CN115551994A - 产生肝细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过过表达转录因子组合产生肝细胞的方法，特别是用于细胞重新编程的方法中。

Description

产生肝细胞的方法

技术领域

本发明涉及通过过表达转录因子的组合来产生肝细胞的方法。

背景技术

肝细胞是肝脏的主要功能细胞。它们提供广泛的基本功能，包括调节葡萄糖和脂质代谢、各种代谢物和药物的解毒、蛋白质合成和胆汁合成。

在药物筛选中，必须确定潜在的候选药物是否会引起肝毒性。目前，肝毒性和药物剂量的筛选通常使用一系列永生化肝细胞系和人原代肝细胞。然而，永生化细胞不具备关键的肝脏药物代谢功能。原代肝细胞提供有限、具有分离和冷冻保存压力、并显示出批次间的差异，因此不适用于高通量筛选。此外，人原代肝细胞的药物代谢功能会因遗传背景而显著变化。可获得的功能性人肝细胞的一致的且具有规模的提供将极大地促进药物开发和肝衰竭治疗的临床应用。先前已经研究了从诱导的多能干细胞(iPSC)生成肝细胞，但是当前的现有技术方法不能提供高通量药物筛选所需的功能性、一致性和规模性水平。此外，用当前方法制备的源自iPSC的肝细胞仍然存在代谢缺陷，因此不适合作为预测性的生理模型(Williams，2018年)。

源自iPSC的肝细胞可以通过多种方式促进药物发现和细胞治疗。成熟的肝细胞可作为原代肝细胞的替代物用于药物发现，以测试药物对肝脏的影响(Williams，2018)。源自iPSC的肝细胞的另一个益处是它们能够模拟肝脏疾病。因此，它们提供了独特的工具来测试药物对来自患者的细胞的功效。对于患有急性肝衰竭或肝源性代谢疾病的患者，与基因治疗相结合时，未成熟或成熟肝细胞或肝祖细胞的移植可以替代全肝移植(Iansante等人.，2018)。

因此，本领域需要提供产生适合用作研究工具和潜在治疗剂的肝细胞的方法。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种产生肝细胞的方法，所述方法包括增加非肝细胞群中的至少三种或更多种转录因子的表达，其中三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体，和培养该细胞群以获得肝细胞。

根据本发明的另一方面，提供了一种从源细胞生产肝细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将编码转录调节蛋白的基因靶向***源细胞的第一遗传安全港位点；和

b)靶向***至少三种或更多种转录因子至源细胞的第二遗传安全港位点，其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体，所述基因可操作地连接诱导型启动子，其中所述诱导型启动子受转录调节蛋白调节；和；

c)培养包含***物的源细胞以获得肝细胞。

根据本发明的另一方面，提供了至少三种或更多种转录因子用于生成肝细胞的用途，其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。

根据本发明的另一方面，提供了可通过本文定义的任何一种方法获得的细胞。

根据本发明的另一方面，提供了一种细胞，其包含一个或多个外源表达盒，所述外源表达盒编码至少三种或更多种转录因子，其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。

根据本发明的另一方面，提供了如本文所定义的用于治疗的细胞。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于将细胞分化为肝细胞的试剂盒，其包含：

(i)源细胞和激活或增加至少三种或更多种转录因子的表达或量的试剂；和/或

(ii)一个或多个表达盒，其编码至少三种或更多种转录因子，

其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。

根据本发明的另一方面，提供了本文定义的试剂盒用于将细胞分化成肝细胞的用途。

根据本发明的另一方面，提供了一种药物筛选方法，所述方法包括使使用本文定义的方法产生的肝细胞或本文定义的肝细胞与药物接触，以及观察由药物诱导的肝细胞的变化。

根据本发明的另一方面，提供了一种治疗患有肝脏疾病或功能障碍或处于肝脏疾病或功能障碍风险中的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的使用本文定义的方法产生的肝细胞或本文定义的肝细胞。

附图说明

图1.具有肝脏重新编程活性的TF的筛选策略

用一组慢病毒载体转导携带与红色荧光蛋白融合的白蛋白基因(ALB:RFP)和与绿色荧光蛋白融合的细胞色素P450 3A4基因(CYP3A4:GFP)双报告基因的人iPSC，每个慢病毒载体都携带单个转录因子。调整慢病毒载体剂量以在大多数细胞中产生每个细胞6种或更少的独特转录因子。在LV转导后第11天，通过荧光激活细胞分选分离表达两种报告基因的细胞，并进行单细胞RNA测序。

图2.从39个TF生成ALB+和CYP3A4+细胞

LV转导后第6天(a-c)和第10天(d-f)以及第10天的未转导(g-i)细胞的透射光(Trans)和落射荧光图像。

图3.从34个TF生成ALB+和CYP3A4+细胞

LV转导后第7天(a-c)和第11天(d-f)以及第11天的未转导(g-i)细胞的透射光(Trans)和落射荧光图像。

图4.第11天ALB-RFP+/CYP3A4-GFP+细胞的单细胞RNA测序

(A)用34个TF转导的第11天的细胞的流式细胞术点图。ALB:RFP+/CYP3A4:GFP+细胞被分选并进行单细胞RNA-seq。

(B)使用均匀流形逼近和投影(Uniform Manifold Approximation andProjection，UMAP)，基于两个数据集中表达的所有基因的表达水平，对分选第11天的细胞和来自MacParland等人，2018的肝脏细胞进行聚类。存在于人肝脏中的非肝细胞细胞类型，如包括在MacParland等人，2018数据集中的胆管细胞、Kuppfer细胞、星状细胞、内皮细胞和免疫细胞，用灰色方块表示。

图5.用于解码诱导肝细胞重新编程的转录因子组合的单细胞RNA-seq(scRNA-seq)数据集。(A)参照细胞的总结：成体肝细胞(MacParland等人，2018)、胎儿肝细胞(Popescu等人，2019)、成体和胎儿肝脏的非肝细胞细胞(MacParland等人，2018和Popescu等人，2019)和诱导型多能干细胞(iPSC)。(B)冷冻保存的成体肝细胞用作对照以测试细胞分类器。(C)从用于重新编程细胞的转录因子(TF)筛选的策略总结，其中使用慢病毒将一组34个(表2中的TF)或17个(表3中的TF加上PROX1)TF引入iPSC，每个慢病毒携带单个TF：在重新编程的第7、10和11天，根据ALB和/或CYP3A4报告基因的表达，通过流式细胞术对细胞进行分选。从34个TF的筛选中获得第2、7和11天的细胞。从17个TF的筛选中获得第10天的ALB+/CYP3A4+细胞。

图6.重新编程细胞与参照细胞的聚类。(A)UMAP图显示参照细胞的单细胞转录组。(B)UMAP图显示参照细胞(灰色)和用作对照的冷冻保存的肝细胞(黑色)的单细胞转录组。(C)UMAP图显示参照细胞灰色)和重新编程细胞(黑色)的聚类。(D)UMAP图显示来自重新编程过程中不同时间点的重新编程细胞的单细胞转录组，通过图5C中所述的流式细胞术进行分选。(E)表格显示不同簇中重新编程细胞的百分比。

