JP7275049B2 - Ｉｌ－２改変体 - Google Patents

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Description

本発明は、ＩＬ－２改変体、該ＩＬ－２改変体の製造方法、該ＩＬ－２改変体を含む組成物および治療剤、ＩＬ－２Ｒαサブユニットに対するＩＬ－２の親和性を向上させる方法、ＩＬ－２Ｒβおよびγサブユニットの少なくともいずれか１つに対するＩＬ－２の親和性を低下させる方法、並びに制御性Ｔ細胞を選択的に活性化させる方法に関する。
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は転写因子Ｆｏｘｐ３（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ Ｐ３）を発現することを特徴とするＣＤ４陽性Ｔ細胞サブセットである。ＴｒｅｇはＩＬ－１０やＴＧＦ－βなど抑制性サイトカインの産生、パーフォリンやグランザイムなど細胞傷害性タンパク質を介した細胞溶解、ＣＴＬＡ－４などを介した抗原提示細胞の機能調節、ＩＬ－２の利用競合による枯渇など多様なメカニズムによってエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の活性化を阻害し、過剰な免疫応答を負に制御している（非特許文献１）。
Ｆｏｘｐ３の変異によるＴｒｅｇの欠損は重篤な全身性の自己免疫反応を呈するＩＰＥＸ（ｉｍｍｕｎｅ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ，ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ，Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ）症候群を発症する。また、複数の自己免疫疾患においてＴｒｅｇの量や質が低下していることから、Ｔｒｅｇを介した免疫制御の破綻が病態発症に寄与していると考えられる（非特許文献２、非特許文献３）。
ＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）は主に活性化Ｔ細胞から産生されるサイトカインであり、様々な免疫細胞の増殖および活性化に寄与する。ヒトにおける成熟体の分子量は約１５ｋＤａ（１３３残基）であり、４つのα－ヘリックスから構成されるｆｏｕｒ－ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ構造を有している（非特許文献４）。
ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）はＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒα）、ＣＤ１２２（ＩＬ－２Ｒβ）、ＣＤ１３２（γｃ）の３つの分子から構成されており、ＩＬ－２に対して中親和性（ＫＤ≒１０－９Ｍ）を示すヘテロダイマー型受容体（ＩＬ－２Ｒβγ）か、高親和性（ＫＤ≒１０－１１Ｍ）を示すヘテロトライマー型受容体（ＩＬ－２Ｒαβγ）が形成された場合にシグナルを伝達する。ＣＤ２５はそれ単体でもＩＬ－２と低親和性（ＫＤ≒１０－８Ｍ）で結合するが、シグナルを伝達することは出来ない（非特許文献５）。
ＩＬ－２Ｒの発現パターンは免疫細胞ごとに異なる。ＣＤ５６ｌｏｗＮＫ細胞やナイーブＴ細胞ではＣＤ２５の発現は非常に低く、ＩＬ－２ＲはＩＬ－２Ｒβγとして機能している。一方、ＴｒｅｇやＣＤ５６ｈｉｇｈＮＫ細胞ではＣＤ２５が発現しており、ＩＬ－２ＲはＩＬ－２Ｒαβγとして機能する（非特許文献６）。
ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαβγの結合では、ＩＬ－２は初めにＣＤ２５に結合した後に、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２と順次結合していくことでＩＬ－２Ｒの三量体化を引き起こす。ＩＬ－２によるＣＤ１２２とＣＤ１３２の二量体化はＣＤ１２２細胞内領域へのＪＡＫ１のリクルートおよびＣＤ１３２細胞内領域へのＪＡＫ３のリクルートを促し、次いでＳＴＡＴ５のリン酸化を引き起こす。リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）は二量体を形成した後に核内に移行し、標的遺伝子の転写を促す（非特許文献７、非特許文献８）。
ＩＬ－２シグナルはＴｒｅｇの恒常性維持において重要な役割を担っている。ＩＬ－２刺激によって生じるｐＳＴＡＴ５は直接的にＦｏｘｐ３の発現を促すことで、Ｔｒｅｇの増殖促進、安定化およびＴｅｆｆの活性化抑制機能を向上させる。Ｔｒｅｇは高親和性受容体であるＩＬ－２Ｒαβγを発現していることに加え、ＩＬ－２シグナルを正に制御するＰｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １（ＰＰ）１およびＰＰ２Ａ活性が高いため、ＩＬ－２刺激によるＴｒｅｇのＳＴＡＴ５のリン酸化やその下流の遺伝子発現は、メモリーＴ細胞のそれよりも１０～１００倍程度低い濃度域で引き起こされる（非特許文献６、非特許文献９）。
ＩＬ－２遺伝子やＩＬ－２Ｒ遺伝子を欠損したマウスでは、Ｔｒｅｇの減少と重篤な自己免疫反応を呈する。ヒトにおいても同様に、ＣＤ２５遺伝子の欠損は自己反応性Ｔ細胞の増殖やＩＰＥＸ症候群と類似の症状を呈する。ＳＬＥ（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）患者やＩ型糖尿病患者では、Ｔ細胞によるＩＬ－２産生能の低下と、それに伴ったＴｒｅｇの減少が認められる（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。
ＩＬ－２シグナルの活性化はＴｒｅｇ機能を増強する。ＳＬＥ様の症状を呈するＭＲＬ／ｌｐｒマウスへのＩＬ－２の投与は、炎症反応を抑制し病態を改善する。また、ＧＶＨＤ（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）患者やＳＬＥ患者へのＩＬ－２の投与はＴｒｅｇの増幅を促し、病態を改善する（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。
しかし、野生型ＩＬ－２の投与はしばしばＮＫ細胞や好酸球の増加を引き起こし、投与部位反応や発熱およびインフルエンザ様症状などを引き起こす。また、ＩＬ－２の血中半減期は約１時間と非常に短いことから、低用量ＩＬ－２療法では、ＩＬ－２を連日投与する必要がある（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６）。
上記の課題解決に向けて、Ｔｒｅｇを選択的に活性化し、且つ血中半減期が延長されたＩＬ－２改変体の創製が試みられている。
ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒαβγ選択性を向上させる試みが行われている。一手法では、ＩＬ－２Ｒβγと相互作用するアミノ酸残基に変異を導入したり、抗ＩＬ－２抗体と免疫複合体を形成させたりする手法が試みられている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、非特許文献１７） 。
しかし、アミノ酸変異の導入は変異に起因した免疫原性増加が生じる。アミノ酸変異を施したヒトＩＬ－２改変体のカニクイザルへの投与は、抗薬物抗体が産生されている。抗ＩＬ－２抗体によるＩＬ－２へのＩＬ－２Ｒαβγ選択性の付与は、ベルシェイプ様の活性となる（特許文献２、特許文献６）。
ＩＬ－２の血中半減期を向上させる試みが行われている。一手法では、抗体由来Ｆｃ 配列を付加する手法が試みられている（特許文献２、特許文献４、特許文献７、非特許文献１８）。他の手法では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非毒性水溶性ポリマーを付加する方法が知られている。（特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、非特許文献１９、非特許文献２０）。また、糖鎖を導入する手法も試みられている（特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４）。
しかし、ＩＬ－２のポリエチレングリコールによる修飾は、生物活性の低下が生じる（非特許文献１９）。
国際公開第２０１０／０８５４９５号 国際公開第２０１４／１５３１１１号 米国特許出願公開第２０１５／０３７４７８８号明細書 米国特許第７１８６８０４号明細書 国際公開第２０１４／０２８７４８号 国際公開第２０１５／１０９２１２号 米国特許出願公開第２０１７／００５１０２９号明細書 国際公開第２０１６／０２５３８５号 日本国特開２０１６－２０２１８７号公報 米国特許第４９０２５０２号明細書 米国特許第５２０６３４４号明細書 米国特許第５１５３３１０号明細書 米国特許第５３１２９０３号明細書 米国特許第５４１７９７０号明細書
Front Immunol, 2013. 4(378) Nat Rev Immunol, 2014. 14(5):343-349 Autoimmun Rev, 2015. 14(2):105-116 Annu Rev Immunol, 2008. 26:453-479 Immunity, 2013. 38(1):13-25 Diabetes, 2015. 64(6):2172-2183 J Biol Chem, 1997. 272(50):31821-31828 Nat Rev Immunol. 2012 Feb 17;12(3):180-90 Nat Rev Immunol. 2015 May;15(5):283-94 Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(7):3168-3171 N Engl J Med, 2011. 365(22):2110-2121 Curr Diab Rep, 2014. 14(12):553 J Immunol, 2014. 193(5):2168-2177 N Engl J Med, 2011. 365(22):2055-2066 Ann Rheum Dis, 2015. 74(4):791-792 Blood. 2014 Dec 4;124(24):3572-6. Curr Pharm Des, 2002. 8(24):2171-83 J Autoimmun, 2015. 56:66-80 American College of Rheumatology Annual Meeting, San Diego, CA, 2017. Poster Abstract 2715: NKTR-358: A Selective, First-in-Class IL-2 Pathway Agonist Which Increases Number and Suppressive Function of Regulatory T Cells for the Treatment of Immune Inflammatory Disorders, Langowski, J., et al. http://www.nektar.com/application/files/6315/1001/4171/NKTR-358_2017ACR_ABS2715.pdf Biotechnology (N Y), 1990. 8(4):343-346
本発明は、ＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が向上し、且つＴｒｅｇを選択的に活性化する新規なＩＬ－２改変体を提供することを目的とする。
上記課題を鋭意検討した結果、本発明者らは、ＩＬ－２に糖鎖またはＰＥＧを結合させることにより改変したＩＬ－２改変体により、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２（以下、ＩＬ－２と略記する）改変体。
（２）糖鎖が結合したＩＬ－２改変体および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合したＩＬ－２改変体である（１）に記載のＩＬ－２改変体。
（３）ＩＬ－２受容体（以下ＩＬ－２Ｒ）αβγに対する選択性が向上している、（１）または（２）に記載のＩＬ－２改変体。
（４）ＩＬ－２のアミノ酸配列における、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３および１３０番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基に糖鎖が結合している、（２）または（３）に記載のＩＬ－２改変体。
（５）糖鎖が下記（式４）～（式８）、（式Ｙ１）、（式Ｙ２）または（式Ｙ３）で表される構造を有する糖鎖より選ばれる少なくとも１つである、（２）～（４）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
Figure 0007275049000001
Figure 0007275049000002
Figure 0007275049000003
Figure 0007275049000004
Figure 0007275049000005
Figure 0007275049000006
Figure 0007275049000007
Figure 0007275049000008
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３および１３０番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されているアミノ酸配列を含む、（２）～（５）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、１２、1５、１６、１９、８８、９１および１１９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されているアミノ酸配列を含む、（２）～（６）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（８）糖鎖が結合したシステイン残基由来の基が、下記（式１）で表される構造を有する、（６）または（７）に記載のＩＬ－２改変体。
Figure 0007275049000009
［（式１）中、Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅは糖鎖示す。］
（９）糖鎖が結合したアスパラギン残基由来の基が、下記（式２）で表される構造を有する、（６）または（７）に記載のＩＬ－２改変体。
Figure 0007275049000010
［（式２）中、Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅは糖鎖を示す。］
（１０）糖鎖が結合したＩＬ－２改変体にさらにＰＥＧが結合したＩＬ－２改変体である、（２）～（９）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（１１）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、１、３、５１および７８番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含む、（２）～（１０）のいずれか1に記載のＩＬ－２改変体。
（１２）IＬ－２のアミノ酸配列における、４、５、６、７、８、６０、７８、７９、９９、１００、１０１および１２９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基にＰＥＧが結合している、（２）または（３）に記載のＩＬ－２改変体。
（１３）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、４、５、６、７、８、６０、７８、７９、９９、１００、１０１および１２９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含む、（２）、（３）および（１２）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（１４）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における４、５、８、７８および１２９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合しているアミノ酸残基に置換されている、（２）、（３）、（１２）および（１３）のいずれか1に記載のＩＬ－２改変体。
（１５）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における４、５、８、７８および１２９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合しているアミノ酸残基に置換されている、（２）、（３）、（１２）～（１４）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（１６）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、４、５および８番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基、ならびに、７８番目または１２９番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合しているアミノ酸残基に置換されている、（２），（３）、（１２）～（１５）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（１７）ＰＥＧが結合したアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合した非天然アミノ酸残基である、（２）、（３）、（１２）～（１６）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（１８）ＰＥＧが結合した非天然アミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したチオール基（－ＳＨ）を有するアミノ酸残基由来の基、またはＰＥＧが結合したアジド基を有するアミノ酸残基由来の基である、（１７）に記載のＩＬ－２改変体。
（１９）ＰＥＧが結合した非天然アミノ酸残基が、Ｎ６－［｛（ｏ－ａｚｉｄｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｙ｝ｃａｒｂｏｎｙｌ］－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ）残基由来の基、Ｎ６－［｛（ｍ－ａｚｉｄｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｙ｝ｃａｒｂｏｎｙｌ］－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ）残基由来の基またはシステイン残基由来の基である、（１７）または（１８）に記載のＩＬ－２改変体。
（２０）ＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Lｙｓ残基由来の基が、下記（式１１）および/または（式１２）で表される構造を有する、（１９）に記載のＩＬ－２改変体。
Figure 0007275049000011
Figure 0007275049000012
（２１）ＰＥＧが結合したｍ－Ａｚ－Ｚ－Lｙｓ残基由来の基が、下記（式Ｘ４）および/または（式Ｘ５）で表される構造を有する、（１９）に記載のＩＬ－２改変体。
Figure 0007275049000013
Figure 0007275049000014
（２２）ＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基が、下記（式Ｘ１１）および/または（式Ｘ１２）および/または（式Ｘ１３）で表される構造を有する、（１９）に記載のＩＬ－２改変体。
Figure 0007275049000015
Figure 0007275049000016
Figure 0007275049000017
（２３）ＰＥＧが直鎖状である、（２）、（１０）～（２２）いずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（２４）ＰＥＧが分岐状である、（２）、（１０）～（２２）いずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（２５）ＰＥＧが、平均分子量１０ｋＤａ以上のＰＥＧである、（２）、（１０）～（２４）いずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（２６）結合しているＰＥＧが、平均分子量１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａまたは８０ｋＤａのＰＥＧである（２）、（１０）～（２５）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（２７）結合しているＰＥＧが、下記（式１３）、（式１４）、（式１５）、（式１６）、（式Ｘ７）、（式Ｘ８）、（式Ｘ９）、（式Ｘ１０）、（式Ｘ１１）、（式Ｘ１３）、（式Ｘ１４）または（式Ｘ１５）の少なくとも１つの式で表される構造を有する、（２）、（１０）～（２６）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
Figure 0007275049000018
Figure 0007275049000019
Figure 0007275049000020
Figure 0007275049000021
Figure 0007275049000022
Figure 0007275049000023
Figure 0007275049000024
Figure 0007275049000025
Figure 0007275049000026
Figure 0007275049000027
Figure 0007275049000028
Figure 0007275049000029
（２８）ＩＬ－２のＮ末端にさらにメチオニン残基が結合している、（１）～（２７）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（２９）ＩＬ－２のＮ末端のアラニンが欠損している、（１）～（２８）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体。
（３０）ＩＬ－２のＮ末端のアラニンが欠損し、さらにメチオニンが結合している、（１）～（２９）に記載のＩＬ－２改変体。
（３１）（１）～（３０）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体の製造方法。
（３２）（１）～（３０）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体を含む組成物。
（３３）（１）～（３０）のいずれか１に記載のＩＬ－２改変体を含む、免疫疾患の治療剤。
（３４）ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性を向上させる方法。
（３５）ＩＬ－２に糖鎖および／またはＰＥＧを結合させることを含む、（３４）に記載の方法。
（３６）ＩＬ－２のアミノ酸配列における、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３および１３０番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基に、糖鎖を結合させることを含む、（３５）に記載の方法。
（３７）糖鎖が、下記（式４）～（式８）、（式Ｙ１）、（式Ｙ２）または（式Ｙ３）で表される構造を有する糖鎖より選ばれる少なくとも１つである、（３５）または（３６）に記載の方法。
Figure 0007275049000030
Figure 0007275049000031
Figure 0007275049000032
Figure 0007275049000033
Figure 0007275049000034
Figure 0007275049000035
Figure 0007275049000036

Figure 0007275049000037
（３８）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列を含むＩＬ－２において、該アミノ酸配列の１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３および１３０番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基を、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換することを含む、（３５）～（３７）のいずれか１に記載の方法。
（３９）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、１２、1５、１６、１９、８８、９１および１１９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換することを含む、（３５）～（３８）のいずれか１に記載の方法。
（４０）糖鎖が結合したシステイン残基由来の基が、下記（式１）で表される構造を有する、（３８）または（３９）に記載の方法。
Figure 0007275049000038
［（式１）中、Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅは糖鎖示す。］
（４１）糖鎖が結合したアスパラギン残基由来の基が、下記（式２）で表される構造を有する、（３８）または（３９）に記載の方法。
Figure 0007275049000039
［（式２）中、Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅは糖鎖を示す。］
（４２）糖鎖が結合したＩＬ－２改変体にさらにＰＥＧを結合させることを含む（３５）～（４１）のいずれか１に記載の方法。
（４３）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、１、３、５１および７８番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含む、（４２）に記載の方法。
（４４）ＩＬ－２のアミノ酸配列における、４、５、６、７、８、６０、７８、７９、９９、１００、１０１および１２９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基にＰＥＧが結合している、（３５）に記載の方法。
（４５）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、４、５、６、７、８、６０、７８、７９、９９、１００、１０１および１２９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含む、（３５）または（４４）に記載の方法。
（４６）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における４、５、８、７８および１２９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合しているアミノ酸残基に置換されている、（３５）、（４４）および（４５）のいずれか１に記載の方法。
（４７）配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における４、５、８、７８および１２９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合しているアミノ酸残基に置換されている、（３５）、（４４）～（４６）のいずれか１に記載の方法。
（４８）ＰＥＧが結合したアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合した非天然アミノ酸残基である、（３５）、（４２）～（４７）のいずれか１に記載の方法。
（４９）ＰＥＧが結合した非天然アミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したチオール基（－ＳＨ）を有するアミノ酸残基由来の基、またはＰＥＧが結合したアジド基を有するアミノ酸残基由来の基である、（４８）に記載の方法。
（５０）ＰＥＧが結合した非天然アミノ酸残基が、Ｎ６－［｛（ｏ－ａｚｉｄｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｙ｝ｃａｒｂｏｎｙｌ］－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ）残基由来の基、Ｎ６－［｛（ｍ－ａｚｉｄｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｙ｝ｃａｒｂｏｎｙｌ］－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ）残基由来の基またはシステイン残基由来の基である、（４８）または（４９）に記載の方法。
（５１）ＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Lｙｓ残基由来の基が、下記（式１１）および/または（式１２）で表される構造を有する、（５０）に記載の方法。
Figure 0007275049000040
Figure 0007275049000041
（５２）ＰＥＧが結合したｍ－Ａｚ－Ｚ－Lｙｓ残基由来の基が、下記（式Ｘ４）および/または（式Ｘ５）で表される構造を有する、（５０）に記載の方法。
Figure 0007275049000042
Figure 0007275049000043
（５３）ＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基が、下記（式Ｘ１１）および/または（式Ｘ１２）および/または（式Ｘ１３）で表される構造を有する、（５０）に記載の方法。
Figure 0007275049000044
Figure 0007275049000045
Figure 0007275049000046
（５４）ＰＥＧが直鎖状である、（３５）、（４２）～（５３）のいずれか１に記載の方法。
（５５）ＰＥＧが分岐状である、（３５）、（４２）～（５３）のいずれか１に記載の方法。
（５６）ＰＥＧが、平均分子量１０ｋＤａ以上のＰＥＧである、（３５）、（４２）～（５５）のいずれか１に記載の方法。
（５７）ＰＥＧが、平均分子量１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａまたは８０ｋＤａのＰＥＧである（３５）、（４２）～（５６）のいずれか１に記載の方法。
（５８）結合しているＰＥＧが、下記（式１３）、（式１４）、（式１５）、（式１６）、(式Ｘ７)、（式Ｘ８）、（式Ｘ９）、（式Ｘ１０）、（式Ｘ１１）、（式Ｘ１３）、（式Ｘ１４）または（式Ｘ１５）の少なくとも１つの式で表される構造を有する、（３５）、（４２）～（５７）のいずれか１に記載の方法。
Figure 0007275049000047
Figure 0007275049000048
Figure 0007275049000049
Figure 0007275049000050
Figure 0007275049000051
Figure 0007275049000052
Figure 0007275049000053
Figure 0007275049000054
Figure 0007275049000055
Figure 0007275049000056
Figure 0007275049000057
Figure 0007275049000058
（５９）ＩＬ－２のＮ末端にさらにメチオニン残基が結合している、（３４）～（５８）のいずれか１に記載の方法。
（６０）ＩＬ－２のＮ末端のアラニンが欠損している、（３４）～（５９）のいずれか１に記載の方法。
（６１）ＩＬ－２のＮ末端のアラニンが欠損し、さらにメチオニンが結合している、（３４）～（６０）のいずれか１に記載の方法。
（６２）制御性Ｔ細胞を選択的に活性化させる方法。
（６３）ＩＬ－２Ｒβおよびγサブユニットの少なくとも一方に対するＩＬ－２の親和性を低下させる方法。
（６４）ＩＬ－２Ｒαサブユニットに対するＩＬ－２の親和性を向上させる方法。
本発明のＩＬ－２改変体は、Ｔｒｅｇに高発現しているＩＬ－２Ｒαβγに選択的に結合してＴｒｅｇを選択的に活性化する。本発明によれば、ＩＬ－２改変体、該ＩＬ－２改変体の製造方法、該ＩＬ－２改変体を含む組成物および免疫疾患の治療剤、ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒαβγへの選択性を増加させる方法、ＩＬ－２Ｒαサブユニットに対するＩＬ－２の親和性を向上させる方法、ＩＬ－２Ｒβおよびγサブユニットの少なくともいずれか１つに対するＩＬ－２の親和性を低下させる方法、並びに制御性Ｔ細胞を選択的に活性化させる方法を提供することができる。
図１Ａは各種糖鎖結合ＩＬ－２改変体のＴｒｅｇ増殖促進活性を示す図である。黒丸はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社製ＩＬ－２［以下、ＩＬ－２（Ｐ）と記載］、黒三角はＨ１６Ｃ－２、黒四角はＬ１９Ｃ－９、黒横棒はＮ８８Ｃ－２の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図１Ｂは各種糖鎖結合ＩＬ－２改変体のＴｒｅｇ増殖促進活性を示す図である。黒丸はＥ１５Ｃ－１１、黒三角はＬ１９Ｃ－１１＊、黒四角はＬ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、黒ひし形はＶ９１Ｃ－１１／Ｖ１１５Ｃ－１１、黒横棒はＶ９１Ｃ－１１／Ｎ１１９Ｃ－１１、白丸はＡ１Ｃ－１１／Ｔ３Ｃ－１１／Ｓ５Ｃ－１１／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図１Ｃは各種Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体のＴｒｅｇ増殖促進活性を示す図である。黒丸はＡ１Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、黒三角はＴ３Ｃ－Ｌｉ２０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、黒四角はＴ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、黒ひし形はＴ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｅ１５Ｃ－１１、黒棒はＴ３Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）／Ｅ１５Ｃ－１１、白丸はＴ３Ｃ－Ｖ８０（Ｍａｌ）／Ｅ１５Ｃ－１１、白三角はＦ７８Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図１Ｄは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＴｒｅｇ増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－ＩＬ－２、黒三角は８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図１Ｅは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＴｒｅｇ増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒三角は８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｓ６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒ひし形は８Ｈｉｓ－Ｔ７（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒横棒は８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図１Ｆは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＴｒｅｇ増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－Ｅ６０（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒三角は８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｒ８１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒ひし形は８Ｈｉｓ－Ｌ９４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図１Ｇは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＴｒｅｇ増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒三角は８Ｈｉｓ－Ｅ１００（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｔ１０１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒ひし形は８Ｈｉｓ－Ｑ１２６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図１Ｈは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＴｒｅｇ増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、黒三角は８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、黒ひし形は８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、黒棒は８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、白丸は８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、白三角はＩ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、白四角はＩ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ８０、白ひし形はＩ１２９Ｃ－Ｖ４０（Ｍａｌ）の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図１Ｉは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＴｒｅｇ増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒三角はＳ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒ひし形はＳ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、黒棒は８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、白丸はＫ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、白三角は８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、白四角は８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、白ひし形は８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図１Ｊは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＴｒｅｇ増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒三角は８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒ひし形は８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒棒は８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図２Ａは各種糖鎖結合ＩＬ－２改変体のＮＫ細胞増殖促進活性を示す図である。黒ひし形はＩＬ－２（Ｐ）、黒四角はＨ１６Ｃ－２、黒三角はＬ１９Ｃ－９、黒丸はＮ８８Ｃ－２の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図２Ｂは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＮＫ細胞増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－ＩＬ－２、黒三角は８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図２Ｃは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＮＫ細胞増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒三角は８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｓ６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒ひし形は８Ｈｉｓ－Ｔ７（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒横棒は８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図２Ｄは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＮＫ細胞増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒三角は８Ｈｉｓ－Ｅ１００（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｔ１０１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒ひし形は８Ｈｉｓ－Ｑ１２６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図２Ｅは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＮＫ細胞増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－Ｅ６０（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒三角は８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｒ８１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、黒ひし形は８Ｈｉｓ－Ｌ９４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図２Ｆは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＮＫ細胞増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、黒三角は８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、黒ひし形は８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、黒横棒は８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、白丸は８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、白三角はＩ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ８０、白四角はＩ１２９Ｃ－Ｖ４０（Ｍａｌ）の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図２Ｇは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＮＫ細胞増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒三角はＳ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒ひし形はＳ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、黒横棒は８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、白丸はＫ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図２Ｈは各種糖鎖結合ＩＬ－２改変体および各種Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体のＮＫ細胞増殖促進活性を示す図である。黒丸はＬ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、黒三角はＡ１Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、黒四角はＴ３Ｃ－Ｌｉ２０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、黒ひし形はＴ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、黒棒はＴ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｅ１５Ｃ－１１、白丸はＴ３Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）／Ｅ１５Ｃ－１１、白三角はＴ３Ｃ－Ｖ８０（Ｍａｌ）／Ｅ１５Ｃ－１１、白四角はＦ７８Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図２Ｉは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＮＫ細胞増殖促進活性を示す図である。黒丸はＩＬ－２（Ｐ）、黒三角はＩ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒ひし形は８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒棒は８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図２Ｉは各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のＮＫ細胞増殖促進活性を示す図である。黒丸は８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒三角は８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒四角は８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒ひし形は８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、黒棒は８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図２Ｋは各種糖鎖結合ＩＬ－２改変体のＮＫ細胞増殖促進活性を示す図である。黒丸はＥ１５Ｃ－１１、黒三角はＬ１９Ｃ－１１＊、黒四角はＶ９１Ｃ－１１／Ｖ１１５Ｃ－１１、黒ひし形はＶ９１Ｃ－１１／Ｎ１１９Ｃ－１１、黒棒はＡ１Ｃ－１１／Ｔ３Ｃ－１１／Ｓ５Ｃ－１１／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１の活性を示す。横軸にＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にＩＬ－２依存性細胞増殖率（％）を記す。 図３は未刺激Ｔｒｅｇ又は各種ＩＬ－２改変体刺激Ｔｒｅｇ共存下でのレスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）の増殖率を示す図である。図３（Ａ）はＣＤ４陽性Ｔｒｅｓｐの増殖率、図３（Ｂ）はＣＤ８陽性Ｔｒｅｓｐの増殖率である。いずれの図も横軸にＴｒｅｓｐとＴｒｅｇの存在比、縦軸にＴｒｅｓｐの増殖率（％）を記す。白ひし形は未刺激、黒ひし形はＩＬ－２（Ｐ）、黒四角はＨ１６Ｃ－２、黒三角はＬ１９Ｃ－９、黒丸はＮ８８Ｃ－２を示す。 図４（Ａ）－図４（Ｅ）は自己血漿で再構成したヒトＰＢＭＣに各種ＩＬ－２改変体を添加し培養した際の培養上清中のサイトカイン濃度を示す図である。図４（Ａ）はＩＬ－４濃度、図４（Ｂ）はＩＬ－６濃度、図４（Ｃ）はＩＬ－１０濃度、図４（Ｄ）はＩＦＮγ濃度および図４（Ｅ）はＴＮＦα濃度である。いずれの図も横軸に添加したＩＬ－２濃度（ｐＭ）、縦軸にサイトカイン産生量（ｐｇ／ｍＬ）を記す。図４（Ｆ）はＴｒｅｇ選択的増殖活性を評価した結果を示す図である。縦軸に、ＣＤ４陽性画分のうち、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３ｈｉｇｈ画分をＴｒｅｇ、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３ｌｏｗ画分をエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）とした時の、その比［Ｔｒｅｇ（％）／Ｔｅｆｆ（％）］を示した。横軸に、添加したＩＬ－２濃度を示す。いずれの図も、白ひし形は未刺激、黒ひし形はＩＬ－２（Ｐ）、黒四角はＨ１６Ｃ－２、黒三角はＬ１９Ｃ－９、黒丸はＮ８８Ｃ－２を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
