CH3CN(500μL)中の中間体39a(20.00mg、35.75μmol)とエチニルベンゼン(10.95mg、107.25μmol、11.77μL)との溶液にCs2CO3(46.59mg、143.00μmol)およびXPhos Pd G3(3.03mg、3.58μmol)を加えた。N2雰囲気下70℃で1時間 N2雰囲気下で撹拌した後、反応混合物を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)によって濃縮し精製して触媒を除去し、次いで分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)によって精製して、(4aR,7aR,8S,9S,11aS)-9-((ジメチルアミノ)メチル)-N-(4-メトキシフェニル)-8-(4-(フェニルエチニル)フェニル)オクタヒドロ-2H-アゼト[1,2-α][1,4]ジオキシノ[2,3-f][1,4]ジアゾシン-6(3H)-カルボキサミド(ギ酸塩)、6.00mg、10.33μmol、収率28.90%)を白色の固形物として得た。
CH3CN(4.00mL)中のN-[[(2R,3R,4S)-3-(4-ブロモフェニル)-4-(トリチルオキシメチル)アゼチジン-2-イル]メチル]-2-ニトロ-ベンゼンスルホンアミド(400.00mg、572.56μmol)とLiClO4(121.83mg、1.15mmol、50.34μL)との溶液にtert-ブチル-[2-[(2R)-オキシラン-2-イル]エトキシ]-ジフェニル-シラン(Organic Letters (2016), 18(3), 468-471)(373.88mg、1.15mmol)を加えた。80℃で16時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去した。残渣をH2O(20mL)で希釈し、DCM(3×20mL)で抽出した。合わせた有機層をブライン(3×10mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得、これを分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=2/1)によって精製して、中間体40(250.00mg、243.87μmol、収率42.59%)を薄黄色の固形物として得た。
DCM(3.00mL)中のN-[[(2R,3R,4S)-3-(4-ブロモフェニル)-1-[(2S)-4-[tert-ブチル(ジフェニル)シリル]オキシ-2-ヒドロキシ-ブチル]-4-(トリチルオキシメチル)アゼチジン-2-イル]メチル]-2-ニトロ-ベンゼンスルホンアミド(中間体40)(250.00mg、243.87μmol)とEt3N(24.68mg、243.87μmol、33.81μL)とDMAP(2.98mg、24.39μmol)との溶液にAc2O(62.24mg、609.68μmol、57.10μL)を加えた。15℃で16時間撹拌した後、H2O(20mL)の添加によって反応混合物をクエンチし、次いでDCM(3×15mL)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得、これを分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=3/1、プレート2)によって精製して、中間体41(270.00mg、243.42μmol、収率99.81%)を白色の固形物として得た。
THF(2mL)およびH2O(2mL)中の酢酸[(1S)-1-[[(2R,3R,4S)-2-[[アセチル-(2-ニトロフェニル)スルホニル-アミノ]メチル]-3-(4-ブロモフェニル)-4-(トリチルオキシメチル)アゼチジン-1-イル]メチル]-3-[tert-ブチル(ジフェニル)シリル]オキシ-プロピル](中間体41)(270.00mg、243.42μmol)の溶液にLiOH.H2O(20.43mg、486.84μmol)を加えた。15℃で1時間撹拌した後、反応混合物をH2O(30mL)で希釈しDCM(20mL*4)で抽出した。合わせた有機層をブライン(20mL*3)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得、これを分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=3/1、プレート1)によって精製して中間体42(200.00mg、187.41μmol、収率76.99%)を白色の固形物として得た。
THF(3mL)中の酢酸[(1S)-1-[[(2R,3R,4S)-3-(4-ブロモフェニル)-2-[[(2-ニトロフェニル)スルホニルアミノ]メチル]-4-(トリチルオキシメチル)アゼチジン-1-イル]メチル]-3-[tert-ブチル(ジフェニル)シリル]オキシ-プロピル](中間体42)(200.00mg、187.41μmol)の溶液にTBAF(98.00mg、374.82μmol)を加えた。15℃で2時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去した。残渣をDCM(30mL)で希釈し、H2O(15mL*5)に次いで食塩水(10mL*3)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得、これを分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=1/1、プレート1)によって精製して、中間体43(150.00mg、180.99μmol、収率96.57%)を白色の固形物として得た。
THF(2mL)中のPPh3(94.94mg、361.98μmol、2.00eq)とDIAD(73.20mg、361.98μmol、70.38μL、2.00eq)との混合物をN2雰囲気下0℃で撹拌し、乳白色の混合物を得た。この混合物にTHF(1mL)中の酢酸[(1S)-1-[[(2R,3R,4S)-3-(4-ブロモフェニル)-2-[[(2-ニトロフェニル)スルホニルアミノ]メチル]-4-(トリチルオキシメチル)アゼチジン-1-イル]メチル]-3-ヒドロキシ-プロピル](中間体43)(150.00mg、180.99μmol)を加えた。15℃で16時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去した。残渣をDCM(30mL)で希釈し、H2O(10mL*2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得て、これを分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=1/1、プレート1)によって精製して、中間体44(150.00mg、粗製)を白色の固形物として得た。
CH3CN(3mL)中の酢酸[(3S,8R,9R,10S)-9-(4-ブロモフェニル)-6-(2-ニトロフェニル)スルホニル-10-(トリチルオキシメチル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-3-イル](中間体44)(150mg、185.01μmol)の溶液にCs2CO3(120.56mg、370.02μmol)およびベンゼンチオール(30.58mg、277.52μmol、28.31μL)を加えた。40℃で2時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去した。残渣をH2O(30mL)で希釈しDCM(20mL*5)で抽出した。合わせた有機層をブライン(20mL*3)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得、これを分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=1/1、プレート1)によって精製して中間体45(180.00mg、粗製)を黄色の固形物として得た。
DCM(3mL)中の酢酸[(3S,8R,9R,10S)-9-(4-ブロモフェニル)-10-(トリチルオキシメチル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-3-イル](中間体45)(180mg、287.73μmol)の溶液に1-イソシアナト-4-メトキシベンゼン(42.91mg、287.73μmol、36.99μL)を加えた。15℃で1時間撹拌した後、H2O(15mL)の添加によって反応混合物をクエンチし、次いでDCM(20mL*4)で抽出した。合わせた有機層をNaHCO3溶液(15mL)、ブライン(15mL*2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得、これを分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=1/1、プレート1)によって精製して中間体46(200mg、258.15μmol、収率89.72%)を白色の固形物として得た。
DCM(3mL)中の酢酸[(3S, 8R,9R,10S)-9-(4-ブロモフェニル)-6-[(4-メトキシフェニル)カルバモイル]-10-(トリチルオキシメチル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-3-イル](中間体46)(200mg、258.15μmol、1.00eq)の溶液にTFA(294.34mg、2.58mmol、191.13μL)を加えた。15℃で2時間撹拌した後、NaHCO3溶液(20mL)の添加によって反応混合物をクエンチし、DCM(20mL*5)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL*3)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得、これを分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=1/1、プレート1)によって精製して中間体47(130.00mg、244.16μmol、収率94.58%)を白色の固形物として得た。
THF(1mL)中のPPh3(128.08mg、488.32μmol、2.00eq)とDIAD(98.74mg、488.32μmol、94.94μL、2.00eq)との混合物をN2雰囲気下0℃で撹拌し、乳白色の混合物を得た。この乳白色の混合物に0℃のTHF(1mL)中の酢酸(3S,8R,9R,10S)-9-(4-ブロモフェニル)-10-(ヒドロキシメチル)-6-[(4-メトキシフェニル)カルバモイル]-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-3-イル](中間体47)(130mg、244.16μmol)とイソインドリン-1,3-ジオン(53.88mg、366.24μmol)との溶液を加えた。15℃で12時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、次いで分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=1/1、プレート1)によって精製して中間体48(200mg、粗製)を黄色の油状物として得た。
EtOH(2mL)中の酢酸[(3S,8R,9S,10S)-9-(4-ブロモフェニル)-10-[(1,3-ジオキソイソインドリン-2-イル)メチル]-6-[(4-メトキシフェニル)カルバモイル]-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-3-イル](中間体48)(200mg、302.32μmol)の溶液にN2H4.H2O(29.39μL、604.64μmol)を加えた。70℃で2時間撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去した。残渣をH2O(10mL)で希釈しDCM(10mL*5)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL*2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得、これを分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1、プレート1)によって精製して中間体49(60mg、122.60μmol、収率40.55%)を白色の固形物として得た。
DCM(3mL)中の(3S,8R,9S,10S)-10-(アミノメチル)-9-(4-ブロモフェニル)-3-ヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド(中間体49)(60mg、122.60μmol)とホルムアルデヒド(54.77μL、735.60μmol)とMgSO4(147.57mg、1.23mmol)とAcOH(0.70μL、12.26μmol)との溶液にNaBH(OAc)3(77.95mg、367.80μmol)を加えた。15℃で2時間撹拌した後、反応混合物をセライトでろ過し、NaHCO3溶液(10mL*3)で洗浄した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して中間体50(50mg、96.63μmol、収率78.81%)を白色の固形物として得た。
CH3CN(1mL)中の(3S,8R,9S,10S)-9-(4-ブロモフェニル)-10-[(ジメチルアミノ)メチル]-3-ヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド(中間体50)(50mg、96.63μmol)とエチニルベンゼン(29.61mg、289.89μmol、31.84μL)との溶液にCs2CO3(125.94mg、386.52μmol)およびXPhos Pd G3触媒(8.18mg、9.66μmol)を加えた。N2雰囲気下70℃で1時間撹拌した後、反応混合物を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1、プレート1)によって精製して触媒を除去し粗生成物を得、これを分取HPLC(分取HPLC(カラム:Luna C18 150*25 5u;移動相:A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)によってさらに精製して、生成物フェニルエチニル)フェニル]-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド(10mg、17.10μmol、収率17.7%、ギ酸塩))を白色の固形物として得た。
THF(1.00mL)中の(3Z,8R,9R,10S)-9-(4-ブロモフェニル)-N-(4-メトキシフェニル)-10-(トリチルオキシメチル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカ-3-エン-6-カルボキサミド(中間体25、980.00mg、1.37mmol、1.00eq)の溶液にBH3-Me2S(10M、686μL、5.00eq)を0℃で加え、反応混合物を25℃で3時間撹拌した。H2O(1.24g、68.56mmol、1.24mL、50.00eq)をゆっくりと加え、反応混合物を25℃で30分間撹拌した。次いで反応溶液にNaOH/H2O(18.27g、68.50mmol、純度15%、50.00eq)およびH2O2(6.66g、68.56mmol、5.65mL、純度35%、50.00eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で3時間撹拌した。反応物をH2O(10mL)でクエンチしDCM(50mL)で抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濃縮して、粗生成物を白色の固形物(混合物)として得て、これをさらに精製することなく次の工程で用いた。
