JP7260182B2 - β2ミクログロブリン欠損細胞 - Google Patents
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Description
本出願において、別段の記載がない限り、利用される技術は、いくつかの周知の参考文献、例えば、「分子クローニング:実習マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」(サンブルック(Sambrook)ら著、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、1989年)および「PCRプロトコル:方法および応用へのガイド(PCR Protocols:A Guide
to Methods and Applications」(イニス(Innis)ら著、アカデミック・プレス(Academic Pres)、1990年、サンディエゴ、カリフォルニア州)のいずれでも確認することができる。
一態様では、本発明は、B2M欠損細胞を提供する。特に、本発明は、B2M遺伝子に遺伝子組換え改変を含む、単離された霊長類細胞、好ましくはヒト細胞を提供する。好ましい一定の実施形態では、この細胞は、B2M遺伝子に遺伝子組換え改変を含むヒト細胞である。関連する態様では、この細胞は、B2M遺伝子のすべてのコピーにおける遺伝子組換え改変を含む。一定の実施形態では、B2M遺伝子の遺伝子改変により、B2Mタンパク質の欠損、またはB2Mタンパク質が発現されなくなる。B2Mは、すべてのHLAクラスIタンパク質の共通の要素であるため、遺伝子組換え改変は、細胞表面でのすべての天然HLAクラスIタンパク質の発現を防止する。B2Mをコードする配列は、配列番号1(GenBankアクセッション番号NM_004048)で示され、B2Mタンパク質配列は、配列番号2で示される。この遺伝子には多数の一塩基多型(SNP)が存在する可能性があり;当業者には理解されるように、本発明のヒト細胞および方法は、このようなB2M遺伝子およびSNPのいずれにも適用可能である。
(実施例)
実施例1 B2M遺伝子におけるノックアウト変異を有するヒト多能性幹細胞の作製
ヒト多能性幹細胞を、すべてのHLAクラスIヘテロ二量体(HLA-A、B、C、D、E、F、およびG)の表面発現に必要な共通のサブユニットをコードするβ2ミクログロブリン(B2M)遺伝子の両方のアレルのノックアウト変異を用いて作製した。アデノ随伴ウイルス(AAV)遺伝子ターゲッティングベクターを用いて、B2M-/-(クラスI陰性)H1ヒトESCを作製した(ウィスコンシン大学(University of Wisconsin))。ヒト多能性幹細胞をAAV遺伝子ターゲッティングベクターに感染させて、B2M遺伝子を、相同的組換えによって不活化させた。AAV媒介遺伝子ターゲッティング法は、例えば、カーン(Khan)ら著、プロトコル(Protocol)、2011年、第482巻、p.482~501、およびカーン(Khan)ら著、サイエンス(Science)、1990年、第248巻、p.1227~30に既に説明されている。これらの参考文献は、参照によりそれらの全容が本明細書に組み入れられるものとする。
マウスにおいて、HLAクラスI陰性細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞による「ミッシングセルフ(missing self)」機構を通じて破壊され得る。ビックス(Bix)ら著、ネイチャー(Nature)、1991年、第349巻、p.329~331。ヒトNK細胞は異なる受容体を有するが、NK細胞傷害の類似した抑制は、HLA-C、E、およびGとNK細胞受容体との相互作用によって仲介される。「ミッシングセルフ」現象は、クラスI欠損造血細胞に関して詳しく説明されている。多くの型のB2M-/-器官がB2M+/+宿主で生き残ることを示す既報告のマウス移植データは、移植する細胞が固形臓器を形成する際に「ミッシングセルフ」現象がそれほど重要ではない可能性を示唆している。しかしながら、「ミッシングセルフ」現象が一部の状況でドナー細胞の生存に有意に影響を与え得ることを考慮し、NK細胞傷害を抑制する特定のHLAクラスI遺伝子を1本鎖融合タンパク質としてB2M-/-細胞に導入した。
(付記)
好ましい実施形態として、上記実施形態から把握できる技術的思想について、記載する。
[項目1]
β2ミクログロブリン(B2M)遺伝子のすべてのコピーに遺伝子組換え改変を含む単離細胞であって、前記細胞がヒト細胞であり、
該細胞は、1本鎖融合ヒト白血球抗原(HLA)クラスIタンパク質をコードすることができるポリヌクレオチドを含む1つ以上の組換え免疫調節遺伝子をさらに含み、
前記1本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、直接またはリンカー配列を介して少なくとも1つのHLAクラス-Iα鎖に共有結合した外来性B2Mタンパク質を含み、
前記HLAクラス-Iα鎖はHLAクラス-I鎖タンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まず、前記外来性B2Mタンパク質はB2Mタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まず、
前記細胞は正常核型を有し且つ非形質転換細胞である、単離細胞。
[項目2]
前記1本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、およびHLA-Gからなる群から選択されるHLAクラスIα鎖に共有結合した前記B2Mタンパク質を含み、前記選択されるHLAクラスIα鎖は、当該HLAクラス-I鎖タンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まない、項目1に記載の細胞。