「Ｔｒｅｇ」または「Ｔｒｅｇ細胞」とは、制御性Ｔ細胞を示す。制御性Ｔ細胞とは、他の免疫細胞の活性を抑制するＴ細胞のクラスであり、フローサイトメトリーを使用して、細胞マーカー表現型であるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋により規定される。
ＦＯＸＰ３は、細胞内タンパク質であり、染色のために、細胞の固定と透過処理を必要とすることから、生存するＴｒｅｇを規定するためには、細胞表面表現型である、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗを使用することができる。
Ｔｒｅｇはまた、ｔＴｒｅｇ（胸腺由来）およびｐＴｒｅｇ（末梢由来であり、末梢のナイーブＴ細胞から分化させた）など、多様なＴｒｅｇサブクラスも含む。全てのＴｒｅｇは、ＩＬ－２Ｒαβγを発現し、ＩＬ－２依存的に増殖するが、本発明のＩＬ－２改変体は、少なくとも１のＴｒｅｇサブクラスを選択的に活性化することができ、好ましくはいずれのサブクラスも選択的に活性化し得る。
「ＩＬ－２」とは、野生型ＩＬ－２、ＩＬ－２改変体いずれの場合もある。
「野生型ＩＬ－２」とは、下記１）～３）のＩＬ－２いずれのものも含む。
１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるヒト由来野生型成熟ＩＬ－２。
２）上記１）の遺伝子組換え体を作製する際に加え得るアミノ酸改変を有するＩＬ－２。
３）上記１）および上記２）のＩＬ－２のＮ末端のアミノ酸残基が欠失したＩＬ－２。
上記２）のアミノ酸改変とは、例えば大腸菌でＩＬ－２を発現させるために配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端に開始コドンによってコードされるメチオニン残基を結合させる改変や、大腸菌でＩＬ－２を発現させ、かつ簡便に精製するために配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端に、ＭＨＨＨＨＨＨＨＨで表されるアミノ酸配列（メチオニンが結合したポリヒスチジン）を結合させる改変や、ＩＬ－２の物性を高めるためにヒト由来野生型成熟ＩＬ－２の１２５番目のアミノ酸残基をアラニン残基またはセリン残基に置換する改変等が挙げられる。
上記３）のＩＬ－２のＮ末端のアミノ酸残基が欠失したＩＬ－２とは、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端のアラニン残基、またはアラニン残基およびプロリン残基が欠失したアミノ酸配列を有するＩＬ－２等が挙げられる。
野生型ＩＬ－２は、具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が結合したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端にＭＨＨＨＨＨＨＨＨで表されるアミノ酸配列が結合したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端のアラニン残基が欠失したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端のアラニン残基が欠失し、かつメチオニンが結合したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端のアラニン残基およびプロリン残基が欠失したアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が結合したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端にＭＨＨＨＨＨＨＨＨで表されるアミノ酸配列が結合したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端のアラニン残基が欠失したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端のアラニン残基が欠失し、かつメチオニンが結合したアミノ酸配列、もしくは配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端のアラニン残基およびプロリン残基が欠失したアミノ酸配列において、１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基もしくはアラニン残基に置換したアミノ酸配列を有するＩＬ－２が挙げられる。上述、Ｎ末端側のアミノ酸配列及び配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のセリン残基は、ＩＬ－２の活性に影響を与えることなく、タンパク質発現またはタンパク質安定性の観点から許容されるアミノ酸配列のバリエーションであり、本発明のＩＬ－２改変体においても本アミノ酸配列のバリエーションが含まれる。
なお、本発明において記載されるＩＬ－２のアミノ酸残基の番号は、いずれも配列番号１で表されるＩＬ－２のアミノ酸配列を基準とした時のアミノ酸残基の番号（位置）を示す。従って、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端のアラニン残基が１番目、プロリン残基が２番目、Ｎ末端に結合したメチオニン残基は－１番目として定義される。
「ＩＬ－２改変体」とは、野生型ＩＬ－２に何らかの改変を加えて作製された、野生型ＩＬ－２の機能を有する全てのタンパク質を含む。改変体としては、例えばアミノ酸改変（例えば、置換、欠失、付加など）により野生型ＩＬ－２が改変されたＩＬ－２改変体、糖鎖修飾により野生型ＩＬ－２が改変されたＩＬ－２改変体、化学修飾により野生型ＩＬ－２が改変されたＩＬ－２改変体などが挙げられる。上記の改変は、自然に生じる改変および人為的な改変のいずれの改変も含む。
「野生型ＩＬ－２の機能」とは、ＩＬ－２Ｒαβγへの結合、ＩＬ－２Ｒβγへの結合、ＣＤ１２２およびＣＤ１３２の細胞内領域を介した細胞内シグナル伝達経路の活性化、ＪＡＫ１のリン酸化、ＪＡＫ３のリン酸化、ＳＴＡＴ５のリン酸化、ＳＴＡＴ３のリン酸化、ＰＩ３Ｋのリン酸化、ＭＥＫのリン酸化、Ｆｏｘｐ３発現促進、Ｆｏｘｐ３により転写が制御されている遺伝子群の発現促進、Ｆｏｘｐ３遺伝子のＴＳＤＲ （Ｔｒｅｇ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ）領域のＤＮＡ脱メチル化促進、ＩＬ－２Ｒβγを発現する免疫細胞の増殖および生存促進、ＩＬ－２Ｒβγを発現する免疫細胞のサイトカイン産生促進、ＩＬ－２Ｒαβγを発現する免疫細胞の増殖および生存促進、ＩＬ－２Ｒαβγを発現する免疫細胞のサイトカイン産生促進、Ｔｒｅｇ増殖および生存促進、ならびにＴｒｅｇのＴｅｆｆ活性化抑制能の向上から選ばれる少なくとも１つの機能を示す。
本発明のＩＬ－２改変体の一態様としては、ＩＬ－２の所定の領域に糖鎖が結合したＩＬ－２改変体、およびＩＬ－２の所定の領域にＰＥＧが結合したＩＬ－２改変体、およびＩＬ－２の所定の領域に糖鎖およびＰＥＧが結合したＩＬ－２改変体が挙げられる。結合としては、例えば、共有結合、非共有結合などが挙げられるが、結合様式は問わない。
「アミノ酸残基」は天然アミノ酸残基と非天然アミノ酸残基のいずれの場合もある。
「天然アミノ酸残基」とは、セレノシステイン残基、及び以下の20種のα-アミノ酸残基：アラニン残基、アスパラギン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン残基、グルタミン酸残基、グリシン残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、リジン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、バリン残基、又はシステイン残基が挙げられる。天然アミノ酸残基はL体とD体の両方を含み、ヒトにおいてはL体のほうが好ましい。
「非天然アミノ酸残基」とは、天然アミノ酸残基以外の全てのアミノ酸残基をいう。非天然アミノ酸残基としては、例えば、天然アミノ酸残基を修飾したアミノ酸残基、人工的にデザインされたアミノ酸残基が挙げられる。
「修飾」とは、化学修飾、翻訳後修飾など、あらゆる修飾を含む。
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、ＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が向上しているＩＬ－２改変体が挙げられる。ＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が向上しているＩＬ－２改変体により、ＩＬ－２Ｒαβγを発現しているＴｒｅｇを選択的に活性化させることができる。
「ＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性」とは、ＩＬ－２がＩＬ－２ＲβγよりもＩＬ－２Ｒαβγに選択的に結合する性質をいう。また、「ＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が向上している」とは、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２改変体のＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が向上していることをいう。
ＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性、またはＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が向上していることは、例えば以下に記載する方法で判断することができる。
（１）各種ＩＬ－２について、ＩＬ－２Ｒαβγに対する結合活性のＥＣ５０値と、ＩＬ－２Ｒβγに対する結合活性のＥＣ５０値を測定する。ＩＬ－２ＲαβγのＥＣ５０がＩＬ－２ＲβγのＥＣ５０よりも小さい、またはＥＣ５０ｒａｔｉｏ値（ＩＬ－２Ｒβγ ＥＣ５０／ＩＬ－２Ｒαβγ ＥＣ５０）が１より大きければ、当該ＩＬ－２はＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性があると判断できる。
また、野生型ＩＬ－２のＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値よりもＩＬ－２改変体のＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値が大きい、または標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値（ＩＬ－２改変体のＥＣ５０ｒａｔｉｏ値／野生型ＩＬ－２のＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値）が１より大きい場合、当該ＩＬ－２改変体はＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が向上していると判断できる。標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値は、１より大きい、５以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上の順で好ましい。野生型ＩＬ－２の代わりに、野生型ＩＬ－２と同等のＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値を有するＩＬ－２改変体を使用してもよい。
ＥＣ５０値の測定方法としては、具体的には例えば、下記（Ａ）～（Ｃ）に示す手順による方法が挙げられる。より具体的な方法としては、実施例において後述する方法が挙げられる。
（Ａ）哺乳動物細胞にヒトＩＬ－２Ｒαβγ、又はヒトＩＬ－２Ｒβγを発現させて、ヒトＩＬ－２依存性生存細胞株を作製し、各細胞株を９６穴プレートに播種する。
（Ｂ）コントロールのＩＬ－２を１０００ｎｇ／ｍｌで添加したウェルのｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｕｎｉｔｓ（ＲＬＵ）値を１００％、ＩＬ－２を含まない培地を添加したウェルのＲＬＵ値を０％として、被験物質であるＩＬ－２改変体のＩＬ－２依存性細胞増殖率を算出する。
（Ｃ）（Ａ）で得られたデータを元に統計解析ソフト（例えば、ＩＢＤＳ社製ＸＬｆｉｔ５ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．３．１．３）を用いてＥＣ５０値を算出する。
（２）野生型ＩＬ－２とＩＬ－２改変体のそれぞれで、ＩＬ－２Ｒ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）－Ｆｃ融合タンパク質であるＣＤ２５ＥＣＤ－Ｆｃ、ＩＬ－２ＲβγＥＣＤ－Ｆｃに対する親和性をＢｉａｃｏｒｅで測定する。野生型よりもＩＬ－２改変体で、ＣＤ２５ＥＣＤ－ＦｃのＫＤ値が小さい、および／またはＩＬ－２ＲβγＥＣＤ－ＦｃのＫＤ値が大きいとき、当該ＩＬ－２改変体はＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が向上していると判断することができる。また、ＣＤ２５ＥＣＤ－ＦｃのＫＤ値に対するＩＬ－２ＲβγＥＣＤ－ＦｃのＫＤ値の相対値が、野生型よりもＩＬ－２改変体で増加しているとき、当該ＩＬ－２改変体はＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が向上していると判断することもできる。
「Ｔｒｅｇを選択的に活性化させる」とは、下記（ａ）～（ｃ）の少なくともいずれか一つをいう。
（ａ）野生型ＩＬ－２よりもＩＬ－２改変体のＴｒｅｇ増殖活性が高い、および／またはＮＫ細胞増殖活性が低い。
（ｂ）野生型ＩＬ－２よりもＩＬ－２改変体で、細胞集団中のエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の割合に対するＴｒｅｇの割合の比［Ｔｒｅｇ（％）／Ｔｅｆｆ（％）］が高い。
（ｃ）野生型ＩＬ－２よりもＩＬ－２改変体で炎症性サイトカインの産生量が低下している、および／または抗炎症性サイトカインの産生量が増加している。
上記（ａ）～（ｃ）のいずれの場合も、野生型ＩＬ－２の代わりに野生型ＩＬ－２と同等の活性を有するＩＬ－２改変体を使用してもよい。
Ｔｒｅｇ増殖活性、およびＮＫ細胞増殖活性は、例えば以下に記載する方法で測定することができる。ＴｒｅｇまたはＮＫ細胞を９６穴プレートに播種し、コントロールのＩＬ－２を添加したウェルのＲＬＵ値を１００％、ＩＬ－２を含まない培地を添加したウェルのＲＬＵ値を０％として、被験物質であるＩＬ－２改変体のＴｒｅｇまたはＮＫ細胞増殖率を算出する。より具体的な方法としては、実施例において後述する方法が挙げられる。
Ｔｒｅｇ（％）／Ｔｅｆｆ（％）は、例えば、以下に記載する方法で測定することができる。ヒト末梢血単核細胞（以下、ＰＢＭＣとも略す）を自己血漿に懸濁し、そこに抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を添加して９６穴プレートに播種後、各種ＩＬ－２を添加して培養する。得られたヒトＰＢＭＣと、蛍光標識抗ヒトＣＤ４抗体、蛍光標識ＣＤ２５抗体、蛍光標識抗Ｆｏｘｐ３抗体と反応させた後、フローサイトメーター（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ）にて各種蛍光強度を測定する。
得られたデータを、データ解析ソフト（例えば、ＴｒｅｅＳｔａｒ社製ＦＬｏｗＪｏ、ｖｅｒｓｉｏｎ７．６．５）を用いて解析し、ＣＤ４陽性画分の中で、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３ｈｉｇｈ画分をＴｒｅｇ、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３ｌｏｗ画分をエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）として、その存在比［Ｔｒｅｇ（％）／Ｔｅｆｆ（％）］を算出する。より具体的な方法としては、実施例において後述する方法が挙げられる。
各種サイトカインの産生量は、例えば、以下に記載する方法で測定することができる。ヒトＰＢＭＣを自己血漿に懸濁し、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を添加して９６穴プレートに播種後、各種ＩＬ－２を添加して培養し、上清中のサイトカイン産生量を定量する。より具体的な方法としては、実施例において後述する方法が挙げられる。
本発明のＩＬ－２改変体の一態様としては、ＩＬ－２に糖鎖が結合することにより改変されたＩＬ－２改変体（以下、糖鎖結合ＩＬ－２改変体とも略す。）、ＩＬ－２にＰＥＧが結合することにより改変されたＩＬ－２改変体（以下、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体とも略す。）が挙げられる。以下、各改変体について説明する。
［糖鎖結合ＩＬ－２改変体］
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、ＩＬ－２のアミノ酸配列における１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３および１３０番目のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基に糖鎖が結合しているＩＬ－２改変体が好ましい。
本明細書において、「糖鎖」とは、単糖または２以上の単糖がグリコシド結合という結合を介して結合したものをいい、いずれの糖鎖を用いることもできる。
ＩＬ－２に結合する糖鎖としては、具体的には例えば、下記（式４）～（式８）および（式Ｙ１）～（式Ｙ３）で表される構造を有する糖鎖からなる群より選ばれる少なくとも１が挙げられる。ＩＬ－２のアミノ酸配列における前記アミノ酸残基に該糖鎖を結合させることにより、ＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性を向上させることができる。また、（式６）のα１－６アーム、α１－３アームのＭａｎｎｏｓｅ（Ｍａｎ）のそれぞれにＮ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（ＧｌｃＮＡｃ）が１つ結合した糖鎖、（式７）のα１－６アーム、α１－３アームのＭａｎ－ＧｌｃＮＡｃのそれぞれからＧａｌａｃｔｏｓｅ（Ｇａｌ）が１つ除かれた糖鎖（Ｇ１）、（式８）の非還元末端のＳｉａｌｉｃ ａｃｉｄ（Ｓｉａｌ）が１つ除かれた糖鎖、および（式Ｙ３）の非還元末端のＳｉａｌが１～４個除かれた糖鎖も本発明のＩＬ－２改変体の糖鎖に用いることができる。
Figure 0007275049000059
Figure 0007275049000060
Figure 0007275049000061
Figure 0007275049000062
Figure 0007275049000063
Figure 0007275049000064
Figure 0007275049000065
Figure 0007275049000066
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３および１３０番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されているアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体が好ましく、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における、１２、１３、1５、１６、１９、８８、９１および１１９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されているアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体がより好ましい。
本実施形態においては、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基またはアラニン残基に置換したアミノ酸配列がより好ましい。
システイン残基またはアスパラギン残基由来の基とは、それぞれシステイン残基の側鎖チオールまたはアスパラギン残基の側鎖アミドが修飾されている基をいう。
糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基とは、システイン残基の側鎖チオールまたはアスパラギン残基の側鎖アミドに化学修飾により糖鎖が結合した基をいう。システイン残基またはアスパラギン残基由来の基は、リンカー等により修飾されていてもよく、リンカーを介してシステイン残基またはアスパラギン残基と糖鎖とが結合していてもよい。
糖鎖が結合したシステイン残基由来の基としては、例えば、下記（式１）に示すように、システイン残基の側鎖チオールにＣＨ２ＣＯＮＨリンカーを介して糖鎖が結合した構造を有するアミノ酸残基が挙げられる。システイン残基の側鎖チオールと糖鎖とは、リンカーを介さずに結合していてもよい。
Figure 0007275049000067
上記（式１）中、Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅは糖鎖を示す。
糖鎖が結合したアスパラギン残基由来の基としては、例えば、下記（式２）に示すように、アスパラギン残基の側鎖アミドに化学修飾により糖鎖が結合した構造が挙げられる。アスパラギン残基の側鎖アミドと糖鎖とは、リンカーを介して結合していてもよい。
Figure 0007275049000068
上記（式２）中、Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅは糖鎖を示す。
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、例えば野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３および１３０番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体が挙げられる。
野生型ＩＬ－２に糖鎖が１つ結合したＩＬ－２改変体の例としては、以下に記載する物が挙げられる。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１１番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１３番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１５番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１６番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１８番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１９番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、２０番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８４番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８７番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８８番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９１番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９２番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１０８番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１１５番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１１９番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２２番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２３番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１３０番目のアミノ酸残基が、糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されている、ＩＬ－２改変体。
上記ＩＬ－２改変体において、結合している糖鎖はいずれの糖鎖であってもよいが、例えば（式４）、（式５）、（式６）、（式７）、（式８）または（式Ｙ３）で示される構造を持つ糖鎖が挙げられる。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式７）または（式８）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１３番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）または（式８）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１５番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）、（式８）または（式Ｙ３）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１６番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）、（式５）、（式６）または（式７）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１８番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）または（式８）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）、（式７）、（式８）、または（式Ｙ３）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、２０番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）または（式８）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８４番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８７番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）または（式８）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８８番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）、（式７）または（式８）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）、（式７）または（式８）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９２番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１０８番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）または（式７）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１１５番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）または（式７）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２２番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２３番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１３０番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）または（式７）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
本発明の一実施形態としては、野生型ＩＬ－２に少なくとも２つの糖鎖を結合させたＩＬ－２改変体も挙げられる。野生型ＩＬ－２に２つの糖鎖を結合させた例としては、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における１、３、４、５、８、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、２３、３２、３８、５１、７６、８４、８７、８８、９１、９２、１００、１０２、１０４、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３、１２７および１３０番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも２つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されたアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体が挙げられる。
野生型ＩＬ－２に糖鎖が２つ結合したＩＬ－２改変体の例としては、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における１、３、４、５、８、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、２３、３２、３８、５１、７６、８４、８７、８８、９１、９２、１００、１０２、１０４、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３、１２７および１３０番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる１つのアミノ酸残基、および、１１、１２、１８、２０、８４、８７、８８、９１、１０８、１１５、１１９、１２２および１２３番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる１つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されているアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体が好ましい。
本発明の具体的なＩＬ－２改変体の一実施形態としては、以下に示すものが挙げられる。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８番目および１９番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および１６番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１５番目および１１９番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１９番目および２３番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および９１番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および１１５番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および１１９番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１３番目および９１番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１３番目および１１５番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１３番目および１１９番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１９番目および１１５番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９１番目および１１５番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９１番目および１１９番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
上記ＩＬ－２改変体において、結合している糖鎖はいずれの糖鎖であってもよいが、例えば（式４）または（式８）で示される構造を持つ糖鎖が挙げられる。
また、本発明の具体的なＩＬ－２改変体の一実施形態としては、以下に示すものも挙げられる。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８番目および１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および1６番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ１２番目に結合する（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であり、かつ１６番目に結合する（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）であり、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１５番目および１１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１９番目および２３番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および９１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および１１５番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および１１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１３番目および９１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１３番目および１１５番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１３番目および１１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１９番目および１１５番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９１番目および１１５番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９１番目および１１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
本発明の一実施形態としては、野生型ＩＬ－２に少なくとも３つ糖鎖を結合させたＩＬ－２改変体も挙げられる。野生型ＩＬ－２に３つの糖鎖を結合させた例としては、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における１，３，４、５、８、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、２３、３２、３８、５１、７６、８４、８７、８８、９１、９２、１００、１０２、１０４、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３、１２７および１３０番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも３つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されたアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体が挙げられる。
また、野生型ＩＬ－２に糖鎖が３つ結合した例としては、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における１、３、４、５、８、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、２３、３２、３８、５１、７６、８４、８７、８８、９１、９２、１００、１０２、１０４、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３、１２７および１３０番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基と、１１、１２、１８、２０、８４、８７、８８、９１、１０８、１１５、１１９、１２２および１２３番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されているアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体がより好ましい。