DCM(2mL)中の中間体51(1.2g、1.64mmol)とEt3N(497.85mg、4.92mmol)とDMAP(20.04mg、164μmol)との溶液に0℃でAc2O(334.86mg、3.28mmol)を加えた。25℃で3時間撹拌した後、反応物をH2O(10mL)でクエンチしDCM(20mL)で抽出して有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、酢酸[(8R,9R,10S)-9-(4-ブロモフェニル)-6-[(4-メトキシフェニル)カルバモイル]-10-(トリチルオキシメチル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-4-イル]の2つの異性体を得た。各異性体は分取TLCによって分離して、異性体1(126mg、収率9.92%、Rf=0.5)を白色の固形物として、異性体2(197mg、収率15.50%、Rf=0.4)を白色の固形物として、混合画分である酢酸[(8R,9R,10S)-9-(4-ブロモフェニル)-6-[(4-メトキシフェニル)カルバモイル]-10-(トリチルオキシメチル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-4-イル](624mg、収率49.11%、Rf=0.3)を白色の固形物として生成した。各立体異性体は個別に分離されたが、各化合物の4位の立体化学は決定できなかった。
異性体1:
異性体2:
混合画分
DCM(2mL)中の酢酸[(8R,9R,10S)-9-(4-ブロモフェニル)-6-[(4-メトキシフェニル)カルバモイル]-10-(トリチルオキシメチル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-4-イル](624mg、805.43μmol)の溶液にTFA(918.35mg、8.05mmol、596.33μL)を加えた。25℃で3時間撹拌した後、反応混合物をNaHCO3(10mL)によってクエンチしDCM(20mL)で抽出して有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得、分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体53(265mg、収率61.80%)を白色の固形物として得た。
THF(2mL)中の中間体53(275mg、516.5μmol)とイソインドリン-1,3-ジオン(83.59mg、568.15μmol)とPPh3(203.21mg、774.75μmol)との溶液に25℃のDIAD(156.66mg、774.75μmol)を滴下した。25℃で5時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体54(460mg、粗製)を薄黄色の固形物として得た。
EtOH(1mL)中の中間体54(460mg、695.35μmol)の溶液にヒドラジン水和物(53.28mg、1.04mmol、51.73μL)を滴下した。80℃で2時間撹拌した後、反応混合物をろ過し濃縮して、精製することなく中間体55(500mg、粗製)を褐色の液体として得、次の工程で直接用いた。HRMS(ESI):C24H28BrN4O3[M+H]+の計算値531.15、測定値531.1
EtOH:H2O=2:1(1mL)中の中間体55(300mg、564.50μmol)の溶液にLiOH.H2O(47.37mg、1.13mmol)を加えた。40℃で2時間撹拌した後、反応混合物をH2O(3mL)で希釈しDCM(10mL)で抽出して有機層を得た。有機層を濃縮し分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=10:1)によって精製して白色の固形物として中間体56(90mg、収率32.58%)を得た。
DCM(2mL)中の中間体56(90mg、183.9μmol)の撹拌溶液にHCHO(149.26mg、1.84mmol、136.93μL、37%溶液)およびMgSO4(442.72mg、3.68mmol)を加えた。25℃で0.5時間撹拌した後、さらにNaBH(OAc)3(194.88mg、919.49μmol)を加えた。25℃で1.5時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=10:1)によって精製して、中間体57(58mg、収率60.95%)を薄褐色の固形物として得た。
アセトニトリル(1mL)中の中間体57(50mg、96.63μmol)とエチニルベンゼン(29.61mg、289.89μmol)との溶液にXPhos Pd G3(8.18mg、9.66μmol)およびCs2CO3(62.97mg、193.26μmol)を加えた。70℃で2時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製して、(8R,9S,10S)-10-[(ジメチルアミノ)メチル]-3-ヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-9-[4-(2-フェニルエチニル)フェニル]-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミドの各立体異性体を得た。各異性体を分離して異性体1(5.1mg、収率9.80%)および異性体2(17.1mg、収率32.85%)を白色の固形物として生成した。
E16:異性体1:
E17:異性体2:
DCM(5mL)中の中間体51(500.00mg、682.41μmol、1eq)の溶液にデス・マーチン(347.32mg、818.89μmol)を加えた。25℃で3時間撹拌した後、反応混合物を飽和Na2SO3(5mL)によってクエンチしDCM(10mL)で抽出して有機層を得た。有機層を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって濃縮して中間体58(280mg、収率56.15%)を褐色の固形物として得た。
MeOH(2mL)中の中間体58(250mg、342.14μmol)の撹拌溶液にN-メチルメタンアミン(2M、1.71mL)およびCH3COOH(205.46mg、3.42mmol)を加えた。25℃で0.5時間撹拌した後、NaBH3CN(21.50mg、342.14μmol)を加えた。25℃で1.5時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=15:1)によって精製して中間体59(120mg、収率46.16%)を薄褐色の固形物として得た。C32H33N4O[M+H]+のHRMS(ESI)計算値759.28、測定値759.2。
DCM(1mL)中の中間体59(115mg、151.36μmol)の撹拌溶液にTFA(172.58mg、1.51mmol)を加えた。25℃で12時間撹拌した後、反応混合物を飽和NaHCO3(5mL)でクエンチしDCM(5mL)で抽出して有機層を得た。有機溶液を採取し、濃縮し、次いで分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=10:1)によって精製して中間体60(45.00mg、収率57.45%)を薄褐色の固形物として得た。
アセトニトリル(1mL)中の中間体59(30mg、57.98μmol)とエチニルベンゼン(17.76mg、173.94μmol)との溶液にXPhos Pd G3(4.91mg、5.80μmol)およびCs2CO3(37.78mg、115.96μmol)を加えた。70℃で2時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製して、異性体1(E18)(2.60mg、収率8.32%)および異性体2(E19)(11.40mg、収率36.50%)として分離した(8R,9R,10S)-4-(ジメチルアミノ)-10-(ヒドロキシメチル)-N-(4-メトキシフェニル)-9-[4-(2-フェニルエチニル)フェニル]-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミドの各立体異性体を白色の固形物として得た。
E18:異性体1
E19:異性体2
実施例21(「E21」)
THF(2mL)中の実施例18および19の混合物(165mg、318.87μmol、1eq)とイソインドリン-1,3-ジオン(51.61mg、350.75μmol)とPPh3(125.45mg、478.30μmol)との溶液にDIAD(96.72mg、478.30μmol)を滴下した。25℃で12時間撹拌した後、残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=0:1)によって精製して、中間体61(184mg、収率89.25%)を薄黄色の固形物として得た。
EtOH(1mL)中の中間体61(174mg、260.56μmol)の溶液にヒドラジン水和物(19.96mg、390.84μmol)を滴下した。80℃で2時間撹拌した後、反応混合物をろ過し濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=6:1)によって精製して、中間体62(50.00mg、収率35.69%)を褐色の液状物として得た。C33H39N5O2[M+H]+のHRMS(ESI)計算値538.31、測定値538.2
DCM(2.00mL)中の中間体61(50mg、96.81μmol)の撹拌溶液にHCHO(78.57mg、968.10μmol、72.08μL)およびMgSO4(116.53mg、968.10μmol)を加えた。25℃で0.5時間撹拌した後、CH3COOH(5.81mg、96.81μmol)およびNaBH(OAc)3(102.59mg、484.05μmol)を加えた。25℃で1.5時間撹拌した後、反応混合物をH2O(5mL)によってクエンチしDCM(20mL*3)で抽出して有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLCによって精製して、(8R,9S,10S)-9-(4-ブロモフェニル)-4-(ジメチルアミノ)-10-[(ジメチルアミノ)メチル]-N-(4-メトキシフェニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミドの各異性体を異性体1(E20)(2.90mg、5.33μmol、収率5.51%)を薄褐色の固形物として
を、および異性体2(E21)(15.20mg、27.91μmol、収率28.83%)を薄褐色の固形物として
を、取得しかつ分離した。
アセトン/H2O=10:1(1mL)中の中間体25(220mg、307.83μmol)とNMO(43.27mg、369.4μmol)との溶液に25℃のOsO4(7.83mg、30.78μmol)を加えた。25℃で12時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣をprep-TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:5)によって精製し、中間体63a(120mg、収率52.07%)を白色の固形物として
を、および中間体63b(134mg、収率58.14%)を白色の固形物として
を、得た。
DCM(2mL)中の中間体63a(60mg、80.14μmol)の溶液にTFA(91.37mg、801.39μmol)を加えた。25℃で3時間撹拌した後、反応物をNaHCO3(10mL)でクエンチしDCM(20mL)で抽出して有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル)によって精製し中間体64a(35mg、収率86.24%)を白色の固形物として得た。
アセトニトリル(1mL)中の中間体64a(20mg、39.5μmol)と3-エチニルピリジン(8.15mg、78.99μmol)との溶液にXPhos Pd G3(3.34mg、3.95μmol)およびCs2CO3(25.74mg、78.99μmol)を加えた。70℃で1時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製し、(3S,4R,8R,9R,10S)-3,4-ジヒドロキシ-10-(ヒドロキシメチル)-N-(4-メトキシフェニル)-9-(4-(ピリジン-3-イルエチニル)フェニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド(6.8mg、収率29.69%)を白色の固形物として得た。
DCM(2mL)中の中間体63b(130mg、173.63μmol)の溶液にTFA(197.98mg、1.74mmol)を加えた。25℃で3時間撹拌した後、反応物をNaHCO3(10mL)でクエンチしDCM(20mL)で抽出して有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル)によって精製し中間体64b(75mg 収率85.30%)を白色の固形物として得た。
アセトニトリル(1mL)中の中間体64b(20mg、39.50μmol)と3-エチニルピリジン(8.15mg、78.99μmol)との溶液にXPhos Pd G3(3.34mg、3.95μmol)およびCs2CO3(25.74mg、78.99μmol)を加えた。70℃で2時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製し、(3R,4S,8R,9R,10S)-3,4-ジヒドロキシ-10-(ヒドロキシメチル)-N-(4-メトキシフェニル)-9-(4-(ピリジン-3-イルエチニル)フェニル)-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド(7.4mg、収率29.69%)を白色の固形物として得た。C30H32N4O5[M+H]+のHRMS(ESI)計算値529.24、測定値529.30
0℃のDCM(80mL)中の(R)-オキシラン-2-イルメタノール(3.00g、40.50mmol、2.68mL)とイミダゾール(5.51g、80.99mmol)との溶液にTBDPSCl(13.36g、48.60mmol、12.48mL)を加えた。25℃で12時間撹拌した後、反応物をH2O(20mL)でクエンチしDCM(60mL*2)によって抽出して有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=10:1)によって精製して、中間体A2(12.66g、収率100.00%)を無色の液体として得た。
CuI(1.83g、9.60mmol、1.5eq)を窒素下で三口フラスコに入れ、次いで無水THF(20mL)を加えた。得られた混合物を-78℃まで冷却し、次いで内部温度を-78℃未満に維持しながら臭化ビニルマグネシウム(1M、22.40mL、3.5eq)を滴下した。不均質混合物を-20℃まで温め、この温度で30分間撹拌した。溶液を再び-78℃まで冷却した後、中間体A2(2.00g、6.40mmol、1eq)を滴下した。混合物を撹拌し、20℃まで12時間徐々に温めた。H2O(20mL)で反応混合物をクエンチし、DCM(60mL*2)によって抽出して有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=7:1)によって精製して、中間体A3(2.18g、収率100.00%)を無色の液体として得た。
0℃のDCM(2mL)中の中間体A3(2.18g、6.40mmol、1eq)、Et3N(1.94g、19.21mmol、3eq)とDMAP(78.21mg、640.18μmol、0.1eq)との溶液に無水酢酸(980.06mg、9.60mmol、1.5eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で3時間撹拌した。TLC(石油エーテル:酢酸エチル=10:1)は反応が完了したことを示し、反応混合物はH2O(10mL)でクエンチしDCM(20mL*3)で抽出して有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=10:1)によって精製し、中間体A4(2.30 g、収率93.94%)を無色の液状物として得た。
DCM/MeOH=1:1(30mL)中の中間体A4(1.70g、4.44mmol、1eq)の-78℃の溶液を溶液が青色になるまでO2中のO3流で処理した。次いで色が無くなるまで溶液にN2を吹き込んだ。得られた溶液をMe2S(2.76g、44.44mmol、10eq)で処理し、20℃まで温め、2時間撹拌した。TLC(石油エーテル:酢酸エチル=5:1)は反応が完了したことを示し、反応混合物はDCM(50mL)で希釈しH2O(10mL)で洗浄して有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ、濃縮して、中間体A5(1.70g、粗製)をさらに精製することなく無色の液状物として得た。