图7.第11天的RFP+/GFP+群的单细胞中外源转录因子(eTF)的表达

直方图显示表达不同数量的独特外源TF(eTF)的细胞频率。

图8.用14个TF编程的细胞中成熟肝细胞标志物的表达

在第13天在转导一组携带14个TF(列于表4)的慢病毒载体后，细胞的透射光(Trans)和落射荧光图像。

(A)用抗CYP3A4蛋白的抗体染色的细胞的透射和落射荧光图像。

(B)用抗CYP2C9和UGT1A蛋白的抗体染色的细胞的透射和落射荧光图像。箭头指向共同表达所有4种肝标志物的细胞。

图9.显示细胞类型特异性基因表达的热图。基于图6的UMAP聚类将细胞分组为细胞类型簇。单个细胞在水平轴上比对，并绘制了标准化的基因表达水平。底部的标尺显示按比例缩放的标准化基因表达水平。细胞类型特异性基因沿纵轴显示。(A)成体肝细胞特异性基因；(B)在成体和胎儿肝细胞中都表达的基因；(C)在胎儿肝细胞中富集的基因；和(D)多能干细胞基因。

图10.显示与肝细胞特异性细胞功能相关的基因表达的热图。单个细胞在水平轴上比对，并绘制了标准化的基因表达水平。基因根据与特定功能的相关性进行分组，并沿纵轴显示。底部的标尺显示按比例缩放的标准化基因表达水平。(A)在氨基酸、葡萄糖和脂质代谢中具有功能的基因；(B)在药物代谢中具有功能的基因。

图11.基于整个数据集检测到的所有基因的标准化表达的层次聚类。

图12.与参照细胞类型聚集的重新编程细胞的转录因子含量。(A)柱状图显示与参照成体肝细胞聚集的细胞中检测到的独特TF的数量。(B)点图显示从34个TF筛选获得的重新编程细胞中的单个TF表达谱。行(从上到下)显示与胎儿肝细胞、成体肝细胞、非肝细胞(其他肝脏细胞)和iPSC聚集的重新编程细胞的组。(D)点图显示从17个TF筛选获得的重新编程细胞中的单个TF表达谱。行(从上到下)显示与胎儿肝细胞、成体肝细胞、非肝细胞(其他肝脏细胞)和iPSC聚集的重新编程细胞的组。(D)表5列出了TF筛选中成体肝细胞簇中富集的4种TF的组合。(E)表6列出了两种TF筛选中成体肝细胞簇中富集的3种TF的组合。

图13.组合CREB3L3-FOXA1-NR1I2-HHEX可以将iPSC重新编程为肝细胞样细胞。(A)在重新编程的第7天和第12天，表达ALB-RFP和CYP3A4-GFP报告基因的重新编程细胞的实时图像。在相同培养基中平行培养的非转导(NT)细胞不表达报告基因。(B)参与不同肝细胞特异性功能途径的蛋白质的荧光抗体染色图像。对以下基因在重新编程的第21天进行染色：CYP1A2(药物代谢一期)、CYP2C9(药物代谢一期)、CYP2D6(药物代谢一期)、UGT1A1(药物代谢二期)、PCK2(葡萄糖代谢)、ASGR1(血清稳态)(C)CYP3A4的功能测定：CYP3A4-GLO测定法。实验在重新编程的第13天和第21天进行，2次技术重复。从3个独立的iPSC系(iPSC 1-3)获得用表达特定4个TF(4LV)的慢病毒转导的重新编程细胞和未转导的对照(NT)，并平行培养。来自肝脏肿瘤的2种不同肝细胞系Huh-7和HepG2用作对照。误差棒显示重复之间的标准偏差。

图14.FOXA1和HHEX是重新编程为ALB+肝细胞所必需的，NR1I2是从ALB+发展为ALB+/CYP3A4+肝细胞样细胞所必需的。在重新编程的(A)第8天和(B)第14天显示表达ALB-RFP和CYP3A4-GFP报告基因的重新编程细胞的实时图像。

图15.在重新编程为ALB+/CYP3A4+肝细胞样细胞中，FOXA3可替代FOXA1。显示了在第19天表达ALB-RFP和CYP3A4-GFP报告基因的重新编程细胞的实时图像。在相同培养基中平行培养的非转导(NT)细胞不表达报告基因。

图16.在重新编程为ALB+/CYP3A4+肝细胞样细胞中，NR1I3可替代NR1I2。显示了在第13天表达ALB-RFP和CYP3A4-GFP报告基因的重新编程细胞的实时图像。在相同培养基中平行培养的非转导(NT)细胞不表达报告基因。

具体实施方式

本发明提供了通过增加选择的一组转录因子的表达而从源细胞产生肝细胞的方法，本发明人已确定了所述转录因子诱导细胞分化成肝细胞。

定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文所用，以下术语具有以下赋予它们的含义。

如本文所用，提及“转录因子”是指在原核生物和真核生物中都参与基因调节的蛋白质。在一个实施方案中，转录因子可以对基因表达具有正性影响，因此可以称为“激活子”或“转录激活子”。在另一个实施方案中，转录因子可以对基因表达产生负性影响，因此可以称为“抑制子”或“转录抑制因子”。激活子和抑制子是通常使用的术语，它们的功能可以为本领域技术人员所识别。

关于增加转录因子的量的术语“增加量”是指增加目的细胞(例如，源细胞)中转录因子的量。在一些实施方案中，当转录因子的量相对于对照(例如，没有所述表达盒的源细胞)为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多时，细胞中转录因子的量增加(例如，通过指导编码一种或多种转录因子的多核苷酸的表达的表达盒)。在一些实施方案中，增加表达包括“过表达”转录因子，即，将转录因子的表达增加至高于细胞中转录因子的内源表达水平。

本发明的方法可以用于“细胞群”，即，可以分化成所需细胞类型的细胞集合。所述细胞群可以包括“源细胞”，也称为“起始细胞”，即，分化为所需细胞类型之前的细胞类型。

本文提及的“多能”是指具有分化成生物体中发现的所有细胞类型的潜力的细胞。一种形式的多能干细胞称为诱导型多能干细胞，是本发明特别感兴趣的。“诱导型多能干细胞”(iPSC)是通过被迫表达对维持胚胎干细胞的最典型特性很重要的基因和因子而被重新编程为胚胎干细胞样状态的细胞。2006年的研究表明，四种特定转录因子的过表达可以将成体细胞转化为多能干细胞。Oct-3/4和Sox基因家族的某些成员已被确定为参与诱导过程的潜在关键转录调节物。其他基因，包括Klf家族、Myc家族、Nanog和Lin28的某些成员，可提高诱导效率。可用作重新编程因子以产生iPSC的基因的示例包括Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、Lin28b、Sall4、Esrrb、Tbx3和Glis1、GATA3、GATA6，这些重新编程因子可以单独使用，或其两种或更多种组合使用。特别地，重新编程因子可以至少包括Yamanaka因子，即，Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc。这些重新编程因子也可以与本发明中目的转录因子组合使用。