本発明の一実施形態としては、野生型ＩＬ－２に少なくとも４つ糖鎖を結合させたＩＬ－２改変体も挙げられる。野生型ＩＬ－２に４つの糖鎖を結合させた例としては、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における１、３、４、５、８、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、２３、３２、３８、５１、７６、８４、８７、８８、９１、９２、１００、１０２、１０４、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３、１２７および１３０番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも４つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されたアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体が挙げられる。
また、野生型ＩＬ－２に糖鎖が４つ結合した例としては、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における１、３、４、５、８、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、２３、３２、３８、５１、７６、８４、８７、８８、９１、９２、１００、１０２、１０４、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３、１２７および１３０番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基と、１１、１２、１８、２０、８４、８７、８８、９１、１０８、１１５、１１９、１２２および１２３番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されているアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体がより好ましい。
本発明の一実施形態としては、野生型ＩＬ－２に少なくとも５つ糖鎖を結合させたＩＬ－２改変体も挙げられる。野生型ＩＬ－２に５つの糖鎖を結合させた例としては、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における１、３、４、５、８、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、２３、３２、３８、５１、７６、８４、８７、８８、９１、９２、１００、１０２、１０４、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３、１２７および１３０番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる５つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されたアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体が挙げられる。
また、野生型ＩＬ－２に糖鎖が５つ結合した例としては、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における１、３、４、５、８、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、２３、３２、３８、５１、７６、８４、８７、８８、９１、９２、１００、１０２、１０４、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３、１２７および１３０番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基と、１、３、５、１２、３２、５１、７６、９１、１００、１０２および１０４番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されているアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体がより好ましい。
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、以下に示すものが挙げられる。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、３番目、１２番目、３２番目、７６番目および９１番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１番目、３番目、５番目、１２番目および９１番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、３番目、１２番目、５１番目、９１番目および１００番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、３番目、１２番目、７６番目、９１番目および１００番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目、９１番目、１００番目、１０２番目および１０４番目のアミノ酸残基が、それぞれ糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
上記ＩＬ－２改変体において、結合している糖鎖はいずれの糖鎖でもよいが、例えば（式８）で示される構造を持つ糖鎖が挙げられる。
また、本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、以下に示すものも挙げられる。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、３番目、１２番目、３２番目、７６番目および９１番目のアミノ酸残基が、（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１番目、３番目、５番目、１２番目および９１番目のアミノ酸残基が、（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、３番目、１２番目、５１番目、９１番目および１００番目のアミノ酸残基が、（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、３番目、１２番目、７６番目、９１番目および１００番目のアミノ酸残基が、（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目、９１番目、１００番目、１０２番目および１０４番目のアミノ酸残基が、（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）であるＩＬ－２改変体。
本実施形態においては、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基またはアラニン残基に置換したアミノ酸配列がより好ましい。
［糖鎖結合ＩＬ－２改変体の製造方法］
糖鎖結合ＩＬ－２改変体の製造方法としては、糖鎖結合ペプチドを化学合成した後にフォールディングさせる手法（化学合成法）、または野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における糖鎖導入位置のアミノ酸残基を糖鎖が結合し得るアミノ酸残基へと置換したＩＬ－２改変体を大腸菌などの宿主細胞により発現させた後に、糖鎖が結合し得るアミノ酸残基へ糖鎖を結合させる方法（発現法）が挙げられる。
本明細書において「ペプチド」とは、複数のアミノ酸残基がペプチド結合を介して鎖状につながったものをいう。特に記載のない場合は、各アミノ酸残基の側鎖には保護基を含んでいてもよく、Ｎ末端のアミノ基、Ｃ末端のカルボキシル基が修飾されていてもよい。
糖鎖結合ＩＬ－２改変体は、化学合成法および発現法の組み合わせによって製造されてもよい。以下、各方法について説明する。
（化学合成法による糖鎖結合ＩＬ－２改変体の製造）
化学合成法においては、少なくとも一つ以上の糖鎖結合ペプチドフラグメントとペプチドフラグメントとを順次連結させた後にフォールディングさせることにより糖鎖結合ＩＬ－２改変体を製造することが好ましい。
連結させるペプチドフラグメントと糖鎖結合ペプチドフラグメントの総数として、好ましくは２～１５個のフラグメント、より好ましくは２～５個のフラグメントを用いることが好ましい。糖鎖結合ペプチドフラグメントおよびペプチドフラグメントはチオエステル化し、糖鎖結合ペプチドチオエステルおよびペプチドチオエステルとして連結させてもよい。
ペプチドフラグメント、ペプチドチオエステルを合成する方法としては、例えば、ペプチド合成で常用される方法［例えば、第５版 実験化学講座１６ 有機化合物の合成ＩＶ：カルボン酸・アミノ酸・ペプチド（日本化学会編、丸善株式会社、２００５年）、Chemical Ligation: Tools for Biomolecule Synthesis and Modification（Luca D. DiAndreaら著、Wiley、2017年）等に記載の方法］が挙げられる。
この際、ペプチドの溶解性を向上させるなどのために、２アミノ酸の代わりにシュードプロリン（J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 9218-9227）またはイソペプチド（Angew. Chem. Int. Ed., 2015, 54, 8226-8230）を使用することも出来る。
また、ペプチドフラグメント、ペプチドチオエステルを合成する方法としては、例えば、ペプチド固相合成法の代わりに高橋らによって開発されたＡｊｉｐｈａｓｅ技術（Tetrahedron Lett., 2012, 53, 1936.）、および岡田らによって開発されたＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｈｉｖｉｎｇ技術（J. Org. Chem., 2013, 78, 320-327）などの液相合成法が挙げられる。
また、ペプチドフラグメントを合成する方法としては、例えば、従来公知の方法に従い、例えば、ポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切断、オリゴヌクレオチドの調製、ＤＮＡのライゲーション、ｍＲＮＡの単離、適切な宿主細胞へのＤＮＡの導入による形質転換体の取得、形質転換体の培養を含む組換えＤＮＡ法により製造する方法、または無細胞タンパク質発現法（Current Opinion in Biotechnology 2002, 13:297-303）などに記載の方法が挙げられる。ペプチドチオエステルを合成する方法としては、例えば、（Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:6705-6710）などに記載の方法が挙げられる。
ペプチドフラグメント、ペプチドチオエステルなどに糖鎖を結合させる方法としては、例えば、ペプチドフラグメントのシステイン残基の側鎖チオールに糖鎖を結合させる場合、特許第４６０７０１７号公報などに記載の方法が挙げられる。また、例えば、ペプチドフラグメントのアスパラギン残基の側鎖アミドに糖鎖を結合させる場合、特許第４１１９４２８号公報などに記載の方法が挙げられる。また、糖鎖の製造方法としては、例えば、国際公開第０３／００８４３１号に記載の方法などが挙げられる。
ペプチドフラグメントおよび／または糖鎖結合ペプチドフラグメントを連結する方法としては、ペプチド合成で常用される方法［例えば、第５版 実験化学講座１６ 有機化合物の合成ＩＶ：カルボン酸・アミノ酸・ペプチド（日本化学会編、丸善株式会社、２００５年）、Chemical Ligation: Tools for Biomolecule Synthesis and Modification（Luca D. DiAndreaら著、Wiley、2017年）、Chemoselective and Bioorthogonal Ligation Reactions Volume 1、 2（W.Russ Algarら著、Wiley、2017年）等に記載の方法］が挙げられ、Ｃ末端をチオエステルとしたペプチドフラグメントと、Ｎ末端がシステイン残基である別のペプチドフラグメントとのネイティブケミカルライゲーション（ＮＣＬ）法が好ましい。
ペプチドフラグメントおよび／または糖鎖結合ペプチドフラグメントの連結は任意の箇所で行うことができるが、ＮＣＬ法を用いる場合には、Ｃ末端側ペプチドフラグメントのＮ末端アミノ酸残基としてはシステイン残基およびアラニン残基が好ましく、より好ましくはシステイン残基である。
ペプチドフラグメントおよび／または糖鎖結合ペプチドフラグメントを連結する方法としては、具体的には例えば、Ｃ末端側フラグメントのＮ末端アミノ酸残基としてアラニン残基を用いる場合には、定法［Chemical Ligation: Tools for Biomolecule Synthesis and Modification（Luca D. DiAndreaら著、Wiley、2017年）等に記載の方法］に従い、アラニン残基をシステインへ残基と置換したＣ末端側ペプチドフラグメントとＮ末端側ペプチドチオエステルフラグメントとをＮＣＬ法により連結した後に脱硫反応によりシステイン残基をアラニンへ残基と変換する方法が挙げられる。
糖鎖結合ペプチドをフォールディングする方法としては、例えば、ペプチドのフォールディングで常用される方法［例えば、第５版 実験化学講座１６ 有機化合物の合成IV：カルボン酸・アミノ酸・ペプチド（日本化学会編、丸善株式会社、２００５年）、Chemical Ligation: Tools for Biomolecule Synthesis and Modification（Luca D. DiAndreaら著、Wiley、2017年）等に記載の方法］が挙げられる。
（発現法による糖鎖結合ＩＬ－２改変体の製造）
発現法においては、糖鎖結合ＩＬ－２改変体は、従来公知の方法に従い、例えば、ポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切断、オリゴヌクレオチドの調製、ＤＮＡのライゲーション、ｍＲＮＡの単離、適切な宿主細胞へのＤＮＡの導入による形質転換体の取得、形質転換体の培養を含む組換えＤＮＡ法、および化学修飾による糖鎖導入により製造できる。
糖鎖結合ＩＬ－２改変体は、例えば、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、糖鎖が結合し得るアミノ酸残基を含むように変異が導入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む発現カセットを適切な発現ベクターに組み込み、宿主細胞に該発現ベクターを導入して、得られたタンパク質に化学修飾で糖鎖を結合させることにより、糖鎖結合ＩＬ－２改変体を得ることができる。
上記発現ベクターの作製に用いる野生型ＩＬ－２をコードする塩基配列としては、ＮＣＢＩアクセションＮｏ．ＮＭ＿０００５８６で表される塩基配列からシグナル配列をコードする塩基配列を除いた塩基配列、配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードする塩基配列などが挙げられる。
ＩＬ－２をコードする塩基配列は、人工遺伝子合成や、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）など遺伝子バンクに登録された配列から適当なプライマーを設計し、当該動物の細胞または組織等から抽出したｍＲＮＡよりＲＴ－ＰＣＲを行うことにより取得できる。
また、糖鎖結合ＩＬ－２改変体は、上記発現ベクターを目的の糖鎖を生合成できる宿主細胞に導入することにより、得ることもできる。
前記発現ベクターは、具体的には例えば、前記変異が導入されたＩＬ－２をコードする塩基配列を所望の位置（例えば、５’末端）に組み込んだ発現に適したベクター中のプロモーターの下流に連結することにより、発現ベクターを得ることができる。当該発現ベクターは、宿主に合わせて分泌シグナルを有していてもよい。
糖鎖が結合し得るアミノ酸残基を含むように野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列に部位特異的に変異を導入する方法としては、公知の方法を用いることができる（米国特許出願公開２００４／０１７１１５４号明細書；Storici et al, 2001, Nature Biotechnology, 19, p.773-776：Kren et al, 1998, Nat. Med., vol.4, p.285-290；Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. News lett., Vol. 43, p.15-16）。また、部位特異的な変異の導入には、市販のキットを用いてもよい。
具体的には、例えば、糖鎖が結合し得るアミノ酸残基としてシステイン残基を用いる場合、野生型ＩＬ－２のアミノ酸残基をシステイン残基に置換したＩＬ－２改変体は、米国特許第５２０６３４４号明細書、国際公開第２０１６／０２５３８５号等に記載の方法に従い調製することが出来、該ＩＬ－２改変体への糖鎖の結合は、特許第４６０７０１７号公報に記載の方法に従い行うことができる。
ＩＬ－２をコードする塩基配列を含む領域は、５’末端に翻訳開始コドンを有し、また、３’末端には翻訳終始コドンを有していてもよい。また、ＩＬ－２をコードする塩基配列を発現させるには、その上流にプロモーターを接続することが好ましい。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応したプロモーターであれば特に制限されない。形質転換する宿主が枯草菌である場合は、例えば、ＳＰ０１、ＳＰ０２およびＰｅｎＰプロモーターが挙げられる。宿主が酵母である場合は、例えば、ＰＨ０５、ＰＧＫ、ＧＡＰおよびＡＤＨプロモーターが挙げられる。宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター等が挙げられる。宿主が動物細胞である場合は、例えば、ＳＶ４０由来のプロモーターおよびレトロウイルスのプロモーターが挙げられる。
ＩＬ－２タンパク質はＥ．ｃｏｌｉ内でシグナル配列を伴わずに発現させることもでき、該タンパク質は、封入体から回収し、活性形態へとリフォールディングさせることができる。このような発現系は米国特許第７１０５６５３号明細書に記載されている。
シグナル配列を使用して、ＩＬ－２タンパク質の発現を容易にすることもできる。哺乳動物細胞のシグナル配列としては、例えば、天然ヒトＩＬ－２シグナル配列、ＴＣＲコード配列と相同なシグナル配列、マウスＩＬ－２コード配列と相同なシグナル配列が挙げられる。また、他の適切なシグナル配列／宿主細胞対としては、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ内で分泌させるためのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓａｃＢシグナル配列、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓによる分泌のためのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α接合因子シグナル配列、またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酸ホスファターゼｐｈｏＩシグナル配列を含む。シグナル配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位をコードする配列を介して、タンパク質コード配列へと直接接続することもでき、短いヌクレオチド架橋を介して接続することもできる。
真核生物タンパク質発現系の転写および翻訳を増強するためのエレメントを用いてもよく、例えば、異種プロモーターの両側１０００ｂｐの位置に、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターを置くことにより、植物細胞内の転写レベルを、１０～４００倍高めることができる。
宿主細胞としては、特に限定されず、原核細胞および真核細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｕｓなどの原核細胞、並びにＨＥＫ、Ｊ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２－Ｏ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＫＢ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３、臍帯静脈内皮細胞等の動物細胞およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ ｒｉｓ等の酵母株およびＳｆ９またはＴｎ等などの昆虫細胞が挙げられる。
宿主細胞は、目的の糖鎖の生合成ができるように改変されたものであってもよい。
宿主の形質転換は、それぞれの宿主について一般的に行われている方法または適応可能な方法であればよい。例えば、宿主が大腸菌や酵母であれば、リチウム法などで作製したコンピテント細胞に組み換えＤＮＡを含む発現ベクターを温度ショック法またはエレクトロポレーション法により導入する。宿主が動物細胞であれば、増殖期等の細胞に組み換えＤＮＡを含む発現ベクターをリン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法により導入する。
このようにして得られた形質転換体は、それぞれの宿主に一般的に用いられている培地、あるいは適用可能な培養液を用いて培養してタンパク質を発現させ、必要に応じてさらに化学修飾で糖鎖を結合させることにより、糖鎖結合型ＩＬ－２タンパク質を製造することができる。培養液としては、例えば、宿主が大腸菌である場合はLB培地などの培養液、宿主が酵母である場合はＹＰＤ培地などの培養液、宿主が動物細胞である場合はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＭＥＭにウシ胎児血清を加えた培養液が挙げられる。
培養は、それぞれの宿主について一般的に用いられている条件あるいは適用可能な条件であればよい。例えば、宿主が酵母であれば、約２５～３７℃にて約１２時間～２週間培養を行い、必要により、通気や撹拌を加えることができる。宿主が動物細胞の場合は、３７℃にて、５％炭酸ガス、１００％湿度の条件で約２４時間～２週間培養を行い、必要により、気相の条件を変化または撹拌してもよい。
［ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体］
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、ＩＬ－２のアミノ酸配列における、４、５、６、７、８、６０、７８、７９、９９、１００、１０１および１２９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基にＰＥＧが結合している改変体が好ましく、７８および１２９番目の少なくとも一方のアミノ酸残基にＰＥＧが結合しているＩＬ－２改変体がより好ましい。
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における、４、５、６、７、８、６０、７８、７９、９９、１００、１０１および１２９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体が好ましく、７８および１２９番目の少なくとも一方のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体がより好ましい。
本実施形態において、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が結合したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端アラニン残基が欠損したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端アラニン残基が欠損しメチオニン残基が結合したアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が結合したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端アラニン残基が欠損したアミノ酸配列、および配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端アラニン残基が欠損しメチオニン残基が結合したアミノ酸配列において、１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基またはアラニン残基に置換したアミノ酸配列がより好ましい。
「ＰＥＧ」とは、「－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－」（ｎは２以上）で表されるエチレングリコールが重合した構造を含む水溶性ポリマーである、ポリ（エチレングリコール）分子である。ＰＥＧとしては、ＰＥＧ４、平均分子量１０ｋＤａ以上のものが好ましく、例えば、平均分子量１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ，１００ｋＤａ，２００ｋＤａ等が挙げられるが、特に限定されない。またＰＥＧの形状としては、直鎖状でもよいし、分岐鎖状でもよいが、これらに限定されない。ＩＬ－２のアミノ酸配列における前記アミノ酸残基にＰＥＧを化学的に結合させることにより、ＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性を向上させることができる。ＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性を向上させたＩＬ－２改変体により、Ｔｒｅｇを選択的に活性化させることができる。
ＰＥＧが結合したアミノ酸残基としては、例えばＰＥＧが結合したシステイン残基および非天然アミノ酸残基が挙げられる。
ＰＥＧが結合した非天然アミノ酸残基としては、例えば、ＰＥＧが結合したチオール基を有するアミノ酸残基由来の基並びにＰＥＧが結合したアジド基を有するアミノ酸残基由来の基が挙げられる。チオール基を有するアミノ酸残基としては、具体的には例えば、アセチルシステイン、ホモシステインなどが挙げられるが、これらに限定されない。アジド基を有するアミノ酸残基としては、具体的には例えば、ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基、ｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基、Ｎ６－ジアゾリジン、ｐ－アジドフェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。非天然アミノ酸残基としては、他に、国際公開第２０１７／０３０１５６号、[Nature. 2017 Nov 29;551(7682):644-647.]、国際公開第２０１３／０６８８７４号、米国出願公開第２０１４／００４６０３０号明細書、[Bioconj. Chem., 2014, 25 (2), pp 351-361]、国際公開第２０１４／０４４８７２号、[Bioconj. Chem. 2015 Nov 18;26(11):2249-60]、国際公開第２０１４／１２４２５８号、[Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28;108(26):10437-42]等に記載される非天然アミノ酸残基でもよい。ＰＥＧと上記非天然アミノ酸残基とは、リンカーを介して結合していてもよい。当該リンカーはＰＥＧや非天然アミノ酸残基の種類に応じて適宜変更することができる。
前記ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基は、下記（式１０）で表される構造を有するアミノ酸残基である。
Figure 0007275049000069
前記ｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基は、下記（式ＸＸ１）で表される構造を有するアミノ酸残基である。
Figure 0007275049000070
ＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基またはＰＥＧが結合したｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基とは、ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基またはｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓのアジド基にアセチレンを反応させてできたリンカーを介して、ＰＥＧが結合した構造が挙げられる。アセチレンとしては、例えば、Ｄｉｂｅｎｚｙｌｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ（ＤＢＣＯ）、Ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎｙｎｅ（ＢＣＮ）等が挙げられる。また、アセチレンの代わりに、[J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, pp 8820]、[Org. Lett. 2000, 2, pp2141]、[Org. Lett. 2000, 2, pp1939.]等に記載の方法に従い、アミド結合を介して、ＰＥＧが結合した構造等が挙げられるが、これらに限定されない。
ＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基またはｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基は、具体的には例えば、下記（式１１）および／または（式１２）、または下記（式Ｙ４）および／または（式Ｙ５）で表される構造が挙げられる。
Figure 0007275049000071
Figure 0007275049000072
Figure 0007275049000073
Figure 0007275049000074
式中ＰＥＧとしては、ＰＥＧの平均分子量や構造により多様なＰＥＧを用いることができる。具体的には例えば、下記（式１３）、平均分子量２０ｋＤａである場合の下記式（１４）、平均分子量３０ｋＤａである場合の下記式（１４）、平均分子量４０ｋＤａである場合の下記（式Ｘ０）、平均分子量５０ｋＤａである場合の下記（式１５）、平均分子量４０ｋＤａである場合の下記（式１６）、平均分子量８０ｋＤａである場合の下記（式１６）、平均分子量４０ｋＤａである場合の下記（式Ｘ１）、平均分子量８０ｋＤａである場合の下記（式Ｘ２）または平均分子量４０ｋＤａである場合の下記（式Ｘ３）で表される構造が挙げられるが、これらに限定されない。また、式中ＰＥＧが下記（式Ｘ３）で表される場合、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ３の４分岐鎖に限らず、２分岐鎖または３分岐鎖のものも同様に用いることができる。
Figure 0007275049000075
Figure 0007275049000076
Figure 0007275049000077
Figure 0007275049000078
Figure 0007275049000079
Figure 0007275049000080
Figure 0007275049000081
Figure 0007275049000082
ＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基とは、具体的には例えば、システイン残基のチオール基にマレイミドを反応させてできたリンカーを介してＰＥＧが結合した下記（式Ｙ６）および／または（式Ｙ７）および／または（式Ｙ８）で表される構造、システイン残基のチオール基にハロアセチル基を反応させてできたリンカーを介してＰＥＧが結合した下記（式Ｙ９）で表される構造などが挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 0007275049000083
Figure 0007275049000084
Figure 0007275049000085
Figure 0007275049000086
式中ＰＥＧとは、具体的には例えば、平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ７）または平均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ７）または平均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ８）で表される構造が挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 0007275049000087
Figure 0007275049000088
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、以下に記載するＩＬ－２改変体が好ましい。
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、例えばＩＬ－２に１つのＰＥＧが結合した、以下に記載するＩＬ－２改変体が挙げられる。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、４番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、５番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、６番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、６０番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７８番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７９番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９９番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１００番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１０１番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２９番目のアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
上記のＩＬ－２改変体において、結合するＰＥＧの大きさとしては、平均分子量２０ｋＤａ以上のＰＥＧが好ましく、例えば平均分子量２０、３０、４０、５０、６０、７０、または８０ｋＤａのＰＥＧが挙げられる。
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、例えばＩＬ－２に１つのＰＥＧが結合した、以下に記載するＩＬ－２改変体も挙げられる。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、４番目のアミノ酸残基が、平均分子量２０ｋＤａまたは平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、５番目のアミノ酸残基が、平均分子量２０ｋＤａまたは平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、６番目のアミノ酸残基が、平均分子量２０ｋＤａまたは平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７番目のアミノ酸残基が、平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８番目のアミノ酸残基が、平均分子量２０ｋＤａまたは平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、６０番目のアミノ酸残基が、平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７８番目のアミノ酸残基に平均分子量２０ｋＤａまたは平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）、平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ０）、平均分子量５０ｋＤａである場合の（式１５）、平均分子量４０ｋＤａまたは８０ｋＤａである場合の（式１６）、平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１）、平均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ２）または平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ３）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７９番目のアミノ酸残基が、平均分子量２０ｋＤａまたは平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９９番目のアミノ酸残基が、平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１００番目のアミノ酸残基が、平均分子量２０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１０１番目のアミノ酸残基が、平均分子量２０ｋＤａまたは平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２９番目のアミノ酸残基に（式１３）、あるいは平均分子量２０ｋＤａまたは平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）、平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ０）、平均分子量４０ｋＤａまたは８０ｋＤａである場合の（式１６）、平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１）、平均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ２）、平均分子量５０ｋＤａである場合の（式１５）または平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ３）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２９番目のアミノ酸残基が、４０ｋＤａである場合の（式１６）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２９番目のアミノ酸残基が、平均分子量４０ｋＤａまたは８０ｋＤａである場合の（式Ｘ７）および/または（式Ｘ８）で表されるＰＥＧが結合したしステイン残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、ＩＬ－２に少なくとも２つのＰＥＧが結合した以下に記載するＩＬ－２改変体が好ましい。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、４番目および７８番目のアミノ酸残基が、それぞれＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、５番目および７８番目のアミノ酸残基が、それぞれＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８番目および７８番目のアミノ酸残基が、それぞれＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７８番目および７９番目のアミノ酸残基が、それぞれＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７８番目および９９番目のアミノ酸残基が、それぞれＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７８番目および１２９番目のアミノ酸残基が、それぞれＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、４番目および１２９番目のアミノ酸残基が、それぞれＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、５番目および１２９番目のアミノ酸残基が、それぞれＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８番目および１２９番目のアミノ酸残基が、それぞれＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７９番目および１２９番目のアミノ酸残基が、それぞれＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９９番目および１２９番目のアミノ酸残基が、それぞれＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されたＩＬ－２改変体。
上記のＩＬ－２改変体において、結合するＰＥＧの大きさとしては、平均分子量２０ｋＤａ以上のＰＥＧが好ましく、例えば平均分子量２０、３０、４０、５０、６０、７０、もしくは８０ｋＤａのＰＥＧが挙げられる。
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、ＩＬ－２に少なくとも２つのＰＥＧが結合した、以下に記載するＩＬ－２改変体も好ましい。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、４番目および７８番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、４番目および７８番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ０）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、４番目および７８番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量５０ｋＤａである場合の（式１５）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、５番目および７８番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、５番目および７８番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ０）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８番目および７８番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）、平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ０）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７８番目および７９番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７８番目および９９番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７８番目および１２９番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、４番目および１２９番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）、平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ０）または平均分子量５０ｋＤａである場合の（式１５）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、５番目および１２９番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）、平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ０）または平均分子量５０ｋＤａである場合の（式１５）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、８番目および１２９番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）、平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ０）または平均分子量５０ｋＤａである場合の（式１５）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、７９番目および１２９番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９９番目および１２９番目のアミノ酸残基が、それぞれ平均分子量３０ｋＤａである場合の（式１４）で表されるＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基に置換されたＩＬ－２改変体。