DCM(12mL)中のN-(((2R,3R,4S)-3-(4-ブロモフェニル)-4-((トリチルオキシ)メチル)アゼチジン-2-イル)メチル)-2-ニトロベンゼンスルホンアミド(WO2015070204)(1.20g、1.72mmol、1eq)の撹拌溶液に25℃の中間体A5(1.46g、3.78mmol、2.2eq)およびCH3COOH(103.29mg、1.72mmol、1eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で0.5時間撹拌した。混合物にNaBH(OAc)3(1.09g、5.16mmol、3当量)を加えた。得られた反応混合物を25℃で1.5時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、H2O(5mL)によって反応混合物をクエンチし、DCM(10mL*3)で抽出して、有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体69(1.67g、粗製)を薄褐色の固形物として得た。
THF(16mL)中の中間体69(1.67g、1.56mmol、1eq)の撹拌溶液にTBAF(1.22g、4.68mmol、3eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体70(920.00mg、収率71.16%)を白色の固形物として得た。
THF(20mL)中の中間体70(660.00mg、796.36μmol、1eq)の撹拌溶液にPPh3(835.51mg、3.19mmol、4eq)とDIAD(644.13mg、3.19mmol、619.35μL、4eq)との混合物を加えた。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体71(445.00mg、粗製)を白色の固形物として得た。
THF(20.00mL)中の中間体71(660.00mg、796.36μmol、1eq)の撹拌溶液にPPh3(835.51mg、3.19mmol、4eq)とDIAD(644.13mg、3.19mmol、619.35μL、4eq)との混合物を加えた。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体72(445.00mg、粗製)を白色の固形物として得た。
DCM(2mL)中の中間体72(154.00mg、246.17μmol、1eq)とEt3N(49.82mg、492.34μmol、68.25μL、2eq)との撹拌溶液に1-イソシアナト-4-メトキシベンゼン(40.39mg、270.78μmol、34.82μL、1.1eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物をH2O(2mL)によってクエンチし、DCM(10mL*3)で抽出して有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体73(169mg、収率88.61%)を白色の固形物として得た。
DCM(2mL)中の中間体73(169.00mg、218.14μmol、1eq)の撹拌溶液にTFA(248.72 mg, 2.18mmol、10eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物をNaHCO3によってクエンチし、DCM(10mL*3)で抽出して有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:2)によって精製して、中間体74(81.00mg、152.13μmol、収率69.74%)を白色の固形物として得た。HRMS(ESI):C25H30BrN3O5[M+H]+の計算値532.14、測定値534.1
THF(2mL)中の中間体74(81.00mg、104.55μmol、1eq)とイソインドリン-1,3-ジオン(16.92mg、115.01μmol、1.1eq)とPPh3(41.13mg、156.82μmol、1.5eq)との溶液に25℃のDIAD(31.71mg、156.82μmol、30.49μL、1.5eq)をN2下で滴下した。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体75(58.00mg、収率83.86%)を黄色の固形物として得た。
EtOH(1mL)中の中間体75(58.00mg、87.67μmol、1eq)の溶液に25℃のヒドラジン水和物(6.72mg、131.51μmol、6.52μL、純度98%、1.5eq)をN2下で滴下した。得られた反応混合物を70℃で1時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物を濃縮して残渣中間体76をさらなる精製をせずに得た。HRMS(ESI):C25H31BrN4O4[M+H]+の計算値531.15、測定値531.1
EtOH:H2O=1:1(1mL)中の中間体76(46.00mg、86.56μmol、1eq)の溶液に25℃のLiOH.H2O(7.26mg、173.12μmol、2eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で2時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物をH2O(2mL)によってクエンチし、DCM(10mL*3)で抽出して有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ、濃縮して、中間体77(80.00mg、粗製)を白色の固形物として得た。HRMS(ESI):ET6538-397-P1P C23H29BrN4O3[M+H]+の計算値489.14、測定値491.1
THF(2mL)中の中間体77(757.00mg、1.01mmol、1eq)とイソインドリン-1,3-ジオン(164.07mg、1.12mmol、1.1eq)とPPh3(398.85mg、1.52mmol、1.5eq)との溶液に25℃のDIAD(307.49mg、1.52mmol、1.5eq)をN2下で滴下した。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体78(1.13g、粗製)を黄色の固形物として得た。
アセトニトリル(1mL)中の中間体78(40.00mg、77.30μmol、1eq)とエチニルベンゼン(23.68mg、231.90μmol、25.47μL、3.00eq)との溶液にXPhos Pd G3(6.54mg、7.73μmol、0.1eq)およびCs2CO3(50.37mg、154.60μmol、2eq)を加えた。得られた反応混合物を70℃で2時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製して、(4S,8R,9S,10S)-10-[(ジメチルアミノ)メチル]-4-ヒドロキシ-N-(4-メトキシフェニル)-9-[4-(2-フェニルエチニル)フェニル]-1,6-ジアザビシクロ[6.2.0]デカン-6-カルボキサミド (6.10mg、収率14.65%)を白色の固形物として得た。HRMS(ESI):C33H38N4O3[M+H]+の計算値539.29、測定値539.4
DCM(60mL)中のN-(((2R,3R,4S)-3-(4-ブロモフェニル)-4-((トリチルオキシ)メチル)アゼチジン-2-イル)メチル)-2-ニトロベンゼンスルホンアミド(WO2015070204)(8.50g、11.51mmol、1eq)、DMAP(140.58mg、1.15mmol、0.1eq)およびEt3N(3.49g、34.52mmol、4.79mL、3eq)の溶液にBOC2O(2.76g、12.66mmol、1.1eq)を加え、反応混合物を25℃で4時間撹拌した。TLC(石油エーテル:DCM=3:1)は反応が完了したことを示し、反応混合物はH2O(100mL)でクエンチしDCM(300mL)で抽出して有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=3:1)によって精製して、中間体79(8.19g、収率84.83%)を褐色の固形物として得た。
EtOH(10mL)中の中間体79(7.70g、9.18mmol、1eq)の溶液に1,3-ジメチルヘキサヒドロピリミジン-2,4,6-トリオン(2.15g、13.77mmol、1.5eq)およびPd(PPh3)4(1.06g、917.98μmol、0.1eq)を加え、反応混合物を40℃で2時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応物は10%NaOH(20mL)でクエンチし、DCM(500mL)で抽出して有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=3:1)によって精製して、中間体80(6.44g、8.06mmol、収率87.83%)を薄褐色の固形物として得た。
DMF(60mL)中の中間体80(6.44g、8.06mmol、1eq)とK2CO3(3.34g、24.18mmol、3eq)との溶液に25℃の2-(ブロモメチル)プロパ-2-エン-1-オール(1.83g、12.09mmol、1.5eq)を加え、反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応物はH2O(50mL)でクエンチし、DCM(100mL)で抽出して有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=2:1)によって精製して、中間体81(5.52g、収率78.83%)を白色の固形物として得た。
MeOH(50mL)中の中間体81(5.00g、5.75mmol、1eq)の溶液にK2CO3(3.97g、28.75mmol、5eq)を加え、反応混合物を80℃で3時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応物はH2O(100mL)でクエンチし、DCM(300mL)で抽出して有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体82(2.50g、3.25mmol、収率56.56%)を白色の固形物として得た。
DMF(1.00mL)中の中間体82(2.50g、3.25mmol、1eq)の溶液に25℃の3-ブロモプロパ-1-エン(590.18mg、4.88mmol、1.5eq)およびK2CO3(1.35g、9.76mmol、3eq)を加え、反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応物はH2O(100mL)でクエンチし、DCM(500mL)で抽出して有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体83(2.62g、収率99.68%)を白色の固形物として得た。
DCM(20mL)中の中間体83(2.20g、2.72mmol、1eq)の溶液に、[1,3-ビス(2,4,6-トリメチルフェニル)イミダゾリジン-2-イリデン]-ジクロロ-[(2-イソプロピルフェニル)メチレン]ルテニウム(ホイベダ・グラブス第二世代触媒)(426.12mg、680.04μmol、0.25eq)を加え、反応混合物を40℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応物を濃縮して残渣を得た。残渣をシリカカラムクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体84(2.12g、収率100.00%)を白色の固形物として得た。
THF(15mL)中の中間体84(750.00mg、960.65μmol、1eq)とEt3N(1.94g、19.21mmol、2.66mL、20eq)との溶液に2-ニトロベンゼンスルホノヒドラジド(2.09g、9.61mmol、10eq)を加え、反応混合物を40℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応物をH2O(3mL)によってクエンチし、DCM(10mL*2)で抽出して有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体85(1.50g、収率100.00%)を黄色の固形物として得た。
0℃のDCM(15mL)中の中間体85(1.49g、1.90ミリモル、1eq)とEt3N(576.78mg、5.70ミリモル、3eq)とDMAP(23.21mg、190.00μmol、0.1eq)との溶液に無水酢酸(387.94mg、3.80mmol、355.91μL、2eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で3時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物はH2O(10mL)でクエンチし、DCM(30mL*2)で抽出して有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体86(1.51g、収率96.32%)を白色の固形物として得た。
アセトニトリル(15mL)中の中間体86(1.51g、1.83mmol、1eq)とベンゼンチオール(302.57mg、2.75mmol、280.16μL、1.5eq)との溶液に25℃のCs2CO3(1.19g、3.66mmol、2eq)を滴下した。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物をH2O(10mL)でクエンチし、DCM(20mL*3)で抽出して有機層を得た。有機物を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン:メタノール=10:1)によって精製して、中間体87(1.09g、粗製)を白色の固形物として得た。HRMS(ESI):C37H39BrN2O3[M+H]+の計算値639.21、測定値639.1
DCM(10mL)中の中間体87とEt3N(344.05mg、3.40mmol、2eq)との溶液に0℃の1-イソシアナト-4-メトキシ-ベンゼン(278.91mg、1.87mmol、1.1eq)を滴下した。得られた反応混合物を25℃で3時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物はH2O(20mL)でクエンチし、DCM(50mL*3)で抽出して有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体87(1.10g、収率81.76%)を白色の固形物として得た。
MeOH(7mL)中の中間体88(750.00mg、950.85μmol、1eq)の溶液にK2CO3(394.25mg、2.85mmol、3eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物をろ過してろ液を得、濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体88(757.00mg、粗製)を白色の固形物として得た。
THF(2mL)中の中間体89(757.00mg、1.01mmol、1eq)とイソインドリン-1,3-ジオン(164.07mg、1.12mmol、1.1eq)とPPh3(398.85mg、1.52mmol、1.5eq)との溶液に25℃のDIAD(307.49mg、1.52mmol、1.5eq)をN2下で滴下した。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体90(1.13g、粗製)を黄色の固形物として得た。
EtOH(2mL)中の中間体90(1.13g、1.29mmol、1eq)の溶液にNH2NH2.H2O(98.86mg、1.94mmol、純度98%、1.5eq)を滴下した。得られた反応混合物を70℃で1時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物をH2O(2mL)によってクエンチし、DCM(10mL*3)で抽出して有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=12:1)によって精製して、中間体91(586.00mg、収率60.91%)を白色の固形物として得た。