本文提及的“体细胞”是指构成生物体的任何类型的细胞，不包括生殖细胞。因此，体细胞包括例如皮肤、心脏、肌肉、骨或血细胞及其干细胞。在一个实施方案中，体细胞可以是成体细胞或源自成体的细胞，其表现出成体或非胚胎细胞的一种或多种可检测特征。

本发明的方法(例如，iPSC的细胞重新编程)用于生成“肝细胞”，也可称为“肝细胞”。如本文所用，术语“肝(hepatic)”是指与肝脏实质细胞相关的细胞。该术语包括具有成体肝细胞的一些但不是全部特征的肝细胞样细胞，以及成熟、全功能和/或代谢活跃的成体肝细胞。该术语还包括成体和胎儿肝祖细胞(包括肝胆双潜能祖细胞)和胎儿肝细胞。该术语包括在体内移植时具有移植肝脏组织能力的其他细胞。通过这种方法产生的肝细胞可以至少与迄今为止通过定向分化产生的肝细胞具有相同的功能。

本文提及的“培养”包括向包含生长因子和/或必需营养素的培养基添加细胞(例如，细胞群，即，源细胞)。应当理解，可以根据由本发明的方法产生的细胞或细胞群来调整这样的培养条件。

在提及多肽时提及“变体”可以是例如与全长多肽至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。变体可以是全长多肽的片段，特别是多肽的功能片段。只要具有目的活性(例如将源细胞分化为肝细胞的能力)，片段可以是全长野生型多肽或其结构域的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。优选避免本领域已知的消除或显著降低蛋白质活性的变异。在一些实施方案中，变体缺少全长多肽的N-和/或C-末端部分，例如，从任一末端缺少多达10、20或50个氨基酸。在一些实施方案中，功能变体或片段具有全长野生型多肽的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的活性。使用本领域已知的测定法，本领域技术人员将知晓或能够容易地确定特定多肽变体或片段是否具有功能。例如，可以使用本文所述的测定法评估表1-4中列出的转录因子的变体产生肝细胞的能力。

“启动子”是由参与启动和调节多核苷酸转录的蛋白质识别的核苷酸序列。“诱导型启动子”是核苷酸序列，其中与启动子可操作地连接的基因序列的表达受分析物、辅因子、调节蛋白等控制。术语“启动子”或“控制元件”旨在包括全长启动子区域和这些区域的功能(例如，控制转录或翻译)区段。

术语“可操作地连接”指的是元件的布置，其中配置如此描述的组件以执行它们的通常功能。因此，当调节因子存在时，与基因序列可操作地连接的给定启动子能够影响该序列的表达。启动子不必与序列连续，只要它发挥指导其表达的作用。因此，例如，在启动子序列和基因序列之间可以存在***的未翻译但转录的序列，并且启动子序列仍然可以被认为与基因序列“可操作地连接”。因此，术语“可操作地连接”旨在涵盖诱导盒中的启动子元件和基因序列的任何间距或方向，其允许在转录复合物识别启动子元件时启动诱导盒的转录。

如本文所用，术语“载体”旨在指用作载体以将遗传物质携带到细胞中的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环或圈，其中可以连接其他DNA区段。载体的另一种类型是感染性但非致病性的病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到某些病毒遗传元件。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物和酵母载体)。在导入宿主细胞后，其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。然而，本发明旨在包括具有等同功能的此类其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、仙台病毒和腺相关病毒)，还包括噬菌体和噬菌粒***。载体的另一种类型包括RNA分子，例如，mRNA和稳定的RNA，其将编码的遗传信息携带至细胞。

提及“受试者”、“患者”或“个体”是指待治疗的受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、非人灵长类动物、农场动物(例如牛)、运动动物或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠或小鼠。在一些实施方案中，受试者是人。在替代实施方案中，受试者是非人哺乳动物，例如小鼠。

术语“足够量”是指足以产生所需效果的量。术语“治疗有效量”是有效改善疾病或疾患的症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。

如本文所用，术语“约”在本文中使用时包括比指定值高多达10％且包括10％、并且低多达10％且包括10％，适当地，比指定值高多达5％且包括5％、并且低多达5％且包括5％，特别是指定值。术语“之间”包括指定边界的值。

应当理解，本文所述的任何方法都可以具有在体外、离体或者体内进行的一个或多个或所有步骤。

转录因子

根据本发明的第一方面，提供了一种产生肝细胞的方法，所述方法包括增加(或已经增加了)非肝细胞群中的至少三种或更多种转录因子的表达，其中三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体，和培养(或已经培养了)该细胞群以获得肝细胞。

根据本发明的另一方面，提供了一种产生肝细胞的方法，所述方法包括增加细胞群中的一种或多种选自以下的转录因子的蛋白质表达：AR、ARID3C、ATF5、CEBPA、CREB3L3、CUX2、EPAS1、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HLF、HNF1A、HNF4A、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、NR0B2、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、ONECUT1、ONECUT2、PPARA、PROX1、RORA、RORC、RXRA、SALL1、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16、及其变体，和培养该细胞群以获得肝细胞。

所述方法可以包括增加足够数量的能够引起细胞群分化为肝细胞的转录因子(例如，表1、2、3和4所列的及其变体和同种型)的表达(特别是蛋白质表达)，由此使细胞群分化为肝细胞。在本发明的上下文中，这些因子也可以称为“重新编程因子”。如本文所述，可以增加外源或内源(特别是外源)转录因子的表达。

在一个实施方案中，(例如，至少一种或多种，例如至少三种或更多种)转录因子选自：AR、ARID3C、ATF5、CEBPA、CREB3L3、CUX2、EPAS1、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HLF、HNF1A、HNF4A、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、NR0B2、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、ONECUT1、ONECUT2、PPARA、PROX1、RORA、RORC、RXRA、SALL1、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16、及其变体，其中增加AR、ATF5、CEBPA、CREB3L3、EPAS1、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HLF、HNF1A、HNF4A、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、ONECUT1、PPARA、PROX1、RORA、RORC、RXRA、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16、及其变体中的至少一种的表达，具体地，其中增加ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1及其变体中的至少一种的表达。

在一个实施方案中，所述方法包括增加两种或更多种转录因子的表达，特别是增加三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种和六种或更多种转录因子的表达，所述转录因子选自：AR、ARID3C、ATF5、CEBPA、CREB3L3、CUX2、EPAS1、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HLF、HNF1A、HNF4A、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、NR0B2、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、ONECUT1、ONECUT2、PPARA、PROX1、RORA、RORC、RXRA、SALL1、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16及其变体。