本実施形態において、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が結合したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端アラニン残基が欠損したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端アラニン残基が欠損しかつメチオニン残基が結合したアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が結合したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端アラニン残基が欠損したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端アラニン残基が欠損しかつメチオニン残基が結合したアミノ酸配列において、１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基またはアラニン残基に置換したアミノ酸配列が好ましい。
［ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体の製造法］
ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体の製造方法としては、化学合成法と発現法が挙げられる。ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体は、化学合成法および発現法の組み合わせによって製造されてもよい。以下、各方法について説明する。
（化学合成法によるＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体の製造）
化学合成法によるＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体の製造方法としては、例えば、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列におけるＰＥＧ導入位置のアミノ酸残基をタンパク質の部位特異的なＰＥＧ化を可能とする化学的反応性を有するアミノ酸残基へと置換したペプチドを化学合成した後に、フォールディングさせて得られるＩＬ－２改変体に対し、ＰＥＧを結合させてＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体を製造する手法、およびＰＥＧ結合ペプチドフラグメントを化学合成した後にフォールディングさせることによりＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体を製造する方法が挙げられる。
ＰＥＧ結合ペプチドフラグメントは、ペプチドフラグメントにおけるタンパク質の部位特異的なＰＥＧ化を可能とする化学的反応性を有するアミノ酸残基へＰＥＧを導入する方法により製造することができる。
ＰＥＧ結合ペプチドフラグメントを化学合成した後にフォールディングさせる方法としては、少なくとも一つ以上のＰＥＧ結合ペプチドフラグメントとペプチドフラグメントを順次連結させた後にフォールディングする方法、または化学合成したＩＬ－２全長ペプチドフラグメントに対してＰＥＧを導入した後にフォールディングさせる方法等が挙げられる。
ペプチドフラグメントを合成する方法、およびペプチドフラグメントを順次連結させた後にフォールディングさせる方法としては、例えば、（化学合成法による糖鎖結合ＩＬ－２改変体の製造）の項において上記した方法と同様の方法が挙げられる。
野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列におけるＰＥＧ導入位置のアミノ酸残基をタンパク質の部位特異的なＰＥＧ化を可能とする化学的反応性を有するアミノ酸残基へと置換したペプチドを合成したのち、フォールディングにより得られるＩＬ－２改変体に対し、ＰＥＧを導入する方法としては、例えば、米国特許第５２０６３４４号明細書、国際公開第２０１２／０６５０８６号に記載の方法が挙げられる。また、ペプチドフラグメントにおけるタンパク質の部位特異的なＰＥＧ化を可能とする化学的反応性を有するアミノ酸残基へＰＥＧを導入する方法としては[Biomaterials 22 (2001) 405-417］、［Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 25831-25864］、［J. Pharm. Sci., 105 (2016) 460-475］に記載の方法が挙げられる。
タンパク質の部位特異的なＰＥＧ化を可能とする化学的反応性を有するアミノ酸残基としては、例えば、チオール基を有するアミノ酸残基並びにアジド基を有するアミノ酸残基が挙げられる。チオール基を有するアミノ酸残基としては、例えば、システイン、アセチルシステイン、ホモシステインなどが挙げられるが、これらに限定されない。
アジド基を有するアミノ酸残基としては、例えば、ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基、ｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基、Ｎ６－アジドリジン、ｐ－アジドフェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。他には、国際公開第２０１７／０３０１５６号、[Nature. 2017 Nov 29;551(7682):644-647.]、国際公開第２０１３／０６８８７４号、米国特許出願公開第２０１４／００４６０３０号明細書、[Bioconj. Chem., 2014, 25 (2), pp351-361]、国際公開第２０１４／０４４８７２号、[Bioconj. Chem. 2015 Nov 18;26(11):2249-60]、国際公開第２０１４／１２４２５８号、[Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28;108(26):10437-42]に記載される非天然アミノ酸残基でもよい。ＰＥＧと上記非天然アミノ酸残基とは、リンカーを介して結合していてもよい。
上記リンカーとは、炭素数１～２０の炭化水素基であり、炭素が酸素、窒素、硫黄などで修飾されていてもよく、また炭素が酸素、窒素、硫黄に置換されていてもよい。当該リンカーはＰＥＧや非天然アミノ酸残基の種類に応じて適宜変更することができる。
化学合成法としては、具体的には例えば、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列におけるＰＥＧ導入位置のアミノ酸残基を、システインなどチオール基を有するアミノ酸残基および／またはｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基などアジド基を有するアミノ酸残基へと置換したペプチドを化学合成したのち、フォールディングにより得られるＩＬ－２改変体に対し、ＰＥＧを導入してＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体を製造する方法が挙げられる。システイン残基を導入したＩＬ－２改変体にＰＥＧを結合させる方法としては、米国特許第５２０６３４４号明細書に記載の方法などが挙げられる。
また、具体的には例えば、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列におけるＰＥＧ導入位置のアミノ酸残基を、システインまたは非天然アミノ酸残基へと置換したペプチドを化学合成したのち、フォールディングにより得られるＩＬ－２改変体に対し、ＰＥＧを導入してＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体を製造する方法が挙げられる。
ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体の合成には、下記（式ＸＸ２）で表すＰＥＧ試薬を用いることができる。
Figure 0007275049000089
式中、Ｘは、チオール基と反応性を有する官能基、アジド基と反応性を有する官能基、Ｎ末端アミノ基と選択的に反応する官能基を示す。
チオールと反応性を有する官能基としては、具体的には例えば、チオール基、マレイミド基、アクリル基、ヨードアセチル基、ブロモアセチル基、クロロアセチル基などが挙げられ、好ましくはヨードアセチル基、マレイミド基が良い。
アジドと反応性を有する官能基としては、具体的には例えば、アセチレン基、ＤＢＣＯ基、ＤＢＮ基、中員環構造上にヘテロ原子を含むシクロアルキン（Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54,1190-1194)、チオエステル基などが挙げられ、好ましくはＤＢＣＯが挙げられる。
Ｎ末端アミノ基と選択的に反応する官能基としては、具体的には例えばアルデヒドなどが挙げられる。
式中、Ｌｉｎｋｅｒとしては、炭素数１～２０の炭化水素基であり、炭素が酸素、窒素、硫黄などで修飾されていてもよく、炭素が酸素、窒素、硫黄に置換されていてもよい。
式中、ｎは０または１を表す。
式中、ＰＥＧとは、「－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）m－」（ｍは２以上）で表されるエチレングリコールが重合した構造を含む水溶性ポリマーである、ポリ（エチレングリコール）分子である。ＰＥＧの分子量は、例えば、ＰＥＧ４、平均分子量２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、または２００ｋＤａ等が挙げられるが、特に限定されない。またＰＥＧの形状としては、直鎖状でもよいし、分岐鎖状でもよいが、これらに限定されない。
用いるＰＥＧ試薬によって、立体異性体、光学異性体、幾何異性体などが形成される場合があるが、これらの異性体は公知の方法で分離して用いてもよく、混合物として用いてもよい。得られるＩＬ－２改変体は巨大分子であるためこれら部分構造の異性体の構造的相違はほぼ影響しないものと考えられる。
上記ＰＥＧ試薬は、市販のＰＥＧ試薬以外にも、市販のＰＥＧ試薬から調製したＰＥＧ試薬を使用することもできる。例えば、末端にカルボキシル基やＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのカルボン酸等価体を有するＰＥＧ試薬に対し、チオール基またはアジド基と反応性を有するアミンを縮合させることで、ＰＥＧ試薬を調製することができる。また、末端にアミノ基を有するＰＥＧ試薬に対し、チオール基またはアジド基と反応性を有するカルボキシル基やＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのカルボン酸等価体を縮合することなどによっても合成することができるが、これらに限定されない。
（発現法によるＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体の製造）
発現法によるＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体の製造方法としては、例えば、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列におけるＰＥＧ導入位置のアミノ酸残基をタンパク質の部位特異的なＰＥＧ化を可能とする化学的反応性を有するアミノ酸残基に置換したＩＬ－２改変体を大腸菌などの宿主細胞により発現させた後に、該ＩＬ－２改変体における該アミノ酸残基へ化学修飾によってＰＥＧを結合させることによりＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体を製造する方法が挙げられる。
具体的には、例えば、（発現法による糖鎖結合ＩＬ－２改変体の製造）の項において上記した方法と同様にして、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列におけるＰＥＧ導入位置に、タンパク質の部位特異的なＰＥＧ化を可能とする化学的反応性を有するアミノ酸残基への置換が導入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む発現カセットを適切な発現ベクターに組み込み、該発現ベクターを大腸菌などの宿主細胞に導入して形質転換体を得て、該形質転換体にＩＬ－２改変体を発現させて、該ＩＬ－２改変体のシステイン残基または非天然アミノ酸残基に化学修飾によってＰＥＧを結合させることにより、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体を得る方法が挙げられる。
大腸菌を宿主細胞とする場合、発現効率または作製したタンパク質の精製等のために、野生型ＩＬ－２のＮ末端にリンカーを導入して発現カセットを構成してもよい。該リンカーとしては、例えば、メチオニン残基、８個のポリヒスチジン、およびメチオニン残基を含む８個のポリヒスチジン等が挙げられる。
ＩＬ－２のアミノ酸残基をシステイン残基に置換したＩＬ－２改変体の調製方法としては、例えば、米国特許第５２０６３４４号明細書、国際公開第２０１６／０２５３８５号等に記載の方法が挙げられる。
ＩＬ－２のアミノ酸残基をタンパク質の部位特異的なＰＥＧ化を可能とする化学的反応性を有する非天然アミノ酸残基に置換したＩＬ－２改変体の調製方法としては、国際公開第２０１７／０３０１５６号、[Nature. 2017 Nov 29;551(7682):644-647.]、国際公開第２０１３／０６８８７４号、米国特許出願公開２０１４／００４６０３０号明細書、[Bioconj. Chem., 2014, 25 (2), pp 351-361]、国際公開第２０１４／０４４８７２号、[Bioconj. Chem. 2015 Nov 18;26(11):2249-60]、国際公開第２０１４／１２４２５８号、[Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28;108(26):10437-42]、に記載される方法が挙げられる。
また、ＩＬ－２のアミノ酸残基をｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基またはｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基に置換したＩＬ－２改変体の製造方法、および当該ＩＬ－２改変体にＰＥＧを結合させる方法としては、例えば、国際公開第２０１７／０３０１５６号に記載の方法が挙げられる。
ＩＬ－２のアミノ酸配列におけるＰＥＧ導入位置のアミノ酸残基をタンパク質の部位特異的なＰＥＧ化を可能とする化学的反応性を有するアミノ酸残基に置換したＩＬ－２改変体対しＰＥＧを導入する方法としては、日本国特許第５２０６３４４号公報、国際公開第２０１２／０６５０８６号、国際公開第２０１７／０３０１５６号、[Nature. 2017 Nov 29;551(7682):644-647.]、国際公開第２０１３／０６８８７４号、米国出願公開第２０１４／００４６０３０号明細書、[Bioconj. Chem., 2014, 25 (2), pp 351-361]、国際公開第２０１４／０４４８７２号、[Bioconj. Chem. 2015 Nov 18;26(11):2249-60]、国際公開第２０１４／１２４２５８号、[Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28;108(26):10437-42]に記載の方法などに従いＰＥＧを導入することができる。
［糖鎖結合ＩＬ－２改変体またはＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体に、さらにＰＥＧまたは糖鎖を結合させたＩＬ－２改変体、およびその製造方法］
上述した糖鎖結合ＩＬ－２改変体は、さらにＰＥＧが結合していてもよい。また、上述したＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体も、さらに糖鎖が結合していてもよい。これらＩＬ－２改変体は、上述の［糖鎖結合ＩＬ－２改変体の製造方法］、および［ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体の製造方法］を組み合わせて製造することができる。また、国際公開第２０１２／０６５０８６号などに従い、Ｎ末端のアミノ基に選択的にＰＥＧを導入することもできる。
ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体に対してさらに糖鎖を導入する場合、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における、１１、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、１０８、１１５、１１９、１２２、１２３および１３０番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基に糖鎖が結合しているアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体が好ましく、１２、１１５および１１９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基に糖鎖が結合しているＩＬ－２改変体がより好ましい。
糖鎖結合ＩＬ－２改変体に対してさらにＰＥＧを導入する場合、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における、１、３、４、５、６、７、８、５１、６０、７８、７９、９９、１００、１０１および１２９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体が好ましく、１、３、５１および７８番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含むＩＬ－２改変体がより好ましい。
ＰＥＧが結合したアミノ酸残基としては、例えばＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基、Ｎ末端アミノ酸残基由来の基および非天然アミノ酸残基が挙げられる。
システイン残基由来の基またはＮ末端アミノ酸残基由来の基とは、システイン残基の側鎖チオール基またはＮ末端アミノ酸残基の主鎖アミノ基に化学修飾などによりＰＥＧが結合した基をいう。ＰＥＧと、システイン残基由来の基またはＮ末端アミノ酸残基由来の基とは、リンカーを介して結合していてもよい。当該リンカーはＰＥＧや非天然アミノ酸残基の種類に応じて適宜変更することができる。
ＰＥＧが結合した非天然アミノ酸残基としては、例えばチオール基を有するアミノ酸残基由来の基またはアジド基を有するアミノ酸残基由来の基に化学修飾などによりＰＥＧが結合した基などが挙げられる。チオール基を有するアミノ酸残基由来の基としては、例えば、ＰＥＧが結合したアセチルシステイン残基由来の基、ＰＥＧが結合したホモシステイン残基由来の基などが挙げられるが、これらに限定されない。
ＰＥＧが結合したアジド基を有するアミノ酸残基由来の基としては、例えば、ＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基、ＰＥＧが結合したｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基、ＰＥＧが結合したＮ６－ジアゾリジン残基由来の基、ＰＥＧが結合したｐ－アジドフェニルアラニン残基由来の基などが挙げられるが、これらに限定されない。
非天然アミノ酸残基としては、他に、国際公開第２０１７／０３０１５６号、[Nature. 2017 Nov 29;551(7682):644-647.]、国際公開第２０１３／０６８８７４号、米国出願公開第２０１４／００４６０３０号明細書、[Bioconj. Chem., 2014, 25 (2), pp 351-361]、国際公開第２０１４／０４４８７２号、[Bioconj. Chem. 2015 Nov 18;26(11):2249-60]、国際公開第２０１４／１２４２５８号、[Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28;108(26):10437-42]等に記載される非天然アミノ酸残基でもよい。ＰＥＧと上記非天然アミノ酸残基とは、リンカーを介して結合していてもよい。当該リンカーはＰＥＧや非天然アミノ酸残基の種類に応じて適宜変更することができる。
野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における１番目のアミノ酸残基を、ＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換する場合、ＰＥＧが結合したＮ末端アミノ酸残基由来の基、ＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基、ＰＥＧが結合したアセチルシステイン残基由来の基、ＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基、ＰＥＧが結合したｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基が好ましく、ＰＥＧが結合したＮ末端アミノ酸残基由来の基、ＰＥＧが結合したアセチルシステイン残基由来の基がより好ましい。
野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列における３、４、５、６、７、８、５１、６０、７８、７９、９９、１００、１０１および１２９番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基をＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換する場合、ＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基、ＰＥＧが結合したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基、ＰＥＧが結合したｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基由来の基が好ましく、ＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基がより好ましい。
ＰＥＧが結合したＮ末端アミノ酸残基由来の基とは、具体的には例えば、アラニン残基の主鎖アミノ基に対してアルデヒドを反応させてできたリンカーを介してＰＥＧが結合された下記（式Ｚ０）で表される構造などが挙げられる。
Figure 0007275049000090
式中ＰＥＧとは、具体的には例えば、平均分子量２０ｋＤａである場合の下記（式Ｘ００）で表される構造が挙げられるがこれらに限定されない。
Figure 0007275049000091
ＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基とは、具体的には例えば、システイン残基の側鎖チオール基に対してハロアセチル基を反応させてできたリンカーを介してＰＥＧが結合された下記（式Ｘ４）で表される構造、マレイミドを反応させてできたリンカーを介してＰＥＧが結合された下記（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）などが挙げられる。
Figure 0007275049000092
Figure 0007275049000093
Figure 0007275049000094
Figure 0007275049000095
式中ＰＥＧとして具体的には、平均分子量２０ｋＤａである場合の下記（式Ｘ１１）、平均分子量が４０ｋＤａである場合の下記（式Ｘ１１）、平均分子量が４０ｋＤａである場合の下記（式Ｘ１３）、平均分子量が８０ｋＤａである場合の下記（式Ｘ１３）、平均分子量が４０ｋＤａである場合の下記（式Ｘ１４）、平均分子量が８０ｋＤａである場合の下記（式Ｘ１４）、平均分子量が５０ｋＤａである場合の下記（式Ｘ１５）で表される構造が挙げられるがこれらに限定されない。
Figure 0007275049000096
Figure 0007275049000097
Figure 0007275049000098
Figure 0007275049000099
ＰＥＧが結合したアセチルシステイン残基由来の基とは、具体的には例えば、アセチルシステイン残基の側鎖チオール基に対してハロアセチル基を反応させてできたリンカーを介してＰＥＧが結合された下記（式ＸＸ３）で表される構造、マレイミドを反応させてできたリンカーを介してＰＥＧが結合された下記（式Ｘ８）および／または（式Ｘ９）および／または（式Ｘ１０）などが挙げられる。
Figure 0007275049000100
Figure 0007275049000101
Figure 0007275049000102
Figure 0007275049000103
式中ＰＥＧとは、具体的には例えば、平均分子量が４０ｋＤａである場合の上記（式Ｘ１１）、平均分子量が４０ｋＤａである場合の上記（式Ｘ１３）、平均分子量が８０ｋＤａである場合の上記（式Ｘ１３）、平均分子量が８０ｋＤａである場合の上記（式Ｘ１４）、平均分子量が５０ｋＤａである場合の上記（式Ｘ１５）で表される構造が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明のＩＬ－２改変体の一実施形態としては、以下に記載するＩＬ－２改変体が好ましい。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１１番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ１番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ１番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１９番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ１番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、３８番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ１番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９１番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ１番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および９１番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ１番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９１番目および１１９番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ１番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および９１番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ３番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１５番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ３番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および１１９番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ３番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および９１番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ５１番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ７８番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および１１９番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ７８番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１５番目のアミノ酸残基が糖鎖が結合したアミノ酸残基に置換され、かつ７８番目のアミノ酸残基がＰＥＧが結合したアミノ酸残基に置換されているＩＬ－２改変体。
上述本発明のＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体に結合させる糖鎖、ＰＥＧは、上述種々のものを組み合わせて用いることができる。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式７）で表される構造であり、かつ１番目のアミノ酸残基が（式Ｘ０）に示すＰＥＧが結合したＮ末端アミノ酸残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ０）のＰＥＧの構造が平均分子量２０ｋＤａである場合の（式Ｘ００）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式７）で表される構造であり、かつ１番目のアミノ酸残基が（式Ｘ０）に示すＰＥＧが結合したＮ末端アミノ酸残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ０）のＰＥＧの構造が平均分子量２０ｋＤａである場合の（式Ｘ００）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、３８番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式７）で表される構造であり、かつ１番目のアミノ酸残基が（式Ｘ０）に示すＰＥＧが結合したＮ末端アミノ酸残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ０）のＰＥＧの構造が平均分子量２０ｋＤａである場合の（式Ｘ００）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式７）で表される構造であり、かつ１番目のアミノ酸残基が（式Ｘ０）に示すＰＥＧが結合したＮ末端アミノ酸残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ０）のＰＥＧの構造が平均分子量２０ｋＤａである場合の（式Ｘ００）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基および９１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ１番目のアミノ酸残基が（式ＸＸ３）で表されるＰＥＧが結合したアセチルシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式ＸＸ３）のＰＥＧの構造が平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１３）または平均分子量５０ｋＤａである場合の（式Ｘ１５）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基および９１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ１番目のアミノ酸残基が（式Ｘ８）および/または（式Ｘ９）および/または（式Ｘ１０）で表されるＰＥＧが結合したアセチルシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ８）および/または（式Ｘ９）および/または（式Ｘ１０）のＰＥＧの構造が平均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ１３）、または平均分子量５０ｋＤａである場合の（式Ｘ１５）、または平均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ１４）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ１番目のアミノ酸残基が（式ＸＸ３）で表されるＰＥＧが結合したアセチルシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式ＸＸ３）のＰＥＧの構造が平均分子量５０ｋＤａである場合の（式Ｘ１５）、または平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１３）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、９１番目および１１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ１番目のアミノ酸残基が（式ＸＸ３）で表されるＰＥＧが結合したアセチルシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式ＸＸ３）のＰＥＧの構造が平均分子量５０ｋＤａである場合の（式Ｘ１５）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基および９１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ３番目のアミノ酸残基が（式Ｘ４）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ４）のＰＥＧの構造が平均分子量２０ｋＤａである場合の（式Ｘ１１）、または平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１１）、または平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１３）、または平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１４）、または平均分子量５０ｋＤａである場合の（式Ｘ１５）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基および９１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ３番目のアミノ酸残基が（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）のＰＥＧの構造が平均分子量５０ｋＤａである場合の（式Ｘ１５）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、９１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）で表される構造であり、かつ３番目のアミノ酸残基が（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）のＰＥＧの構造が平均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ１４）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、９１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式４）で表される構造であり、かつ３番目のアミノ酸残基が（式Ｘ４）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ４）のＰＥＧの構造が平均分子量５０ｋＤａである場合の（式Ｘ１５）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１５番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ３番目のアミノ酸残基が（式Ｘ４）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ４）のＰＥＧの構造が平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１３）または平均分子量５０ｋＤａである場合の（式Ｘ１５）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１５番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ３番目のアミノ酸残基が（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）のＰＥＧの構造が平均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ１３）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基および１１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ３番目のアミノ酸残基が（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）のＰＥＧの構造が平均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ１３）、または均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ１４）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基および１１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ３番目のアミノ酸残基が（式Ｘ４）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ４）のＰＥＧの構造が平均分子量５０ｋＤａである場合の（式Ｘ１５）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基および９１番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ５１番目のアミノ酸残基が（式Ｘ４）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ４）のＰＥＧの構造が平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１１）、または平均分子量５０ｋＤａである場合の（式Ｘ１５）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ７８番目のアミノ酸残基が（式Ｘ４）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ４）のＰＥＧの構造が平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１１）、または平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１３）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ７８番目の（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）のＰＥＧの構造が平均分子量４０ｋＤａまたは８０ｋＤａである場合の（式Ｘ１３）、または均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ１４）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および１１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ７８番目のアミノ酸残基が（式Ｘ４）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ４）のＰＥＧの構造が平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１３）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２番目および１１９番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ７８番目の（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ５）および／または（式Ｘ６）および／または（式Ｘ７）のＰＥＧの構造が平均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ１３）、または均分子量８０ｋＤａである場合の（式Ｘ１４）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
・野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１５番目のアミノ酸残基が（式１）に示す糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式１）のＳａｃｃｈａｒｉｄｅの構造が（式８）で表される構造であり、かつ７８番目のアミノ酸残基が（式Ｘ４）で表されるＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換されており、かつ（式Ｘ４）のＰＥＧの構造が平均分子量４０ｋＤａである場合の（式Ｘ１２）で示される構造である、ＩＬ－２改変体。
本実施形態において、野生型ＩＬ－２のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が結合したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端アラニン残基が欠損したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端アラニン残基が欠損しメチオニン残基が結合したアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列もしくは配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が結合したアミノ酸配列、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端アラニン残基が欠損したアミノ酸配列、および配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端アラニン残基が欠損しメチオニン残基が結合したアミノ酸配列において、１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基またはアラニン残基に置換したアミノ酸配列が好ましい。