DCM(6mL)中の中間体91(586.00mg、785.80μmol、1eq)の撹拌溶液にHCHO(637.77mg、7.86mmol、585.11μL、10eq)およびMgSO4(945.86mg、7.86mmol、10eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で0.5時間撹拌した。混合物にCH3COOH(47.19mg、785.80μmol、1eq)およびNaBH(OAc)3(832.71mg、3.93mmol、5eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で1.5時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、H2O(5mL)によって反応混合物をクエンチし、DCM(20mL*3)で抽出して、有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=12:1)によって精製して、中間体92(370.00mg、収率60.85%)を薄褐色の固形物として得た。
DCM(1mL)中の中間体92(370.00mg、478.16μmol、1eq)の撹拌溶液にTFA(545.20mg、4.78mmol、10eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、NaHCO3(5mL)によって反応混合物をクエンチし、DCM(10mL*3)で抽出して、有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=8:1)によって精製して、薄褐色の固形物として得た(172.00mg、収率67.68%)。
THF(2mL)中の中間体93(172.00mg、323.62μmol、1eq)とイソインドリン-1,3-ジオン(52.38mg、355.98μmol、1.1eq)とPPh3(127.32mg、485.43μmol、1.5eq)との溶液に25℃のDIAD(98.16mg、485.43μmol、1.5eq)をN2下で滴下した。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=10:1)によって精製して、中間体94(152.00mg、収率71.10%)を黄色の固形物として得た。
EtOH(2mL)中の中間体94(152.00mg、230.09μmol、1eq)の溶液にNH2NH2.H2O(17.63mg、345.14μmol、17.12μL、純度98%、1.5eq)を滴下した。得られた反応混合物を70℃で1時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物をH2O(2mL)によってクエンチし、DCM(10mL*3)で抽出して有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=5:1)によって精製して、中間体95(80.00mg、収率65.54%)を白色の固形物として得た。HRMS(ESI):C26H36BrN5O2[M+H]+の計算値530.21、測定値530.1
DCM(2mL)中の中間体95(120.00mg、226.20μmol、1eq)の撹拌溶液にHCHO(183.43mg、2.26mmol、168.28μL、10eq)およびMgSO4(272.28mg、2.26mmol、10eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で0.5時間撹拌した。混合物にCH3COOH(13.58mg、226.20μmol、1eq)およびNaBH(OAc)3(239.71mg、1.13mmol、5eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で1.5時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、H2O(5mL)によって反応混合物をクエンチし、DCM(20mL*3)で抽出して、有機層を得た。有機層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=2:1)によって精製して白色の固形物として(100.00mg、収率79.15%)得た。
アセトニトリル(1mL)中の中間体96(50.00mg、89.52μmol、1 eq)とエチニルベンゼン(27.43mg、268.55μmol、29.49μL、3eq)との溶液にXPhos Pd G3(7.58mg、8.95μmol、0.1eq)およびCs2CO3(58.33mg、179.04μmol、2eq)を加えた。得られた反応混合物を70℃で2時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、H2O(5mL)によって反応混合物をクエンチし、DCM(10mL*3)で抽出して、有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製し、実施例25(10.00mg、17.25μmol、収率19.27%)を白色の固形物として得た。HRMS(ESI):C36H45N5O2[M+H]+の計算値580.36、測定値580.5
DCM(3.6mL)中の中間体88(180.00mg、228.20μmol、1eq)の撹拌溶液にTFA(2.28mmol、168.96μL、10eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、飽和NaHCO3(10mL)で反応混合物をクエンチし、DCM(50mL*3)で抽出して有機層を得て、この層を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=12:1)によって精製して、中間体97(300.00mg、粗製)を白色の固形物として得た。
THF(2mL)中の中間体97(300.00mg、549.00μmol、1eq)とイソインドリン-1,3-ジオン(88.85mg、603.90μmol、1.1eq)とPPh3(216.00mg、823.50μmol、1.5eq)との溶液に25℃のDIAD(166.52mg、823.50μmol、1.5eq)を滴下した。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体98(458.00mg、粗製)を黄色の固形物として得た。
EtOH(2mL)中の中間体98(458.00mg、677.95μmol、1eq)の溶液にNH2NH2.H2O(51.95mg、1.02mmol、純度98%、1.5eq)を滴下した。得られた反応混合物を70℃で1時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物をH2O(2mL)によってクエンチし、DCM(10mL*3)で抽出して有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=12:1)によって精製して、中間体99(180.00mg、収率48.67%)を白色の固形物として得た。
アセトニトリル(1mL)中の中間体100(60.00mg、104.62μmol、1eq)とエチニルベンゼン(32.05mg、313.85μmol、34.47μL、3eq)との溶液にXPhos Pd G3(8.86mg、10.46μmol、0.1eq)およびCs2CO3(68.17mg、209.23μmol、2eq)を加えた。得られた反応混合物を70℃で2時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=7:1)によって精製して中間体101(42.00mg、収率67.50%)を褐色の固形物として得た。HRMS(ESI):C36H42N4O4[M+H]+の計算値595.32、測定値565.2
MeOH(2mL)中の中間体101(42.00mg、70.62μmol、1eq)の溶液にK2CO3(29.28mg、211.86μmol、3eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、H2O(5mL)によって反応混合物をクエンチし、DCM(10mL*3)で抽出して、有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製し、化合物E26(10.80mg、収率27.67%)を白色の固形物として得た。
アセトニトリル(1mL)中の中間体92(30.00mg、38.77μmol、1 eq)とエチニルベンゼン(11.88mg、116.31μmol、12.77μL、3eq)との溶液にXPhos Pd G3(3.28mg、3.88μmol、0.1eq)およびCs2CO3(25.26mg、77.54μmol、2eq)を加えた。得られた反応混合物を70℃で2時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(ジクロロメタン:メタノール=7:1)によって精製して中間体102(50.00mg、粗製)を褐色の固形物として得た。HRMS(ESI):C53H54N4O3[M+H]+の計算値795.42、測定値795.4
DCM(1mL)中の中間体102(50.00mg、62.89μmol、1eq)の撹拌溶液にTFA(71.71mg、628.91μmol、46.56μL、10.00eq)を加えた。得られた反応混合物を25℃で12時間撹拌した。LCMSは、反応が完了したことを示し、NaHCO3(5mL)によって反応混合物をクエンチし、DCM(10mL*3)で抽出して、有機層を得た。層を無水Na2SO4で乾燥させ濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製し、化合物E27(4.70mg、収率13.52%)を白色の固形物として得た。
DCM(250.00mL)中の[(2R,3R,4S)-1-アリル-3-(4-ブロモフェニル)-4-(トリチルオキシメチル)アゼチジン-2-イル]メタンアミン(J.O.C. (2012), 77(17), 7187-7211)(25.00g、31.62mmol、1.00eq)の溶液にTEA(25.59g、252.92mmol、35.06mL、8.00eq)を加え、次いでそれを0℃まで冷却した。TFAA(26.56g、126.46mmol、17.59mL、4.00eq)を反応混合物に滴下した。20℃で16時間撹拌した後、反応混合物をNaHCO3溶液(100mL)によってクエンチし、DCM(50mL×3)で抽出し、合わせた有機層を濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル= 20/1~1:1)によって精製し、中間体103(11.00g、16.94mmol、収率53.56%)を黄色の固形物として得た。
EtOH(169.00mL)中の中間体103(11.00g、16.94mmol、1.00eq)の溶液にN2雰囲気下で1,3-ジメチルバルビツール酸(3.97g、25.41mmol、1.50eq)およびPd(PPh3)4(1.96g、1.69mmol、0.10eq)を加えた。混合物を40℃で16時間撹拌した。反応混合物をNaHCO3溶液(200mL)によってクエンチし、DCM(50mL×3)で抽出し、合わせた有機層を濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=10/1~5:1)によって精製し、中間体104(7.80g、12.80mmol、収率75.55%を黄色の固形物として得た。
DCM(50.00mL)中の中間体104(4.00g、6.56mmol、1.00eq)とN-[(1R)-3-[tert-ブチル(ジフェニル)シリル]オキシ-1-ホルミル-プロピル]カルバミン酸tert-ブチル(その全体が参照により本明細書に組み入れられるBioorganic & Medicinal Chemistry (2006), 14(1), 214-236に記載のように合成)(2.90g、6.56mmol、1.00eq)との溶液にMgSO4(158.00mg、1.31mmol、20.00eq)およびNaBH(OAc)3(139.10mg、656.30μmol、10.00eq)を加えた。20℃で16時間撹拌した後、さらなるN-[(1R)-3-[tert-ブチル(ジフェニル)シリル]オキシ-1-ホルミル-プロピル]カルバミン酸tert-ブチル(1g)を加えた。さらに0.5時間後、反応混合物をNaHCO3溶液(200mL)によってクエンチし、DCM(50mL×3)で抽出し、合わせた有機層を濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル= 20/1~10:1)によって精製し、中間体105(4.20g、4.06mmol、収率61.85%を黄色のガム状物として得た。
THF(50.00mL)中の中間体105(4.20g、4.06mmol、1.00eq)の溶液にTBAF(1.59g、6.09mmol、1.50eq)を加えた。20℃で16時間撹拌した後、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=10/1~2:1)によって精製し、中間体106(2.30g、2.89mmol、収率71.23%を黄色の固形物として得た。
DCM(30.00mL)中の中間体106(2.30g、2.89mmol、1.00eq)の溶液にN2下0℃のDMP(2.45g、5.78mmol、1.79mL、2.00eq) を加えた。混合物を0℃で1時間撹拌した。LCMSは、反応物106が完全に消費され、大部分が所望の生成物であることを示し、反応混合物はH2O(20mL)中のNaHCO3(2.5g)とNa2SO3(2.5g)との溶液によってクエンチし、DCM(20mL×3)で抽出し、合わせた有機層を濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=2/1~0:1)によって精製し、中間体107(1.80g、2.27mmol、収率78.37%を黄色の固形物として得た。
MeOH(20.00mL)およびH2O(77.13mg、4.28mmol、77.13μL、2.00eq)中の中間体107(1.70g、2.14mmol、1.00eq)の溶液にK2CO3(591.32mg、4.28mmol、2.00eq)を加えた。20℃で16時間撹拌した後、追加のK2CO3(200mg)を加えた。さらに2時間後、反応混合物を水(30mL)に溶解し、DCM(20mL×3)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥させ、次いで濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル= 5/1~0:1)によって精製し、中間体108(750.00mg、771.30μmol、収率45.05%、純度70%)を黄色の固形物として得た。
DCM(18.00mL)中の中間体108(750.00mg、1.10mmol、1.00eq)の溶液にAcOH(66.17mg、1.10mmol、63.02μL、1.00eq)およびNaBH(OAc)3(2.34g、11.02mmol、10.00eq)を加えた。混合物を20℃で0.5時間撹拌した。LCMSは、反応物108が完全に消費され、大部分が所望の生成物であることを示し、反応混合物はNaHCO3溶液(20mL)によってクエンチし、DCM(10mL×3)で抽出し、合わせた有機層を濃縮して中間体109を黄色の固形物(750mg、粗製)として得て、これを次の工程で直接用いた。
DCM(10.00mL)中の中間体109(750.00mg、769.02μmol、1.00eq)の溶液にTEA(38.91mg、384.51μmol、53.30μL、0.50eq)および1-イソシアナト-4-メトキシ-ベンゼン(137.64mg、922.82μmol、118.66μL、1.20eq)を加えた。混合物を20℃で0.5時間撹拌した。LCMSは、反応物109が完全に消費され、大部分が所望の生成物であることを示した。反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸メチル)、さらに分取HPLC(カラム;Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)で精製した。中間体110(150.00mg、180.33μmol、収率23.45%)を白色の固形物として得た。