在一个实施方案中，(例如，至少一种或多种，例如至少三种或更多种)转录因子选自：AR、ATF5、CEBPA、CREB3L3、EPAS1、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HLF、HNF1A、HNF4A、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、ONECUT1、PPARA、PROX1、RORA、RORC、RXRA、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16、及其变体。

在一个实施方案中，所述方法包括增加两种或更多种转录因子的表达，特别是增加三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种转录因子的表达，所述转录因子选自：AR、ATF5、CEBPA、CREB3L3、EPAS1、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HLF、HNF1A、HNF4A、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、ONECUT1、PPARA、PROX1、RORA、RORC、RXRA、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16、及其变体。

在一个实施方案中，(例如，至少一种或多种，例如至少三种或更多种)转录因子选自：ATF5、ARID3C、CREB3L3、CUX2、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR0B2、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、ONECUT2、RXRA、SALL1、SREBF1及其变体。

在一个实施方案中，所述方法包括增加两种或更多种转录因子的表达，特别是增加三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种和六种或更多种转录因子的表达，所述转录因子选自：ATF5、ARID3C、CREB3L3、CUX2、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR0B2、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、ONECUT2、RXRA、SALL1、SREBF1及其变体。

在一个实施方案中，(例如，至少一种或多种，例如至少三种或更多种)转录因子选自：ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1及其变体。

在一个实施方案中，所述方法包括增加两种或更多种转录因子的表达，特别是增加三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种和六种或更多种转录因子的表达，所述转录因子选自：ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1及其变体。

在一个实施方案中，(例如，至少一种或多种，例如至少三种或更多种)转录因子选自：ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、RXRA、SREBF1及其变体。

在一个实施方案中，(例如，至少一种或多种，例如至少三种或更多种)转录因子选自：ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3及其变体。

在一个实施方案中，转录因子包括FOXA1。FOXA1可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自FOXA1与ATF5、CREB3L3、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括CREB3L3。CREB3L3可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自CREB3L3与ATF5、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，所述方法包括增加FOXA1和CREB3L3与选自表1、2、3或4的表中的一种、两种、三种或四种(特别是一种或两种)转录因子的组合的表达。在进一步的实施方案中，FOXA1和CREB3L3与一种或两种选自以下列表的转录因子组合使用：ATF5、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体，特别是与HHEX、HNF4G、KLF9、MLXIPL、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括HHEX。HHEX可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自HHEX与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，所述方法包括增加FOXA1和HHEX与选自表1、2、3或4的表中的一种、两种、三种或四种(特别是一种或两种)转录因子的组合的表达。在进一步的实施方案中，FOXA1和HHEX与一种或两种选自以下列表的转录因子组合使用：ATF5、CREB3L3、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体，特别是与CREB3L3、HNF4G、KLF9、MLXIPL、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，所述方法包括增加FOXA1、CREB3L3和HHEX与选自表1、2、3或4的表中的一种、两种、三种或四种(特别是一种)转录因子的组合的表达。在进一步的实施方案中，FOXA1、CREB3L3和HHEX与选自以下列表的转录因子组合使用：ATF5、FOXA2、FOXA3、GATA4、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体，特别是与HNF4G、KLF9、MLXIPL、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括NR1I2。NR1I2可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自NR1I2与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括FOXA3。FOXA3可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自FOXA3与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包含NR1I3。NR1I3可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自NR1I3与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，三种或更多种转录因子选自：FOXA1、FOXA2、FOXA3、CREB3L3、HHEX、NR1I2、NR1I3或其变体。

本发明人在本文中已经表明FOXA因子(也称为转录因子的HNF3亚家族)可以互换使用。因此在一个实施方案中，三种或更多种转录因子选自：FOXA1、FOXA2或FOXA3，与两种或更多种选自以下的转录因子的组合：NR1I2；NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。在进一步的实施方案中，三种或更多种转录因子选自：FOXA1、FOXA2或FOXA3；CREB3L3；HHEX；NR1I2；NR1I3；或其变体。

此外，因子NR1I2和NR1I3(核受体亚家族第1组第I家族的成员)也可以互换使用。因此在进一步的实施方案中，三种或更多种转录因子选自：NR1I2或NR1I3，与两种或更多种选自以下的转录因子的组合：FOXA1；FOXA2；FOXA3；CREB3L3；HHEX；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。在进一步的实施方案中，三种或更多种转录因子选自：NR1I2或NR1I3；FOXA1；FOXA2；FOXA3；CREB3L3；HHEX；或其变体。

根据本发明进一步的方面，提供了一种产生肝细胞的方法，所述方法包括增加(非肝细胞)细胞群中的至少三种或更多种转录因子的表达，其中三种或更多种转录因子选自：

(a)FOXA1、FOXA2或FOXA3；

(b)NR1I2或NR1I3；和

(c)至少一种或多种选自以下的额外的转录因子：HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体，

和培养所述细胞群以获得肝细胞。

在一个实施方案中，转录因子包括：(i)FOXA1、FOXA2或FOXA3，(ii)CREB3L3和(iii)NR1I2或NR1I3。在进一步的实施方案中，转录因子包括FOXA1、CREB3L3和NR1I2。

在一个实施方案中，转录因子包括：(i)FOXA1、FOXA2或FOXA3，(ii)HHEX和(iii)NR1I2或NR1I3。在进一步的实施方案中，转录因子包括FOXA1、HHEX和NR1I2。

在一个实施方案中，转录因子包括：(i)FOXA1、FOXA2或FOXA3，(ii)CREB3L3，(iii)HHEX和(iv)NR1I2或NR1I3。在另一个实施方案中，所述方法包括增加FOXA1、CREB3L3、NR1I2和HHEX的表达。因此，根据本发明的另一方面，提供了一种产生肝细胞的方法，所述方法包括增加非肝细胞群中(i)FOXA1、FOXA2或FOXA3；(ii)CREB3L3；(iii)HHEX和(iv)NR1I2或NR1I3的表达，和培养所述细胞群以获得肝细胞。根据本发明的另一方面，提供了一种产生肝细胞的方法，所述方法包括增加非肝细胞群中FOXA1、CREB3L3、NR1I2和HHEX的表达，和培养所述细胞群以获得肝细胞。

在一个实施方案中，转录因子包括GATA4。GATA4可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自GATA4与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括HNF4A。HNF4A可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自HNF4A与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括ATF5。ATF5可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自ATF5与CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括MLXIPL。MLXIPL可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自MLXIPL与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括KLF9。KLF9可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自KLF9与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括RXRA。RXRA可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自RXRA与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括FOXA2。FOXA2可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自FOXA2与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括SREBF1。SREBF1可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自SREBF1与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括ONECUT1。ONECUT1可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自ONECUT1与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、HNF4G、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，转录因子包括HNF4G。HNF4G可以与一种或多种，例如一种、两种、三种、四种或五种转录因子组合使用，所述转录因子选自表1、2、3或4中所列出的。在进一步的实施方案中，所述方法包括增加两种至六种转录因子的表达，所述转录因子选自HNF4G与ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、RXRA、SREBF1或其变体的组合。