本発明のＩＬ－２改変体には、一般的に体内動態を改善することが知られている動態改善素子を結合させることで、血中半減期を制御することがきる。動態改善素子としては、糖鎖、ペプチド、タンパク質、脂質などがあげられ、［Therapeutic Proteins（Roland Kontermann編、Wiley Blackwell、2012年）］に記載の方法を組合せて用いることができる。具体的には、本発明のＩＬ－２改変体のＴｒｅｇ細胞増殖活性の選択性に影響を与えないように、シアリル化、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ、Ｏ－グリコシル化、ＰＥＧミミックとしてのぺプチド、タンパク質の融合、抗体の定常領域又はFｃ領域の融合、アルブミンなどの血清蛋白質との融合（脂質導入してアルブミンと融合させる方法も含む）、またはリン脂質、ナノ粒子との結合、ナノ粒子への封中などの方法によって血中半減期を制御することができる。
［ＩＬ－２改変体が有する生物活性の評価］
ＩＬ－２改変体の生物活性は、当該技術分野における公知の任意の適した方法によって評価することができる。評価方法には後述する実施例において記載のものを含む。ＩＬ－２改変体の生物活性を評価する方法としては、具体的には例えば、以下の（ａ）～（ｅ）の方法が挙げられる。これらの方法は、ＩＬ－２改変体の治療効果、効能および薬力学的特性の測定にも使用できる。
（ａ）ＩＬ－２改変体により刺激されるＴｒｅｇ細胞の増殖活性を測定する方法
ＩＬ－２改変体または野生型ＩＬ－２を添加した培地でＴｒｅｇ細胞を培養し、Ｔｒｅｇ細胞の増殖率を測定する。他に、Ｔｒｅｇ細胞の増殖活性を測定する方法としては、例えば、フローサイトメトリーにより、混合細胞集団内のＴｒｅｇ細胞数の増大を測定する方法、およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋マーカー表現型またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗマーカー表現型の存在比率を測定する方法；分離したＴｒｅｇ細胞へのトリチウム化チミジンの取り込みにより測定する方法；Ｋｉ－６７などの増殖に関連する細胞周期タンパク質のＴｒｅｇ細胞内の発現の増大を測定する方法；Ｔｒｅｇ細胞内のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）などの生体蛍光色素の細胞***に関連する希釈をフローサイトメトリーにより測定する方法が挙げられる。
（ｂ）ＩＬ－２改変体により刺激されるＮＫ細胞の増殖活性を測定する方法
ＩＬ－２改変体または野生型ＩＬ－２を添加した培地でＮＫ細胞を培養し、ＮＫ細胞の増殖率を測定する。他に、ＮＫ細胞の増殖活性を測定する方法としては、例えば、フローサイトメトリーにより、混合細胞集団内のＮＫ細胞数の増大を測定する方法、およびＣＤ５６＋マーカー表現型の存在比率を測定する方法；分離したＮＫ細胞へのトリチウム化チミジンの取り込みにより測定する方法；Ｋｉ－６７などの増殖に関連する細胞周期タンパク質のＮＫ細胞内の発現の増大を測定する方法；ＮＫ細胞内のＣＦＳＥなどの生体蛍光色素の細胞***に関連する希釈をフローサイトメトリーにより測定する方法が挙げられる。
本発明のＩＬ－２改変体は、野生型ＩＬ－２と比較して、Ｔｒｅｇ増殖活性が高い、および／またはＮＫ細胞増殖活性が低いことが好ましい。野生型ＩＬ－２の代わりに、野生型ＩＬ－２と同等のＴｒｅｇ増殖活性および/またはＮＫ細胞増殖活性を有するＩＬ－２改変体を用いてもよい。
（ｃ）ＩＬ－２改変体により刺激されたＴｒｅｇによるレスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）の増殖阻害活性を測定する方法
ＩＬ－２改変体または野生型ＩＬ－２を添加した培地でＴｒｅｇを培養し、これと適当なＴＣＲ刺激存在下でＴｒｅｓｐ（ＣＤ４＋Ｔｒｅｓｐ、ＣＤ８＋Ｔｒｅｓｐ）と共培養したときのＴｒｅｓｐの増殖率を測定し、野生型ＩＬ－２と比較してＩＬ－２改変体によるＴｒｅｓｐの増殖阻害率を評価する。本発明のＩＬ－２改変体は、野生型ＩＬ－２と比較して、少なくとも同等のＴｒｅｓｐの増殖阻害活性を有するＴｒｅｇを増殖させることが好ましい。野生型ＩＬ－２の代わりに、野生型ＩＬ－２と同等のＴｒｅｓｐの増殖阻害活性を有するＴｒｅｇを増殖させるＩＬ－２改変体を用いてもよい。
（ｄ）Ｅｘ ｖｉｖｏアッセイ
ＴｅｆｆやＮＫ細胞の機能的エフェクター分子であるＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＦＮγまたはＴＮＦα等の炎症性サイトカインについて、ＩＬ－２改変体または野生型ＩＬ－２を添加した培地でＰＢＭＣを培養し、培養上清中のサイトカイン産生量を測定する。また、同様の方法で抗炎症性サイトカインの産生量を測定してもよい。本発明のＩＬ－２改変体は、野生型ＩＬ－２と比較して、炎症性サイトカインの産生量を減少させる、および／または、抗炎症性サイトカインの産生量が増加させることが好ましい。野生型ＩＬ－２の代わりに、野生型ＩＬ－２と同等の炎症性サイトカインおよび/または抗炎症性サイトカインを産生させるＩＬ－２改変体を用いてもよい。
（ｅ）Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比の測定
ＩＬ－２改変体または野生型ＩＬ－２を添加した培地で培養したＰＭＢＣを抗ヒトＣＤ４抗体、抗ヒトＣＤ２５抗体、抗ヒトＦｏｘｐ３抗体と反応させ、フローサイトメトリーによるＣＤ４陽性画分の中でＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３ｈｉｇｈ画分をＴｒｅｇ、ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３ｌｏｗ画分をエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）とし、その存在比［Ｔｒｅｇ（％）／Ｔｅｆｆ（％）］（Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比）を算出する。データの解析は市販のデータ解析ソフト（例えば、ＴｒｅｅＳｔａｒ社製Ｆｌｏｗｊｏ、ｖｅｒｓｉｏｎ７．６．５）により行う。本発明のＩＬ－２改変体は、野生型ＩＬ－２と比較して、Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比が向上していることが好ましい。野生型ＩＬ－２の代わりに、野生型ＩＬ－２と同等のＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比を有するＩＬ－２改変体を用いてもよい。
［組成物］
本発明の一実施形態は、有効量の本発明のＩＬ－２改変体を含む組成物である。組成物の形態としては、例えば、医薬組成物および試薬が挙げられる。
後述する実施例において示すように、本発明のＩＬ－２改変体によりＴｒｅｇを選択的に活性化させることから、本発明のＩＬ－２改変体を含む組成物は、免疫抑制作用を有する組成物として好適に用いることができる。また、本発明の一実施形態として、本発明のＩＬ－２改変体を含む免疫疾患の治療剤が提供される。
本発明の組成物が用いられる病態または疾患としては、例えば、全身性エリテマトーデス、乾癬、慢性移植片対宿主病、急性移植片対宿主病、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、セリアック病、特発性血栓性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、シェーグレン症候群、強皮症、喘息、ブドウ膜炎、表皮過形成、円形脱毛症、ベーチェット病、高安動脈炎、軟骨炎症、骨分解、関節炎、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、少関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身性発症若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸疾患性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性脈管炎、少関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身性発症関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸疾患性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、脈管炎、筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、変形性関節症、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫、動脈炎、リウマチ性多発筋痛、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、スティル病、慢性閉塞性肺疾患、ギラン・バレー症候群、１型糖尿病、グレーブス病、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、ウィスコット・アルドリッチ症候群など炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等が挙げられる。
本発明における組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤および坐剤などとして、経口的または非経口的に使用することができる。
これら製剤化においては、薬理学上許容される担体、具体的には例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
また、本発明における組成物の投与にはシリンジを使用してもよいが、他のデバイスを使用してもよい。デバイスとしては、例えばインジェクターペン、オートインジェクターデバイス、無針デバイス、または皮下パッチデバイス等が挙げられる。
本発明の組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象とすることができる。具体的には、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどが挙げられるが、これらに制限されない。また、健常状態であってもよく、羅患状態であってもよい。ただし、本発明の組成物が医薬組成物である場合には、罹患状態の動物を対象として使用する。
組成物におけるＩＬ－２改変体の有効量は、例えば、治療の状況および目的に依存する。適切な投与量は、ＩＬ－２改変体が使用される適応症、投与のルート、並びに投与する対象のサイズ（体重、体表面または器官サイズ）および／または状態（年齢および健康状態）に依存して調整し得る。
例えば、１回当たりの投与量または摂取量は、一般に、１ｎｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは、０．０１μｇ／ｋｇ体重～１ｍｇ／ｋｇ体重である。
本発明の組成物の製品（医薬品、試薬）またはその説明書は、免疫を抑制するために用いられる等の旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。
［ＩＬ－２Ｒへの選択性］
本発明の一実施形態は、ＩＬ－２Ｒαβγに対するＩＬ－２の選択性を向上させる方法である。本実施形態においては、上記した方法によりＩＬ－２に糖鎖またはＰＥＧを結合させて改変することにより、ＩＬ－２Ｒαβγに対するＩＬ－２の選択性を向上できる。
ＩＬ－２Ｒαβγに対するＩＬ－２の選択性が向上しているとき、ＩＬ－２Ｒαサブユニットに対するＩＬ－２改変体の親和性が、野生型ＩＬ－２の親和性よりも向上している場合と、ＩＬ－２Ｒβおよびγサブユニットの少なくとも一方に対するＩＬ－２改変体の親和性が、野生型ＩＬ－２の親和性よりも低下している場合とがあり得る。
本発明の一実施形態は、ＩＬ－２Ｒαサブユニットに対するＩＬ－２の親和性を向上させる方法である。「ＩＬ－２Ｒαサブユニットに対するＩＬ－２の親和性が向上する」とは、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２改変体のＩＬ－２Ｒαサブユニットに対する親和性が向上していることをいう。本実施形態においては、上記した方法によりＩＬ－２に糖鎖またはＰＥＧを結合させて改変することにより、野生型ＩＬ－２よりも、作製されたＩＬ－２改変体のＩＬ－２Ｒαサブユニットに対する親和性を向上させ、ＩＬ－２Ｒαβγに対するＩＬ－２の選択性を向上させることができる。
ＩＬ－２Ｒαサブユニットに対するＩＬ－２の親和性は、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）に対するＩＬ－２の結合性をＢｉａｃｏｒｅにより測定し、ｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅモデルを用いて解離定数ＫＤを求めることにより評価することができる。ＢｉａｃｏｒｅによるＩＬ－２Ｒαに対するＩＬ－２の結合性は、実施例において後述する方法により測定できる。本実施形態においては、ＩＬ－２Ｒαに対するＩＬ－２改変体のＫＤは、野生型ＩＬ－２の改変体よりも低いことが好ましい。野生型ＩＬ－２の代わりに、野生型ＩＬ－２と同等のＩＬ－２Ｒαへの親和性を有するＩＬ－２改変体を用いてもよい。
本発明の一実施形態は、ＩＬ－２Ｒβおよびγサブユニットの少なくとも一方に対するＩＬ－２の親和性を低下させる方法である。「ＩＬ－２Ｒβおよびγサブユニットの少なくとも一方に対するＩＬ－２の親和性が低下する」とは、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２改変体のＩＬ－２Ｒβおよびγサブユニットの少なくとも一方に対する親和性が低下していることをいう。本実施形態においては、上記した方法によりＩＬ－２に糖鎖またはＰＥＧを結合させて改変することにより、野生型ＩＬ－２と比較して、作製されたＩＬ－２改変体のＩＬ－２Ｒβおよびγサブユニットの少なくとも一方に対する親和性を低下させ、ＩＬ－２Ｒαβγに対するＩＬ－２の選択性を向上できる。
例えば、ＩＬ－２Ｒβγサブユニットに対するＩＬ－２の親和性は、ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒβγに対する結合性をＢｉａｃｏｒｅにより測定し、１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを用いて解離定数ＫＤを求めることにより評価することができる。ＢｉａｃｏｒｅによるＩＬ－２Ｒβγに対するＩＬ－２の結合性は、実施例において後述する方法により測定できる。本実施形態においては、ＩＬ－２Ｒβγに対するＩＬ－２のＫＤは野生型ＩＬ－２と比較して高いことが好ましい。野生型ＩＬ－２の代わりに、野生型ＩＬ－２と同等のＩＬ－２Ｒβγサブユニットへの親和性を有するＩＬ－２改変体を用いることができる。
［制御性Ｔ細胞を選択的に活性化させる方法］
本発明の一実施形態は、本発明のＩＬ－２改変体を用いて制御性Ｔ細胞を選択的に活性化させる方法である。本実施形態においては、本発明のＩＬ－２改変体を被験対象に投与して、制御性Ｔ細胞を選択的に活性化させることができる。
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］糖鎖結合ＩＬ－２改変体の合成
表１～５に示す各種ＩＬ－２改変体を下記に記載の方法で作製した。
Figure 0007275049000104

Figure 0007275049000105
Figure 0007275049000106
Figure 0007275049000107
Figure 0007275049000108
〈表１～５の説明〉
・糖鎖結合位置：野生型成熟ヒトＩＬ－２のアミノ酸配列（配列番号１）（以下、単に野生型ＩＬ－２とも記載する）のＮ末端からの位置
・Ｃｙｓ変異位置：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端からの位置
・１２５位変異：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２５番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は－、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はＳと記載する。
表中、糖鎖結合位置の置換後のアミノ酸残基の列に記載した構造について以下に示す。
Ｃ－糖（ＧｌｃＮＡｃ、ｇｌｕｃｏｓｅ、ｌａｃｔｏｓｅ、ｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ｐｅｎｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ａｓｉａｌｏ、ｄｉｓｉａｌｏ、ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ）とは、システインの側鎖チオールにＣＨ２ＣＯＮＨリンカーを介して糖鎖が導入された下記（式１）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000109
上記（式１）中、Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅは糖鎖示す。
Ｎ－糖（ＧｌｃＮＡｃ、ｄｉｓｉａｌｏ）とは、アスパラギンの側鎖アミドに糖鎖が導入された下記（式２）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000110
上記（式２）中、Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅは糖鎖示す。
ＧｌｃＮＡｃとは下記（式Ｙ１）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000111
Ｇｌｕｃｏｓｅとは下記（式Ｙ２）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000112
ｌａｃｔｏｓｅとは下記（式４）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000113
ｔｒｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅとは下記（式５）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000114
ｐｅｎｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅとは下記（式６）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000115
ａｓｉａｌｏとは下記（式７）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000116
ｄｉｓｉａｌｏとは下記（式８）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000117
ｔｅｔｒａｓｉａｌｏとは下記（式Ｙ３）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000118
・表中、Ｃｙｓ変異位置の置換後のアミノ酸残基の列に記載したＡｃＣとは下記（式ＸＸＸ）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000119
Figure 0007275049000120
〈表６の説明〉
・変異位置：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端からの位置
・１２５位変異：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２５番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は－、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はＳと記載する。
表中、置換後のアミノ酸残基の列に記載したＣ－ａｃｅｔａｍｉｄｅとは、下記（式９）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000121
（工程１）ペプチドセグメント１の合成
ＩＬ－２アミノ酸配列１－５７のペプチドチオエステルまたは糖鎖結合ペプチドチオエステルを以下の方法にて調製した。
（工程１－１ａ－１）ペプチドヒドラジドの合成
［Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 6978-6981］に記載される方法に従い得られるトリチルヒドラジン樹脂に、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（５当量）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（５当量）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（５当量）を用いてＤＭＦ中で１残基目のアミノ酸残基を樹脂へ担持した。定法に従い、ＤＭＦ中での、Ｆｍｏｃアミノ酸（５．３当量）、ＨＣＴＵ（５当量）、Ｎ－メチルモルホリン（５当量）または２，４，６－トリメチルピリジン（５当量）を用いたアミノ酸の伸長と、２０％ピペリジン－ＤＭＦ溶液による脱保護を繰り返すことで、２残基目以降のアミノ酸を伸長した。伸長したペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、水を用いて樹脂からの脱離と側鎖保護基を除去した後、氷冷したエーテル中に滴下し、生じた沈殿を遠心分離によって回収した。逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、ペプチドヒドラジドを合成した。
この際、システインへ糖鎖を導入する場合には糖鎖を導入する位置をシステインへと変異させたペプチドヒドラジドを調製した。また、２種類の糖鎖を導入する場合は、一方をシステイン、もう一方をＳ－アセタミドメチルシステインへと変異させたペプチドヒドラジドを調製した。
また、アミノ酸配列３位または５１位をシステインへと変異させたＩＬ－２改変体を調製する際には、糖鎖を導入する位置をシステイン、アミノ酸配列３位または５１位をＳ－アセタミドメチルシステインへと変異させたペプチドヒドラジドを調製した。
また、アミノ酸配列１位をアセチルシステインへと変異させたアナログを調製する際には、糖鎖を導入する位置をシステイン、アミノ酸配列１位をＳ－アセタミドメチルシステインへと変異させたペプチドを樹脂上で伸長した後、Ｎ末端アミノ基を無水酢酸、ピリジンを用いてアセチル化し、上記方法に従い樹脂からの脱離と側鎖保護基の除去、精製を行い、１位をアセチルシステインへと変異させたペプチドヒドラジドを調製した。
（工程１－１ａ－２）Ｃｙｓ－糖鎖結合ペプチドヒドラジドまたはＣｙｓ－アセタミド結合ペプチドヒドラジドの合成
（工程１－１ａ－１）にて得られるペプチドヒドラジドへのブロモアセチル糖鎖（国際公開第２００５／０１００５３号に記載される方法に従い調製）を用いた糖鎖導入は、［Tetrahedron Lett., 2004, 45, 3287-3290, Carbohydr. Res. 2009, 344, 762-770］に記載される方法で実施し、目的の糖鎖結合ペプチドヒドラジドを合成した。
ブロモアセチル糖鎖の代わりに、ブロモアセタミドを用いて、上記と同様の手法にてＣｙｓ－アセタミド結合ペプチドヒドラジドを合成した。
（工程１－１ｂ）Ａｓｎ－糖鎖結合ペプチドヒドラジドの合成
［Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 6978-6981］に記載される方法に従い得られるトリチルヒドラジン樹脂に、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（５当量）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（５当量）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（５当量）を用いてＤＭＦ中で１残基目のアミノ酸残基を樹脂へ担持した。定法に従い、ＤＭＦ中での、Ｆｍｏｃアミノ酸（５．３当量）、ＨＣＴＵ（５当量）、Ｎ－メチルモルホリン（５当量）を用いたアミノ酸の伸長と、２０％ピペリジン－ＤＭＦ溶液による脱保護を繰り返すことで、２残基目以降の糖鎖結合Ａｓｎ以外のアミノ酸を伸長した。
糖鎖結合Ａｓｎ（国際公開２００４／００５３３０号に記載される方法に従い調製）は、国際公開第２００４／００５３３０号に記載される方法で伸長した。伸長したペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、水を用いて樹脂からの脱離と側鎖保護基を除去した後、氷冷したエーテル中に滴下し、生じた沈殿を遠心分離によって回収した。逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、Ａｓｎ－糖鎖結合ペプチドヒドラジドを合成した。
（工程１－２ａ）ペプチドチオエステルまたは糖鎖結合ペプチドチオエステルの合成
（工程１－１ａ－１）にて得られるペプチドヒドラジドまたは（工程１－１ａ－２）にて得られるＣｙｓ－糖鎖結合ペプチドヒドラジドまたはにて得られるＣｙｓ－アセタミド結合ペプチドヒドラジドまたは（工程１－１ｂ）にて得られるＡｓｎ－糖鎖結合ペプチドヒドラジドを６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ３）に溶解し―２０℃に冷却した後、２００ｍｍｏｌ／Ｌ 亜硝酸ナトリウム、６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７）を加え５分間撹拌した。４００ｍｍｏｌ／Ｌ ２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ６）を加え―１５℃で１時間半撹拌した後、逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、ペプチドチオエステルまたは糖鎖結合ペプチドチオエステルを得た。
（工程１－２ｂ）２種類の糖鎖結合ペプチドチオエステルの合成
２種類の糖鎖を導入する場合、（工程１－１ａ－２）にて得られる糖鎖結合ペプチドヒドラジドの反応溶液に、酢酸に懸濁させた酢酸銀を加え６時間撹拌しＳ－アセタミドメチル基を除去した。ジチオトレイトールを加えた後、遠心分離して得られる上清をゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ－７５）によって４ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、５ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ５）へと溶媒交換した。溶出液に、６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ３）を加え、２ｍｏｌ／Ｌ 塩酸を用いてｐＨ３に調整した後、－１５℃に冷却した。
６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、２００ｍｍｏｌ／Ｌ 亜硝酸ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７）を加えて、―１５℃で５分間撹拌した後、６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、４００ｍｍｏｌ／Ｌ ２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ６）を加え、―１５℃で１時間半撹拌し、逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、糖鎖結合ペプチドチオエステルを得た。
得られた糖鎖結合ペプチドチオエステルに対し、（工程１－１ａ－２）に記載の方法に従い、２種類目の糖鎖を導入し、逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、２種類の糖鎖結合ペプチドチオエステルを得た。
（工程２）ペプチドセグメント２の合成
ＩＬ－２アミノ酸配列５８－１０４のペプチドヒドラジドまたは糖鎖結合ペプチドヒドラジドを以下の方法にて調製した。
（工程２－１ａ－1）ペプチドヒドラジドの合成
［Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 6978-6981］に記載される方法に従い得られるトリチルヒドラジン樹脂に、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ（５当量）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（５当量）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（５当量）を用いてＤＭＦ中で１残基目のアミノ酸残基を樹脂へ担持した。
定法に従い、ＤＭＦ中での、Ｆｍｏｃアミノ酸（５．３当量）、ＨＣＴＵ（５当量）、Ｎ－メチルモルホリン（５当量）または２，４，６－トリメチルピリジン（５当量）を用いたアミノ酸の伸長と、２０％ピペリジン－ＤＭＦ溶液による脱保護を繰り返すことで、２残基目以降のアミノ酸を伸長した。
伸長したペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、水を用いて樹脂からの脱離と側鎖保護基を除去した後、氷冷したエーテル中に滴下し、生じた沈殿を遠心分離によって回収した。逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、ペプチドヒドラジドを合成した。
この際、糖鎖を導入する場合には糖鎖を導入する位置をシステインへと変異し、さらにアミノ酸配列５８をチオプロリンへと変異させたペプチドヒドラジドを調製した。アミノ酸配列７８位をシステインへと変異させたアナログを調製する際には、アミノ酸配列７８位をシステインへと変異させたペプチドヒドラジドを調製した。アミノ酸配列９１位に糖鎖を導入し、アミノ酸配列７８位をシステインへと変異したアナログを調製する際は、アミノ酸配列９１位をシステイン、アミノ酸配列７８位をＳ－アセタミドメチルシステインへと変異させたペプチドヒドラジドを調製した。
（工程２－１ａ－２）Ｃｙｓ－糖鎖結合ペプチドヒドラジドまたはＣｙｓ－アセタミド結合ペプチドヒドラジドの合成の合成
（工程２－１ａ－１）にて得られるペプチドヒドラジドへのブロモアセチル糖鎖（国際公開第２００５／０１００５３号に記載される方法で調製）を用いた糖鎖導入を、［Tetrahedron Lett., 2004, 45, 3287-3290, Carbohydr. Res. 2009, 344, 762-770］に記載される方法に従い実施した反応溶液に対し、ブロモアセチル糖鎖に対して１０当量の２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを加えた後、８ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩水溶液、２ｍｏｌ／Ｌ 塩酸、メトキシアミン塩酸塩を加えてｐＨ４に調整し、室温にて２０分反応させた。逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、Ｃｙｓ－糖鎖結合ペプチドヒドラジドを合成した。
ブロモアセチル糖鎖の代わりに、ブロモアセタミドを用いて、上記と同様の手法にてＣｙｓ－ブロモアセタミド結合ペプチドヒドラジドを合成した。
（工程２－１ｂ）Ａｓｎ－糖鎖結合ペプチドヒドラジドの合成
（工程１－１ｂ）と同様の手法にてＡｓｎ－糖鎖結合ペプチドヒドラジドを調製した。
（工程３）ペプチドセグメント３の合成
ＩＬ－２アミノ酸配列１０５－１３３のペプチドまたは糖鎖結合ペプチドを以下の方法にて調製した。
（工程３－１）可溶化タグ（Ｈ－Ｃ（Ｎｐｙｓ）ＲＲＲＲＲ－ＮＨ２）の調整
Ｒｉｎｋ－アミド樹脂に、ＤＭＦ中でのＦｍｏｃアミノ酸（５．３当量）、ＨＣＴＵ（５当量）、Ｎ－メチルモルホリン（５当量）を用いたアミノ酸の伸長と、２０％ピペリジン－ＤＭＦ溶液による脱保護を繰り返すことでアミノ酸を伸長した。伸長したペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、水を用いて樹脂からの脱離と側鎖保護基を除去した後、氷冷したエーテル中に滴下し、生じた沈殿を遠心分離によって回収し、可溶化タグ（Ｈ－Ｃ（Ｎｐｙｓ）ＲＲＲＲＲ－ＮＨ２）を調製した。
（工程３－２）可溶化タグ導入ペプチドの合成
ＩＬ－２アミノ酸配列１０５－１３３のペプチドを以下の方法にて調製した。
ＨＭＰＢ－ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂に、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（５当量）、１－（メシチレン－２－スルホニル）－３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール（５当量）、１－メチルイミダゾール（３．５当量）を用いて１残基目のアミノ酸残基を樹脂に担持した。定法に従い、ＤＭＦ中での、Ｆｍｏｃアミノ酸（５．３当量）、ＨＣＴＵ（５当量）、Ｎ－メチルモルホリン（５当量）または２，４，６－トリメチルピリジン（５当量）を用いたアミノ酸の伸長と、２０％ピペリジン－ＤＭＦ溶液による脱保護を繰り返すことで、２残基目以降のアミノ酸を伸長した。
伸長したペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、水を用いて樹脂からの脱離と側鎖保護基を除去した後、氷冷したエーテル中に滴下し、生じた沈殿を遠心分離によって回収しペプチドの粗精製物を得た。この際、システインへ糖鎖を導入する場合には糖鎖を導入する位置をシステインへと変異し、さらにアミノ酸配列１０５をチオプロリンへと変異させたペプチドを調製した。
（工程３－１）にて得られる可溶化タグ（ペプチド粗生成物に対して３当量）を６．８ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、３１０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、５当量の無水酢酸を加え室温下１時間撹拌した。１０当量のアルギニン塩酸塩を加えた後、８ｍｏｌ／Ｌグアニジン塩酸塩、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩水溶液（ｐＨ８）に溶解した上記ペプチド粗生成物を加え室温下１時間撹拌した。逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、可溶化タグ導入ペプチドを合成した。
（工程３－３）可溶化タグ導入ペプチドへの糖鎖導入
（工程３－２）にて得られる可溶化タグ導入ペプチドを８ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、５ｍｍｏｌ／Ｌ トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、２００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６）に溶解し、ブロモアセチル糖鎖（５当量、国際公開第２００５／０１００５３号に記載される方法で調製）の６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７）溶液を加え５時間反応させた。
ブロモアセチル糖鎖に対して４当量の２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを加え１時間撹拌した後、６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解したメトキシアミン塩酸塩（３００当量）を加え、２ｍｏｌ／Ｌ 塩酸を用いてｐＨ４に調整し１時間反応させた。逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、糖鎖結合ペプチドを合成した。
（工程４）ＩＬ－２改変体、糖鎖結合ＩＬ－２改変体の合成
（工程４－１）ペプチドセグメント１と２の連結反応
上記（工程１）にて得られるペプチドセグメント１と上記（工程２）にて得られるペプチドセグメント２（１．１当量）とを、８ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、１００ｍＭ トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、１００ｍＭ アスコルビン酸、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ４－メルカプトフェニル酢酸、２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、反応させた後、逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、ペプチドセグメント１と２の連結体を合成した。
（工程４－２）ペプチドセグメント１と２の連結体のチオエステル化
上記（工程４－１）にて得られるペプチドセグメント１と２の連結体を、（工程１－２ａ）と同様の手法にてチオエステル化した。
（工程４－３）ペプチドセグメント３との連結
上記（工程４－２）にて得られるペプチドチオエステルと上記（工程３）にて得られるペプチドセグメント３（１当量）とを、８ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、１００ｍＭ トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、１００ｍＭ アスコルビン酸、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ４－メルカプトフェニル酢酸、２００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、反応させた後、逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、ペプチドセグメント１、２および３の連結体を合成した。
（工程４－４）アセタミドメチル基の脱保護
上記（工程４－３）にて得られるペプチドセグメント１、２および３の連結体のシステインがアセタミドメチル基で保護されている場合、以下に示す方法でアセタミドメチル基を除去した。
ペプチドセグメント１、２および３の連結体を、６ｍｏｌ／Ｌ 尿素、５ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ５）に溶解し、酢酸に懸濁させた酢酸銀（４２０当量）を加え５時間撹拌した。過剰量のジチオトレイトールを加えた後、遠心分離して得られる上清を逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、脱アセタミドメチル体を取得した。
（工程４－５）シアル酸ベンジルエステルの脱保護
上記（工程４－３）にて得られるペプチドセグメント１、２および３の連結体の糖鎖上のシアル酸側鎖カルボン酸がベンジル基で保護されている場合、国際公開第２００４／００５３３０号に記載される方法に従い、ベンジル基を除去した後、逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、脱ベンジル体を取得した。
（工程４－６）ＩＬ－２改変体、糖鎖結合ＩＬ－２改変体の合成
（工程４－３）または（工程４－４）または（工程４－５）で合成したペプチドセグメント１、２および３の連結体を、６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、１００ｍｍｏｌ／Ｌ トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８）に溶解した後、１００ｍｍｏｌ／Ｌ トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、１０ｍｍｏｌ／Ｌ 還元型グルタチオン、１ｍｍｏｌ／Ｌ酸化型グルタチオン（ｐＨ８）を加え、室温下１８時間撹拌した。逆相ＨＰＬＣカラム［プロテオナヴィ（商品名）、資生堂社製］にて精製し、ＩＬ－２改変体、糖鎖結合ＩＬ－２改変体を取得した。
得られたＩＬ－２改変体、糖鎖結合ＩＬ－２改変体は、質量分析にて計算値と実測値が一致していること、および／または、ＣＤスペクトルが野生型ＩＬ－２と一致すること、および／または、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出されるバンドが想定分子量のバンドの位置であることを確認できたことから、品質および純度が問題ないことを確認した。
［実施例２］Ｎ末ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体の合成
表７に示すＮ末ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２を下記に記載の方法で作製した。
Figure 0007275049000122
＜表７の説明＞
・糖鎖結合位置、ＰＥＧ結合位置：野生型成熟ヒトＩＬ－２のアミノ酸配列（配列番号１）（以下、単に野生型ＩＬ－２とも記載する）のＮ末端からの位置
・１２５位変異：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２５番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は－、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はＳと記載する。
・表中、糖鎖結合位置の置換後のアミノ酸残基の列に記載した構造について以下に示す。
Ｃ－糖（ａｓｉａｌｏ）とは、システインの側鎖チオールにＣＨ２ＣＯＮＨリンカーを介して糖鎖が導入された下記（式１）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000123
上記（式Ｘ１）において、Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅは糖鎖示す。
ａｓｉａｌｏとは下記（式７）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000124
表中、ＰＥＧ結合位置の置換後のアミノ酸残基の列に記載した構造について以下に示す。
Ａ１－ＰＥＧ（ＣＨＯ）［Ｌｉ２０（ＣＨＯ）］とは、アラニン主鎖アミノ基に（ＣＨ２）３リンカーを介してＰＥＧが導入された下記（式Ｚ０）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000125
Ｌｉ２０とは、上記（式Ｚ０）中、ＰＥＧが平均分子量約２０ｋＤａの下記（式Ｘ００）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000126
糖鎖結合ＩＬ－２改変体の１ ｍＭ ＥＤＴＡ, ２０ ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液 （ｐＨ５．５）に、室温下でＰＥＧ－アルデヒド （１０当量、ＰＪＫ－２４１；Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧ Ｗｏｒｋｓ）の２０ ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液 （ｐＨ５．５）を加え室温下３０分撹拌した後、ＮａＢＨ３（ＣＮ）（１０００当量）を加え３時間撹拌した。
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５（１０ｋＤａ）を用いた限外濾過により０．０５％トリフルオロ酢酸、２％アセトニトリリル水溶液に溶媒置換した後、サイズ排除クロマトグラフィー（カラム；Ｗａｔｅｒｓ製、ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ４５０Ａ、３．５μｍ、７．８×１５０ｍｍとＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ２００Ａ、３．５μｍ、 ７．８×１５０ｍｍを連結）にて精製し、Ｎ末ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体を合成した。