DCM(3.00mL)中の中間体110(120.00mg、144.26μmol、1.00eq)の溶液に0℃のTFA(1.54g、13.51mmol、1.00mL、93.63eq)を加えた。混合物を20℃で1時間撹拌した。LCMSは、反応物110が完全に消費され、大部分が所望の生成物であることを示し、反応混合物はNaHCO3溶液(20mL)によってクエンチし、NH3.H2O(1mL)で洗浄し、DCM(10mL×3)で抽出し、合わせた有機層を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)で精製して中間体111(60.00mg、122.60μmol、収率84.98%)を白色の固形物として得た。
DCM(3.00mL)中の中間体111(60.00mg、122.60μmol、1.00eq)とHCHO(99.50mg、1.23mmol、91.28μL、10.00eq)との溶液にMgSO4(147.57mg、1.23mmol、10.00eq)およびNaBH(OAc)3(259.84mg、1.23mmol、10.00eq)を20℃で加えた。混合物を20℃で1時間撹拌した。LCMSは、反応物111が完全に消費され、大部分が所望の生成物であることを示し、反応混合物はNaHCO3溶液(10mL)によってクエンチし、DCM(5mL×3)で抽出し、合わせた有機層を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)によって精製して中間体112(38.00mg、73.44μmol、収率59.90%)を黄色の固形物として得た。
CH3CN(350.00μL)中の中間体112(25.00mg、48.31μmol、1.00eq)とエチニルベンゼン(14.80mg、144.93μmol、15.91μL、3.00eq)との溶液にN2雰囲気下でCs2CO3(47.22mg、144.93μmol、3.00eq)およびXPhos Pd G3(4.09mg、4.83μmol、0.10eq)を加えた。混合物を70℃で3時間撹拌した。LCMSは、反応物1が完全に消費され、大部分が所望の生成物であることを示し、反応混合物を水(2mL)に溶解し、DCM(2mL×3)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥させ、次いで濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)によって精製し、次いで分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)でさらに精製して、化合物E28(13.00mg、24.13μmol、収率49.95%、ギ酸塩として)を白色の固形物として得た。
中間体105(中間体105)の合成後に、中間体105の代わりにエナンチオマーN-[(1S)-3-[tert-ブチル(ジフェニル)シリル]オキシ-1-ホルミル-プロピル]カルバミン酸tert-ブチル(Bioorganic & Medicinal Chemistry (2006))を利用して、実施例28に記載されたものと同様に合成を実施した。
エナンチオマー(R)-(1-((tert-ブチルジフェニルシリル)オキシ)-4-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸tert-ブチル(US 20150266867)を出発物質として利用して実施例3に示すように合成を実施した。
DMF(62.5mL)中のN-[[(2R,3R,4S)-1-アリル-3-(4-ブロモフェニル)-4-(トリチルオキシメチル)アゼチジン-2-イル]メチル]-2-ニトロ-ベンゼンスルホンアミド(WO2015070204)(5.00g、6.77mmol、1.00eq)の溶液にK2CO3(2.11g、15.23mmol、2.25eq)を加え、0℃まで冷却し、これによってDMF(7.5mL)中の2-(ブロモメチル)プロパ-2-エン-1-オール(2.04g、13.54mmol、2.00eq)を加えた。混合物を20℃で16時間撹拌した。LC-MSは、反応物113が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を水(300ml)の添加によってクエンチし酢酸エチル(100mL*2)で抽出した。合わせた有機層をブライン(100mL*2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル= 20:1~2:1)によって精製し、中間体113(5.00g、6.18mmol、収率91.32%)を白色の固形物として得た。
DCM(500.00mL)中の中間体113(5.00g、6.18mmol、1.00eq)の溶液にホベイダ・グラブス第二世代触媒(774.77mg、1.24mmol、0.20eq)を加えた。混合物を55℃で2時間撹拌した。TLC(石油エーテル:酢酸エチル=1:1)は中間体113が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=20:1~1:1)によって精製し、中間体114(4.00g、5.12mmol、収率82.90%)を褐色の固形物として得た。
THF(51.00mL)中の中間体114(4.00g、5.12mmol、1.00eq)の溶液に2-ニトロベンゼンスルホノヒドラジド(5.56g、25.60mmol、4.00eq)およびTEA(5.18g、51.23mmol、7.10mL、10.00eq)を加えた。40℃で16時間撹拌した後、水(100mL)の添加によって反応混合物をクエンチし酢酸エチル(50mL*2)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=10/1~1:1)で精製して中間体115(3.60g、粗製)を白色の固形物として得た。
DCM(80.00mL)中の中間体115(3.60g、4.60mmol、1.00eq)の溶液に0℃のDMAP(56.19mg、460.00μmol、0.1eq)およびTEA(465.40mg、4.60mmol、637.53μL、1.00eq)、次いでAc2O(939.07mg、9.20mmol、861.53μL、2.00eq)を加えた。20℃で2時間撹拌した後、飽和NaHCO3水溶液(150mL)の添加によって反応混合物をクエンチしDCM(50mL*2)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=30/1~1:1)によって精製し、中間体116(3.00g、3.64mmol、収率79.07%)を白色の固形物として得た。
アセトニトリル(80.00mL)中の中間体116 6(3.00g、3.64mmol、1.00eq)の溶液に0℃のCs2CO3(1.42g、4.37mmol、1.20eq)およびベンゼンチオール(「PhSH」)(601.14mg、5.46mmol、1.50eq)を加えた。20℃で16時間撹拌した後、水(100mL)の添加によって反応混合物をクエンチし酢酸エチル(30mL*2)で抽出した。合わせた有機層をブライン(50mL*2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=10:1~1:1)によって精製し、中間体117(2.00g、3.13mmol、収率85.90%)を白色の固形物として得た。
DCM(50.00mL)中の中間体117(2.00g、3.13mmol、1.00eq)の溶液に0℃の1-イソシアナト-4-メトキシ-ベンゼン(560.21mg、3.76mmol、1.20eq)を滴下した。混合物を15℃で2時間撹拌した。LC-MSは、中間体117が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を水(100ml)の添加によってクエンチしDCM(30mL*2)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM:MeOH=100:1~20:1)によって精製して、中間体118(2.20g、2.79mmol、収率89.11%)を白色の固形物として得た。
DCM(1.00mL)およびMeOH(1mL)中の中間体118(200.00mg、253.56μmol、1.00eq)の溶液にK2CO3(175.22mg、1.27mmol、5.00eq)を加えた。混合物を15℃で4時間撹拌した。LC-MSは、中間体118が完全に消費され、所望のMSのメインピークが1つ検出されたことを示した。反応混合物を水(10mL)の添加によってクエンチしDCM(5mL*2)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=10:1~1:1)によって精製し、中間体119(150.00mg、200.88μmol、収率79.22%)を白色の固形物として得た。
3mLのTHF中のPPh3(0.15g)の溶液に0℃のDIAD(0.11mL)を加えた。5分後、この混合物を0℃のTHF(1mL)中の中間体119(20.00mg、26.78μmol、1.00eq)およびイソインドリン-1,3-ジオン(5.91mg、40.17μmol、1.50eq)の溶液に加えた。混合物を15℃で16時間撹拌した。LC-MSは、中間体9が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=1:1)によって精製して、中間体120(10.00mg、11.42μmol、収率42.63%)を白色の固形物として得た。
EtOH(10.00mL)中の中間体120(500.00mg、570.87μmol、1.00eq)の溶液にN2H4.H2O(28.58mg、570.87μmol、27.75μL、1.00eq)を加えた。混合物を70℃で1時間撹拌した。LC-MSは、中間体120が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を水(30mL)の添加によってクエンチしDCM(10mL*2)で抽出した。合わせた有機層をブライン(10mL*2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM:MeOH =100:1~10:1)によって精製して、中間体121(150.00mg、粗製)をPh3POを含有する黄色の固形物として得た。
DCM(5.00mL)中の中間体121(150.00mg、201.14μmol、1.00eq)の溶液にMgSO4(290.53mg、2.41mmol、12.00eq)およびHCHO(98.21mg、1.21mmol、90.10μL、純度37%、6.02eq)、次いでNaBH(OAc)3(639.44mg、3.02mmol、15.00eq)を加えた。混合物を15℃で16時間撹拌した。LC-MSは、中間体121が完全に消費され、所望のMSが1つ検出されたことを示した。反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(20mL)の添加によってクエンチしDCM(5mL*2)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=20:1)によって精製して中間体122(60.00mg、77.54μmol、収率38.55%)を黄色の固形物として得た。
アセトニトリル(1.00mL)中の中間体122(60.00mg、77.54μmol、1.00eq)の溶液にエチニルベンゼン(23.76mg、232.62μmol、25.55μL、3.00eq)、Cs2CO3(101.06mg、310.16μmol、4.00eq)およびXphos Pd G3 (6.56mg、7.75μmol、0.1 eq)を加えた。混合物を70℃で2時間撹拌した。LC-MSは、反応物が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を水(10mL)の添加によってクエンチしDCM(5mL*2)で抽出した。合わせた有機層をブライン(5mL*2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=20:1)で精製して中間体123(50.00mg、62.89μmol、収率81.11%)を黄色の固形物として得た。
DCM(1.00mL)中の中間体123(50.00mg、62.89μmol、1.00eq)の溶液にTFA(71.71mg、628.90μmol、46.56μL、10.00eq)を加えた。混合物を25℃で1時間撹拌した。LC-MSは、中間体123が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(10mL)の添加によってクエンチしDCM(5mL*2)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)によって精製して、化合物E31(4.50mg、8.14μmol、収率12.95%)を白色の固形物として得た。
DCM(10.00mL)中の中間体122(400.00mg、516.93μmol、1.00eq)の溶液にTFA(589.40mg、5.17mmol、382.73μL、10.00eq)を加えた。混合物を25℃で1時間撹拌した。LC-MSは中間体122が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(10mL)の添加によってクエンチしDCM(5mL*2)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM:MeOH =100:1~10:1)によって精製して、中間体124(130.00mg、粗製)を黄色の固形物として得た。
3mLのTHF中のPPh3(0.15g)の溶液に0℃のDIAD(0.11mL)を加えた。この混合物(1.16mL)を0℃のTHF(1.00mL)中の中間体124(30.00mg、56.45μmol、1.00eq)とイソインドリン-1,3-ジオン(12.46mg、84.67μmol、1.50eq)との溶液に加えた。混合物を25℃で16時間撹拌した。LC-MSは、中間体124が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=20:1)によって精製して、中間体125(30.00mg、粗製)を、Ph3POを含有する白色の固形物として得た。
EtOH(2.00mL)中の中間体125(100.00mg、151.38μmol、1.00eq)の溶液にN2H4.H2O(7.58mg、151.38μmol、7.36μL、1.00eq)を加えた。混合物を70℃で1時間撹拌した。LC-MSは、中間体125が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を水(10mL)の添加によってクエンチしDCM(5mL*2)で抽出した。合わせた有機層をブライン(5mL*2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=8:1)で精製して中間体126(90.00mg、粗製)を黄色の固形物として得た。
DCM(2.00mL)中の中間体126(45.00mg、84.83μmol、1.00eq)の溶液にHCHO(41.31mg、508.98μmol、37.90μL、37%溶液、6.00eq)およびMgSO4(122.53mg、1.02mmol、12.00eq)を加え、30分間撹拌した後、NaBH(OAc)3(269.68mg、1.27mmol、15.00eq)を加えた。混合物を15℃で16時間撹拌した。LC-MSは、中間体126が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(10mL)の添加によってクエンチしDCM(3mL*2)で抽出した。合わせた有機層をブライン(3mL*2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)で精製して中間体127(20.00mg、35.81μmol、収率42.21%)を黄色の固形物として得た。