在一个实施方案中，所述方法包括增加两种或更多种转录因子的表达，特别是增加三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种和六种或更多种转录因子的表达，所述转录因子选自：ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、KLF9、MLXIPL、NR1I2、NR1I3、RXRA、SREBF1及其变体。

在一个实施方案中，转录因子选自AR、ARID3C、CUX2、EPAS1、FOXA3、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、ONECUT2、PPARA、RORA、RORC、RXRA、SALL1、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16及其变体。在进一步的实施方案中，转录因子选自：AR、ARID3C、CUX2、EPAS1、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、ONECUT2、PPARA、RORA、RORC、RXRA、SALL1、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16及其变体。在又一个实施方案中，转录因子选自：AR、ARID3C、CUX2、EPAS1、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、RORA、RORC、RXRA、SALL1、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16及其变体。

在一个实施方案中，转录因子选自：AR、EPAS1、FOXA3、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、PPARA、RORA、RORC、RXRA、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16及其变体。在进一步的实施方案中，转录因子选自：AR、EPAS1、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、PPARA、RORA、RORC、RXRA、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16及其变体。在又一个实施方案中，转录因子选自：AR、EPAS1、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、RORA、RORC、RXRA、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16及其变体。

在一个实施方案中，转录因子选自：FOXA3、HNF4G、KLF9、MLXIPL、RXRA、SREBF1及其变体。在进一步的实施方案中，转录因子选自：HNF4G、KLF9、MLXIPL、RXRA、SREBF1及其变体。

在一个实施方案中，增加ARID3C、CUX2、HNF4G、KLF9、MLXIPL、RXRA、SALL1或SREBF1中的至少一种的表达，优选地增加与选自以下的一种或多种转录因子的组合的表达：ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、NR0B2、NR1I2、NR1I3、ONECUT1、ONECUT2及其变体。

在一个实施方案中，增加HNF4G、KLF9、MLXIPL、RXRA或SREBF1中的至少一种的表达，优选地增加与选自以下的一种或多种转录因子的组合的表达：ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、NR1I2、NR1I3、ONECUT1及其变体。

在一个实施方案中，增加KLF9、MLXIPL、RXRA或SREBF1中的至少一种的表达，优选地增加与选自以下的一种或多种转录因子的组合的表达：ATF5、CREB3L3、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HNF4A、NR1I2、NR1I3及其变体。

如本文提供的数据所示(参见，例如，图12的表5和6)，包含至少三种或四种在表1、2、3和4中列出的转录因子的多个组合存在于重新编程为成体肝细胞的细胞中。因此，在一个实施方案中，本发明的方法中使用的转录因子包括表5和6中所列的组合之一。

本发明的方法包括使用目的转录因子的变体(即，如表1、2、3和4中所述)。对转录因子的提及还包括物种变体、同源物、等位基因形式、突变体形式及其等同物，包括其中不会对功能结构产生不利影响的保守取代、添加、缺失。转录因子基因的核酸序列的变化可导致氨基酸序列的保守变化或取代。因此，本发明包括具有保守改变或取代的多肽。本发明包括进行保守取代的序列，所述保守取代不改变感兴趣转录因子蛋白的活性。

表1.用于生成肝细胞的转录因子，包括登录号(2020年3月11日访问)

在本文提供的实施例中显示了表1中描述的转录因子诱导源细胞分化成肝细胞。可以使用转录因子的不同组合。例如，表1中列出的一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个基因(及其同种型或变体)可用于本发明的方法中。在进一步的实施方案中，使用的转录因子可以选自表2、3或4(及其同种型或变体)。这些基因中的许多具有不同的同种型，这些同种型可具有相似的功能，因此考虑用于本发明。

在一个实施方案中，所述方法包括增加两种或更多种转录因子的表达，特别是增加三种、四种、五种或六种或更多种转录因子的表达。优选地，所述方法包括增加三种或更多种转录因子的表达。更优选地，所述方法包括增加四种或更多种转录因子的表达。

在一个实施方案中，所述方法包括增加三种至八种转录因子的表达，例如增加四种至七种转录因子的表达，特别是增加四种或五种转录因子的表达。在一个实施方案中，所述方法包括增加二种至八种转录因子的表达，特别是增加三种至六种或三种至五种转录因子的表达。在一个实施方案中，所述方法包括增加两种转录因子、三种转录因子、四种转录因子、五种转录因子或六种转录因子的表达。

所述方法可以包括将编码或提供如本文所述的转录因子组合的核酸或蛋白制剂引入源细胞，和在适合将细胞重新编程为肝细胞的条件下培养细胞。

根据一个方面，提供了一种从源细胞产生肝细胞的方法，所述方法包括诱导编码本文所述的一种或多种转录因子(例如，如表1所列出的)的基因的表达增加，其中源细胞分化形成肝细胞。

在一个实施方案中，诱导基因以高于源细胞内源性表达水平的水平表达基因。

在一个实施方案中，所述方法包括通过多能干细胞(特别是诱导型多能干细胞)的细胞重新编程产生肝细胞。

根据本发明的另一方面，提供了一种或多种转录因子用于生成肝细胞的用途，所述转录因子选自：AR、ARID3C、ATF5、CEBPA、CREB3L3、CUX2、EPAS1、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HLF、HNF1A、HNF4A、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、NR0B2、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、ONECUT1、ONECUT2、PPARA、PROX1、RORA、RORC、RXRA、SALL1、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16及其变体。根据本发明的另一方面，提供了至少三种或更多种转录因子用于生成肝细胞的用途，其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。本发明的这些方面可以与本文所述的任何转录因子的组合一起使用。

细胞类型

所述方法可用于任何细胞类型，包括干细胞。在干细胞的情况下，使用所述方法产生肝细胞可称为“细胞重新编程”、“正向重新编程”、“直接编程”或“直接分化”，即，多能干细胞分化为肝细胞。此外，肝细胞的细胞重新编程可用作通用术语，指使用转录因子将源细胞分化为肝细胞。

适用于本发明方法的细胞来源可以包括，例如，任何干细胞或非肝细胞。例如，干细胞可以是多能干细胞，例如诱导型多能干细胞、胚胎干细胞或源自核转移或细胞融合的多能干细胞。可以优选的是，胚胎干细胞源自不破坏胚胎的情况下，特别是在细胞是人的情况下。在一些实施方案中，干细胞不是来源于人或动物胚胎，即，本发明不涉及任何涉及破坏人或动物胚胎的方法。干细胞还可以包括多能干细胞、寡能干细胞或单能干细胞。干细胞还可以包括胎儿干细胞或成体干细胞，例如造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞。在某些方面，干细胞可以从脐带、胎盘、羊水、绒毛膜、胚泡、骨髓、脂肪组织、脑、外周血、脐带血、经血、血管、骨骼肌、皮肤和肝脏中分离。

