CN110168093B - 一种转染细胞内寄生虫的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种转染细胞内寄生虫的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括聚乙烯亚胺，所述试剂盒还包括皂素和/或聚乙二醇辛基苯基醚。本发明试剂盒转染快速，转染效率高，转染成功率高；转染后阳性虫株获取耗时短，不需要长时间药物筛选；仅需要极少量的化学转染试剂，不需要昂贵的转染仪器；原料成本低，单次转染的试剂耗费较低；具有一次转染多个基因表达载体的潜力。

Description

一种转染细胞内寄生虫的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种转染细胞内寄生虫的试剂盒及其应用，具体为一种转染细胞内寄生虫的试剂盒和转染细胞内寄生虫的方法。

背景技术

艾滋病、结核病和疟疾是世界三大最致命传染病。根据世界卫生组织的统计，在世界范围内，截止到2015年，仍然有43.8万人死于疟疾这种疾病，其中90％的死亡率集中在非洲地区，7％发生在东南亚地区，2％发生在东部地中海地区(World HealthOrganization.World Malaria Report 2015.)。而临床疟疾的发生主要是由于处于红细胞内期的人恶性疟原虫(Plasmodium falciparum,P.falciparum)这种原生动物寄生虫感染所导致的。到目前为止，由于对P.falciparum的基本生物学研究尚有诸多未知领域，从而限制了抗疟疾药物治疗和疟疾疫苗的发展。

事实上，仍然有大约50％的恶性疟原虫基因的功能是未知的(Webster WA,McFadden GI.From the genome to the phenome:tools to understand the basicbiology of Plasmodium falciparum.J Eukaryot Microbiol.2014,61(6):655-71.)。多种遗传学工具已经被应用于红内期恶性疟原虫基因功能的研究，但进展缓慢(de Koning-Ward TF,Gilson PR,Crabb BS.Advances in molecular genetic systems inmalaria.Nat Rev Microbiol.2015,13(6):373-87.Birnbaum J,Flemming S,Reichard N,Soares AB,Mesén-Ramírez P,Jonscher E,Bergmann B,Spielmann T.A genetic systemto study Plasmodium falciparum protein function.Nat Methods.2017,14(4):450-456.)。而疟原虫体内特定基因的遗传操作不成功往往是由于疟原虫转染效率过低以及转染后疟原虫的存活率过低所导致的。尽管研究者们开发了多种替代方法用于疟原虫的转染，基于红细胞电穿孔的DNA自发吸收法仍然是将外源DNA导入红内期P.falciparum的首选方式(Deitsch K,Driskill C,Wellems T.Transformation of malaria parasites bythe spontaneous uptake and expression of DNA from human erythrocytes.NucleicAcids Res.2001,29(3):850-3.Skinner-Adams TS,Lawrie PM,Hawthorne PL,GardinerDL,Trenholme KR.Comparison of Plasmodium falciparum transfectionmethods.Malar J.2003,2:19.)。但是这种电穿孔转染法需要经过长期的培养和多轮药物筛选才有可能获得阳性的转基因虫株(Birnbaum J,Flemming S,Reichard N,Soares AB,Mesén-Ramírez P,Jonscher E,Bergmann B,Spielmann T.A genetic system to studyPlasmodium falciparum protein function.Nat Methods.2017,14(4):450-456.)。

“Lu et al.,2016；Birnbaum et al.,2017”报道了在P.falciparum基因组的非必需基因位点进行简单的绿色荧光蛋白(GFP)基因的敲入也需要几十天才能获取阳性虫株(Lu J,Tong Y,Pan J,Yang Y,Liu Q,Tan X,Zhao S,Qin L,Chen X.A redesignedCRISPR/Cas9system for marker-free genome editing in Plasmodiumfalciparum.Parasit Vectors.2016,9:198.Birnbaum J,Flemming S,Reichard N,SoaresAB,Mesén-Ramírez P,Jonscher E,Bergmann B,Spielmann T.A genetic system tostudy Plasmodium falciparum protein function.Nat Methods.2017,14(4):450-456.)。而且这种方法需要昂贵的电穿孔转染装置和相配套的电转液(cytomix)才能进行，需要的DNA的量也较大，一次转染就要耗费几百微克的DNA分子，用于负载DNA的红细胞和用于转染的疟原虫需要分别准备，并且在转染初期需要频繁的换液，相对比较耗时、耗力、费钱。

与其他物种不同，体外持续培养的P.falciparum必须寄生在人的红细胞中才能生存(Trager W,Jensen JB.Human malaria parasites in continuousculture.Science.1976,193(4254):673-5.)，这就意味着外源DNA需要穿过人红细胞膜、疟原虫细胞膜和疟原虫核膜三层膜***才能进入到疟原虫的细胞核中。并且，人成熟红细胞的自发内吞作用效率非常低(Colin FC,Schrier SL.Spontaneous endocytosis in humanneonatal and adult red blood cells:comparison to drug-induced endocytosis andto receptor-mediated endocytosis.Am J Hematol.1991,37(1):34-40.)，这很可能是由于致密的红细胞膜骨架增加了膜脂双层的强度(Lux SE 4th.Anatomy of the red cellmembrane skeleton:unanswered questions.Blood.2016,127(2):187-99.)进而阻止了膜囊泡的内化。这使得传统的阳离子脂质体法、阳离子聚合物法等化学转染法很难实现对红内期疟原虫的转染。尽管如此，在红内期发育的过程中，P.falciparum本身依然存在着自发内吞作用(Hoppe HC,van Schalkwyk DA,Wiehart UI,Meredith SA,Egan J,WeberBW.Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodiumfalciparum.Antimicrob Agents Chemother.2004,48(7):2370-8.Smythe WA,Joiner KA,Hoppe HC.Actin is required for endocytic trafficking in the malaria parasitePlasmodium falciparum.Cell Microbiol.2008,10(2):452-64.)，因此，如何让包含基因序列的转染复合物透过宿主的细胞膜是化学转染法成功的关键。

聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)是一种稳定的阳离子聚合物，广泛用于哺乳动物细胞转染(Longo PA,Kavran JM,Kim MS,Leahy DJ.Transient mammalian celltransfection with polyethylenimine(PEI).Methods Enzymol.2013,529:227-40.)，也曾被用于与P.falciparum同属原生动物寄生虫的弓形虫Toxoplasma gondii的基因转染(Salehi N,Peng CA.Gene transfection of Toxoplasma gondii using PEI/DNApolyplexes.J Microbiol Methods.2012,91(1):133-7.)。PEI可将DNA压缩成带正电荷的颗粒从而与细胞表面的阴离子结合，之后，PEI/DNA复合物被细胞内吞并释放到细胞质中(Sonawane ND,Szoka FC Jr,Verkman AS.Chloride accumulation and swelling inendosomes enhances DNA transfer by polyamine-DNA polyplexes.J Biol Chem.2003,278(45):44826-31.Huth S,Lausier J,Gersting SW,Rudolph C,Plank C,Welsch U,Rosenecker J.Insights into the mechanism of magnetofection using PEI-basedmagnetofectins for gene transfer.J Gene Med.2004,6(8):923-36.)。巧合的是，另一种阳离子聚合物，聚酰胺-胺型树枝状聚合物(polyamidoamine dendrimer)曾被报道可用于转染红内期P.falciparum(Mamoun CB,Truong R,Gluzman I,Akopyants NS,Oksman A,Goldberg DE.Transfer of genes into Plasmodium falciparum by polyamidoaminedendrimers.Mol Biochem Parasitol.1999,103(1):117-21.)，但后续的研究发现，应用该方法转染P.falciparum并添加药物筛选以获取稳定转染虫株的多次重复试验却无一成功(Skinner-Adams TS,Lawrie PM,Hawthorne PL,Gardiner DL,Trenholme KR.Comparisonof Plasmodium falciparum transfection methods.Malar J.2003,2:19.)。

历史上，研究者们开发了一系列红内期P.falciparum的转染方法。其中使用范围最广也最常用的是红细胞负载DNA的电穿孔转染法，它依赖于昂贵的电穿孔转染仪器和转染试剂，仅仪器成本就高达几十万元人民币，单次转染的试剂耗费也要几百元人民币，而且单次转染所用的新鲜的人红细胞和正处于裂殖体期的P.falciparum(几百微升感染率超过10％的虫血)需要分开准备，DNA用量也较多(几十到几百微克)，一次电转染需要耗费2-3小时才能完成，且至少需要近三十天的体外培养和药物筛选才有可能获得阳性的虫株，转染效率和成功率都很低(约为百万分之一的转染率)。也有少数研究者尝试采用化学转染法，但是有报道的最高转染效率还不到10％，而且实验成功率非常低(近乎无法重复)，所用试剂也很昂贵。

除了疟原虫以外，其他种类的细胞内寄生虫也面临着化学转染的难题。为了解决人恶性疟原虫化学转染的难题，主要在于能否研发出一种方法来让恶性疟原虫感染的人红细胞膜穿孔但是又不损伤其内寄生的疟原虫，然后再利用诸如聚乙烯亚胺/DNA复合体颗粒来透过恶性疟原虫感染的人红细胞膜并实现疟原虫转染。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明提供一种转染细胞内寄生虫的试剂盒及其应用，采用试剂盒进行转染细胞内寄生虫可以解决寄生虫转染效率低下、成功率低下的问题，实现多个质粒DNA共转染的体系。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种转染细胞内寄生虫的试剂盒，所述试剂盒包括聚乙烯亚胺；

所述试剂盒还包括皂素和/或聚乙二醇辛基苯基醚。

本发明中，通过聚乙烯亚胺(PEI)以及皂素和/或聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的协同作用，可以实现基因对细胞内寄生虫的高效转染，整个过程只需约30min，转染效率可达50％以上，最高可达100％。

根据本发明，所述试剂盒包括PEI和皂素。

本发明中，发明人发现采用Triton X-100和PEI配合转染寄生虫会对寄生虫产生一定的毒性，造成寄生虫的死亡比例高，而采用皂素和PEI配合使用，无毒副作用，寄生虫可以继续生存，基因也可在寄生虫内稳定表达。

根据本发明，所述寄生虫为疟原虫、巴贝斯虫、人类Colpodella样寄生虫(肾形目寄生虫)、利什曼原虫或锥虫中的任意一种或任意两种的组合，优选为疟原虫，进一步优选为细胞内疟原虫。