[項目3]
前記1本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、前記B2Mタンパク質、ならびに、HLA-E、HLA-G、およびHLA-Aからなる群から選択されるHLAクラスIα鎖を含み、前記選択されるHLAクラスIα鎖は、当該HLAクラス-I鎖タンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まない、項目1に記載の細胞。
[項目4]
前記1本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、前記B2Mタンパク質、および、HLA-Aタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないHLA-Aを含む、項目1~3のいずれか1項に記載の細胞。
[項目5]
前記1本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、前記B2Mタンパク質、および、HLA-A0201タンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないHLA-A0201を含む、項目1~4のいずれか1項に記載の細胞。
[項目6]
前記1本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、前記B2Mタンパク質、および、HLA-Eタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないHLA-Eを含む、項目1~3のいずれか1項に記載の細胞。
[項目7]
前記1本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、前記B2Mタンパク質、および、HLA-Gタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないHLA-Gを含む、項目1~3のいずれか1項に記載の細胞。
[項目8]
前記1本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、前記B2Mタンパク質および、HLA-Bタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないHLA-Bを含む、項目1または2に記載の細胞。
[項目9]
前記1本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、前記B2Mタンパク質および、HLA-Cタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないHLA-Cを含む、項目1または2に記載の細胞。
[項目10]
前記1本鎖融合HLAクラスIタンパク質が、前記B2Mタンパク質および、HLA-Fタンパク質のシグナル配列を含むかまたは含まないHLA-Fを含む、項目1または2に記載の細胞。
[項目11]
前記細胞が、前記1本鎖融合HLAクラスIタンパク質によって前記細胞の表面に提示される標的ペプチド抗原をさらに発現する、項目1~10のいずれか1項に記載の細胞。
[項目12]
前記標的ペプチド抗原が、前記1本鎖融合HLAクラスIタンパク質に共有結合している、項目11に記載の細胞。
[項目13]
前記細胞が、自殺遺伝子産物をコードすることができる1つ以上の組換え遺伝子をさらに含む、項目1~12のいずれか1項に記載の細胞。
[項目14]
前記自殺遺伝子産物が、チミジンキナーゼおよびアポトーシスシグナル伝達タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む、項目13に記載の細胞。
[項目15]
前記細胞が幹細胞である、項目1~14のいずれか1項に記載の細胞。
[項目16]
前記幹細胞が、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、肝幹細胞、神経幹細胞、膵幹細胞、および間葉幹細胞からなる群から選択される、項目15に記載の細胞。
[項目17]
前記幹細胞が多能性幹細胞である、項目15または16に記載の細胞。
[項目18]
前記幹細胞が分化している、項目15~17のいずれか1項に記載の細胞。
[項目19]
前記分化細胞が、樹状細胞、膵島細胞、肝細胞、筋細胞、ケラチノサイト、神経細胞、造血細胞、リンパ球、赤血球、血小板、骨格筋細胞、眼細胞、間葉細胞、線維芽細胞、肺細胞、消化管細胞、血管細胞、内分泌細胞、脂肪細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、項目18に記載の細胞。
[項目20]
項目11または12に記載の細胞を含むワクチンであって、前記標的ペプチド抗原に特異的な免疫応答を霊長類で誘発することができる、ワクチン。
[項目21]
前記霊長類がヒトである、項目20に記載のワクチン。
[項目22]
項目1~19のいずれか1項に記載の細胞を含むキット。
[項目23]
移植片をさらに含み、前記移植片が、項目1~19のいずれか1項に記載の細胞を含む、項目22に記載のキット。
[項目24]
免疫アジュバントをさらに含む、項目20に記載のワクチンを含むキット。
Claims (31)
- β2ミクログロブリン(B2M)遺伝子に遺伝子操作による破壊を含む単離細胞であって、霊長類細胞であり、
前記細胞がさらに、1本鎖融合非古典的ヒト白血球抗原(HLA)クラスIタンパク質をコードすることができる1つ以上のポリヌクレオチドを含み、
前記1本鎖融合非古典的HLAクラスIタンパク質が、HLA-E、HLA-F、およびHLA-Gからなる群から選択されるHLAクラスIα鎖の少なくとも一部に共有結合したB2Mの少なくとも一部を含み、