アセトニトリル(1.00mL)中の中間体127(15.00mg、26.86μmol、1.00eq)の溶液にエチニルベンゼン(10.97mg、107.42μmol、3.00eq)、Xphos Pd G3 (2.27mg、2.69μmol、0.10eq)およびCs2CO3(35.00mg、107.42μmol、4.00eq)を加えた。混合物を70℃で1時間撹拌した。LC-MSは、中間体127が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を水(10mL)の添加によってクエンチし酢酸エチル(3mL*2)で抽出した。合わせた有機層をブライン(3mL*2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=8:1)で精製して化合物E32(4.30mg、7.42μmol、収率27.61%)を黄色の固形物として得た。
DCM(10.00mL)中の中間体118(600.00mg、760.68μmol、1.00eq)の溶液にTFA(867.33mg、7.61mmol、563.20μL、10.00eq)を加えた。混合物を20℃で2時間撹拌した。LC-MSは、中間体118が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(30mL)の添加によってクエンチしDCM(10mL*2)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM/MeOH=1:0~20:1)によって精製して、中間体128(300.00mg、549.00μmol、収率72.17%)を白色の固形物として得た。
0℃のTHF(19ml)中のトリフェニルホスフィン(1g、3.76mmol)の溶液にDIAD(0.73mL、3.76mmol)をゆっくりと加えた。この調製された混合物(11mL)を0℃のTHF(15.00mL)中の中間体128(300.00mg、549.00μmol、1.00eq)とイソインドリン-1,3-ジオン(121.16mg、823.50μmol、1.50eq)との溶液に加え、次いで混合物をN2雰囲気下25℃で16時間撹拌した。LC-MSは、中間体128が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM:MeOH =1:0~10:1)によって精製して、中間体129(400.00mg、粗製)を、Ph3POを含有する黄色の固形物として得た。
EtOH(10.00mL)中の中間体129(400.00mg、592.09μmol、1.00eq)の溶液にN2H4.H2O(29.64mg、592.09μmol、28.78μL、1.00eq)を加えた。混合物を70℃で2時間撹拌した。反応混合物を水(30mL)の添加によってクエンチしDCM(30mL*2)で抽出した。合わせた有機層をブライン(30mL*2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM:MeOH=1:0~20:1)によって精製して、中間体130(280.00mg、513.32μmol、収率86.70%)を白色の固形物として得た。
DCM(5.00mL)中の中間体130(140.00mg、256.66μmol、1.00eq)の溶液にMgSO4(370.73mg、3.08mmol、12.00eq)およびHCHO(124.99mg、1.54mmol、114.67μL、37%溶液、6.00eq)を加え、次いでNaBH(OAc)3(815.95mg、3.85mmol、15.00eq)を少量づつ加えた。混合物を15℃で16時間撹拌した。LC-MSは、中間体130が完全に消費され、所望のMSが1つ検出されたことを示した。反応混合物を飽和NaHCO3水溶液(20mL)の添加によってクエンチしDCM(5mL*2)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=20:1)によって精製して、中間体131(73.00mg、127.28μmol、収率49.59%)を白色の固形物として得た。
アセトニトリル(4.00mL)中の中間体131(73.00mg、127.28μmol、1.00eq)の溶液にエチニルベンゼン(39mg、381.85μmol、3.00eq)、Xphos Pd G3 (10.77mg、12.73μmol、0.10eq)およびCs2CO3(165.89mg、509.14μmol、4.00eq)を加えた。混合物を70℃で1時間撹拌した。LC-MSは、中間体131が完全に消費され、所望のMSが検出されたことを示した。反応混合物を水(10mL)の添加によってクエンチし酢酸エチル(3mL*2)で抽出した。合わせた有機層をブライン(3mL*2)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、DCM:MeOH=10:1)で精製して中間体132(30.00mg、50.44μmol、収率39.63%)を褐色の固形物として得た。
MeOH(500.00μL)/DCM(0.5mL)中の中間体132(30.00mg、50.44μmol、1.00eq)の溶液にK2CO3(34.86mg、252.20μmol、5.00eq)を加えた。混合物を15℃で1時間撹拌した。LC-MSは、中間体132が完全に消費され、所望のMSのメインピークが1つ検出されたことを示した。反応混合物を水(10mL)の添加によってクエンチしDCM(5mL*2)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Luna C18 150*25 5u;移動相:[水(0.225%ギ酸)-アセトニトリル];B%:25%~45%、12分)によって精製して化合物E33(11.00mg、18.37μmol、収率36.42%、ギ酸塩))を白色の固形物として得た。
DCM(291.00mL)中の(2R,3R,4S)-1-アリル-3-(4-ブロモフェニル)-4-((トリチルオキシ)メチル)アゼチジン-2-カルボニトリル(J.O.C (2012), 77(17), 7187-7211)(16.00g、29.12mmol、1.00eq)の溶液に25℃のTFA(33.20g、291.20mmol、21.56mL、10.00eq)を加えた。混合物を25℃で16時間撹拌した。TLCは反応物が完全に消費されたことを示し、所望の生成物が観察され、NaHCO3溶液(500mL)でクエンチし、DCM(200mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して残渣(8.95g、粗製)を黄色の固形物として得て、これを次の工程に直接用いた。
EtOH(290.00mL)中の中間体133(8.95g、29.14mmol、1.00eq)と1, 3-ジメチルバルビツール酸(6.82g、43.71mmol、1.50eq)とPd(PPh3)4(3.37g、2.91mmol、0.10eq)との混合物を、3回、脱気しN2でパージし、次いで混合物をN2雰囲気下40℃で16時間撹拌した。LCMSは、反応物133が完全に消費されたことを示し、所望のMSが観察され、濃縮して残渣を得た。残渣を分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(10mM NH4HCO3)B:アセトニトリル)で精製し、中間体134(4.70g、17.60mmol、収率60.38%)を橙色の固形物として得た。
THF(3.50mL)中の中間体134(1.60g、5.99mmol、1.00eq)の溶液にP(OEt)3(39.81mg、239.59μmol、41.04μL、0.04eq)、酢酸(E)-ブタ-2-エン-1-イル(724.70mg、6.35 mmol、1.06eq)、アリル(クロロ)パラジウム(21.92mg、59.90μmol、0.01eq)およびDBU(911.89mg、5.99mmol、902.86μL、1.00eq)を加え、混合物を、3回、脱気しN2でパージし、次いで混合物をN2雰囲気下40℃で16時間撹拌した。反応物を水(15mL)でクエンチし、DCM(20mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル= 10/1~0:1)によって精製し、中間体135(150.00mg、466.98μmol、収率7.80%)を白色の固形物として得た。
DMF(6.00mL)中の中間体135(1.23g、3.83mmol、1.00eq)の溶液にイミダゾール(1.56g、22.98mmol、6.00eq)およびTBSCl(2.31g、15.32mmol、1.88mL、4.00eq)を加えた。混合物を25℃で16時間撹拌した。LCMSは、反応物が完全に消費されたことを示し、所望のMSが観察され、水(30mL)で洗浄し、酢酸エチル(30mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル= 100/1~10:1)によって精製し、中間体136(1.60g、3.67mmol、収率95.93%)を白色の固形物として得た。
THF(200.00mL)中の中間体136(1.85g、4.25mmol、1.00eq)の溶液にN2雰囲気下0℃のLiBHEt3(1M、5.06mL、10.00eq)を加えた。混合物を25℃で2時間撹拌した。LCMSは、反応物136が完全に消費されたことを示し、所望のMSが観察され、H2O(100mL)でクエンチ、酢酸エチル(300ml×3)で抽出し、濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM/MeOH=1/0~10:1)によって精製して、中間体137(1.40g、3.19mmol、収率74.95%)を油状物として得た。
THF(55.00mL)中の中間体138(1.36g、3.09mmol、1.00eq)の溶液に0℃のTEA(9.91g、97.95mmol、13.58mL、31.70eq)および2-ニトロベンゼンスルホニルクロリド(2.05g、9.27mmol、3.00eq)を加えた。混合物を25℃で2時間撹拌した。LCMSは、反応物1が完全に消費されたことを示し、所望のMSが観察され、濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=20/1~5:1)で精製して中間体138(1.93g、粗製)を黄色の油状物として得た。
DMF(15.00mL)中の中間体138(1.95g、3.12mmol、1.00eq)の溶液にK2CO3(647.17mg、4.68mmol、1.50eq)、次いで3-ブロモプロパ-1-エン(1.13g、9.36mmol、808.84μL、3.00eq)を加えた。混合物を25℃で16時間撹拌した。LCMSは、反応物138が完全に消費され、所望のMSが観察されたことを示し、ブライン(20mL×3)で洗浄し、酢酸エチル(20mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル= 20/1~5:1)によって精製し、中間体139(1.90g、2.86mmol、収率91.61%を黄色のガム状物として得た。
DCE(368.00mL)中の中間体139(1.84g、2.77mmol、1.00eq)の溶液にホベイダ・グラブス第一世代触媒(569.51mg、692.50μmol、0.25eq)を加えた。混合物を90℃で16時間撹拌した。反応混合物をろ過し減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=5:1)によって精製した。中間体140(1.25g、1.96mmol、収率70.88%)を薄黒色の固形物として得た。
THF(40.00mL)中の中間体140(1.00g、1.57mmol、1.00eq)の溶液にTEA(1.43g、14.13mmol、1.96mL、9.00eq)および2-ニトロベンゼンスルホノヒドラジド(1.02g、4.71mmol、3.00eq)を加えた。混合物を油浴中40℃で16時間撹拌した。LCMSは、反応物140が完全に消費され、大部分が所望の生成物であることを示した。反応混合物をNaHCO3の飽和溶液(20mL)でクエンチし、酢酸エチルで3回抽出した(30mL×3)。合わせた有機抽出物をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=20/1~5:1)によって精製し、中間体141(830.00mg、1.04mmol、収率66.22%、純度80%)を黄色の固形物として得た。
CH3CN(8.00mL)中の中間体141(830.00mg、1.30mmol、1.00eq)の溶液にCs2CO3(508.28mg、1.56mmol、1.20eq)およびベンゼンチオール(214.77mg、1.95mmol、198.86μL、1.50eq)を加えた。20℃で16時間撹拌した後、反応物を水(15mL)で希釈し、酢酸エチル(15mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=5:1)によって精製し、中間体142(580.00mg、1.02mmol、収率78.70%、純度80%)を黄色の固形物として得た。
DCM(10.00mL)中の中間体142(550.00mg、1.21mmol、1.00eq)の溶液に0℃のTEA(61.36mg、606.35μmol、84.05μL、0.50eq)および1-イソシアナト-4-メトキシ-ベンゼン(180.88mg、1.21mmol、155.93μL、1.00 eq)を加えた。20℃で3時間撹拌した後、反応物を水(10mL)で希釈し、DCM(20mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=10/1~5:1)によって精製し、中間体143(700.00mg、1.16mmol、収率95.99%)を黄色の固形物として得た。
THF(10.00mL)中の中間体143(690.00mg、1.14mmol、1.00eq)の溶液にTBAF(596.13mg、2.28mmol、2.00eq)を加えた。混合物を50℃で16時間撹拌した。TLCは反応物1が完全に消費され、所望の生成物が観察されたことを示し、水(10mL×3)で洗浄し、酢酸エチル(20mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM/MeOH=1/0~20:1)によって精製して、中間体144(440.00mg、900.86μmol、収率79.02%)を黄色の固形物として得た。
THF(18.00mL)中の中間体144(420.00mg、859.92μmol、1.00eq)の溶液に0℃のイソインドリン-1,3-ジオン(189.78mg、1.29mmol、1.50eq)、PPh3(451.09mg、1.72mmol、2.00eq)およびDIAD(347.77mg、1.72mmol、334.39μL、2.00eq)を加えた。混合物を25℃で16時間撹拌した。LCMSは、反応物145が完全に消費され、大部分が所望の生成物であることを示し、水(10mL)で洗浄し、酢酸エチル(10mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル= 5/1~1:1)によって精製し、中間体145(800.00mg、645.63μmol、収率75.08%、純度50%)を褐色のガム状物として得た。
EtOH(14.00mL)中の中間体145(750.00mg、605.28μmol、1.00eq)の溶液にNH2NH2.H2O(30.30mg、605.28μmol、29.42μL、1.00eq)を加えた。混合物を80℃で2時間撹拌した。LCMSは、中間体145が完全に消費され、大部分が所望の生成物(中間体146)であることを示し、水(40mL)で洗浄し、酢酸エチル(30mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、DCM/MEOH=0/1~10:1)で精製して(10S,10aR)-9-アミノ-10-(4-ブロモフェニル)-N-(4-メトキシフェニル)-6-メチルオクタヒドロピロロ[1,2-α][1,4]ジアゾシン-2(1H)-カルボキサミド(「R146」)(190mg)を黄色の混合物の固形物として得
中間体146(40mg)を黄色の固形物として得た。
H)。
DCM(3.00mL)中の化合物146(15.00mg、21.54umol、1.00eq)の溶液にHCHO(17.48mg、215.42umol、16.04uL、純度37%、10.00eq)およびMgSO4(51.86mg、430.83umol、20.00eq)に続いてNaBH(OAc)3(45.66mg、215.42umol、10.00eq)を加えた。混合物を20℃で2時間撹拌した後、得られた混合物をろ過し、ろ液を濃縮した。残渣を分取TLC(SiO2、ジクロロメタン:メタノール=20:1)によって精製して、化合物147(5.00mg、7.76umol、収率36.02%、純度80%)を薄黄色の固形物として得た。