第二方面，本发明提供一种采用如第一方面所述的试剂盒转染细胞内寄生虫的方法，包括如下步骤：

(1)采用试剂盒中的皂素和/或聚乙二醇辛基苯基醚处理待转染的寄生虫感染的细胞；

(2)向步骤(1)处理后的待转染寄生虫感染的细胞添加转染的基因序列与聚乙烯亚胺的复合物进行孵育转染。

根据本发明，所述皂素和/或聚乙二醇辛基苯基醚的质量体积比分别为0.001-0.05％，例如可以是0.001％、0.002％、0.003％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.012％、0.013％、0.015％、0.016％、0.018％、0.02％、0.022％、0.025％、0.026％、0.028％、0.03％、0.032％、0.035％、0.038％、0.04％、0.042％、0.045％、0.048％或0.05％，优选为0.001-0.03％，进一步优选为0.001-0.01％。

本发明中，发明人发现，当皂素浓度控制在0.03％(wt/v,质量/溶液总体积)以下，寄生虫感染的细胞相对完整，很少细胞出现裂解的情况，特别是皂素浓度在0.001％(wt/v)-0.01％(wt/v)之间的浓度最好，在这个浓度范围内，能够最大限度的保持寄生虫感染的细胞的完整性，也就能够保持细胞内寄生虫的活性，同时也适用于后续的PEI转染。

根据本发明，所述基因序列为质粒DNA载体、DNA表达框序列或RNA表达框序列中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，所述转染可以同时转染多个基因表达载体，所述转染包括瞬时转染和稳定转染，所述瞬时转染为转染游离表达的DNA，所述稳定转染为转染能够发生基因组整合的基因编辑***。

本发明中，所述基因序列为能够转染到寄生虫的基因都是可行的，主要包括：药物筛选阳性转染虫株用的抗性基因、报告基因或功能基因，其中所述报告基因例如可以是绿色荧光蛋白(GFP)和/或红色荧光蛋白(RFP)以及荧光素酶等；所述功能基因包括敲除疟原虫自身的功能基因，或者引入需要超表达的功能基因，功能基因可以来自任何寄生虫，也可以来自其他物种。

根据本发明，发明人发现聚乙烯亚胺中的氨基氮和所述基因序列中的磷酸基的摩尔比非常重要，对转染的效率会产生很大的影响，本发明中所述聚乙烯亚胺中的氨基氮和所述基因序列中的磷酸基的摩尔比为1-16000，例如可以是1、2、3、4、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1500、1800、2000、2300、2400、2500、2800、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、110000、120000、130000、140000、150000或160000，优选为1-2500，进一步优选为5-100。

在一个具体的实施例中，所述根据PEI的胺基氮(N)和质粒DNA磷酸基(P)的摩尔数的比例计算PEI的添加量的具体计算如下：用于瞬时转染的游离表达质粒为例，其磷酸盐摩尔浓度(P)＝质粒DNA重量(1μg)/(双链质粒DNA的碱基对(6669bp)×DNA碱基对(钠盐)的平均分子量(650g/mol/bp))≈0.23pmol，按氮磷比(N/P)为30来计算，PEI的胺基氮(N)需要6.9pmol，而本发明所使用的PEI含有11％的N-丙酰化的胺基，而PEI的平均分子量约为25,000g/mol，所以需要的PEI的添加量为(6.9pmol/0.11)×25,000g/mol≈1.6μg，也就是需要加入1.6μl的PEI工作溶液(1μg/μl)。

根据本发明，所述聚乙烯亚胺的分子量与后续PEI的添加量有直接关系，PEI的平均分子量约为25000，本发明所述PEI的分子量为1000-750000，例如可以是1000、1100、1200、1300、1500、1600、1800、2000、2200、2300、2500、2800、3000、3200、3500、3800、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、12000、13000、15000、18000、20000、22000、25000、28000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、70000、80000、90000、100000、130000、150000、200000、250000、300000、350000、400000、450000、500000、550000、600000、650000、700000或750000，优选为10000-30000。

根据本发明，步骤(1)之前还包括寄生虫的体外培养和同步化的步骤，本发明中所述的体外培养和同步化为本领域的常规技术，本领域技术人员可以根据培养的寄生虫的不同而进行选择，在此不作特殊限定。

优选地，步骤(2)之后还包括培养的步骤。

根据本发明，所述培养的步骤具体包括：去除含有转染试剂的培养基，加入新鲜的培养基进行培养。

优选地，所述培养的温度为30-40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为35-38℃。

优选地，所述培养的时间为48h以上，例如可以是48h、49h、50h、51h、52h、53h、54h、55h、56h、58h、60h、62h、63h、65h、68h、70h、72h、75h、78h、80h、82h、85h、88h、90h、92h、95h、96h、98h或100h，优选为48-96h。

优选地，所述培养采用三气培养箱。

本发明中，由于转染效率高不需要经过药物筛选或者只经过短时间筛选就能获得阳性转染虫株，由于本发明中瞬时转染和稳定转染中转染基因的不同，所述瞬时转染无需进行筛选，所述稳定转染需要2-3周的药物筛选。

本发明中，所述稳定转染中药物筛选采用的是杀稻瘟菌素S灭瘟素。

根据本发明，所述方法包括如下步骤：

(1)寄生虫的体外培养和同步化；

(2)采用试剂盒中的皂素和/或聚乙二醇辛基苯基醚处理待转染的寄生虫感染的细胞，所述皂素和/或聚乙二醇辛基苯基醚的质量体积比分别为0.001-0.05％；

(3)向步骤(2)处理后的待转染寄生虫感染的细胞添加转染的基因序列与聚乙烯亚胺的复合物进行孵育转染，所述聚乙烯亚胺中的氨基氮和所述基因序列中的磷酸基的摩尔比为1-16000，所述聚乙烯亚胺的分子量为1000-750000；