精製したＮ末ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した。その結果すべての改変体において、ＰＥＧの分子量が増加した単一のバンドが認められ、高純度のＮ末ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体が得られたことが確認できた。
［実施例３］Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体の合成
表８に示すＣｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２を下記に記載の方法で作製した。
Figure 0007275049000127
〈表８の説明〉
・ＰＥＧ結合位置、糖鎖結合位置１および２：野生型成熟ヒトＩＬ－２のアミノ酸配列（配列番号１）（以下、単に野生型ＩＬ－２とも記載する）のＮ末端からの位置
・１２５位変異：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２５番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は－、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はＳと記載する。
・表中、糖鎖結合位置の置換後のアミノ酸残基の列に記載した構造について以下に示す。
Ｃ－糖（ｌａｃｔｏｓｅ、ｄｉｓｉａｌｏ）とは、システインの側鎖チオールにＣＨ２ＣＯＮＨリンカーを介して糖鎖が導入された下記（式１）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000128
上記（式１）において、Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅは糖鎖示す。
ｌａｃｔｏｓｅとは下記（式４）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000129
ｄｉｓｉａｌｏとは下記（式８）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000130
表中、ＰＥＧ結合位置の置換後のアミノ酸残基の列に記載した構造について以下に示す。
Ｃ－ＰＥＧ（ＩＡｃ）［Ｌｉ２０（ＩＡｃ）、Ｌｉ４０（ＩＡｃ）、Ｖ４０（ＩＡｃ）、Ｗ４０（ＩＡｃ）、Ｙ５０（ＩＡｃ）］とは、システイン側鎖にＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３Ｏリンカーを介してＰＥＧが導入された下記（式Ｘ４）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000131
Ｃ－ＰＥＧ（Ｍａｌ）［Ｖ４０（Ｍａｌ）、Ｖ８０（Ｍａｌ）、Ｗ８０（Ｍａｌ）、Ｙ５０（Ｍａｌ）］とは、システイン側鎖に３－（３－チオ-２，５-ジオキソピロリジン－１－イル）－プロピルオキシリンカーを介してＰＥＧが導入された下記（式Ｘ５）で表される構造であることを示す。この際、Ｃ－ＰＥＧ（Ｍａｌ）はジオキソピロリジン環が開環した（式Ｘ６）または（式Ｘ７）で表される構造であっても良い。
Figure 0007275049000132
Figure 0007275049000133
Figure 0007275049000134
ＡｃＣ－ＰＥＧ（ＩＡｃ）［Ｌｉ４０（ＩＡｃ）、Ｙ５０（ＩＡｃ）］とは、アセチルシステイン側鎖にＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３Ｏリンカーを介してＰＥＧが導入された下記（式ＸＸ３）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000135
ＡｃＣ－ＰＥＧ（Ｍａｌ）［Ｖ８０（Ｍａｌ）、Ｗ８０（Ｍａｌ）、Ｙ５０（Ｍａｌ）］とは、Ｎ－アセチルシステイン側鎖に３－（３－チオ-２，５-ジオキソピロリジン－１－イル）－プロピルオキシリンカーを介してＰＥＧが導入された下記（式Ｘ８）で表される構造であることを示す。この際、ＡｃＣ－ＰＥＧ（Ｍａｌ）はジオキソピロリジン環が開環した（式Ｘ９）または（式Ｘ１０）で表される構造であってもよい。
Figure 0007275049000136
Figure 0007275049000137
Figure 0007275049000138
Ｌｉ２０とは、上記（式Ｘ４）～（式Ｘ１０）中、ＰＥＧが平均分子量約２０ｋＤａの下記（式Ｘ１１）で表される構造であることを示し、
Figure 0007275049000139
Ｌｉ４０とは、上記（式Ｘ４）～（式Ｘ１０）中、ＰＥＧが平均分子量約４０ｋＤａの上記（式Ｘ１１）で表される構造であることを示し、
Ｖ４０とは、上記（式Ｘ４）～（式Ｘ１０）中、ＰＥＧが平均分子量約４０ｋＤａの下記（式Ｘ１３）で表される構造であることを示し、
Figure 0007275049000140
Ｖ８０とは、上記（式Ｘ４）～（式Ｘ１０）中、ＰＥＧが平均分子量約８０ｋＤａの上記（式Ｘ１３）で表される構造であることを示し、
Ｗ４０とは、上記（式Ｘ４）～（式Ｘ１０）中、ＰＥＧが（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍの平均分子量が５ｋＤａであり、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎの平均分子量が７．５ｋＤａである下記（式Ｘ１４）で表される構造であることを示し、
Figure 0007275049000141
Ｗ８０とは、上記（式Ｘ４）～（式Ｘ１０）中、ＰＥＧが（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍの平均分子量が５ｋＤａであり、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎの平均分子量が１７．５ｋＤａである上記（式Ｘ１４）で表される構造であることを示し、
Ｙ５０とは、上記（式Ｘ４）～（式Ｘ１０）中、ＰＥＧが（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍの平均分子量が１０ｋＤａであり、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎの平均分子量が２０ｋＤａである下記（式Ｘ１５）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000142
（工程１）ＰＥＧ－ハロアセチルの調製
ＰＥＧ－アミン（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２－４００ＰＡ；日油株式会社またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ３－４００ＰＡ１００Ｕ；日油株式会社またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４－４００ＰＡ；日油株式会社）をクロロホルムに溶解し、１－Ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（５当量）、４－ジメチルアミノピリジン（５当量）、ヨード酢酸 （５当量）を加え室温下９０時間撹拌した。エーテル／イソプロパノール=１／１を加え、析出した固体をろ取した。残渣を水に溶解し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５（１０ｋＤａ）を用いた限外濾過によりヨード酢酸を除去し、凍結乾燥することでＰＥＧ－ＩＡｃを合成した。
（工程２）Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体の合成
表５に示す糖鎖結合ＩＬ－２改変体の １ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に、室温下でＰＥＧ－ハロアセチル（５当量、上記工程１で合成した化合物またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ－２００ＩＡ；日油株式会社またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ－４００ＩＡ；日油株式会社）またはＰＥＧ－マレイミド （５．０ｎｍｏｌ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２－８００ＭＡ；日油株式会社またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４－４００ＭＡ１００Ｕ；日油株式会社またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４－８００ＭＡ；日油株式会社）の１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を加えた後、０．１ｍｏｌ/Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．２～７．４に調整し、２時間撹拌した。サイズ排除クロマトグラフィー（カラム；Ｗａｔｅｒｓ製、ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ４５０Ａ、３．５μｍ、７．８×１５０ｍｍとＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ２００Ａ、３．５μｍ、７．８×１５０ｍｍを連結）にて精製し、Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体を合成した。
精製したＣｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した。その結果すべての改変体において、ＰＥＧの分子量が増加した単一のバンドが認められ、高純度のＣｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体が得られたことが確認できた。
［実施例４］大腸菌用８Ｈｉｓ－ＩＬ－２およびｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ヒトＩＬ－２およびｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２発現ベクターの調製
表９に示す大腸菌用８Ｈｉｓ－ＩＬ－２発現ベクターおよびｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２発現ベクターおよびｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２発現ベクターを以下の方法により作製した。
Figure 0007275049000143
〈表９の説明〉
・Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入位置：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端からの位置
・１位修飾：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のアラニン残基の修飾を表す。ＭＨＨＨＨＨＨＨＨＡとは、Ｎ末端アラニン残基にメチオニンおよびポリヒスチジン配列（ＨＨＨＨＨＨＨＨ）タグが結合していることを表す。
・１２５位変異：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２５番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は－、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はＳと記載する。
表中、置換後のアミノ酸残基の列に記載したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓとは下記（式１０）で表される構造を示し、
Figure 0007275049000144
ｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓとは下記（式ＸＸ１）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000145
ＩＬ－２としては、配列番号１で表される野生型成熟ヒトＩＬ－２アミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をシステインからセリンに置換し、かつＮ末端にメチオニンおよびポリヒスチジン配列（ＨＨＨＨＨＨＨＨ）タグが結合したアミノ酸配列からなる８Ｈｉｓ－ＩＬ－２（アミノ酸配列：配列番号２、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列：配列番号３）をもとにして、上記発現ベクターを作製した。
ｐＦＬＡＧ－ＣＴＳ（ＳＩＧＭＡ社製）のｌａｃリプレッサー遺伝子ｌａｃＩの直下流に、ピロリジンｔＲＮＡの塩基配列およびピロリジルｔＲＮＡ合成酵素（以下Ｐｙｌ ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡＰｙｌとも記載する）をコードする塩基配列が挿入されたｐＦＬＡＧ－ＣＴＳ－Ｐｙｌ ＴＳ（国際公開第２０１７／０３０１５６号）のＮｄｅＩ制限酵素サイトとＳａｌＩ制限酵素サイトの間に、８Ｈｉｓ－ＩＬ－２をコードする塩基配列（配列番号３）を挿入することで、大腸菌用の８Ｈｉｓ－ＩＬ－２発現ベクター（以下ｐＦＬＡＧ－ＣＴＳ－Ｐｙｌ ＴＳ＿８Ｈｉｓ－ｈＩＬ－２と記載する）を作製した。
８Ｈｉｓ－ＩＬ－２の塩基配列を基にして、ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓまたはｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓを導入する部位に相当するコドンをアンバー（ＴＡＧ）コドンに置換した塩基配列（配列番号４～１８、２７～３７）をＰＣＲ法または人工遺伝子合成（日本ジーンウィズ株式会社）にて作製した。得られた塩基配列を、ｐＦＬＡＧ－ＣＴＳ－Ｐｙｌ ＴＳ－８Ｈｉｓ－ｈＩＬ－２の８Ｈｉｓ－ＩＬ－２の塩基配列と置換した。
［実施例５］８Ｈｉｓ－ＩＬ－２およびｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ＩＬ－２およびｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２の調製
表１０に示す８Ｈｉｓ－ＩＬ－２およびｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２およびｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２を以下の方法により作製した。
Figure 0007275049000146
〈表１０の説明〉
・Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入位置：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端からの位置
・１位修飾：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のアラニン残基の修飾を表す。ＭＨＨＨＨＨＨＨＨＡとは、Ｎ末端アラニン残基にメチオニンおよびポリヒスチジン配列（ＨＨＨＨＨＨＨＨ）タグが結合していることを表す。
・１２５位変異：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２５番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は－、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はＳと記載する。
表中、置換後のアミノ酸残基の列に記載したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓとは下記（式１０）で表される構造を示し、
Figure 0007275049000147
ｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓとは下記（式ＸＸ１）で表される構造を示す。
Figure 0007275049000148
実施例４で作製した大腸菌用８Ｈｉｓ－ＩＬ－２発現ベクターおよびｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２発現ベクターまたはｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２発現ベクターを大腸菌Ｂ－９５．ｄｅｌＡ［Sci Rep, 2015. 5(9699)］に導入した。８Ｈｉｓ－ＩＬ－２発現ベクターおよび各種ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２発現ベクターまたはｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２発現ベクター１００ｎｇを１００μＬのコンピテントセルに加えて緩やかに混和し、氷上で３０分間静置した。
続いて、４２℃の温浴に３０秒間加温した後、再度氷上に２分間静置した。ＬＢ培地５００μＬを加えて３７℃に設定したインキュベータにて６０分間振とう培養を行った後、終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（和光純薬社製）を含むＬＢプレート（１．５ｗ／ｖ％アガロース）に全量をプレーティングした。３７℃に設定したインキュベータで一晩培養を行った後、プレートで生育してくる大腸菌を遺伝子導入株として選抜した。
得られた遺伝子導入株を全量回収し、終濃度１ｍＭのｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓまたはｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ（国際公開第２０１７／０３０１５６号に記載の方法に従いＧＶＫ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社にて合成）、終濃度１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを添加した８００ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ［ＭＯＰＳ（ナカライテスク社製） １ｗ／ｖ％、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＤＩＦＣＯ社製） ３ｗ／ｖ％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ社製） ２ｗ／ｖ％］に播種し、３７℃に設定したバイオシェーカーで、１６５ｒｐｍで振とう培養した。
菌体溶液の６００ｎｍの吸光度の値が１．５～２．０になった段階で終濃度１．０ｍｍｏｌ／Ｌのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ナカライテスク社製）を添加し、４２℃に設定したバイオシェーカーで、１６５ｒｐｍで３時間振とう培養して各ヒトＩＬ－２を発現させた。
培養後の菌体溶液を遠心分離［ＣＲ２１Ｅ（日立製作所社製）、７０００ｒｐｍ、４℃、５分間］することで大腸菌菌体を回収後、４０ｍＬのＢ－ＰＥＲ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加し溶菌させ、遠心分離（１２０００×ｇ、４℃、５分間）することで封入体を得た。
得られた封入体を３２ｍＬのＩｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｄｙ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて溶解後、再度遠心分離（１２０００×ｇ、４℃、３０分間）し、上清を回収した。
封入体可溶化液を６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩（和光純薬社製）を含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（和光純薬社製）（ｐＨ８．０）で３倍容量に希釈後、ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に添加した。６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩を含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ イミダゾールおよび６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩を含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。２８０ｎｍの吸光度を測定することで、溶出液のタンパク質濃度を測定した。
リフォールディングバッファー［１ｍｍｏｌ／Ｌ 酸化型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）］で上記溶出液を３倍希釈し、４℃にて一晩静置した。その後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（３ｋＤａ）（メルクミリポア社製）で濃縮した。
ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア社製）にＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）を接続し、移動相として２ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩を含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を送液した。上記濃縮液をＳＥＣカラムに添加し、単量体画分を回収した。
得られた画分はＤ－ＰＢＳ（ナカライテスク社製）で２倍希釈し室温にて６時間静置後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（３ｋＤａ）を用いた限界ろ過によりＤ－ＰＢＳにバッファー置換した。
作製したすべてのｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２またはｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて８Ｈｉｓ－ＩＬ－２と同じ分子量のバンドであること確認した。
［実施例６］大腸菌用ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ＩＬ－２発現ベクターの調製
表１１に示す大腸菌用ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ＩＬ－２発現ベクターを以下の方法により作製した。
Figure 0007275049000149
〈表１１の説明〉
・Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入位置：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端からの位置
・１位修飾：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のアラニン残基の修飾を表す。ＭＡとは、Ｎ末端アラニン残基にメチオニンが結合していることを表す。Ｍとは、アラニンからメチオニンにアミノ酸残基を置換する変異を加えていることを表す。
・１２５位変異：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２５番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は－、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はＳと記載する。
表中、置換後のアミノ酸残基の列に記載したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓとは下記（式１０）で表される構造をいう。
Figure 0007275049000150
ＩＬ－２としては、配列番号１で表される野生型成熟ヒトＩＬ－２アミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をシステインからセリンに置換し、かつＮ末端にメチオニン結合したアミノ酸配列からなるＩＬ－２（アミノ酸配列：配列番号３８、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列：配列番号３９）、または配列番号１で表される野生型成熟ヒトＩＬ－２アミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をシステインからセリンに置換し、１番目のアラニン残基を欠損し、かつＮ末端にメチオニン結合したアミノ酸配列（アミノ酸配列：配列番号４０、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列：配列番号４１）からなるＩＬ－２をもとにして、上記発現ベクターを作製した。
ｐＦＬＡＧ－ＣＴＳ－Ｐｙｌ ＴＳのＮｄｅＩ制限酵素サイトとＳａｌＩ制限酵素サイトの間に、ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓを導入する部位に相当するコドンをアンバー（ＴＡＧ）コドンに置換した塩基配列（配列番号４２～５０）を挿入することで、大腸菌用の各種ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ＩＬ－２発現ベクター（以下ｐＦＬＡＧ－ＣＴＳ－Ｐｙｌ ＴＳ＿ｈＩＬ－２と記載する）を作製した。
［実施例７］ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ＩＬ－２の調製
表１２に示すＩＬ－２の任意のアミノ酸残基をｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ残基に置換したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ＩＬ－２は以下の方法で作製した。
Figure 0007275049000151
＜表１２の説明＞
・ｏ－Ａｚ－Ｚ－ＬｙｓＫ導入位置：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端からの位置
・１位修飾：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のアラニン残基の修飾を表す。ＭＡとは、Ｎ末端アラニン残基にメチオニンが結合していることを表す。Ｍとは、アラニンからメチオニンにアミノ酸残基を置換する変異を加えていることを示す。
・１２５位変異：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２５番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は－、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はＳと記載する。
表中、置換後のアミノ酸残基の列に記載したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓとは下記（式１０）で表される構造をいう。
Figure 0007275049000152
実施例６で作製した大腸菌用ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ＩＬ－２発現ベクターを大腸菌Ｂ－９５．ｄｅｌＡ［Sci Rep, 2015. 5(9699)］に導入し、実施例５に記載の方法にて封入体可溶化液を調製した。
ＡＫＴＡ ＦＰＬＣにＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１００ ＨＲ（ＧＥヘルスケア社製）を接続し、移動相として２ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩を含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を送液した。上記封入体可溶化液をＳＥＣカラムに添加し、単量体画分を回収した。
酸化型グルタチオンを２ ｍｍｏｌ／Ｌになるよう添加し、４℃にて一晩静置した。その後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（３ｋＤａ）（メルクミリポア社製）で濃縮しＮＡＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて０．４ ｍｏｌ／Ｌ アルギニン塩酸塩、５ ｗ／ｖ％ トレハロースを含む１０ ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）にバッファー置換した。
作製したｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ＩＬ－２は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにてアミノ酸配列から予想される分子量を有することを確認した。
［実施例８］ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２またはｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２またはｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ＩＬ－２のＰＥＧ化
表１３～１５に示すｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２またはｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２またはｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ＩＬ－２のＰＥＧ化体（以下ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体と記載する）を以下の方法で調製した。
Figure 0007275049000153
Figure 0007275049000154
Figure 0007275049000155
〈表１３、１４および１５の説明〉
・ＰＥＧ導入位置：配列番号１のＮ末端からの位置
・１位修飾：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のアラニン残基の修飾を表す。ＭＡとは、Ｎ末端アラニン残基にメチオニンが結合していることを表し、ＭＨＨＨＨＨＨＨＨＡとは、Ｎ末端アラニン残基にメチオニンおよびポリヒスチジン配列（ＨＨＨＨＨＨＨＨ）タグが結合していることを表す。
・１２５位変異：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２５番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。アミノ酸残基の変異を加えていない場合は－、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はＳと記載する。
表中、置換後のアミノ酸残基の列に記載した構造について以下に示す。
（ｏＡｚＺＫ）－ＰＥＧ（ＰＥＧ４、Ｌｉ２０、Ｌｉ３０、Ｌｉ４０、Ｖ４０、Ｖ８０、Ｗ４０、Ｗ８０、Ｙ５０、ＩＩＩＩ４０）とは、リジンの側鎖アミノ基に、リンカーを介してＰＥＧが導入された下記（式１１）または式（１２）で表される構造であることを示し、
Figure 0007275049000156
Figure 0007275049000157
（ｍＡｚＺＫ）－ＰＥＧ（Ｖ４０）とは、リジンの側鎖アミノ基に、リンカーを介してＰＥＧが導入された下記（式ＸＸ４）または（式ＸＸ５）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000158
Figure 0007275049000159
ＰＥＧ４とは下記（式１３）で表される構造であることを示し、
Figure 0007275049000160
Ｌｉ２０とは、平均分子量約２０ｋＤａである場合の下記（式１５）で表される構造であることを示し、
Figure 0007275049000161
Ｌｉ３０とは、平均分子量約３０ｋＤａである場合の上記（式１５）で表される構造であることを示し、
Ｌｉ４０とは、平均分子量約４０ｋＤａの下記（式Ｘ１０５）で表される構造であることを示し、
Figure 0007275049000162
Ｙ５０とは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍの平均分子量が１０ｋＤａであり、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎの平均分子量が２０ｋＤａである下記（式Ｘ１０７）で表される構造であることを示し、
Figure 0007275049000163
Ｖ４０とは、平均分子量が４０ｋＤａである下記（式Ｘ１０９）で表される構造であることを示し、
Figure 0007275049000164
Ｖ８０とは、平均分子量が８０ｋＤａである上記（式Ｘ１０９）で表される構造であることを示し、
Ｗ４０とは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍの平均分子量が５ｋＤａであり、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎの平均分子量が７．５ｋＤａである下記（式Ｘ１１１）で表される構造であることを示し、
Figure 0007275049000165
Ｗ８０とは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍの平均分子量が５ｋＤａであり、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎの平均分子量が１７．５ｋＤａである下記（式Ｘ１１２）で表される構造であることを示し、
Figure 0007275049000166
ＩＩＩＩ４０とは、平均分子量が４０ｋＤａである下記（式Ｘ１１３）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000167
（工程１ａ）ＰＥＧ－ＤＢＣＯの調製１
ＰＥＧ―カルボン酸（ｍＰＥＧ－ＡＡ ４０Ｋ；Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧ Ｗｏｒｋｓ社製）をクロロホルムに溶解し、１－Ｅｔｈｙｌ－３－（３―ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ （５当量）、４－ジメチルアミノピリジン（５当量）、Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ―ａｍｉｎｅ （５当量、Ａ２７６３；東京化成工業）を加え室温下３時間撹拌した。エーテル／イソプロパノール=１／１を加え、析出した固体をろ取することで、ＰＥＧ－ＤＢＣＯを合成した。
（工程１ｂ）ＰＥＧ－ＤＢＣＯの合成２
ＰＥＧ－ＮＨＳ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２－４００ＧＳ２；日油株式会社またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２－８００ＧＳ２；日油株式会社またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４－４００ＧＳ２；日油株式会社またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４－８００ＴＳ；日油株式会社またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２－４００ＧＳ１００Ｕ；日油株式会社またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＸＹ４－４００ＴＳ；日油株式会社）をクロロホルムに溶解し、Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ―ａｍｉｎｅ （５当量、Ａ２７６３；東京化成工業）を加え室温下３時間撹拌した。エーテル／イソプロパノール＝１／１を加え、析出した固体をろ取することで、ＰＥＧ－ＤＢＣＯを合成した。
（工程２）ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体の調製
ＰＥＧ－ＤＢＣＯ（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ ２０ｋＤａ（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ社製）、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ ３０ｋＤａ（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ社製）または工程１ａもしくは工程１ｂにて調製したＰＥＧ－ＤＢＣＯをＤ－ＰＢＳで溶解し、これをｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２またはｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２またはｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ＩＬ－２に２０ｍｏｌ当量添加し、室温にて一晩静置した。
ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＦＬＡＧを結合させたＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体はＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて、メーカーマニュアルに記載の手順で目的タンパク質を精製した。
ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＦＬＡＧ以外のＰＥＧを結合させたＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体は、はじめにＭｏｎｏＳ ５／５０ＧＬ(ＧＥヘルスケア社製)を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより未反応のＰＥＧを除去した。移動相には５０ ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用いた。ついでＳｕｐｅｒｒｏｓｅ６ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３０ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによりＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体を分取した。移動相には、２ ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩を含む１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いた。
得られたＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（３ｋＤａ）を用いた限界ろ過、またはＮＡＰカラムによりＤ－ＰＢＳ又は５ｗ／ｖ％ トレハロースを含む１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．５）又は０．４ ｍｏｌ／Ｌアルギニン塩酸塩、５ｗ／ｖ％ トレハロースを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）にバッファー置換した。
精製したＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した。その結果すべてのＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体において、ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２またはｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２またはｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入ＩＬ－２に対してＰＥＧの分子量が増加した単一のバンドが認められ、高純度のＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体が得られたことが確認できた。
［実施例９］ Ｉ１２９Ｃ変異ＩＬ－２発現ベクターの調製
配列番号１で表される野生型成熟ヒトＩＬ－２アミノ酸配列の１番目のアラニンを欠損し、１２５番目のアミノ酸残基をシステインからセリンに、１２９番目のアミノ酸残基をイソロイシンからシステインに置換し、かつＮ末端にメチオニンが結合したアミノ酸配列からなるＩＬ－２（アミノ酸配列：配列番号５１、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列：配列番号５２、以下ＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃと記載する）をもとにして、上記発現ベクターを作製した。
ＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃの塩基配列（配列番号５２）を人工遺伝子合成（株式会社ラグアスジャパン）にて調製し、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトの間に挿入することで、大腸菌用のＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃ発現ベクター（以下ｐＥＴ－２２ｂ（＋）-ｈＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃと記載する）を作製した。
Figure 0007275049000168
＜表１６の説明＞
・Ｃｙｓ変異位置：配列番号１のＮ末端からの位置
・１位修飾：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のアラニン残基の修飾を表す。Ｍとは、アラニンからメチオニンにアミノ酸残基を置換していることを示す。
・１２５位変異：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２５番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。アミノ酸残基の変異を加えていない場合は－、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はＳと記載する。
［実施例１０］ＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃの調製
ＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃを下記に記載の方法で作製した。実施例９で作製した大腸菌用ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｈＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製)に導入し、実施例５に記載の方法にて封入体を得た。