前記1本鎖融合非古典的HLAクラスIタンパク質が、NK細胞の表面の抑制性受容体との結合について正常な機能を有することができる、単離細胞。 - 前記非古典的HLAクラスIタンパク質が、HLA-Eである、請求項1に記載の細胞。
- 前記非古典的HLAクラスIタンパク質が、HLA-Fである、請求項1に記載の細胞。
- 前記非古典的HLAクラスIタンパク質が、HLA-Gである、請求項1に記載の細胞。
- 複数の異なる1本鎖融合非古典的HLAクラスIタンパク質を含む、請求項1に記載の細胞。
- 前記細胞が、B2M遺伝子のすべてのコピーに、遺伝子操作された破壊を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞が、前記1本鎖融合非古典的HLAクラスIタンパク質によって前記細胞の表面に提示されるペプチドをさらに含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ペプチドが、前記1本鎖融合非古典的HLAクラスIタンパク質に共有結合している、請求項7に記載の細胞。
- 前記1本鎖融合非古典的ヒト白血球抗原(HLA)クラスIタンパク質のB2Mタンパク質が、完全長のB2Mタンパク質である、請求項1~8のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記1本鎖融合非古典的ヒト白血球抗原(HLA)クラスIタンパク質の前記B2Mタンパク質と前記非古典的HLAクラス-Iα鎖とがリンカー配列を介して結合されている、請求項1~9のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記1本鎖融合非古典的ヒト白血球抗原(HLA)クラスIタンパク質の前記B2Mタンパク質が、リーダー配列を含んでいない、請求項1~10のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記HLAクラス-Iα鎖が、リーダー配列を含んでいない、請求項1~11のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞が、自殺遺伝子産物をコードすることができる1つ以上の組換え遺伝子をさらに含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記自殺遺伝子産物が、チミジンキナーゼおよびアポトーシスシグナル伝達タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項13に記載の細胞。
- 前記細胞が、正常核型を有している、請求項1~14のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞が、非形質転換細胞である、請求項1~15のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞が、幹細胞である、請求項1~16のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記幹細胞が、多能性幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、肝幹細胞、神経幹細胞、膵幹細胞、および間葉幹細胞からなる群から選択される、請求項17に記載の細胞。
- 前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項17または18に記載の細胞。
- 前記細胞が、分化細胞である、請求項1~19のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記分化細胞が、樹状細胞、膵島細胞、肝細胞、筋細胞、ケラチノサイト、神経細胞、造血細胞、リンパ球、赤血球、血小板、骨格筋細胞、眼細胞、間葉細胞、線維芽細胞、肺細胞、消化管細胞、血管細胞、内分泌細胞、脂肪細胞、骨髄間質細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、請求項20に記載の細胞。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項1~21のいずれか1項に記載の細胞。
- 請求項1~22のいずれか1項に記載の細胞と、生理学的に適合した緩衝液とを含む、医薬組成物。
- 移植の必要な患者における移植に使用するための医薬組成物であって、前記細胞の有効量が前記患者に投与される、請求項23に記載の医薬組成物。
- 前記患者が免疫適格である、請求項24に記載の医薬組成物。
- 前記細胞が分化細胞である、請求項24または25に記載の医薬組成物。
- 前記患者がヒトであり、前記細胞がヒト細胞である、請求項23~26のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 病状の治療を必要とする患者における病状の治療に使用するための医薬組成物であって、前記細胞の有効量が患者に投与されるものであり、前記病状が糖尿病、自己免疫疾患、癌、感染症、貧血、白血球減少症、心筋梗塞、心不全、骨格もしくは関節の症状、骨形成不全症、火傷、または遺伝的皮膚疾患である、請求項23に記載の医薬組成物。
- a)前記患者が免疫適格である;
b)前記細胞が分化細胞である;
c)前記患者がヒトであり且つ前記細胞がヒト細胞である;および/または
d)前記病状が糖尿病であり且つ前記細胞が膵島細胞であり、前記病状が心筋梗塞あるいは心不全であり且つ前記細胞が心筋細胞であり、もしくは前記病状が火傷あるいは遺伝的皮膚疾患であり且つ前記細胞がケラチノサイトである、請求項28に記載の医薬組成物。 - 請求項1~22のいずれか1項に記載の細胞を含む、キット。
- 前記キットが、移植片をさらに含み、前記移植片が、請求項1~22のいずれか1項に記載の細胞を含む、請求項30に記載のキット。
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