(4)去除含有转染试剂的培养基，加入新鲜的培养基在三气培养箱中温度30-40℃培养48h以上，得到稳定表达的虫株。

作为优选技术方案，所述方法包括如下步骤：

(1)疟原虫的体外培养和同步化；

(2)采用试剂盒中的皂素处理待转染的疟原虫感染的细胞，所述皂素的质量体积比分别为0.001-0.01％；

(3)向步骤(2)处理后的待转染疟原虫感染的细胞添加转染的基因序列与聚乙烯亚胺的复合物进行孵育转染，所述聚乙烯亚胺中的氨基氮和所述基因序列中的磷酸基的摩尔比为5-100，所述聚乙烯亚胺的分子量为10000-30000；

(4)去除含有转染试剂的培养基，加入新鲜的培养基在三气培养箱中温度35-38℃培养48-96h以上，得到稳定表达的虫株。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明试剂盒通过聚乙烯亚胺(PEI)以及皂素和/或聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的协同作用，可以实现基因对寄生虫的高效转染，整个过程只需约30min，转染效率可达50％以上，最高可达100％，转染后的虫株无需长时间筛选，最多只需2-3周就可以筛选得到阳性虫株；

(2)本发明转染试剂盒仅需要少量的聚乙烯亚胺(PEI)以及皂素和/或聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，原料成本低，单次转染的试剂耗费较低，且能够一次转染多个基因表达载体，效率高；

(3)本发明方法简单，操作方便，便于推广应用。

附图说明

图1为用于瞬时转染P.falciparum虫株的游离表达载体图谱；

图2(A)为用于稳定转染P.falciparum虫株的基于CRISPR-Cas9基因编辑pPfInt-Pf47 Site Cleavage载体图谱，图2(B)为用于稳定转染P.falciparum虫株的基于CRISPR-Cas9基因编辑pPfInt-GFP&NanoLuc Donor载体图谱；

图3为细胞内寄生虫化学转染的基本流程；

图4(A)为明胶富集前的P.falciparum虫株经Giemsa染色的结果；图4(B)为明胶富集后的P.falciparum虫株经Giemsa染色的结果；

图5(A)为质量体积比为0.001％的皂素处理对P.falciparum 3D7感染红细胞的影响，图5(B)为质量体积比为0.01％的皂素处理对P.falciparum 3D7感染红细胞的影响，图5(C)为质量体积比为0.03％的皂素处理对P.falciparum 3D7感染红细胞的影响，图5(D)为质量体积比为0.05％的皂素处理对P.falciparum3D7感染红细胞的影响，图5(E)为质量体积比为0.1％的皂素处理对P.falciparum3D7感染红细胞的影响；

图6为pPfEps-mCherry游离表达载体采用皂素与PEI配合瞬时转染P.falciparum3D7虫株的荧光显微镜检测结果，其中，图6(A)为明场拍照，图6(B)为经Hoechst 33258染料处理后，在UV通道拍照的结果，图6(C)为红色荧光检测通道的拍照结果，图6(D)为图6(A)、图6(B)和图6(C)的叠加图；

图7为CRISPR-Cas9基因编辑表达载体稳定转染P.falciparum 3D7虫株的荧光显微镜检测结果，其中，图7(A)为明场拍照，图7(B)为绿色荧光检测通道的拍照结果，图7(C)为图7(A)和图7(B)的叠加图；

图8(A)为pPfEps-mCherry质粒DNA示意图，图8(B)为pPfEps-mCherry游离表达载体瞬时转染P.falciparum 3D7虫株的PCR鉴定结果，其中，M表示DNA分子量标准，S1,S2为0.001％(wt/v)皂素处理后经PEI转染的虫株的PCR鉴定产物，S3,S4为0.01％(wt/v)皂素处理后经PEI转染的虫株的PCR鉴定产物，WT为野生型P.falciparum 3D7虫株的PCR产物作为阴性对照组，PC为纯化的pPfEps-mCherry质粒DNA作为阳性对照组；

图9(A)为pPfInt-GFP&NanoLuc Donor基因供体质粒DNA与P.falciparum3D7基因组13号染色体上Pf47基因位点的双交换重组示意图，图9(B)为CRISPR-Cas9基因编辑表达载体稳定转染P.falciparum 3D7虫株的PCR鉴定结果，其中，M表示DNA分子量标准，WT为野生型P.falciparum 3D7虫株的PCR产物作为阴性对照组，S1为P.falciparum 3D7稳定转染虫株的PCR产物；

图10为pPfEps-mCherry游离表达载体瞬时转染P.falciparum 3D7虫株的Westernblot(蛋白质印记)鉴定，其中，M表示DNA分子量标准，S1,S2为0.001％(wt/v)皂素处理后经PEI转染的P.falciparum 3D7虫株的细胞裂解液，S3,S4为0.01％(wt/v)皂素处理后经PEI转染的P.falciparum 3D7虫株的细胞裂解液，WT为野生型P.falciparum 3D7虫株的细胞裂解液；