得られた封入体を１５ ｍＬの６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にて溶解後、６０℃で３０分間加温し、遠心分離（１９０００×ｇ、４℃、３０分間）することで上清を回収した（封入体可溶化液）。
封入体可溶化液に１５ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し室温で１０分間静置後、遠心分離（１９０００×ｇ、４℃、３０分間）することで沈殿を回収した。
得られた沈殿を再度６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＡＴを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にて溶解した（沈殿可溶化液）。
ＡＫＴＡ ＦＰＬＣにＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１００ＨＲ（ＧＥヘルスケア社製）を接続し、移動相として６ ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を送液した。上記沈殿可溶化液をＳＥＣカラムに添加し、単量体画分を回収した。
リフォールディングは以下の方法で実施した。上記で調製した単量体ＩＬ－２＿Ｉ１２９ＣをＮＡＰカラムを用いて６ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩を含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にバッファー交換後、２ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、１０ｖｏｌ％グリセロール、６．９ｍｍｏｌ／Ｌ 還元型グルタチオン、０．７ｍｍｏｌ／Ｌ 酸化型グルタチオンを含む１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）にし、室温で一晩静置した。その後、Ｐｒｏｔｅｏｖａｖｉ（資生堂社製）を用いた逆相ＨＰＬＣにてリフォールディング画分を分取し、凍結乾燥した。
作製したＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃの純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した。その結果、アミノ酸配列から予想される分子量を有する単一のバンドを確認した。
[実施例１１] ＩＬ－２＿Ｉ１２９ＣのＰＥＧ化
表１７に示すＩＬ－２＿Ｉ１２９ＣのＰＥＧ化体（以下ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体と記載する）を以下の方法で調製した。
Figure 0007275049000169
〈表１７の説明〉
・ＰＥＧ導入位置：配列番号１のＮ末端からの位置。
・１位修飾：配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目のアラニン残基の修飾を表す。Ｍとは、アラニンからメチオニンにアミノ酸残基を置換していることを示す。
・１２５位変異：配列番号１のＮ末端から１２５番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。アミノ酸残基の変異を加えていない場合は－、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はＳと記載する。
表中、置換後のアミノ酸残基の列に記載した構造について以下に示す。
Ｃ－ＰＥＧ（Ｍａｌ）（Ｖ４０、Ｖ８０、Ｗ８０）とは、システイン側鎖に３－（３－チオ－２，５-ジオキソピロリジン－１－イル）－プロピルオキシリンカーを介してＰＥＧが導入された下記（式Ｘ１１９）で表される構造であることを示す。この際、Ｃ－ＰＥＧ（Ｍａｌ）はジオキソピロリジン環が開環した（式Ｘ１２０）または（式Ｘ１２１）で表される構造であってもよい。
Figure 0007275049000170
Figure 0007275049000171
Figure 0007275049000172
Ｖ４０とは、上記（式Ｘ１１９）～（式Ｘ１２１）中、ＰＥＧが平均分子量約４０ｋＤａの下記（式Ｘ１２２）で表される構造であることを示し、
Figure 0007275049000173
Ｖ８０とは、上記（式Ｘ１１９）～（式Ｘ１２１）中、ＰＥＧが平均分子量約８０ｋＤａの上記（式Ｘ１２２）で表される構造であることを示し、
Ｗ８０とは、上記（式Ｘ１１９）～（式Ｘ１２１）中、ＰＥＧが（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍの平均分子量が５ｋＤａであり、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎの平均分子量が１７．５ｋＤａである下記（式Ｘ１２８）で表される構造であることを示す。
Figure 0007275049000174
実施例１０で調製したＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃの凍結乾燥品を２ｍｏｌ／Ｌ グアニジン塩酸塩、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを含む２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）にて溶解した。ＰＥＧ－マレイミド（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２－４００ＭＡ；日油株式会社またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２－８００ＭＡ；日油株式会社またはＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ４－８００ＭＡ；日油株式会社）をＤ－ＰＢＳで溶解し、これをＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃに対して２０ｍｏｌ当量添加し、室温にて一晩静置した。ＰＥＧ結合ＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃは、実施例８に記載の方法で精製した。得られたＰＥＧ結合ＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃは、ＮＡＰカラムを用いて０．４ｍｏｌ／Ｌ アルギニン塩酸塩、５ｗ／ｖ％ トレハロースを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）にバッファー置換した。
精製したＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した。その結果すべてのＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体において、ＩＬ－２＿Ｉ１２９Ｃに対してＰＥＧの分子量が増加した単一のバンドが認められ、高純度のＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体が得られたことが確認できた。
[実施例１２]ＩＬ－２Ｒαβγ選択性の評価
作製したＩＬ－２改変体のヒトＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性を以下の方法で評価した。
マウスｐｒｏ Ｂ細胞株Ｂａ／Ｆ３（ＲＣＢ０８０５）にヒトＩＬ－２Ｒαβγ、又はヒトＩＬ－２Ｒβγを発現させることで、ヒトＩＬ－２依存性生存細胞株を作製した。各細胞は、ヒトＣＤ２５、ヒトＣＤ１２２、ヒトＣＤ１３２およびｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎをｆｕｒｉｎ切断配列（ＲＡＫＲ）とｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ－ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ由来２Ａペプチド配列（ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）を介して連結したヒトＩＬ－２Ｒαβγ－Ａｚａｍｉｇｒｅｅｎ融合体のアミノ酸配列（配列番号１９）をコードする遺伝子配列（配列番号２０）またはヒトＣＤ１２２、ヒトＣＤ１３２およびｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎをｆｕｒｉｎ切断配列とｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ－ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ由来２Ａペプチド配列を介して連結したヒトＩＬ－２Ｒβγ－Ａｚａｍｉｇｒｅｅｎ融合体のアミノ酸配列（配列番号２１）をコードする遺伝子配列（配列番号２２）を有するｐＤＥＬＴＡベクターをＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂ（Ｌｏｎｚａ社製）を用いてＢａ／Ｆ３に遺伝子導入し、ヒトＩＬ－２に依存性を示すクローンを選抜することで得た。得られた細胞はそれぞれＢａ／Ｆ３－ｈＩＬ－２ＲαβγおよびＢａ／Ｆ３－ｈＩＬ－２Ｒβγとした。
Ｂａ／Ｆ３－ｈＩＬ－２ＲαβγおよびＢａ／Ｆ３－ｈＩＬ－２Ｒβγを遠心管に回収し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離後、上清を吸引除去した。Ｄ－ＰＢＳにて４回洗浄後、アッセイ用培地［ＲＰＭＩ １６４０培地（ナカライテスク社製） ５００ｍＬに非働化ＦＢＳ ５０ｍＬ（ＧＩＢＣＯ社製）およびペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク社製）５ｍＬを加えた培地］にて細胞を５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁し、９６穴白色平底プレート（住友ベークライト社製）に１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。
アッセイ用培地（０％コントロール）、アッセイ用培地にて３９０ｎｍｏｌ／Ｌに希釈した市販ＩＬ－２溶液（終濃度６５ｎｍｏｌ／Ｌ、１００％コントロール）および、アッセイ用培地にて終濃度の６倍濃度に希釈した市販ＩＬ－２であるＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社製ＩＬ－２［以下、ＩＬ－２（Ｐ）と記載する］およびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＩＬ－２［以下、ＩＬ－２（Ｔ）と記載する］又は各種糖鎖結合ＩＬ－２溶液（最高終濃度６５ｎＭ、１０倍の希釈系列で９条件）を２０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４～４８時間培養した。
Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を８０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温にて１０分間静置後、マルチプレートリーダーＡＲＶＯ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光値を測定した。
ＩＬ－２（Ｐ）またはＩＬ－２（Ｔ）を終濃度 ６５ｎｍｏｌ／ｍＬで添加したウェルのｒｅｌａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｕｎｉｔｓ（ＲＬＵ）値を１００％、ＩＬ－２を含まない培地を添加したウェルのＲＬＵ値を０％として、各種改変体のＩＬ－２依存性細胞増殖率（％ ｏｆ ＩＬ－２－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を算出した。得られたデータを基に、統計解析ソフトＸＬｆｉｔ５ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．３．１．３（ＩＢＤＳ社製）を用いてＥＣ５０値の算出を行った。
ＩＬ－２（Ｐ）またはＩＬ－２（Ｔ）よび各種糖鎖結合ＩＬ－２改変体に関し、Ｂａ／Ｆ３－ｈＩＬ－２Ｒαβγに対するＥＣ５０値（ＥＣ５０αβγ）とＢａ／Ｆ３－ｈＩＬ－２ＲβγのＥＣ５０値（ＥＣ５０βγ）の比（ＥＣ５０βγ／ＥＣ５０αβγ）をＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値と定義し、ＩＬ－２Ｒαβγ選択性の指標として用いた。
ＩＬ－２（Ｐ）またはＩＬ－２（Ｔ）のＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値を１とした時の、各種糖鎖結合ＩＬ－２改変体のＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値を標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値として、表１８～２０に示す。
Figure 0007275049000175
Figure 0007275049000176
Figure 0007275049000177
表１８～２０において、標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値が５以上の糖鎖結合ＩＬ－２改変体およびＮ末ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２およびＣｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２を、コントロールであるＩＬ－２（Ｐ）またはＩＬ－２（Ｔ）よりもＩＬ－２Ｒαβγ選択性が高い改変体と判断した。
表１８～２０に示すように、多数の糖鎖結合ＩＬ－２改変体およびＮ末ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２およびＣｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２がＩＬ－２（Ｐ）またはＩＬ－２（Ｔ）よりもＩＬ－２Ｒαβγ選択性が高い改変体であることが確認できた。さらに、Ｑ１３Ｃ－２、Ｑ１３Ｃ－１１、Ｅ１５Ｃ－２、Ｅ１５Ｃ－１１、Ｈ１６Ｃ－２、Ｈ１６Ｃ－３、Ｈ１６Ｃ－５、Ｈ１６Ｃ－９、Ｌ１９Ｃ－２、Ｌ１９Ｃ－９、Ｌ１９Ｃ－１１、Ｌ１９Ｃ－１１＊、Ｎ８８Ｃ－２、Ｉ９２Ｃ－２、Ｓ１３０Ｃ－２、Ｓ１３０Ｃ－９、Ｅ１５Ｃ－１７、Ｌ１９Ｃ－１７、Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ１１５Ｃ－１１、Ｌ１２Ｃ－１１／Ｎ１１９Ｃ－１１、Ｑ１３Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｑ１３Ｃ－１１／Ｖ１１５Ｃ－１１、Ｑ１３Ｃ－１１／Ｎ１１９Ｃ－１１、Ｌ１９Ｃ－１１／Ｖ１１５Ｃ－１１、Ｖ９１Ｃ－１１／Ｖ１１５Ｃ－１１、Ｖ９１Ｃ－１１／Ｎ１１９Ｃ－１１、Ａ１Ｃ－１１／Ｔ３Ｃ－１１／Ｓ５Ｃ－１１／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－１１／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｔ５１Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１／Ｅ１００Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－１１／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｋ７６Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１／Ｅ１００Ｃ－１１、Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１／Ｅ１００Ｃ－１１／Ｔ１０２Ｃ－１１／Ｍ１０４Ｃ－１１、Ａ１－Ｌｉ２０（ＣＨＯ）／Ｑ１１Ｃ－９、Ａ１－Ｌｉ２０（ＣＨＯ）／Ｌ１２Ｃ－９、Ａ１－Ｌｉ２０（ＣＨＯ）／Ｒ３８Ｃ－９、Ａ１－Ｌｉ２０（ＣＨＯ）／Ｖ９１Ｃ－９、Ａ１Ｃ－Ｌｉ４０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ａ１Ｃ－Ｖ８０（Ｍａｌ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ａ１Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ａ１Ｃ－Ｙ５０（Ｍａｌ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ａ１Ｃ－Ｗ８０（Ｍａｌ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ａ１Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１９Ｃ－１１、Ａ１Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）／Ｌ１９Ｃ－１１、Ａ１Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｖ９１Ｃ－１１／Ｎ１１９Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｌｉ２０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｌｉ４０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－２、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（Ｍａｌ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）／Ｅ１５Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ８０（Ｍａｌ）／Ｅ１５Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｅ１５Ｃ－１１、Ｆ７８Ｃ－Ｌｉ４０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１、Ｆ７８Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１、Ｆ７８Ｃ－Ｖ４０（Ｍａｌ）／Ｌ１２Ｃ－１１、Ｆ７８Ｃ－Ｖ８０（Ｍａｌ）／Ｌ１２Ｃ－１１、Ｆ７８Ｃ－Ｗ８０（Ｍａｌ）／Ｌ１２Ｃ－１１、Ｆ７８Ｃ－Ｌｉ４０（ＩＡｃ）／Ｅ１５Ｃ－１１は標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値が３０より大きく、コントロールであるＩＬ－２（Ｐ）またはＩＬ－２（Ｔ）よりもＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が非常に高い糖鎖結合ＩＬ－２改変体およびＮ末ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２およびＣｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２であることが確認できた。
各種ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体についても、同様の方法でＩＬ－２依存性細胞増殖率を測定して標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値を算出した結果を、表２１および表２２に示す。ただし、糖鎖結合ＩＬ－２改変体のコントロールはＩＬ－２（Ｐ）またはＩＬ－２（Ｔ）であったのに対し、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体のコントロールはＩＬ－２（Ｐ）または８Ｈｉｓ－ＩＬ－２を使用した。
Figure 0007275049000178
Figure 0007275049000179
表２１および表２２において、標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値が５以上のＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体を、コントロールである８Ｈｉｓ－ＩＬ－２よりもＩＬ－２Ｒαβγ選択性が高い改変体と判断した。
表２１および表２２に示すように、多数のＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体が８Ｈｉｓ－ＩＬ－２よりもＩＬ－２Ｒαβγ選択性が高い改変体であることが確認できた。さらに８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－ＩＩＩＩ４０、Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ８０、Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ８０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｍＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０, ８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－ＩＩＩＩ４０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ８０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ８０、ｄｅｓＡｌａ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ） －Ｖ４０、ｄｅｓＡｌａ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ８０、ｄｅｓＡｌａ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ８０、Ｉ１２９Ｃ－Ｖ４０(Ｍａｌ)、Ｉ１２９Ｃ－Ｖ８０（Ｍａｌ）、Ｉ１２９Ｃ－Ｗ８０（Ｍａｌ）、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０および８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０は標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値が３０より大きく、コントロールであるＩＬ－２（Ｐ）または８Ｈｉｓ－ＩＬ－２よりもＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が非常に高いＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体であることが確認できた。
上記の実験において、ＩＬ－２（Ｐ）、ＩＬ－２（Ｔ）、野生型ＩＬ－２および８Ｈｉｓ－ＩＬ－２のＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値が同程度であることを確認している。したがって、表１８～２０において標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値が５以上の糖鎖結合ＩＬ－２改変体、およびＰＥＧ化糖鎖結合ＩＬ－２改変体、ならびに表２１および表２２において標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値が５以上のＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体は、野生型ＩＬ－２よりもＩＬ－２Ｒαβγ選択性が高い改変体である。
［実施例１３］Ｔｒｅｇ増殖活性
各種ＩＬ－２のヒトＴｒｅｇに対する細胞増殖活性を以下の方法で測定した。各種ＩＬ－２として、糖鎖結合ＩＬ－２改変体としてＨ１６Ｃ－２、Ｅ１５Ｃ－１１、Ｌ１９Ｃ－９、Ｌ１９Ｃ－１１、Ｎ８８Ｃ－２、Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｖ９１Ｃ－１１／Ｖ１１５Ｃ－１１、Ｖ９１Ｃ－１１／Ｎ１１９Ｃ－１１およびＡ１Ｃ－１１／Ｔ３Ｃ－１１／Ｓ５Ｃ－１１／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体として、Ａ１Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｌｉ２０（ＩＡｃ）/Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）/Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）/Ｅ１５Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）/Ｅ１５Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ8０（Ｍａｌ）/Ｅ１５Ｃ－１１およびＦ７８Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）/Ｌ１２Ｃ－１１、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体として、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｔ７（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｅ６０（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｒ８１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｌ９４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｅ１００（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｔ１０１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｑ１２６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ８０、Ｉ１２９Ｃ－Ｖ４０(Ｍａｌ)、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０および８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０ならびにコントロールとしてＩＬ－２（Ｐ）および８Ｈｉｓ－ＩＬ－２を使用した。
凍結ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）（ＡｌｌＣｅｌｌｓ社製）を３７℃の温浴にて溶解後、培養用培地［Ｘ－ｖｉｖｏ１５ ＳＦＭ（Ｌｏｎｚａ社製） １０００ｍＬ、非働化ヒトＡＢ血清 （ＳＩＧＭＡ社製）１５０ｍＬ］１０ｍＬに懸濁し、接着用Ｔ－７５フラスコ（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ社製）に播種して２４時間静置培養した（３７℃、９５ｖｏｌ％ ａｉｒ／５ｖｏｌ％ ＣＯ２下）。細胞を全量回収し、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ Ｔｃｅｌｌｓ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮した。
Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４－Ａｌｅｘａ４８８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ２５－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１２７－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）にて染色後（氷上、３０分間）、セルソーターＳＨ８００（ＳＯＮＹ社製）にてＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ画分（Ｔｒｅｇ）を分離した。
分離したＴｒｅｇおよび培養用培地にて３回洗浄したＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を混合して、それぞれ３．４×１０４個／ｍＬになるよう培養用培地にて懸濁し、９６穴Ｕ底プレート（ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１５０μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。培養用培地で終濃度の４倍濃度に希釈した各種ＩＬ－２溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して、３７℃、５％ ＣＯ２下で培養を開始した。
５～７日間培養した後、各ウェルの全液量のうち５０μＬを、９６穴白色プレートに移した。Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温にて１０分間静置した後、ルミノメーター（ＴＵＲＮＥＲ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製）にて発光値を測定した。
コントロールのＩＬ－２（Ｐ）または８Ｈｉｓ－ＩＬ－２を終濃度６５ｎｍｏｌ／Ｌで添加したウェルのＲＬＵ値を１００％、ＩＬ－２を含まない培地を添加したウェルのＲＬＵ値を０％として、各種ＩＬ－２のＴｒｅｇ増殖率を算出した。
得られた結果を図１Ａ～Ｊに示す。図１Ａ～Ｃに示すように、ＩＬ－２（Ｐ）はＩＬ－２濃度６５０ｐｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示したのに対し、糖鎖結合ＩＬ－２改変体であるＨ１６Ｃ－２、Ｅ１５Ｃ－１１、Ｌ１９Ｃ－９、Ｌ１９Ｃ－１１＊、Ｎ８８Ｃ－２、Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｖ９１Ｃ－１１／Ｖ１１５Ｃ－１１およびＶ９１Ｃ－１１／Ｎ１１９Ｃ－１１、Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体であるＴ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）/Ｅ１５Ｃ－１１は、ＩＬ－２濃度６５０～６５００ｐｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示した。
また、Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体である、Ｌ１２Ｃ－１１／Ｆ７８Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）は、ＩＬ－２濃度６５ｎｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示した。糖鎖結合ＩＬ－２改変体である、Ａ１Ｃ－１１／Ｔ３Ｃ－１１／Ｓ５Ｃ－１１／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体である、Ａ１Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｌｉ２０（ＩＡｃ）/Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）/Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）/Ｅ１５Ｃ－１１およびＴ３Ｃ－Ｖ8０（Ｍａｌ）/Ｅ１５Ｃ－１１は、ＩＬ－２濃度６５ｎｍｏｌ／ＬにおいてもＩＬ－２依存性細胞増殖率は８０％以下であった。
また、図１Ｄ～Ｊに示すように、コントロールである８Ｈｉｓ－ＩＬ－２はＩＬ－２濃度６５００ｐｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示したのに対し、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体である８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｔ７（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｅ６０（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｒ８１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｌ９４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｅ１００（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｔ１０１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｑ１２６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、Ｉ１２９Ｃ－Ｖ４０(Ｍａｌ)、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、および８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０は、ＩＬ－２濃度６５０～６５００ｐｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示した。
また、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体であるＩ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ８０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０および８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０は、ＩＬ－２濃度６５ｎｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示した。
以上の結果から、評価した全てのＩＬ－２改変体がＴｒｅｇの細胞増殖活性を有することが確認された。また、コントロールであるＩＬ－２（Ｐ）または８Ｈｉｓ－ＩＬ－２（Ｐ）に対して、各種ＩＬ－２改変体、糖鎖結合ＩＬ－２改変体であるＨ１６Ｃ－２、Ｅ１５Ｃ－１１、Ｌ１９Ｃ－９、Ｌ１９Ｃ－１１＊、Ｎ８８Ｃ－２、Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｖ９１Ｃ－１１／Ｖ１１５Ｃ－１１およびＶ９１Ｃ－１１／Ｎ１１９Ｃ－１１、Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体であるＴ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）/Ｅ１５Ｃ－１１、並びにＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体である８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｔ７（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｅ６０（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｒ８１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｌ９４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｅ１００（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｔ１０１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｑ１２６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０, ８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、Ｉ１２９Ｃ－Ｖ４０(Ｍａｌ)、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、および８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０のＴｒｅｇ増殖活性は維持されていた。
また、コントロールであるＩＬ－２（Ｐ）または８Ｈｉｓ－ＩＬ－２（Ｐ）に対して、各種ＩＬ－２改変体、糖鎖結合ＩＬ－２改変体であるＡ１Ｃ－１１／Ｔ３Ｃ－１１／Ｓ５Ｃ－１１／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体であるＡ１Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｌｉ２０（ＩＡｃ）/Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）/Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）/Ｅ１５Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ８０（Ｍａｌ）/Ｅ１５Ｃ－１１およびＦ７８Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）/Ｌ１２Ｃ－１１、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体である、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ８０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０および８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０のＴｒｅｇ増殖活性は低下した。
［実施例１４］ＮＫ細胞増殖活性
各種ＩＬ－２のヒトＮＫ細胞の細胞増殖活性を以下の方法で測定した。各種ＩＬ－２改変体として、糖鎖結合ＩＬ－２改変体として、Ｈ１６Ｃ－２、Ｅ１５Ｃ－１１、Ｌ１９Ｃ－９、Ｌ１９Ｃ－１１＊、Ｎ８８Ｃ－２、Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｖ９１Ｃ－１１／Ｖ１１５Ｃ－１１、Ｖ９１Ｃ－１１／Ｎ１１９Ｃ－１１およびＡ１Ｃ－１１／Ｔ３Ｃ－１１／Ｓ５Ｃ－１１／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体として、Ａ１Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｌｉ２０（ＩＡｃ）/Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）/Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）/Ｅ１５Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）/Ｅ１５Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ8０（Ｍａｌ）/Ｅ１５Ｃ－１１およびＦ７８Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）/Ｌ１２Ｃ－１１、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体として、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｔ７（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｅ６０（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｒ８１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｌ９４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｅ１００（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｔ１０１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｑ１２６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ８０、Ｉ１２９Ｃ－Ｖ４０(Ｍａｌ)、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０および８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０ならびにコントロールとしてＩＬ－２（Ｐ）および８Ｈｉｓ－ＩＬ－２を使用した。
ヒトＰＢＭＣからのＮＫ細胞の分離は下記方法で実施した。実施例１３に記載の方法にて凍結ヒトＰＢＭＣを解凍し、ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてＣＤ５６＋ ＮＫ細胞を分離した。分離した細胞を培養用培地にて３回洗浄後（１５００ｒｐｍ、室温、５分間）、下記の増殖アッセイに供した。
分離したＮＫ細胞を１．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう培養用培地またはＸ－ｖｉｖｏ１０ ＳＦＭ（Ｌｏｎｚａ社製）にて懸濁し、９６穴Ｕ底プレートに１５０μＬ／ｗｅｌｌ（２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）ずつ播種した。培養用培地またはＸ－ｖｉｖｏ１０ ＳＦＭで終濃度の４倍濃度に希釈したＩＬ－２溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃、５％ ＣＯ２下で４～６日間培養した。その後、各種ＩＬ－２のＮＫ細胞増殖率を実施例１３に記載の方法にて算出した。
増殖用培地を用いて得られた結果を図２Ａ～Ｈに、Ｘ－ｖｉｖｏ １０ ＳＦＭを用いて得られた結果を図２Ｉ～Ｋに示す。
図２Ａ、ＨおよびＫに示すように、ＩＬ－２（Ｐ）は増殖用培地ではＩＬ－２濃度６５００ｐｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示したのに対し、糖鎖結合ＩＬ－２改変体である、Ｈ１６Ｃ－２およびＬ１９Ｃ－９は、ＩＬ－２濃度６５ｎｍｏｌ／ＬにおいてもＩＬ－２依存性細胞増殖率は２０％以上、８０％未満であり、糖鎖結合ＩＬ－２改変体である、Ｎ８８Ｃ－２およびＬ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体である、Ａ１Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｌｉ２０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）/Ｅ１５Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）/Ｅ１５Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ８０（Ｍａｌ）／Ｅ１５Ｃ－１１およびＬ１２Ｃ－１１／Ｆ７８Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）は、ＩＬ－２濃度６５ｎｍｏｌ／ＬにおいてもＩＬ－２依存性細胞増殖率は２０％未満を示した。