CH3CN(500.00μL)中の中間体147(5.00mg、9.70μmol、1.00eq)の溶液にエチニルベンゼン(2.97mg、29.10μmol、3.19μL、3.00eq)、Cs2CO3(12.64mg、38.80μmol、4.00eq)を加え、N2で3回脱気し、次いでXPhos Pd G3(821.04ug、0.97μmol、0.10eq)を加えた。70℃で3時間撹拌した後、反応物を水(3mL)で希釈し、酢酸エチル(5mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=1:1)によって精製して、化合物E34(5.00mg、9.32μmol、収率96.04%)を薄黄色の固形物として得た。
(R)-2-ブロモフェニル)オキシラン(8.0g、40.2mmol)を入れたフラスコにアリルアミン(12.03ml、161mmol)を加えた。混合物を55℃で20時間撹拌した。この時間の後、LCMSによる分析は反応が完了したことを示し、混合物を室温まで冷却し、有機溶媒を減圧下で蒸発させた。ヘキサンを残渣に加えると白色の固形物が形成され、ろ過し、高真空下で2時間乾燥させて、所望の生成物(R)-2-(アリルアミノ)-1-(4-ブロモフェニル)エタン-1-オール(9.66g、37.7mmol、収率94%)を白色の固形物として得た。生成物をさらなる精製をせずに次の工程で用いた。
室温の無水アセトニトリル(60ml)中の(R)-2-(アリルアミノ)-1-(4-ブロモフェニル)エタン-1-オール(9.66g、37.7mmol)の溶液にK2CO3(7.82g、56.6mmol)および2-ブロモアセトニトリル(7.88ml、113mmol)を加えた。不均質混合物を窒素雰囲気下85℃で18時間撹拌した。この時間の後、LCMSによる分析は反応が完了したことを示し、混合物を室温まで冷却させた。有機溶媒を減圧下で蒸発させ、水(50ml)で希釈し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機成分をNa2SO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、酢酸エチル/ヘキサン=20~30%)で精製し、(R)-2-(アリル(2-(4-ブロモフェニル)-2-ヒドロキシエチル)アミノ)アセトニトリル(9g、30.5mmol、収率81%)を薄黄色の固形物として得た。
0℃の無水DMF(100ml)中のピリジン(12.1ml、151mmol)の溶液に塩化チオニル(4.38ml、60.3mmol)を滴下した。混合物を0℃で15分間撹拌した。この溶液にDCM(10ml)中の(R)-2-(アリル(2-(4-ブロモフェニル)-2-ヒドロキシエチル)アミノ)アセトニトリル(8.9g、30.2mmol)を5分間かけて加えた。この混合物を0℃で30分間撹拌すると、TLC分析は反応が完了したことを示した。反応混合物にNaHCO3飽和水溶液を加え、得られた溶液を10分間激しく撹拌した後、分液漏斗に移した。層を分離し水相をDCMで抽出し、合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、酢酸エチル/ヘキサン=0~20%)で精製して、所望の中間体(5.00g、9.87mmol、収率92%)を褐色の固形物として得た。
100mlの丸底フラスコに(R)-2-(アリル(2-(4-ブロモフェニル)-2-クロロエチル)アミノ)アセトニトリル(0.55g、1.754mmol)および無水THF(10ml)を入れ、薄黄色の溶液を得た。フラスコをドライアイス/アセトン浴に完全に浸漬させ、-50℃まで冷却した。LiHMDS(1M、THF溶液)をこの冷却溶液に滴下した。完全に添加した後、反応物を-50℃で1時間撹拌した。LCMSおよびTLC分析(ヘキサン中の20%EtOAc、KMnO4染色)は出発物質の完全な消失を示した。反応混合物をNH4Cl飽和水溶液で処理し、得られた溶液を10分間激しく撹拌した後、分液漏斗に移した。層を分離し、水相をEtOAcで抽出し、合わせた有機抽出物をブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、酢酸エチル/ヘキサン=0~20%)で精製し、画分の2つの主要なセットを得た。画分の1つ目のセット(0.16g、0.577mmol、収率33%)から、(2S,3S)-1-アリル-3-(4-ブロモフェニル)アゼチジン-2-カルボニトリル副産物が得られた。画分の2つ目のセット(0.17g、0.613mmol、収率35%)を静置すると固化して所望の生成物(2R,3S)-1-アリル-3-(4-ブロモフェニル)アゼチジン-2-カルボニトリルが得られた。
DCM(23ml)中であり0℃まで冷却した(2R,3S)-1-アリル-3-(4-ブロモフェニル)アゼチジン-2-カルボニトリル(0.62g、2.25mmol)の溶液に撹拌しながらDIBAL-H(2.41ml、13.51mmol)をシリンジでゆっくりと加えた。15分後、45分間にわたり反応物を室温まで温めた。この時間の後、LCMSによる分析は反応が完了したことを示し、反応物は0℃まで冷却させ、メタノール(1.366ml、33.8mmol)をゆっくりと加えた。この混合物に、ロシェル溶液(100mL)をゆっくりと加えた(要注意、発熱性)。水相をDCMで抽出し、合わせた有機相をMgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮して(2R,3S)-1-アリル-3-(4-ブロモフェニル)アゼチジン-2-カルボニトリルを黄色の油状物として得て、これを精製せずに次の工程で用いた。
DCM(26ml)中であり0℃まで冷却した中間体154(1.454g、5.171mmol)の溶液に2,6-ルチジン(1.797ml、15.51mmol)に続いて2-ニトロベンゼン-1-スルホニルクロリド(1.261g、5.69mmol)を一度に加えた。次いで溶液を室温まで温め、16時間撹拌した。反応混合物に水を加え、水層をDCMで抽出した。合わせた有機抽出物をMgSO4で乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、酢酸エチル/ヘキサン=0~20%)で精製して、中間体155(2.4g、収率100%)を得た。
DMF(10.00mL)中の中間体155(5.00g、10.72mmol、1.00eq)の溶液にK2CO3(2.22g、16.08mmol、1.50eq)および3-ブロモプロパ-1-エン(1.95g、16.08mmol、1.39mL、1.50eq)を加えた。混合物を25℃で16時間撹拌した。LCMSは、反応物156が完全に消費され、大部分が所望の生成物であることを示し、反応混合物を水(100mL)に溶解し、DCM(20mL×3)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥させ、次いで濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=10/1~5:1)によって精製し、中間体156(5.00g、9.87mmol、収率92.10%)を褐色の固形物として得た。
トルエン(500.00mL)中の中間体156(5.00g、9.87mmol、1.00eq)の溶液にホベイダ・グラブス第一世代触媒(812mg)をN2雰囲気下で加えた。混合物を油浴中60℃で16時間撹拌した。追加のホベイダ・グラブス第一世代触媒(1218mg)を加え、さらに16時間撹拌した。反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル= 5/1~0:1)によって精製し、中間体157(1.20g、1.25mmol、収率12.71%、純度50%)を、回収されたSM(2.2g)と共に黒色の固形物として得た。
CH3CN(17.00mL)中の中間体157(1.70g、1.78mmol、1.00eq)の溶液にベンゼンチオール(293.67mg、2.67mmol、271.92μL、1.50eq)およびCs2CO3(694.74mg、2.13mmol、1.20eq)を加えた。40℃で16時間撹拌後、反応混合物を水(100mL)に溶解し、DCM(30mL×3)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥させ、次いで濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=1/1~ジクロロメタン:メタノール=10:1)で精製して、中間体158(650.00mg、1.55mmol、収率87.18%、純度70%)を黒色の油状物として得た。
DCM(10.00mL)中の中間体158(650.00mg、1.55mmol、1.00eq)の溶液にTEA(78.52mg、775.92μmol、107.56μL、0.50eq)次いで1-イソシアナト-4-メトキシ-ベンゼン(277.75mg、1.86mmol、239.44μL、1.20eq)をN2雰囲気下20℃で加えた。混合物を20℃で1時間撹拌した。LCMSは、反応物158が完全に消費され、大部分が所望の生成物であることを示し、反応混合物を水(10mL)に溶解し、DCM(5mL×3)で抽出し、有機層をNa2SO4で乾燥させ、次いで濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2、石油エーテル:酢酸エチル=5/1~1:1)によって精製し、中間体159(560.00mg、1.27mmol、収率81.84%)を白色の固形物として得た。
アセトン(5.00mL)およびH2O(500.00μL)中の中間体159(500.00mg、1.13mmol、1.00eq)の溶液に-78℃のNMO(198.63mg、1.69mmol、178.95μL、1.50eq)およびOsO4(2.87mg、11.30μmol、0.59μL、0.01eq)を加えた。得られた反応混合物を次いで20℃で0.5時間撹拌した。TLCは反応物が完全に消費され、2つの所望の生成物が観察されたことを示し、反応混合物を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル)で精製した。中間体160a(100.00mg、209.93μmol、収率61.92%)が白色の固形物として得られ
中間体160b(275.00mg、577.29μmol、収率72.98%)が白色の固形物として得られた。
CH3CN(150.00μL)中の中間体160a(10.00mg、20.99μmol、1.00eq)とエチニルベンゼン(6.43mg、62.97μmol、6.91μL、3.00eq)との溶液にN2雰囲気下でCs2CO3(27.36mg、83.96μmol、4.00eq)およびXphos Pd G3(1.78mg、2.10μmol、0.10eq)を加えた。混合物を70℃で1時間撹拌した。LCMSは、反応物1が完全に消費され、大部分が所望の生成物であることを示した。反応混合物をろ過し、フィルターケーキをDCM(10mL)で洗浄し、ろ液を濃縮して残渣を得た。残渣を分取TLC(SiO2、石油エーテル/酢酸エチル=1:1)によって精製し、次いで分取HPLC(カラム:Waters Xbridge Prep OBD C18 150*30 5u;A:水(0.225%ギ酸)B:アセトニトリル)でさらに精製して、化合物E36(4.00mg、8.04μmol、収率38.30%)を白色の固形物として得た。
化合物E38の合成は中間体4aの代わりに中間体4bを用いた以外は化合物E1の合成と同一の合成経路で実施した。次いで上に記載と同じ反応工程に従った。
実施例39:インビトロ熱帯熱マラリア原虫血液期培養およびアッセイ
熱帯熱マラリア原虫(Dd2、3D7、D6、K1、NF54、V1/3、HB3、7G8、FCBおよびTM90C2B)の株をMalaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)から入手した。熱帯熱マラリア原虫分離株は37℃の93%N2、4%CO2、3%O2の雰囲気中で完全培養培地(10.4g/L RPMI 1640、5.94g/L HEPES、5g/LアルブマックスII、50mg/Lヒポキサンチン、2.1g/L重炭酸ナトリウム、10%ヒト血清および43mg/Lゲンタマイシン)においてO陽性のヒト血液とともに維持した。寄生虫は、寄生虫血症が3~8%に達するまで培地で培養した。寄生虫血症は、ギムザ染色された血液塗抹標本から少なくとも500個の赤血球を検査することにより決定した。化合物スクリーニングのために、培地で2.0%寄生虫血症および2.0%ヘマトクリットの寄生虫希釈液を作成した。25μlの培地を384ウェルの黒色透明底プレートに分注し、DMSO中の各化合物100nlを対照化合物(メフロキン)とともにアッセイプレートに移した。次に、培地中の25μlの寄生虫懸濁液をアッセイプレートに分注して、最終寄生虫血症を1%および最終ヘマトクリットを1%にした。アッセイプレートを72時間37℃でインキュベートした。溶解緩衝液(20mM Tris-HCl、5mM EDTA、0.16%(w/v)サポニン、1.6%(v/v)Triton X-100)中の10× SYBR Green I(Invitrogen;10,000×濃度で供給)からなる検出試薬10μlをアッセイプレートに分注した。至適な染色のために、アッセイプレートを24時間室温で暗所に放置した。アッセイプレートをEnvision(PerkinElmer)において485nm励起および530nm発光設定の505ダイクロイックミラーで読み取った。
HepG2細胞(ATCC)を標準的な組織培養インキュベータ(37℃、5%CO2)中でDMEM、10%(v/v)FBS(Sigma)、および1%(v/v)抗生剤-抗真菌剤で維持した。P.ベルゲイ(ANKA GFP-luc)に感染させたハマダラカ(A. stephensi)をNew York University Langone Medical Center Insectaryから入手した。アッセイには、1ウェルあたり約17,500個のHepG2細胞を384ウェルマイクロタイタープレートにデュプリケートで加えた。37℃で18~24時間後、培地を交換し化合物を加えた。1時間後、切開したばかりの蚊から得られた寄生虫をプレートに加え(1ウェルあたり寄生虫4,000個)、プレートを1,000r.p.mで10分間回転し、次いで37℃でインキュベートした。最終的なアッセイ体積は30μlであった。37℃で48時間インキュベートした後、Bright-Glo(Promega)を寄生虫プレートに加えて相対発光を測定した。各プレートの相対シグナル強度をEnVision(PerkinElmer)システムにより評価した。
マイクロパターン共培養(MPCC)とは、コロニーにまとまりかつ支持間質細胞に囲まれた初代ヒト肝細胞のインビトロ共培養システムである。この形式の肝細胞は、主な肝臓特異的機能および遺伝子発現によって評価されるように、増殖せずに最大で4~6週間まで機能的表現型を維持する。簡潔に説明すると、96ウェルプレートをラット尾I型コラーゲン(50μg/mL)で均一にコーティングし、選択的肝細胞接着を仲介する500μmの島型マイクロドメインにコラーゲンをパターン化するためのソフトリソグラフィー技術に供した。MPCCを作成するために、凍結保存した初代ヒト肝細胞(BioreclamationIVT)を100gにて6分間4℃で遠心分離してペレット化し、トリパンブルー色素排除試験(典型的には70~90%)を用いて生存率を評価し、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む無血清DMEM中でマイクロパターン化コラーゲンプレート(各ウェルが500μMのコロニーにまとまった約10,000個の肝細胞を含む)に播種した。細胞を2~3時間後に1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む無血清DMEMで洗浄し、ヒト肝細胞培養培地48で置き換えた。肝細胞播種の24時間後に3T3-J2マウス胚線維芽細胞を播種した(1ウェルあたり細胞7,000個)。