图11为P.falciparum 3D7稳定转染虫株的NanoLuc荧光素酶活性检测，其中，纵坐标表示NanoLuc荧光素酶活性检测的相对荧光信号强度，横坐标为实验组，S1-S4为4株稳定转染并表达GFP&NanoLuc Luciferase融合蛋白的疟原虫虫株，分别编号为GFP&NanoLuc，WT为P.falciparum 3D7野生型虫株作为阴性对照组；

图12为质量体积比分别为0.001％、0.01％、0.025％和0.1％的Triton X-100处理对P.falciparum 3D7感染红细胞的影响；

图13为pPfEps-mCherry游离表达载体采用Triton X-100与PEI配合瞬时转染P.falciparum 3D7虫株的荧光显微镜检测结果，其中，图13(A)为明场拍照，图13(B)为经Hoechst 33258染料处理后，在UV通道拍照的结果，图13(C)为红色荧光检测通道的拍照结果，图13(D)为图13(A)、图13(B)和图13(C)的叠加图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1：人恶性疟原虫虫株P.falciparum 3D7的体外培养和同步化

采用标准化条件进行人恶性疟原虫虫株P.falciparum 3D7的体外培养和同步化操作(Radfar A,Méndez D,Moneriz C,Linares M,Marín-García P,Puyet A,Diez A,Bautista JM.Synchronous culture of Plasmodium falciparum at high parasitemialevels.Nat Protoc.2009,4(12):1899-915.)：包括使用完全培养基：10.4g/L RPMI 1640，25mM HEPES，0.5％(wt/vol)AlbuMAX I，1.77mM碳酸氢钠，100μM次黄嘌呤，12.5μg/ml硫酸庆大霉素，调pH值为7.2，1％红细胞压积，37℃三气培养箱(1％O₂,3％CO₂,和96％N₂)中培养。每天换一次培养基，并采用吉姆萨染色法(Giemsa staining)计数感染率，待原虫感染率达到10％，采用山梨醇裂解法进行疟原虫同步化。

实施例2：P.falciparum转染的质粒载体以及相关的基因序列

为了测试化学转染法的可行性，分别使用了两套质粒：一种是用于瞬时转染的游离表达质粒即pPfEps-mCherry，如图1所示，其主要元件包括：一个由P.falciparum的组成型启动子5’-CAM(钙调素，calmodulin,cam,Gene ID:PF3D7_1434200)基因的启动子序列和鼠伯氏疟原虫Plasmodium berghei的终止子序列3’-PbDT(双功能二氢叶酸还原酶胸苷合酶，bifunctional dihydrofolate reductase-thymidylate synthase,DHFR-TS,Gene ID:PBANKA_0719300)的3’-端非编码序列所控制的红色荧光蛋白mCherry的融合表达蛋白框，在mCherry蛋白的N-端***了一个KAHRP(knob-associated histidine-rich protein)基因的出膜转运信号肽，而在mCherry蛋白的C-端融合了一个以丝氨酸(S)和丙氨酸(A)组成的链接肽连接的Strep tag蛋白标签；一个由P.falciparum的翻译延长因子的5’-端启动子(5’-PfEf1α,elongation factor 1-alpha,Gene ID:PF3D7_1357000)P.falciparum HRPII基因的3’-端非编码区(3’-HRP2,histidine-rich protein II,HRPII,Gene ID:PF3D7_0831800)所控制的杀稻瘟菌素S抗性基因(Blasticidin-S deaminase,BSD,EC number:3.5.4.23)的表达框，用于转基因疟原虫的抗性筛选；和一个卡那霉素抗性基因(kanamycinphosphotransferase,kanamycin resistance gene,KmR)的表达框，用于在大肠杆菌(例如DH5α,XL-10,Stbl3和NEB Stable等质粒DNA克隆菌株)中进行阳性质粒的筛选和维持该质粒在大肠杆菌中的稳定性；以及质粒DNA的基本骨架和在大肠杆菌中的质粒DNA复制起始点(ColE1origin)序列等。

另一种是用于稳定转染的质粒表达***，如图2(A)-图2(B)所示，包括图2(A)的pPfInt-Pf47 Site Cleavage和图2(B)的pPfInt-GFP&NanoLuc Donor两个质粒，该质粒转染***是基于CRISPR-Cas9基因编辑技术构建的，主要包括一个包含靶向Pf47位点的sgRNA的表达框和一个Cas9基因的表达框的载体，其构建过程与pCBS-Pf47载体的构建构成一致(Lu J,Tong Y,Pan J,Yang Y,Liu Q,Tan X,Zhao S,Qin L,Chen X.A redesignedCRISPR/Cas9system for marker-free genome editing in Plasmodiumfalciparum.Parasit Vectors.2016,9:198.)；以及一个在GFP和NanoLuc融合蛋白表达框的侧翼加上了Pf47位点的5’-端和3’-端同源臂序列的重组供体质粒，与pARM-GFP/RUCki载体的构建过程一致(Lu J,Tong Y,Pan J,Yang Y,Liu Q,Tan X,Zhao S,Qin L,Chen X.Aredesigned CRISPR/Cas9system for marker-free genome editing in Plasmodiumfalciparum.Parasit Vectors.2016,9:198.)，唯一不同的是将pARM-GFP/RUCki载体中的海肾萤光素酶基因(renilla luciferase)替换成了检测灵敏度更高的NanoLuc荧光素酶基因(Hall MP,Unch J,Binkowski BF,Valley MP,Butler BL,Wood MG,Otto P,ZimmermanK,Vidugiris G,Machleidt T,Robers MB,Benink HA,Eggers CT,Slater MR,Meisenheimer PL,Klaubert DH,Fan F,Encell LP,Wood KV.Engineered luciferasereporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinonesubstrate.ACS Chem Biol.2012,7(11):1848-57.)，并以一个GGPSG短肽DNA序列与绿色荧光蛋白GFPm3基因连接在一起形成一个新的融合蛋白表达框。