在一个实施方案中，细胞群是人来源的。源细胞，例如，非肝细胞，可以是人来源的。

在一个实施方案中，细胞群包含干细胞，例如，诱导型多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、造血干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞。在进一步的实施方案中，细胞群包括多能干细胞，例如，iPSC或ESC。

在一个实施方案中，源细胞是干细胞，例如，iPSC、ESC、造血干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞。在进一步的实施方案中，源细胞是多能干细胞，例如，iPSC或ESC。在一些实施方案中，源细胞是iPSC。

从小鼠制备诱导型多能干细胞的方法也是本领域已知的。iPSC的诱导通常需要表达或暴露于至少一个来自Sox家族的成员和至少一个来自Oct家族的成员。Sox和Oct被认为是限定ES细胞标识的转录调节等级体系的核心。例如，Sox可以是Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15或Sox-18；Oct可以是Oct-4。其他因子可以增加重新编程效率，例如Nanog、Lin28、Klf4或c-Myc；具体的重新编程因子的组可以是包含Sox-2、Oct-4、Nanog和任选地，Lin-28的组；或包含Sox-2、Oct4、Klf和任选地，c-Myc的组。在一种方法中，可以通过使用病毒转导用转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4转染细胞来产生iPSC。

在一个实施方案中，肝细胞是人肝细胞。

在一个实施方案中，诱导型多能干细胞来源于患者的体细胞或生殖细胞。这种自体细胞的使用将消除将细胞与受体匹配的需求。或者，可以使用可商购的iPSC，例如可从WICELL(WiCell Research Institute，Inc，Wisconsin，US)获得的那些。或者，细胞可以是组织特异性干细胞，其也可以是自体的或捐赠的。

转录因子的递送

应当理解，用于增加待编程为肝细胞的细胞中转录因子的表达的方法可以包括本领域已知的任何方法，例如，通过诱导先前引入细胞中的一个或多个表达盒的表达，或通过将核酸(如DNA或RNA)、多肽或小分子引入细胞。增加某些内源性的转录抑制基因的表达也可以通过调节上游转录因子表达或表观遗传调节来逆转对这些基因表达的沉默或抑制作用。因此，本发明的方法可以包括在人工增加本文所述的一种或多种转录因子的表达水平的条件下培养细胞群。

在一个实施方案中，通过使细胞群与转录因子(即，编码转录因子的蛋白质)接触来增加转录因子的表达。转录因子的递送可以通过将转录因子蛋白直接电穿孔至细胞来进行。

在另一个实施方案中，通过使细胞群与一种或多种激活或增加转录因子的表达或量的试剂接触来增加转录因子的表达。

在一个实施方案中，所述试剂选自：核酸(即，多核苷酸，例如，信使RNA(mRNA)、编码DNA序列)、蛋白质、适体和小分子、核糖体、RNAi试剂、引导RNA(gRNA)和肽-核酸(PNA)及其类似物或变体。在一个实施方案中，试剂是用于增加一种或多种内源性转录因子表达的转录激活***(例如，用于基因激活***(例如CRISPR/Cas9或TALEN)中的gRNA)。

诱导细胞群(即，源细胞)分化的方法可以包括向细胞递送包含编码一种或多种转录因子的开放阅读框(例如，在表达盒中)的核酸、转录因子蛋白或编码转录因子的开放阅读框的转录激活子。这导致细胞中转录因子的量增加，并且细胞分化形成肝细胞。所述开放阅读框可以是重组表达盒的一部分。

在一个实施方案中，核酸包含重组或外源表达盒，该表达盒包含足够数量的一种或多种转录因子序列(或基因)以引起源细胞的细胞重新编程为肝细胞。外源表达盒可以包含用于诱导表达一种或多种转录因子的外部诱导型转录调节元件，例如诱导型启动子，例如，包含四环素反应元件或其变体。

如果通过引入编码转录因子的外源序列(例如，转录因子基因)来增加转录因子的表达，那么可以理解，可以使用任何合适的***来递送序列。基因递送***可以是转座子***；病毒基因递送***；游离型基因递送***；或同源重组***，例如利用锌指核酸酶、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、或大范围核酸酶、或CRISPR/Cas9等。

或者，如本文所述或本领域普通技术人员已知的，将核酸(例如DNA或RNA)引入细胞可使用用于转化细胞的核酸递送的任何合适方法。此类方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过离体转染、通过注射(包括显微注射)、通过电穿孔、通过磷酸钙沉淀、通过使用DEAE-葡聚糖，然后使用聚乙二醇、通过直接声波加载、通过脂质体介导的转染、通过受体介导的转染、通过微粒轰击、通过用碳化硅纤维搅拌、通过农杆菌介导的转化、以及这些方法的任意组合。通过应用这些技术，细胞可以被稳定或瞬时转化。

此外，表达盒(例如，诱导型重组表达盒)可以包括可切割的序列。这样的序列是被能够特异性切割DNA的实体识别的序列，并且包括限制性位点，所述限制性位点是限制性酶的靶序列或被其他DNA切割实体如核酸酶、重组酶、核酶或人工构建体识别的序列。可以包括至少一个可切割序列，但优选存在两个或更多个。这些可切割序列可以在盒中的任何合适的点，使得如果需要可以选择性地去除盒的选定部分或整个盒。因此，可切割位点可以位于可能需要去除的部分/全部基因序列的侧翼。因此，该方法还可以包括去除表达盒和/或遗传物质。

载体

在一个实施方案中，使用载体将转录因子(例如，转录因子的组合)引入细胞群。本领域技术人员将具备通过标准重组技术构建载体的能力。载体包括但不限于质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。

在一个实施方案中，载体是病毒载体。病毒基因递送***可以是基于RNA或基于DNA的病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体(例如，源自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)、γ逆转录病毒载体、腺病毒(Ad)载体(包括其具有复制能力、复制缺陷和无活性(gutless)形式)、腺相关病毒衍生(AAV)载体、猿病毒40(SV-40)载体、牛***状瘤病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、哈维鼠肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒载体和仙台病毒载体。在进一步的实施方案中，病毒载体选自：慢病毒载体、腺相关病毒载体或仙台病毒载体。在又一个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。

慢病毒载体是本领域众所周知的。慢病毒载体是一种复杂的逆转录病毒，其能够随机整合到宿主细胞基因组中，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还含有其他具有调节或结构功能的基因(例如，辅助基因Vif、Nef、Vpu、Vpr)。慢病毒载体具有能够感染非***细胞的优势，可用于体内和离体基因传递和核酸序列的表达。例如，重组慢病毒载体能够感染非***细胞，其中合适的宿主细胞用两个或更多个携带包装功能的载体转染，即gag、pol和env，以及rev和tat。