細胞質熱帯熱マラリア原虫PheRSのα-(PF3D7_0109800)およびβ-(PF3D7_1104000)サブユニット両方のタンパク質配列をPlasmoDB(http://plasmodb.org/plasmo/)から入手した。大腸菌での発現に最適化された完全長のαおよびβサブユニット遺伝子配列はNco1およびKpn1部位を用いてpETM11(カナマイシン耐性)およびpETM20(アンピシリン耐性)発現ベクターにクローニングし、大腸菌B834細胞に共形質転換した。タンパク質発現は0.5mMイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加によって誘導し、37℃で0.6~0.8のOD600が達成されるまで細胞を成長させた。次いで、誘導後20時間18℃でそれらを成長させた。5,000gで20分間の遠心分離により細胞を分離し、50mM Tris-HCl(pH7.5)、200mM NaCl、4mM β-メルカプトエタノール、15%(v/v)グリセロール、0.1mg/mLリゾチームおよび1mMフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)からなる緩衝液に細菌ペレットを懸濁させた。超音波処理によって細胞を溶解し、20,000gで1時間の遠心分離によって透明化した。上清をプレパック済みNiNTAカラム(GE Healthcare)にアプライし、溶出緩衝液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、80mM NaCl、4mM β-メルカプトエタノール、15%(v/v)グリセロール、1Mイミダゾール)を用いる勾配ミキシングによって結合タンパク質を溶出した。純粋な画分をプールし、さらなる精製のためにヘパリンカラムにロードした。再び、結合タンパク質はヘパリン溶出緩衝液50mM Tris-HCl(pH 7.5)、1M NaCl、4mM β-メルカプトエタノール、15%(v/v)グリセロール)の勾配を用いて溶出した。純粋な画分を再びプールし、50mM Tris-HCl(pH7.5)、200mM NaCl、4 mM β-メルカプトエタノール、1mM DTTおよび0.5 mM EDTAを含有する緩衝液で一晩透析した。TEVプロテアーゼをタンパク質試料に加え(プロテアーゼ:タンパク質比1:50)、20℃で24時間インキュベートしてポリヒスチジンタグを除去した。50mM Tris-HCl(pH7.5)、200mM NaCl、4mM β-メルカプトエタノール、1mM MgCl2におけるGE HiLoad 60/600 Superdexカラムでのゲルろ過クロマトグラフィーによってタンパク質をさらに精製した。溶出タンパク質(熱帯熱マラリア原虫cPheRSのヘテロダイマー)を収集し、SDS-PAGEで純度を測定し、-80℃で保存した。
哺乳類細胞(HepG2、A549、およびHEK293)はATCCから入手し、10%FBSおよび1%(v/v)抗生剤-抗真菌剤を含むDMEM中で常法によって培養した。細胞毒性アッセイのために、化合物処理の1日前に1×106個の細胞を384ウェルプレートに播種した。漸増用量の化合物で細胞を72時間処理し、Cell-Titer Glo(Promega)用いて生存率を測定した。ユニバーサルマイコプラズマ検出キット(ATCC)を用いてすべての細胞株のマイコプラズマ汚染を検査した。
インビトロ特性評価アッセイ(タンパク質結合、ミクロソーム安定性、肝細胞安定性、シトクロムP450(CYP)阻害、および水溶性)は業界で標準的な手法に従って実施した。標準的な手法を用いたQ-Patchシステムを用いてイオンチャネル阻害試験を実施した。
CD-1マウス(実験群あたりn=4;雌;6~7週齢;20~24g、Charles River)に約1×105個のP.ベルゲイ(ANKA GFP-luc)血液期寄生虫を処置の24時間前に静脈内接種し、化合物を経口投与した(0時間目)。寄生虫血症はインビボイメージングシステム(IVIS SpectrumCT、PerkinElmer)によってモニタリングして生物発光シグナルを取得した(150mg kg-1のルシフェリンを撮像の約10分前に腹腔内注射した)。さらに、各マウスから血液塗抹標本を定期的に取得し、ギムザで染色し、血液寄生虫血症の視覚的な検出のために顕微鏡で観察した。25%を超える寄生虫血症の動物は人道的に安楽死させた。
CD-1マウス(実験群あたりn=4;雌;6~7週齢;20~24g、Charles River)に、ハマダラカから切開したばかりの約1×105個のP.ベルゲイ(ANKA GFP-luc)スポロゾイトを静脈内接種した。感染直後にマウスを化合物の単回経口投与で処置し、P.ベルゲイ赤血球期アッセイについて記載されているように感染をモニタリングした。経時実験のために、化合物処置(10mg kg-1の単回経口投与)の時間を感染の5日前から感染の2日後まで変化させた。
CD-1(実験群あたりn=3;雌;6~7週齢;21~24g、Charles River)マウスを、ベヒクルまたは化合物による処置の96時間前に、にP.ベルゲイ(ANKA GFP-luc)で感染させた(0日目)。2日目にメスのハマダラカに20分間マウスの血を吸わせた。1週間後(9日目)、蚊の中腸を切開し、顕微鏡(倍率12.5倍)を覗いてオーシストを数えた。
生体適合性の熱帯熱マラリア原虫(3D7HLH/BRD)をPLoS One 3, e2252 (2008)に記載のように選択した。簡単に説明すると、NSGマウス(実験グループあたりn=2;雌;4~5週齢;19~21g;The Jackson Laboratory)に1mlのヒト赤血球(O陽性、50%ヘマトクリット、5%アルブマックスを含む50%RPMI 1640)を毎日腹腔内注射して、ヒト化循環赤血球(huRBC NSG)を有するマウスを作製した。約2×107個の血液期熱帯熱マラリア原虫3D7HLH/BRD(FASEB J. 25、3583-3593(2011))でhuRBC NSGマウスを静脈内感染させ、感染の5週間後に>1%寄生虫血症を達成した。3回のインビボ継代後、寄生虫を凍結し実験に用いた。1×107個の血液期熱帯熱マラリア原虫3D7HLH/BRD感染の約48時間後、平均寄生虫血症は約0.4%であった。huRBC NSGマウスを単回投与の化合物で経口処置し、寄生虫血症をIVISによって30日間モニタリングして、生物発光シグナルを取得した(150mg kg-1のルシフェリンを撮像の約10分前に腹腔内注射した)。
huRBCNSGマウス(実験グループあたりn=2;雌;4~5週齢;18~20g;Jackson Laboratory)を血液期の熱帯熱マラリア原虫3D7HLH/BRDに2週間感染させ、成熟した生殖母細胞を発達させた。その後マウスを単回経口用量の化合物で処置した。血液試料は11日間採取した。寄生虫病期の分子検出のために、対照および処置マウスから40μlの血液を取得した。簡単に説明すると、ゲノムDNAエリミネーターカラム(Qiagen)ともにRNeasy Plus Kitを用いて血液試料から全RNAを単離した。一本鎖cDNA合成は、SuperScript III First-Strand Synthesis System (Life Technologies)を用いて、抽出されたRNAから実施した。Sci. Transl. Med. 6, 244re5 (2014)に記載のように、時期特異的qRT-PCRアッセイを用いて寄生虫期を定量した。プライマーはPF3D7_0501300(環状期(ring stage)寄生虫)、PF3D7_1477700(未成熟生殖母細胞)およびPF3D7_1031000(成熟生殖母細胞)の転写レベルを測定するように設計した。PF3D7_1120200(熱帯熱マラリア原虫UCE)転写産物用のプライマーは構成的に発現する寄生虫マーカーとして用いた。アッセイは最終濃度250nMの各遺伝子用のプライマーを含む20μlの総反応体積のcDNAを用いて実施した。増幅はSYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)を用いてViia7 qRT-PCR機器(Life Technologies)で次の反応条件で実施した:1サイクル×10分95℃ならびに40サイクル×1秒95℃および20秒60℃。各cDNA試料をトリプリケートで行い、平均Ct値を分析に用いた。各マーカーのカットオフ(陰性対照)を超えて得られたCt値は特定の転写物の存在が無いと見なした。寄生虫接種前の各マウスからの血液試料も同じプライマーセットを用いて「バックグラウンドノイズ」について試験した。どの試料からも増幅は検出されなかった。
FRGノックアウトC57BL/6(ヒト再増殖、>70%)マウス(huHep FRGノックアウト;実験グループあたりn=2;雌;5.5~6ヶ月齢;19~21g;Yecuris)に約1×105個の熱帯熱マラリア原虫(NF54HT-GFP-luc)スポロゾイトを静脈内接種し、接種1日後に単回10mg kg-1経口用量として化合物を投与した。感染はIVISによって毎日モニタリングした。接種の5日後にヒト赤血球(0.4ml、O陽性、50%ヘマトクリット、50%RPMI 1640、5%アルブミン)の毎日の生着(engraftment)を開始した。qPCR分析のために、接種7日後に血液試料(40μl)を採取した。血液期寄生虫の分子検出のために、対照および処置マウスから40μlの血液を得た。簡単に説明すると、ゲノムDNAエリミネーターカラム(Qiagen)とともにRNeasy Plus Kitを用いて血液試料から全RNAを分離した。一本鎖cDNA合成は、SuperScript III First-Strand Synthesis System(Life Technologies)を用いて、抽出されたRNAから実施した。血液期寄生虫の存在はPLOS Comput. Biol. 9, e1003392 (2013)に記載されているように時期特異性が高いqRT-PCRアッセイを用いて定量化した。プライマーはPF3D7_1120200(熱帯熱マラリア原虫UCE)の転写レベルを測定するように設計した。アッセイは最終濃度250nMの各遺伝子用のプライマーを含む20μlの総反応容量のcDNAを用いて実施した。増幅はSYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)を用いてViia7 qRT-PCR機器(Life Technologies)で実施し、反応条件は次のとおりである:1サイクル×10分95℃ならびに40サイクル×1秒95℃および20秒60℃。各cDNA試料をトリプリケートで行い、平均Ct値を分析に用いた。各マーカーのカットオフ(陰性対照)を超えて得られたCt値は特定の転写物の存在が無いと見なした。各マウスからの血液試料も寄生虫接種前に同じプライマーセットを用いてバックグラウンドノイズについて試験した。どの試料からも増幅は検出されなかった。
慢性無症候性C.パルブム感染のNOD SCIDガンママウスモデルを用いてインビボにおける化合物の有効性を試験した。NOD SCIDガンママウスを離乳5~7日後に胃管栄養法によって約1×105個のC.パルブムオーシストに感染させた。感染した動物は感染の1週間後に糞便からオーシストを排出し始め、これは定量PCR(qPCR)によって測定される。陽性対照化合物であるパロモマイシンでの経験に基づくと、4日間の薬剤化合物後に寄生虫排出の80%の減少を検出すべく80%の検定力を達成するためには実験群毎にマウスが4匹必要である。実験薬物レジメン群に加えて、追加の陰性(DMSO/メチルセルロース担体による胃管栄養法)および陽性(1日1回のパロモマイシン2000mg/kg)対照群が各実験に含まれる。マウスは離乳後5~7日(-6日目)で感染させ、感染を1週間後(0日目)に確認し、実験化合物を1~4日目に胃管栄養法によって投与する。投与頻度は示したとおりである。処置有効性は5日目にqPCRによる糞便オーシスト排出の測定によって評価した。
ヒト回盲腺癌(HCT-8)細胞はATCCから入手し、HEPES、ピルビン酸ナトリウム(1mM)、および10%ウマ血清(ATCC)と120U/mlペニシリンと120μg/mlストレプトマイシンを加えたL-グルタミン(ATCC)を含むRPMI1640培地を有するT-75組織培養フラスコで維持した。細胞を、384ウェルの、組織培養処理され周囲が黒く底が透明なマイクロウェルプレート(BD Falcon)に8,850個/ウェルの密度で細胞を播種し、コンフルエントになるまで成長させた。次いで、これらに接種培地(ウマ血清不含RPMI1640)に懸濁させた5.5×103個の刺激(primed)C.パルブムオーシスト(Bunchgrass Farms、Deary、ID)を接種した。オーシストは過去に記載されたプロトコル(J. Eukaryot. Microbiol. 46:56S-57S)に従って脱嚢のために刺激(primed)された。簡単に記載すると、オーシストは10mM HClで10分間、37℃で処理し、遠心分離し、Ca2+およびMg2+を加えたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のタウロコール酸ナトリウム(Sigma-Aldrich)の2mM溶液で処理した。懸濁液を10分間16℃でインキュベートし、次いで接種培地で希釈し、各ウェルに加えた。感染細胞を37℃で3時間インキュベートし、この時点で20%ウマ血清を含む同じ体積の増殖培地(総血清濃度10%)。化合物を希釈し、EC50曲線の作製のために0.12、0.37、1.1、3.3、および10μMの固定用量(各濃度、n=14)で分析した。最終EC50曲線の場合、3つのウェルを感染させずに残したが、対応する濃度の化合物のそれぞれで処理してバックグラウンド染色を評価した。すべての曲線は、ボトム制約(bottom constraint)を0に設定したGraphPad Prism中のlog[阻害剤]対応答_変数スロープ式(log[inhibitor] versus response _ variable slope equation)(式3)を用いて作製した。
明細書において引用したあらゆる特許、特許出願、および刊行物の開示はそれら全体が参照により本明細書に組み入れられる。US Publication No. 2016/0289235の開示も参照により組み入れられる。特定の態様では、発明の化合物はUS Publication No. 2016/0289235の表1に記載の化合物ではない。
Claims (14)
- 式(I)の構造を有する化合物またはその薬学的に許容される塩:
式中、
R1は置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリールであり;
R2は置換されていてもよいアルコキシ、シクロアルコキシまたはヘテロシクリルであり;
R3は水素または-CH2-Xであり;
R4およびR5は独立して水素、-X、または-CH2-Xであり、R4およびR5は一緒になって5員または6員の縮合環を形成してもよく、R4およびR5の少なくとも一方は水素ではなく;
R6およびR7は独立して水素またはRであり;かつ
z1~z8は独立してそれぞれ出現時にCHまたはNより選択され;ここで
-Xは独立してそれぞれ出現時に-OH、-OR、-S(O)R、-S(O)2R、-N(R)-S(O)2R、-S(O)2-N(R)(R)、-S(O)2-NHR、-N(R)-C(O)-R、-NH2、または-N(R)(R)より選択され;かつ
Rは、独立してそれぞれ出現時に、置換されていてもよいC1~C12アルキルであり、
ここで、ヘテロアリールは、N、O、およびSより選択される1、2、または3個の環ヘテロ原子を含有し残りの環原子がCである芳香環を少なくとも1個有する、5~12個の原子の芳香族単環式または多環式基を意味し、
ヘテロシクリルは、炭素環原子の1、2または3個がヘテロ原子によって置き換えられた単環式または多環式アルキル環を意味する。 - 薬学的に許容される賦形剤および請求項1~3のいずれか一項記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物。
- 有効量の請求項1~3のいずれか一項記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、対象における寄生虫性疾患を処置または予防するための薬学的組成物。
- 請求項4記載の薬学的組成物を非ヒト対象に投与する工程を含む、非ヒト対象における寄生虫性疾患の処置または予防の方法。
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