实施例3：P.falciparum转染实验

转染的流程如图3所示，先将体外培养并经过明胶富集的红细胞内期P.falciparum虫株进行细胞通透处理，再孵育转染，具体如下：

由于位于P.falciparum二号染色体上的Knob结构相关的组氨酸富集蛋白(KAHRP)对人红细胞膜蛋白1(PfEMP1)的出膜转运至关重要，其信号肽能够帮助其融合蛋白分泌到红内期P.falciparum体外。因此，当原虫感染率达到10％的时候，首先采用明胶富集的方法来富集2号染色体完整的P.falciparum虫株(Waterkeyn JG,Cowman AF,CookeBM.Plasmodium falciparum:gelatin enrichment selects for parasites with full-length chromosome 2.Implications for cytoadhesion assays.Exp Parasitol.2001,97(2):115-8.)，其结果如图4(A)-图4(B)所示，可见，富集后的虫株多处于大滋养体期或裂殖体期，利于PEI/DNA复合物颗粒的转染。

按照如下步骤对P.falciparum感染的红细胞(iRBCs)进行通透穿孔实验：首先，将5ml压积为1％的虫血转移到一个无菌的15ml离心管中，在350×g，室温离心5分钟，收集得到约50μl iRBCs。加入1ml经37℃预热过的洗涤用培养基：10.4g/L RPMI 1640，25mMHEPES，100μM次黄嘌呤，12.5μg/ml硫酸庆大霉素，350×g，室温离心5分钟去上清。加入500μl用洗涤用培养基配制的不同浓度的皂素(Sigma-Aldrich,Cat.#S4521)溶液，浓度范围分别是0.001％(wt/v)～0.1％(wt/v)，室温孵育3分钟后，1900×g，室温离心3min去除上清液，再用1ml经37℃预热的P.falciparum完全培养基洗涤一次。经穿孔处理的iRBCs经涂片和显微镜镜检来确定细胞通透的最佳皂素浓度，结果如图5(A)-图5(E)所示，皂素浓度(wt/v,皂素质量/溶液总体积)大于0.03％会导致iRBCs的裂解，不适合用于后续的PEI/DNA复合物颗粒转染。

以最佳皂素浓度通透的iRBCs细胞来完成转染实验，皂素浓度控制在0.03％(wt/v)以下，iRBCs细胞相对完整，很少细胞出现裂解的情况，特别是皂素浓度在0.001％(wt/v)～0.01％(wt/v)之间的浓度最好，在这个浓度范围内，能够最大限度的保持iRBCs的完整性，也就能够保持疟原虫的活性，同时也适用于后续的PEI转染。

转染

首先配制25kD线性聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI,Polysciences,Cat.#23966)工作溶液：将称量好的PEI用加热至80℃的无内毒素的无菌去离子水溶解，冷却至室温，用盐酸调pH值至7.0，将溶液用无内毒素的无菌去离子水定容至所需的浓度1μg/μl，用0.22μm滤膜过滤除菌后分装并储存于-20℃备用。

需要通过计算来确定PEI的胺基氮(N)和质粒DNA磷酸基(P)的摩尔数的比例，以用于瞬时转染的游离表达质粒pPfEps-mCherry为例，其磷酸盐摩尔浓度(P)＝质粒DNA重量(1μg)/(双链质粒DNA的碱基对(6669bp)×DNA碱基对(钠盐)的平均分子量(650g/mol/bp))≈0.23pmol，按氮磷比(N/P)为30来计算，PEI的胺基氮(N)需要6.9pmol，而本发明所使用的PEI(Polysciences,Cat.#23966)含有11％的N-丙酰化的胺基，而PEI的平均分子量约为25,000g/mol，所以需要的PEI的添加量为(6.9pmol/0.11)×25,000g/mol≈1.6μg，也就是需要加入1.6μl的PEI工作溶液(1μg/μl)。发明人验证聚乙烯亚胺中的氨基氮和所述基因序列中的磷酸基的摩尔比(N/P)在1-16000的效果，发现，当N/P为1-16000时都可实现转染，在N/P比在5-100时效果最好。

按照N/P比例为30，依次将1μg DNA和对应量的PEI加入200μl不含有血清的DMEM基本培养基(C11995500BT,Gibco)中，充分混匀后室温孵育20min。在此期间，准备好经过合适浓度的皂素溶液(0.001％～0.05％)通透过的iRBCs。将PEI/DNA复合物与准备好的iRBCs轻柔混匀后转入预先加有7ml经37℃预热的P.falciparum完全培养基的T25培养瓶(Cat.#169900,Thermo Scientific)中，加入适量的经洗涤用培养基润洗的人新鲜红细胞，维持红细胞压积在1％左右。将培养瓶置于37℃的三气培养箱中培养8小时后换液，加入37℃预热的新鲜完全培养基，继续在37℃的三气培养箱中培养。