在一个实施方案中，病毒载体以高感染复数(MOI)使用。高MOI有助于确保将多于一种转录因子引入源细胞。在一个实施方案中，MOI大于0.5，例如1.0或以上。

在一个实施方案中，通过质粒将编码一种或多种转录因子的核酸序列引入细胞中。在一个实施方案中，将在单个质粒上的至少一种编码转录因子的核酸序列引入细胞中。

在一个实施方案中，质粒是游离型的。游离型载体能够将大的DNA片段引入细胞，但保持在染色体外，每个细胞周期复制一次，有效地分配给子细胞，并且基本上不引发免疫反应。在替代实施方案中，可以使用基于爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的游离型载体、基于酵母的载体、基于腺病毒的载体、基于猿病毒40(SV40)的游离型载体或基于牛***状瘤病毒(BPV)的载体。

位点特异性递送

可以使用用于将核酸序列***特定序列的任何合适的技术，并且在本领域中描述了几种。合适的技术包括在所需位置引入断裂并允许载体重组到间隙中的任何方法。因此，靶向位点特异性基因组修饰的关键第一步是在待修饰的基因组基因座处创建双链DNA断裂(DSB)。可以利用不同的细胞修复机制来修复DSB并引入所需的序列，这些是非同源末端连接修复(NHEJ)，其更容易出错；由供体DNA模板介导的同源重组修复(HR)可用于***诱导盒。

存在几种技术，其允许在基因组中定制位点特异性地生成DSB。其中许多涉及使用定制的核酸内切酶，例如锌指核酸酶、TALEN或成簇的规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白(CRISPR/Cas9)***。

锌指核酸酶是人工酶，其通过将锌指DNA结合结构域与限制性酶FokI的核酸酶结构域融合而产生。后者具有非特异性切割结构域，该结构域必须二聚化才能切割DNA。这意味着需要两个锌指核酸酶单体才能使FokI结构域二聚化并切割DNA。DNA结合结构域可以设计为靶向任何目的基因组序列，是Cys2His2锌指的串联阵列，其中的每个识别靶序列中的三个连续核苷酸。两个结合位点相隔5-7bp，以实现FokI结构域的最佳二聚化。因此，该酶能够在特定位点切割DNA，并通过确保必须发生两个近端DNA结合事件以实现双链断裂来增加靶标特异性。

转录激活子样效应核酸酶或TALEN，是二聚转录因子/核酸酶。它们是通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域(核酸酶)融合而制成的。转录激活子样效应子(TALE)可以被工程化，使其几乎可以结合任何所需的DNA序列，因此当与核酸酶组合时，可以在特定位置切割DNA。TAL效应子是由黄色单胞菌属(Xanthomonas)细菌分泌的蛋白质，其DNA结合结构域包含重复的高度保守的33-34个氨基酸序列，具有不同的第12和第13氨基酸。这两个位置是高度可变的并且显示出与特定核苷酸识别的强相关性。氨基酸序列和DNA识别之间的这种直接关系允许通过选择在两个可变位置包含适当残基的重复区段组合来工程化特定的DNA结合结构域。因此，TALEN由33到35个氨基酸模块的阵列构建而成，其中每个都靶向单个核苷酸。通过选择模块的阵列，几乎可以靶向任何序列。同样，使用的核酸酶可以是FokI或其衍生物。

已经确定了三种类型的CRISPR机制，其中II型是研究最多的。CRISPR/Cas9***(II型)利用Cas9核酸酶在由短向导RNA确定的位点使DNA发生双链断裂。CRISPR/Cas***是一种原核免疫***，其赋予对外来遗传元件的抗性。CRISPR是包含短的碱基序列重复的原核DNA区段。每次重复之后都是来自先前暴露于外来遗传元件的“protospacer DNA”的短区段。CRISPR间隔物使用RNA干扰识别并切割外源遗传元件。CRISPR免疫反应通过两个步骤发生：CRISPR-RNA(crRNA)生物发生和crRNA引导的干扰。CrRNA分子由从protospacer DNA转录的可变序列和CRISPR重复序列组成。然后每个crRNA分子与第二RNA杂交，称为反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)，这两者最终与核酸酶Cas9形成复合物。crRNA的protospacer DNA编码部分指导Cas9切割互补的靶DNA序列，如果它们与称为protospacer相邻基序(PAM)的短序列相邻。这种自然***已经过工程化和开发，以在基因组DNA的特定位点引入DSB断裂，以及许多其他应用。特别是，可以使用来自化脓性链球菌的CRISPR II型***。简而言之，CRISPR/Cas9***包含两个组件，它们被递送到细胞以提供基因组编辑：Cas9核酸酶本身和gRNA。gRNA是定制的、位点特异性crRNA(针对靶序列)和标准化的tracrRNA的融合体。

一旦形成了DSB，就会提供与靶向基因座同源的供体模板；DSB可以通过同源定向修复(HDR)途径进行修复，从而允许进行精确***。

该***的衍生物也是可能的。Cas9的突变形式是可用的，例如Cas9D10A，其只有切口酶活性。这意味着其只切割一条DNA链，并且不激活NHEJ。相反，当提供同源修复模板时，DNA修复仅通过高保真HDR途径进行。Cas9D10A可与Cas9复合物成对使用，Cas9复合物被设计为与两个sgRNA(所述sgRNA与靶位点相反链上的相邻区域互补)结合产生相邻的DNA切口，这可能是特别有利的。

可以将用于使双链DNA断裂的元件引入一个或多个载体中，例如质粒，用于在细胞中表达。

因此，在本发明的方法中可以使用在基因组中制备特异性、靶向双链断裂以实现基因/诱导盒***的任何方法。可优选地，用于***基因/诱导盒的方法利用锌指核酸酶、TALEN和/或CRISPR/Cas9***或其任何衍生物中的任何一种或多种。

一旦通过任何合适的方式制备了DSB，就可以如下所述以任何合适的方式提供用于***的基因/诱导盒。基因/诱导盒和相关遗传物质形成供体DNA，用于在DSB修复DNA，并使用标准细胞修复机制/途径***。如上所述，断裂的启动方式将改变用于修复损伤的途径。

受控的表达

在一个实施方案中，在受控的转录下进行转录因子的表达。在本发明的这个方面，可以在细胞内控制转录因子的转录和翻译(表达)。如果需要，这允许转录因子的过表达。

携带转录因子的外源表达盒可以包含外部诱导型转录调节元件(即，诱导型启动子)，用于转录因子的诱导型表达。所述诱导型表达盒可以通过添加外源物质来控制。无论使用何种培养条件，外源物质都将控制基因序列在诱导型表达盒内的表达；并且可以连续提供然后撤回，以诱导转录或在需要转录时提供，这取决于其作用方式。

可以使用WO2018096343中描述的双盒表达***来增加本文描述的转录因子的表达，该文献通过引用并入本文。该***针对遗传安全港(GSH)位点，其提供降低的***遗传物质的表观遗传沉默的风险。