また、ＩＬ－２（Ｐ）はＸ－ｖｉｖｏ １０ ＳＦＭではＩＬ－２濃度６５ｐｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示したのに対し、糖鎖結合ＩＬ－２改変体である、Ｅ１５Ｃ－１１はＩＬ－２濃度６５００ｐｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示し、糖鎖結合ＩＬ－２改変体である、Ｌ１９Ｃ－１１＊、Ｖ９１Ｃ－１１／Ｖ１１５Ｃ－１１およびＶ９１Ｃ－１１／Ｎ１１９Ｃ－１１は、ＩＬ－２濃度６５ｎｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示し、糖鎖結合ＩＬ－２改変体である、Ａ１Ｃ－１１／Ｔ３Ｃ－１１／Ｓ５Ｃ－１１／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１はＩＬ－２濃度６５ｎｍｏｌ／ＬにおいてもＩＬ－２依存性細胞増殖率は２０％以下であった。
次いで図２Ｂ～ＧおよびＩ～Ｊに示すように、８Ｈｉｓ－ＩＬ－２は増殖用培地ではＩＬ－２（Ｐ）と同様にＩＬ－２濃度６５００ｐｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示したのに対し、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体である、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｔ７（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｅ６０（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｒ８１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｌ９４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｅ１００（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｔ１０１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０および８Ｈｉｓ－Ｑ１２６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０ はＩＬ－２濃度６５ｎｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示し、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体である、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０および８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０はＩＬ－２濃度６５ｎｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が２０％以上、８０％未満であり、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体である、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ８０、Ｉ１２９Ｃ－Ｖ４０（Ｍａｌ）、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０およびＫ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０はＩＬ－２濃度６５ ｎｍｏｌ／ＬにおいてもＩＬ－２依存性細胞増殖率は２０％未満であった。また、ＩＬ－２（Ｐ）はＸ－ｖｉｖｏ １０ ＳＦＭではＩＬ－２濃度６５ｐｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示したのに対し、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体である、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０および８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０はＩＬ－２濃度６５ｎｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率が８０％以上を示し、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体である、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０および８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０はＩＬ－２濃度６５ｎｍｏｌ／ＬにおいてもＩＬ－２依存性細胞増殖率は２０％以上、８０％未満であった。８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０は最大添加濃度６５００ ｐｍｏｌ／ＬにおいてＩＬ－２依存性細胞増殖率は３０％であった。
以上の結果から、評価した全てのＩＬ－２改変体においてＮＫ細胞に対する細胞増殖活性が低下していることが確認された。特に、糖鎖結合ＩＬ－２改変体であるＨ１６Ｃ－２、Ｅ１５Ｃ－１１、Ｌ１９Ｃ－９、Ｌ１９Ｃ－１１＊、Ｎ８８Ｃ－２、Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｖ９１Ｃ－１１／Ｖ１１５Ｃ－１１、Ｖ９１Ｃ－１１／Ｎ１１９Ｃ－１１およびＡ１Ｃ－１１／Ｔ３Ｃ－１１／Ｓ５Ｃ－１１／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｃｙｓ－ＰＥＧ化、糖鎖結合ＩＬ－２改変体であるＡ１Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｌｉ２０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｌ１２Ｃ－１１／Ｖ９１Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｙ５０（ＩＡｃ）／Ｅ１５Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）／Ｅ１５Ｃ－１１、Ｔ３Ｃ－Ｖ８０（Ｍａｌ）／Ｅ１５Ｃ－１１およびＬ１２Ｃ－１１／Ｆ７８Ｃ－Ｖ４０（ＩＡｃ）、ＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体である８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ８０、Ｉ１２９Ｃ－Ｖ４０（Ｍａｌ）、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０および８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０は、コントロールであるＩＬ－２（Ｐ）および８Ｈｉｓ－ＩＬ－２よりも大きく細胞増殖活性が低下していることが確認された。
ＴｒｅｇはＩＬ－２Ｒαβγを発現しており、ＮＫ細胞はＩＬ－２Ｒβγを発現している。実施例１３および１４の結果から、評価した全てのＩＬ－２改変体は、ＩＬ－２Ｒβγを発現するＮＫ細胞ではなく、ＩＬ－２Ｒαβγを発現するＴｒｅｇを選択的に増殖させることが明らかとなった。
［実施例１５］ＩＬ－２刺激Ｔｒｅｇによる、Ｔｒｅｓｐの増殖阻害活性
以下に記載する方法で、各種ＩＬ－２で刺激して増殖させたヒトＴｒｅｇによる、ヒトＴｒｅｓｐの増殖阻害活性を測定した。すべての細胞は同一ロットの凍結ヒトＰＢＭＣより分離した。各種ＩＬ－２としては、糖鎖結合ＩＬ－２改変体Ｈ１６Ｃ－２、Ｌ１９Ｃ－９、およびＮ８８Ｃ－２ならびにコントロールとしてＩＬ－２（Ｐ）を使用した。
アッセイの７日前に、実施例１３に記載の方法で、凍結ヒトＰＢＭＣからＴｒｅｇを分離した。得られたＴｒｅｇをＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｒｅｇ：ｂｅａｄｓ＝１：１）および各種ＩＬ－２（終濃度６５ｎＭ）存在下で７日間培養した。得られた細胞をＩＬ－２刺激Ｔｒｅｇとした。
試験当日の細胞調製は次の通りに実施した。実施例１３に記載の方法で凍結ヒトＰＢＭＣからＴｒｅｇを分離し、これを未刺激Ｔｒｅｇとした。凍結ヒトＰＢＭＣからＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）およびＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｐａｎ－ＣＤ２５ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてＣＤ３＋ＣＤ２５－Ｔ細胞を分離後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で４０μｍｏｌ／Ｌに希釈したＣｅｌｌｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を室温にて５分間反応させることで細胞をラベリングした。
得られた細胞はレスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）とした。凍結ヒトＰＢＭＣからＡｎｔｉ－ＨＬＡ－ＤＲ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いてＨＬＡ－ＤＲ＋細胞を分離した。得られた細胞はＡＰＣ（Ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）とした。
得られた細胞は抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を終濃度０．５μｇ／ｍＬになるよう添加したＸ－ｖｉｖｏ１５ＳＦＭで懸濁後、Ｔｒｅｓｐは２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（５０μＬ）、ＡＰＣは１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（５０μＬ）、Ｔｒｅｇは１．６×１０２～５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（５０μＬ）（Ｔｒｅｓｐ：Ｔｒｅｇ＝４：１～１２８：１）で９６穴Ｖ底プレート（住友ベークライト社製）に播種し、３７℃、５％ ＣＯ２下で４日間培養した。
その後、細胞をａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４－ＡＰＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）およびａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８－ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）で染色（室温にて１５分間）した後に、フローサイトメーターＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にて各種蛍光強度を測定した。
得られたデータは、ＦＣＳ ｆｉｌｅとして出力した後に、データ解析ソフトＦＬｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ、ｖｅｒｓｉｏｎ７．６．５）を用いてＣＤ４＋ＴｒｅｓｐまたはＣＤ８＋Ｔｒｅｓｐにおける細胞の平均***回数であるｄｉｖｉｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ値について解析を行った。
ＡＰＣとＴｒｅｓｐを添加し、Ｔｒｅｇ無添加のウェルのｄｉｖｉｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ値を１００％コントロール、Ｔｒｅｓｐのみ添加したウェルのｄｉｖｉｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ値を０％コントロールとして、未刺激Ｔｒｅｇ、またはＩＬ－２刺激Ｔｒｅｇ添加時のＴｒｅｓｐの細胞増殖率を算出した。得られた結果を図３（Ａ）および図３（Ｂ）に示す。
図３（Ａ）および図３（Ｂ）に示すように、ＣＤ４＋ＴｒｅｓｐおよびＣＤ８＋Ｔｒｅｓｐの細胞増殖は、未刺激Ｔｒｅｇを用いた場合、Ｔｒｅｇを最大量の５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（Ｔｒｅｓｐ：Ｔｒｅｇ＝４：１）で添加した場合でも阻害されなかった。
一方、ＩＬ－２（Ｐ）、糖鎖結合ＩＬ－２改変体Ｈ１６Ｃ－２、Ｌ１９Ｃ－９、およびＮ８８Ｃ－２を用いて刺激し、増殖させたＩＬ－２刺激Ｔｒｅｇを添加した場合は、いずれも未刺激Ｔｒｅｇを添加したときよりもＴｒｅｓｐの増殖が阻害された。
ＩＬ－２刺激Ｔｒｅｇにより、ＣＤ４＋Ｔｒｅｓｐの増殖は最大４０～６０％程度、ＣＤ８＋Ｔｒｅｓｐの増殖は最大３０～４０％程度阻害された。市販ＩＬ－２で刺激したＴｒｅｇと、糖鎖結合ＩＬ－２改変体で刺激したＴｒｅｇとでは、Ｔｒｅｓｐの増殖阻害率は同等であった。
以上の結果から、作製した糖鎖結合ＩＬ－２改変体は、Ｔｒｅｇの抑制活性をＩＬ－２（Ｐ）と同程度に増強することが明らかとなった。
［実施例１６］Ｅｘ ｖｉｖｏアッセイ
各種ＩＬ－２で刺激したヒトＰＢＭＣの各種サイトカインの産生量を以下に記載する方法で測定した。各種ＩＬ－２としては、糖鎖結合ＩＬ－２改変体Ｈ１６Ｃ－２、Ｌ１９Ｃ－９、およびＮ８８Ｃ－２ならびにポジティブコントロールとしてＩＬ－２（Ｐ）を使用した。
ヒト末梢血を１５ｍＬ遠心管に分注後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収することでヒト血漿を得た。得られた血漿は０．２２μｍフィルターを用いて濾過滅菌した。回収した血漿と等量のＰＢＳを末梢血に添加し希釈後、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いた密度勾配遠心法によりヒトＰＢＭＣを得た。
得られたヒトＰＢＭＣを自己血漿で５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁し、そこに抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を終濃度０．５μｇ／ｍＬになるよう添加した。９６穴Ｕ底プレートに１８０μｌ／ｗｅｌｌで播種後、０．１％ＢＳＡ－ＰＢＳで終濃度の１０倍濃度に希釈した各種ＩＬ－２を２０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加した。３７℃、５％ ＣＯ２下で５日間培養後、培養上清を回収し、上清中のサイトカイン産生量をＨｕｍａｎ Ｔｈ１／２／１７ ＣＢＡ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて定量した。
また得られたヒトＰＢＭＣを用いて、以下に記載する方法で各種ＩＬ－２のＴｒｅｇ選択的増殖活性を測定した。ヒトＰＢＭＣと、Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４－Ａｌｅｘａ４８８を反応後、ＰｅｒＦｉｘ－ＥＸＰＯＳＥ Ｐｈｏｓｐｈｏ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）のＰｅｒＦｉｘ ＥＸＰＯＳＥ Ｂｕｆｆｅｒ １およびＰｅｒＦｉｘ ＥＸＰＯＳＥ Ｂｕｆｆｅｒ ２を用いて細胞の固定および透過処理を行った後に、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ２５－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｏｘｐ３ Ａｌｅｘａ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製、Ｃａｔ＃３２０２１４）を含むＰｅｒＦｉｘ ＥＸＰＯＳＥ Ｂｕｆｆｅｒ ３を添加し、細胞を染色した（遮光、室温、６０分間）。
さらに、ＰｅｒＦｉｘ ＥＸＰＯＳＥ Ｂｕｆｆｅｒ ４を添加して細胞を２回洗浄後（２５００ｒｐｍ、３分間遠心分離）、フローサイトメーターＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にて各種蛍光強度を測定した。
得られたデータは、ＦＣＳ ｆｉｌｅとして出力した後に、データ解析ソフトＦＬｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製、ｖｅｒｓｉｏｎ７．６．５）を用いて解析を行った。ＣＤ４陽性画分の中で、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３ｈｉｇｈ画分をＴｒｅｇ、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３ｌｏｗ画分をエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）とし、その存在比［Ｔｒｅｇ（％）／Ｔｅｆｆ（％）］を算出し、Ｔｒｅｇ選択的増殖活性の指標とした。
測定されたサイトカイン産生量の結果を図４（Ａ）～図４（Ｅ）に示す。図４（Ａ）～図４（Ｅ）に示すように、ＩＬ－２（Ｐ）は、測定したサイトカインのうち、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの全てのサイトカインの産生を促進していた。
一方、糖鎖結合ＩＬ－２改変体ではＩＬ－６およびＩＬ－１０産生量は市販ＩＬ－２と同程度であったが、ＩＬ－４、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの産生量が低下していた。ＩＬ－１７Ａの産生はどの培養条件でも検出限界以下であった。
ＩＬ－１０は抗炎症性サイトカインであり、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαは炎症性サイトカインである。
以上の結果から、作製した糖鎖結合ＩＬ－２改変体の炎症性サイトカインの産生促進活性は、ＩＬ－２（Ｐ）よりも大幅に低下していることが確認できた。
また、得られたＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比を図４（Ｆ）に示す。図４（Ｆ）に示すように、ＩＬ－２（Ｐ）で刺激した場合のＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比は０．２～０．３程度であった。一方、糖鎖結合ＩＬ－２改変体Ｈ１６Ｃ－２、Ｌ１９Ｃ－９、およびＮ８８Ｃ－２で刺激した場合のＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比は、いずれも０．３～０．５程度であった。
以上の結果から、生体内の環境に近い多様な免疫細胞が存在する培養条件下において、作製した糖鎖結合ＩＬ－２改変体はＩＬ－２（Ｐ）と比べて、ＴｅｆｆよりもＴｒｅｇを選択的に増殖させることが明らかとなった。ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆはともにＩＬ－２Ｒαβγを発現しているが、当該ＩＬ－２改変体は、ＴｅｆｆよりもＴｒｅｇを選択的に増殖させる性質を有し、炎症を鎮静化させるのに望ましいＩＬ－２改変体である。
［実施例１７］親和性解析
下記の方法で、各種ＩＬ－２のｈｕｍａｎ ＣＤ２５ＥＣＤ－Ｆｃおよびｈｕｍａｎ ＩＬ－２ＲβγＥＣＤ－Ｆｃに対する親和性を測定した。各種ＩＬ－２として、糖鎖結合ＩＬ－２改変体Ｌ１２Ｃ－２、Ｌ１２Ｃ－９、Ｌ１２Ｃ－１１、Ｈ１６Ｃ－２、Ｌ１９Ｃ－９、Ｌ１２Ｃ－１１、Ｎ８８Ｃ－２およびＶ９１Ｃ－１１、ならびにコントロールとして野生型ＩＬ－２、８Ｈｉｓ－ＩＬ－２およびＩＬ－２（Ｐ）を使用した。
ｈｕｍａｎ ＣＤ２５ＥＣＤ－Ｆｃおよびｈｕｍａｎ ＩＬ－２ＲβγＥＣＤ－ＦｃヒトＣＤ２５の細胞外領域とＣ末端にＡｖｉｔａｇ配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）を有するヒトＩｇＧ１由来Ｆｃから成るＣＤ２５ＥＣＤ－Ｆｃ－Ａｖｉｔａｇのアミノ酸配列（配列番号２３）を基に設計した塩基配列（配列番号２４）を、ＩＮＰＥＰ４ベクターのＢｇｌＩＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに挿入することで、哺乳類細胞用のヒトＣＤ２５ＥＣＤ－Ｆｃ－Ａｖｉｔａｇ発現ベクターを作製した。
また、ヒトＣＤ１２２の細胞外領域とＹ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異およびＣ末端にＡｖｉｔａｇ配列およびポリヒスチジンタグ配列（ＨＨＨＨＨＨＨＨ）を有するヒトＩｇＧ１由来Ｆｃ領域から成るＣＤ１２２ＥＣＤ－Ｆｃ（ｋｎｏｂ）－Ａｖｉｔａｇ－８Ｈｉｓと、ヒトＣＤ１３２の細胞外領域とＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異およびＣ末端にＦＬＡＧタグ配列を有するヒトＩｇＧ１由来Ｆｃ領域から成るＣＤ１３２ＥＣＤ－Ｆｃ（ｈｏｌｅ）－ＦＬＡＧをｆｕｒｉｎ切断配列とｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ－ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ由来２Ａペプチド配列を介して連結したヒトＣＤ１２２ＥＣＤ－Ｆｃ－Ａｖｉｔａｇ－８Ｈｉｓ＿ヒトＣＤ１３２ＥＣＤ－Ｆｃ－ＦＬＡＧのアミノ酸配列（配列番号２５）を基に設計した塩基配列（配列番号２６）を、ＩＮＰＥＰ４ベクターのＢｇｌＩＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに挿入することで、哺乳類細胞用のヒトＩＬ－２ＲβγＥＣＤ－Ｆｃ発現ベクターを作製した。
得られたプラスミドとＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて、各種Ｆｃ融合タンパク質を培養上清中に発現させた。ＣＤ２５ＥＣＤ－ＦｃはＭａｂｓｅｌｅｃｔ ｓｕｒｅ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて粗精製後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによりモノマー画分を分取した（移動相：Ｄ－ＰＢＳ）。
一方、ＩＬ－２ＲβγＥＣＤ－ＦｃはＭａｂｓｅｌｅｃｔ ｓｕｒｅを用いて粗精製後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（移動相：Ｄ－ＰＢＳ）およびＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌを用いた精製によりモノマー画分を分取した。
Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ－１００（ＧＥヘルスケア社製）にセットし、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、親和性測定用フローセルおよびリファレンス用フローセルにａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃを固定化した。
次に、ＨＢＳ－ＥＰ（＋）バッファー（ＧＥヘルスケア社製）にて流路を置換した後、リガンドとして、ＨＢＳ－ＥＰ（＋）にて希釈したＣＤ２５ＥＣＤ－Ｆｃ又はＩＬ－２ＲβγＥＣＤ－Ｆｃを、親和性測定用フローセルにのみ添加した（固定化量：２００～９００ＲＵ）。
その後、アナライトとして、ＨＢＳ－ＥＰ（＋）バッファーにて至適濃度に希釈したＩＬ－２（Ｐ）を親和性測定用フローセルおよびリファレンス用フローセルに添加し、センサーグラムを得た。フローセルの再生反応には３ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２を用いた。
得られたセンサーグラムからの速度論定数の算出にはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ－１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いた。ＣＤ２５ＥＣＤ－Ｆｃに対する結合の解析にはｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅモデルを用い、解離定数ＫＤを求めた。ＩＬ－２ＲβγＥＣＤ－Ｆｃに対する結合の解析には１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを用い、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄおよびＫＤをそれぞれ求めた。得られたＫＤを表２３に示す。
Figure 0007275049000180
表２３に示すように、ＣＤ２５に対するＫＤ値は、糖鎖結合ＩＬ－２改変体とＩＬ－２（Ｐ）とで同程度であった。一方、ＩＬ－２Ｒβγに対するＫＤ値は、糖鎖結合ＩＬ－２改変体がＩＬ－２（Ｐ）よりも高かった。
表１８～２０の結果と合わせると、ＩＬ－２Ｒβγに対するＫＤ値が高いものほど、ＩＬ－２Ｒαβγ選択性が高くなる傾向が確認できた。
以上の結果から、糖鎖結合ＩＬ－２改変体は、ＣＤ２５に対する親和性を維持している一方、ＩＬ－２Ｒβγに対する親和性が低下することで、ＩＬ－２Ｒαβγ選択性が向上したと考えられた。
［実施例１８］糖鎖・ＰＥＧ構造の影響
ＩＬ－２にアミノ酸改変を行うことや、糖鎖またはＰＥＧを結合させることがＩＬ－２Ｒαβγ選択性に与える影響を評価するため、実施例１で作製したＬ１９Ｃ、Ｌ１９Ｃ－ａｃｅｔａｍｉｄｅ、Ｌ１９Ｎ、および実施例５で作製した各種ｏ－Ａｚ－ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２を実施例１２に記載の方法と同様の手法で標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値を測定した。得られた結果を表２４に示す。
Figure 0007275049000181
表２４に示すように、Ｌ１９Ｃ、Ｌ１９Ｃ－ａｃｅｔａｍｉｄｅ、Ｌ１９Ｎの標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値が５～３０であった。表１８に示すように、Ｌ１９Ｃ－２、Ｌ１９Ｃ－９、Ｌ１９Ｃ－１１およびＬ１９Ｃ－１１＊の標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値は３０以上であったことから、Ｌ１９Ｃ－２、Ｌ１９Ｃ－９、Ｌ１９Ｃ－１１およびＬ１９Ｃ－１１＊は糖鎖結合によりＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が向上していることが明らかになった。
また、表２４に示すように、８Ｈｉｓ－Ｑ１２６（ｏＡｚＺＫ）以外のｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ導入８Ｈｉｓ－ＩＬ－２改変体の標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値が５以下であった。表２１および表２２に示すように、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、Ｓ６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｓ６（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｔ７（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｅ６０（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０、８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０、８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｅ１００（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｔ１０１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｔ１０１（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－ＰＥＧ４、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ２０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ３０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｌｉ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｖ４０、８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｗ４０および８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）－Ｙ５０の標準化ＥＣ５０ ｒａｔｉｏ値は５以上であったことから、これらＰＥＧ結合ＩＬ－２改変体はＰＥＧが結合されることによりＩＬ－２Ｒαβγに対する選択性が向上していることが明らかになった。
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１７年１２月２７日付けで出願された日本特許出願（特願２０１７－２５２２２４）に基づいており、その全体が引用により援用される。
配列番号１：野生型成熟ヒトＩＬ－２のアミノ酸配列
配列番号２：８Ｈｉｓ－ＩＬ－２のアミノ酸配列
配列番号３：８Ｈｉｓ－ＩＬ－２の塩基配列
配列番号４：８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号５：８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号６：８Ｈｉｓ－Ｓ６（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号７：８Ｈｉｓ－Ｔ７（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号８：８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号９：８Ｈｉｓ－Ｅ６０（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号１０：８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号１１：８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号１２：８Ｈｉｓ－Ｒ８１（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号１３：８Ｈｉｓ－Ｌ９４（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号１４：８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号１５：８Ｈｉｓ－Ｅ１００（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号１６：８Ｈｉｓ－Ｔ１０１（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号１７：８Ｈｉｓ－Ｑ１２６（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号１８：８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ）， ８Ｈｉｓ－Ｉ１２９（ｍＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号１９：ヒトＩＬ－２Ｒαβγ－Ａｚａｍｉｇｒｅｅｎ融合体のアミノ酸配列
配列番号２０：ヒトＩＬ－２Ｒαβγ－Ａｚａｍｉｇｒｅｅｎ融合体の塩基配列
配列番号２１：ヒトＩＬ－２Ｒβγ－Ａｚａｍｉｇｒｅｅｎ融合体のアミノ酸配列
配列番号２２：ヒトＩＬ－２Ｒβγ－Ａｚａｍｉｇｒｅｅｎ融合体の塩基配列
配列番号２３：ヒトＣＤ２５ＥＣＤ－Ｆｃ－Ａｖｉｔａｇのアミノ酸配列
配列番号２４：ヒトＣＤ２５ＥＣＤ－Ｆｃ－Ａｖｉｔａｇの塩基配列
配列番号２５：ヒトＣＤ１２２ＥＣＤ－Ｆｃ－Ａｖｉｔａｇ－８Ｈｉｓ＿ヒトＣＤ１３２ＥＣＤ－Ｆｃ－ＦＬＡＧのアミノ酸配列
配列番号２６：ヒトＣＤ１２２ＥＣＤ－Ｆｃ－Ａｖｉｔａｇ－８Ｈｉｓ＿ヒトＣＤ１３２ＥＣＤ－Ｆｃ－ＦＬＡＧの塩基配列
配列番号２７：８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）／ Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）の塩基配列
配列番号２８：８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号２９：８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号３０：８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）／Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号３１：８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）／Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号３２：８Ｈｉｓ－Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ）／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号３３：８Ｈｉｓ－Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号３４：８Ｈｉｓ－Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号３５：８Ｈｉｓ－Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号３６：８Ｈｉｓ－Ｈ７９（ｏＡｚＺＫ）／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号３７：８Ｈｉｓ－Ｓ９９（ｏＡｚＺＫ）／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号３８：Ｎ末端メチオニン付加ＩＬ－２ Ｃ１２５Ｓのアミノ酸配列
配列番号３９：Ｎ末端メチオニン付加ＩＬ－２ Ｃ１２５Ｓの塩基配列
配列番号４０：ｄｅｓＡｌａ＿ＩＬ－２ Ｃ１２５Ｓのアミノ酸配列
配列番号４１：ｄｅｓＡｌａ＿ＩＬ－２ Ｃ１２５Ｓの塩基配列
配列番号４２：Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号４３：Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号４４：ｄｅｓＡｌａ＿Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号４５：Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）／ Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号４６：Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号４７：Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）／Ｆ７８（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号４８：Ｓ４（ｏＡｚＺＫ）／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号４９：Ｓ５（ｏＡｚＺＫ）／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号５０：Ｋ８（ｏＡｚＺＫ）／Ｉ１２９（ｏＡｚＺＫ） の塩基配列
配列番号５１：Ｉ１２９Ｃのアミノ酸配列
配列番号５２：Ｉ１２９Ｃの塩基配列

Claims (16)

  1. 配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列を含む、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２（以下、ＩＬ－２と略記する）のアミノ酸配列において、少なくとも１２９番目のアミノ酸残基が、チオール基（－ＳＨ）を有する非天然アミノ酸残基由来の基にＰＥＧが結合した基、またはアジド基を有する非天然アミノ酸残基由来の基にＰＥＧが結合した基に置換された、ＩＬ－２改変体。
  2. 前記チオール基（－ＳＨ）を有する非天然アミノ酸残基由来の基にＰＥＧが結合した基が、システイン残基由来の非天然アミノ酸残基由来の基にＰＥＧが結合した基であり、
    前記アジド基を有する非天然アミノ酸残基由来の基にＰＥＧが結合した基が、Ｎ ６－［｛（ｏ－ａｚｉｄｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｙ｝ｃａｒｂｏｎｙｌ］－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ）残基由来の基にＰＥＧが結合した基、またはＮ６－［｛（ｍ－ａｚｉｄｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｙ｝ｃａｒｂｏｎｙｌ］－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ）残基由来の基にＰＥＧが結合した基である、請求項１に記載のＩＬ－２改変体。
  3. 前記Ｎ ６－［｛（ｏ－ａｚｉｄｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｙ｝ｃａｒｂｏｎｙｌ］－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ｏ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ）残基由来の基にＰＥＧが結合した基が、下記（式１１）および／または（式１２）で表される構造を有する、請求項２に記載のＩＬ－２改変体。
    Figure 0007275049000182
    Figure 0007275049000183
  4. 前記Ｎ ６－［｛（ｍ－ａｚｉｄｏｂｅｎｚｙｌ）ｏｘｙ｝ｃａｒｂｏｎｙｌ］－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ（ｍ－Ａｚ－Ｚ－Ｌｙｓ）残基由来の基にＰＥＧが結合した基が、下記（式Ｘ４）および／または（式Ｘ５）で表される構造を有する、請求項２に記載のＩＬ－２改変体。
    Figure 0007275049000184
    Figure 0007275049000185
  5. 前記システイン残基由来の非天然アミノ酸残基由来の基にＰＥＧが結合した基が、下記（式Ｘ１１）および／または（式Ｘ１２）および／または（式Ｘ１３）で表される構造を有する、請求項２に記載のＩＬ－２改変体。
    Figure 0007275049000186
    Figure 0007275049000187
    Figure 0007275049000188
  6. 前記ＰＥＧが直鎖状である、請求項１～５のいずれか１項に記載のＩＬ－２改変体。
  7. 前記ＰＥＧが分岐状である、請求項１～５のいずれか１項に記載のＩＬ－２改変体。
  8. 前記ＰＥＧが、平均分子量１０ｋＤａ以上のＰＥＧである、請求項１～７のいずれか１項に記載のＩＬ－２改変体。
  9. 前記ＰＥＧが、平均分子量１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａまたは８０ｋＤａのＰＥＧである請求項１～８のいずれか１項に記載のＩＬ－２改変体。
  10. 前記ＰＥＧが、下記（式１３）、（式１４）、（式１５）、（式１６）、（式Ｘ７）、（式Ｘ８）、（式Ｘ９）、（式Ｘ１０）、（式Ｘ１１）、（式Ｘ１３）、（式Ｘ１４）または（式Ｘ１５）の少なくとも１つの式で表される構造を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２改変体。
    Figure 0007275049000189
    Figure 0007275049000190
    Figure 0007275049000191
    Figure 0007275049000192
    Figure 0007275049000193
    Figure 0007275049000194
    Figure 0007275049000195
    Figure 0007275049000196
    Figure 0007275049000197
    Figure 0007275049000198
    Figure 0007275049000199
    Figure 0007275049000200
  11. 前記ＩＬ－２のＮ末端にさらにメチオニン残基が結合している、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＩＬ－２改変体。
  12. 前記ＩＬ－２のＮ末端のアラニンが欠損している、請求項１～１０のいずれか１項に記載のＩＬ－２改変体。
  13. 配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列を含む、ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２９番目のアミノ酸残基が、下記（式１１）または（式１２）で表される構造を有する基に置換され、
    前記（式１１）および（式１２）で表される構造におけるＰＥＧは８０ｋＤａの平均分子量を有し、且つ下記（式１６）または（式Ｘ９）で表される構造を含み、かつ前記ＩＬ－２のアミノ酸配列のＮ末端のアラニンが欠損しているＩＬ－２改変体。
    Figure 0007275049000201
    Figure 0007275049000202
    Figure 0007275049000203
    Figure 0007275049000204
  14. 配列番号１で表されるアミノ酸配列、または配列番号１で表されるアミノ酸配列の１２５番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列を含む、ＩＬ－２のアミノ酸配列において、１２および９１番目のアミノ酸残基は糖鎖が結合したシステイン残基由来の基に置換され、且つ３番目のアミノ酸残基はＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基に置換され、
    前記糖鎖が結合したシステイン残基由来の基は下記（式１）で表される構造を有し、
    前記糖鎖は下記（式８）で表される構造を有し、
    前記ＰＥＧが結合したシステイン残基由来の基は下記（式Ｘ４）、または（式Ｘ５）、（式Ｘ６）若しくは（式Ｘ７）であって、
    前記ＰＥＧは平均分子量が５０ｋＤａであり、且つ下記（式Ｘ１５）で表される、ＩＬ－２改変体。
    Figure 0007275049000205
    Figure 0007275049000206
    Figure 0007275049000207
    Figure 0007275049000208
    Figure 0007275049000209
    Figure 0007275049000210
    Figure 0007275049000211
  15. 請求項１～１４のいずれか１項に記載のＩＬ－２改変体の製造方法。
  16. 請求項１～１４のいずれか１項に記載のＩＬ－２改変体を含む組成物。
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