瞬时转染的虫株在培养过程中不经任何药物筛选。而稳定转染的虫株在转染48小时后在培养基中加入5.0μg/mL blasticidin S(ThermoFisher Scientific,Cat.#R21001)进行筛选，每隔24小时换液一次，直到荧光显微镜观察到明显的阳性虫株后将blasticidinS的浓度降为2.5μg/mL。

实施例4：其他寄生虫的转染

按照与实施例1类似的方式体外培养和同步化巴贝斯虫、人类Colpodella样寄生虫(肾形目寄生虫)、利什曼原虫和锥虫，将与实施例2类似的质粒载体通过实施例3的方式进行转染，发明人发现转染其他寄生虫的效果与疟原虫相当，后续的实验发明人采用疟原虫转染的结果进行说明，在此不作多余的赘述。

实施例5：荧光显微镜实时检测

将P.falciparum转染虫株的iRBCs培养液中按1:1000的比例加入Hoechst33258(Invitrogen,Cat.#H3569)至终浓度为10μg/ml,37℃孵育5分钟，再用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤两次。再将洗涤过的iRBCs涂布到一个低荧光背景的显微玻片上镜检观察。我们的拍照设备选用的是Olympus公司的PLYMPUS IX73型显微镜和100倍的油镜镜头(UPLFLN 100X(OilImmersion)objective lens)。

经鉴定，采用皂素和PEI联合的化学转染法，在72小时以内可以获得瞬时转染的阳性虫株，荧光显微镜检测结果如图6(A)-图6(D)所示，转染效率的统计结果如表1所示；

在2-3周以内，经过5轮药物筛选(自转染后两天开始加入5.0μg/mL blasticidinS筛选，每天换液直到获得阳性虫株)，可以获得稳定转染的阳性虫株，结果如图7(A)-图7(C)。

表1、P.falciparum 3D7体外瞬时转染效率统计

从表1可以看出转染成功率可以达到100％，转染效率在50％以上，但是，单独只用PEI转染我们未能发现任何阳性的虫株出现。

从图6(A)-图6(D)可以看出，报告基因mCherry的融合蛋白表达正常，报告基因的红色荧光确实来自化学转染获得的疟原虫株；从图7(A)-图7(C)可以看出，报告基因GFP的表达正常，报告基因的绿色荧光确实来自化学转染获得的疟原虫株，转染成功率可以达到100％。

实施例6：PCR鉴定

转染后72小时，离心收集瞬时转染的染虫红细胞，并用PBS缓冲溶液(pH7.4)洗涤两次备用。加入5倍体积浓度为0.1％的皂素溶液裂解染虫红细胞。轻柔颠倒混匀室温孵育2分钟。4℃,1900×g离心5分钟收集染虫红细胞裂解后释放的疟原虫和相关的细胞膜碎片。去上清并用3倍体积的PBS缓冲溶液(pH7.4)洗涤三次后备用。采用同样的方法收集野生型P.falciparum和稳定转染的P.falciparum。直接使用疟原虫细胞作为模板进行PCR扩增鉴定。实验方案根据PCR试剂盒说明书(Takara,Cat.#R050Q)的标准方案拟定。PCR检测靶标及引物如表2所示，PCR检测结果如图8和图9所示。

表2 PCR检测靶标及引物列表

从图8可以看出，采用引物对P1/P2检测报告基因mCherry的DNA条带大小为619bp，采用引物对P3/P4检测bsd基因的DNA条带大小为399bp；从图9可以看出，野生型P.falciparum 3D7虫株的PCR产物作为阴性对照组，其扩增片段大小为1390bp；S1,P.falciparum 3D7稳定转染虫株的PCR产物，其扩增片段大小为4293bp，可见，无论是瞬时转染(图8)还是稳定转染(图9)，都获得了阳性的转染虫株。

实施例7：SDS-PAGE蛋白凝胶电泳和Western blot检测

采用以上从iRBCs中分离疟原虫的方法，收集20μl转染后分离的虫株，加入100μl的2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(Takara,Cat.#9173)，重悬后转入一个1.5ml的EP管(Eppendorf tube)中。100℃加热5分钟。待冷却后，13,000×g室温下离心1分钟收集上清液，即得疟原虫总蛋白SDS-PAGE电泳样品。直接取适量样品，采用10％SDS-PAGE凝胶电泳分析或储存于-20℃备用。

在Western blot分析前，首先采用采用10％SDS-PAGE凝胶电泳分离制备好的疟原虫总蛋白样品，采用湿法转印***(Tanon,China)将SDS-PAGE凝胶电泳完成的蛋白条带转印到一张合适大小的PVDF膜(BioRad,Cat.#1620177)上。将转印好的PVDF膜用5％BSA(用TBST缓冲液配制)室温封闭2小时。经冰预冷的TBST缓冲液洗膜3次(每次6分钟)，加入鼠源一抗(Anti-mCherry antibody(用TBST缓冲液经1:1000稀释,Biovision,Cat.#5993)或者Anti-GAPDH antibody(用TBST缓冲液经1:2000稀释,abcam,Cat.#ab125247)，室温孵育1小时。用冰预冷的TBST缓冲液洗膜3次(每次6分钟)后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG H&L二抗用TBST缓冲液经1:5000稀释,abcam,Cat.#ab205719)，室温孵育1小时。用冰预冷的TBST缓冲液洗膜3次(每次6分钟)后加入ECL试剂(Millipore,Cat.#WBKLS0500)，避光条件下室温孵育5分钟，采用化学发光检测仪(Tanon,China)在不同曝光时间下拍照分析Western blot的结果如图10所示。

从图10可以看出，不包括KAHRP信号肽序列，mCherry-‘SA’Linker-Strep tag融合蛋白的预测平均分子量大小为27.9kDa,而持家基因GADPH蛋白的预测平均分子量大小为36kDa，可见，在化学转染的虫株中成功检测到了报告基因的表达。

实施例8：P.falciparum 3D7稳定转染虫株的NanoLuc荧光素酶活性检测

取一个黑色的96孔板(ThermoFisher Scientific,Cat.#07-200-565)，在检测孔中加入100μl无菌的去离子水，分别吸取3μl P.falciparum 3D7稳定转染虫株感染的红细胞(感染率约为10％)加入含有无菌去离子水的检测孔中，充分混匀。按照NanoLuc荧光素酶检测试剂盒(Promega,Cat.#N1110)说明书配制NanoLuc荧光素酶的反应底物，即将底物和酶反应缓冲液按1:50的比例稀释并混合均匀。在含有P.falciparum 3D7感染的红细胞的样品孔中分别加入100μl配制好的NanoLuc荧光素酶的反应底物，室温下反应3分钟后用酶标仪(BioTek Synergy H1)读取化学发光信号(λmax＝460nm)，记录并统计实验结果，如图11所示。

从图11可以看出，P.falciparum 3D7稳定转染虫株的GFP和NanoLuc荧光素酶的融合蛋白表达正常。

实施例9：Triton X-100和PEI配合转染P.falciparum 3D7的实验

与实施例3相比，除了采用Triton X-100，且Triton X-100的质量体积比为0.001％-0.01％之外，其他条件与方法与实施例3相同。

首先，与实施例3一样，经穿孔处理的iRBCs经涂片和显微镜镜检来确定细胞通透的最佳Triton X-100浓度。

结果如图12所示，Triton X-10浓度(wt/v,皂素质量/溶液总体积)大于或等于0.01％会导致iRBCs的裂解，不适合用于后续的PEI/DNA复合物颗粒转染。

以最佳Triton X-100浓度通透的iRBCs细胞来完成转染实验，Triton X-10浓度控制在0.01％(wt/v)以下，iRBCs细胞相对完整，很少细胞出现裂解的情况，特别是皂素浓度在0.001％(wt/v)-0.005％(wt/v)之间的浓度最好，在这个浓度范围内，能够最大限度的保持iRBCs的完整性，也就能够保持疟原虫的活性，同时也适用于后续的PEI转染。

与实施例3一样，采用游离表达质粒pPfEps-mCherry进行瞬时转染，如图13(A)-图13(D)所示，尽管Triton X-100和PEI配合也能够转染P.falciparum3D7，且在转染后72小时内也能观测到阳性虫株，但是后续的观察发现Triton X-100和PEI配合转染寄生虫会对寄生虫产生一定的毒性，造成寄生虫的死亡比例高，约转染后一周以内，所有经Triton X-100处理过的虫株全部死亡。

对比例1

与实施例3相比，除了采用不采用皂素进行细胞通透的步骤，只包含转染的步骤之外，其他条件与方法与实施例3相同。

结果证明，无法将基因序列转入细胞内疟原虫。

对比例2

与实施例3相比，除了采用不采用PEI进行转染，只采用皂素处理后孵育之外，其他条件与方法与实施例3相同。

结果证明，无法将基因序列转入细胞内疟原虫。

综上所述，本发明试剂盒通过聚乙烯亚胺(PEI)以及皂素和/或聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的协同作用，可以实现基因对寄生虫的高效转染，整个过程只需约30min，转染效率可达50％以上，最高可达100％，转染后的虫株无需长时间筛选，最多只需2-3周就可以筛选得到阳性虫株。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种转染细胞内寄生虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括聚乙烯亚胺和皂素；

所述皂素的质量体积比为0.001-0.01%；所述聚乙烯亚胺的分子量为10000-30000；

所述寄生虫为疟原虫、巴贝斯虫、人类Colpodella样寄生虫、利什曼原虫或锥虫中的任意一种或至少两种的组合。

2.一种权利要求1所述的转染细胞内寄生虫的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）采用试剂盒中的皂素处理待转染的寄生虫感染的细胞；所述寄生虫包括疟原虫、巴贝斯虫、人类Colpodella样寄生虫、利什曼原虫或锥虫中的任意一种或至少两种的组合；所述皂素的质量体积比为0.001-0.01%；

（2）向步骤（1）处理后的待转染寄生虫感染的细胞添加转染的基因序列与聚乙烯亚胺的复合物进行孵育转染；所述聚乙烯亚胺中的氨基氮和所述基因序列中的磷酸基的摩尔比为5-100，所述聚乙烯亚胺的分子量为10000-30000；

去除含有转染试剂的培养基，加入新鲜的培养基进行培养，所述培养的温度为30-40℃；所述培养的时间为48 h以上。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述寄生虫为疟原虫。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基因序列为质粒DNA载体、DNA表达框序列或RNA表达框序列中的任意一种或至少两种的组合。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）之前还包括寄生虫的体外培养和同步化的步骤。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为35-38℃。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养的时间为48-96 h。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养采用三气培养箱。