因此，在一个实施方案中，使用包括以下的方法将编码一种或多种(例如三种或更多种)转录因子的序列引入细胞群：

-将编码转录调节蛋白的基因靶向***细胞的第一遗传安全港位点；和

-将诱导盒靶向***细胞的第二遗传安全港位点，其中所述诱导盒包含与诱导型启动子可操作连接的所述转录因子序列，并且所述启动子受转录调节蛋白调节。

本发明的这个实施方案提供了一种双表达盒***。将编码转录调节蛋白的基因***第一GSH，为诱导盒的表达提供了控制机制，该诱导盒与诱导型启动子可操作地连接并***第二GSH位点。在一个实施方案中，第一和第二GSH是不同的。

GSH位点是基因组内的基因座，其中可以***基因或其他遗传物质而对细胞或***的遗传物质没有任何有害影响。最有益的是GSH位点，其中***基因序列的表达不受来自相邻基因的任何通读表达的干扰，并且诱导盒的表达最大限度地减少了对内源性转录程序的干扰。已经提出了更正式的标准，以帮助确定特定基因座将来是否是GSH位点(Papapetrou等人，(2011))，这些标准包括以下位点：(i)距任何基因5'末端50kb或更远，(ii)距任何与癌症相关的基因300kb或更远，(iii)距离任何microRNA(miRNA)300kb或更远，(iv)位于转录单位之外，和(v)位于超保守区(UCR)之外。可能没有必要满足所有这些建议的标准，因为已经确定的GSH并不满足所有的标准。认为合适的GSH将满足至少2、3、4条或所有这些标准。在本发明的方法中可以使用任何合适的GSH位点，基础是该位点允许***遗传物质而不会对细胞产生有害影响并且允许***的遗传物质转录。本领域技术人员可以使用这些简化的标准来鉴定合适的GSH，和/或使用上面列出的更正式的标准。

在一个实施方案中，第一和第二遗传安全港位点(GSH)选自hROSA26基因座、AAVS1基因座、CLYBL基因、CCR5基因或HPRT基因(特别是其中的任何两个)。在遗传安全港位点内特异性的***优于随机的基因组整合，因为预期这是对基因组更安全的修饰，并且不太可能导致不想要的副作用，例如沉默天然基因表达或引起导致癌变细胞类型的突变。

腺相关病毒整合位点1基因座(AAVS1)位于人19号染色体上的蛋白磷酸酶1调节亚基12C(PPP1R12C)基因内，其在人组织中均匀且普遍地表达。AAVS1已被证明是一个有利的转录环境，因为其包含开放的染色质结构和天然染色体绝缘体，这些绝缘体使诱导盒能够抵抗沉默。没有已知的PPP1R12C基因破坏对细胞的不利影响。此外，***该位点的诱导盒在许多不同的细胞类型中仍然保留转录活性。

已根据与小鼠GSH的序列相似性鉴定了hROSA26位点(ROSA26–反向剪接受***点#26)。hROSA26基因座位于3号染色体(3p25.3)上，可在Ensembl数据库(GenBank:CR624523)中找到。整合位点位于THUMPD3长的非编码RNA(反向链)的开放阅读框(ORF)内。由于hROSA26位点具有内源性启动子，***的遗传物质可以利用该内源性启动子，或者可以被***与启动子可操作地连接。

柠檬酸裂解酶Beta样的内含子2(CLYBL)基因，位于13号染色体长臂上，被鉴定为合适的GSH，因为其是已鉴定的源自phiC31整合酶的噬菌体整合热点之一。研究表明，向该基因座随机***的诱导盒是稳定的且表达的。已经表明，在该GSH***诱导盒不干扰局部基因表达(Cerbini等人，(2015))。CLYBL因此提供了可适用于本发明的GSH。

CCR5位于3号染色体(位置3p21.31)上，其是编码HIV-1主要辅助受体的基因。将该位点用作GSH的兴趣是由于该基因中的无效突变，其似乎没有不良影响，但容易产生HIV-1感染抗性。已经开发出靶向第三外显子的锌指核酸酶，从而允许在该基因座***遗传物质。

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因编码转移酶，该酶在通过嘌呤补救途径产生嘌呤核苷酸中起核心作用。

在其他生物体中已鉴定了GSH，包括小鼠中的ROSA26、HRPT和Hipp11(H11)基因座。哺乳动物基因组可包括基于伪attP位点的GSH位点。对于这样的位点，已经开发了hiC31整合酶(链霉菌噬菌体衍生的重组酶)作为非病毒***工具，因为其能够将包含带有attB位点的诱导盒的质粒整合到伪attP位点中。

技术上，第一和/或第二GSH的***可发生在一条染色体上，或发生两条染色体上。GSH存在于二倍体生物的两条染色体上的相同基因基因座。在两条染色体内***是有利的，因为它使得能够增加来自诱导盒内***的遗传物质的转录水平，从而实现特别高的转录水平。

基于定制的在GSH处位点特异性DNA双链断裂的生成，可以实现将遗传物质特异性***特定GSH。然后可以使用任何合适的机制例如同源重组引入遗传物质。可以使用在基因组中制备特定DSB的任何方法，但优选的***包括CRISPR/Cas9及其修改版本、锌指核酸酶和TALEN***。

一个或多个基因序列可以从第二和/或另外的GSH内可控地转录。实际上，诱导盒可包含希望***到GSH的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个基因序列(例如，转录因子序列)，并且其转录是可控诱导的。因此，本发明所需的转录因子可以包含在引入到第二遗传安全港位点中的相同盒内。例如，三种或更多种转录因子可以包括在例如三种单顺反子构建体、一种单顺反子构建体和一种双顺反子构建体、或一种三顺反子构建体中。应当理解，类似的构建体组合可用于实现更高级别的转录因子表达。

或者，如果使用转录因子的组合，则可以将单独的转录因子引入单独的GSH和/或在不同诱导型启动子的控制下。因此，在一个实施方案中，将至少三种或更多种转录因子引入单独的GSH中。这可以通过对三种或更多种转录因子使用三种或更多种不同的GSH位点来实现(即，其中转录因子作为单顺反子盒引入)。或者，通过利用GSH存在于二倍体生物的两条染色体上的相同基因基因座的事实，可以实现，例如，将一种转录因子引入一条染色体上的GSH，将不同的转录因子引入另一条染色体上的相同GSH。如果需要转录因子的不同表达水平或表达时间，该实施方案是有利的。在一个实施方案中，该方法包括将至少三种或更多种转录因子靶向***源细胞的第二、第三和第四遗传安全港位点，每种转录因子可操作地连接到诱导型启动子。每种转录因子的诱导型启动子可以相同，因此都受转录调节蛋白的调节。

转录调节蛋白是与DNA结合的蛋白质，优选与位于启动子内或启动子附近的DNA位点序列特异性结合，并促进转录机制与启动子的结合，从而促进DNA序列的转录(转录激活子)或阻断这一过程(转录抑制子)。

转录调节蛋白结合的DNA序列称为转录因子结合位点或反应元件，其存在于受调节DNA序列的启动子内或附近。转录激活蛋白与反应元件结合并促进基因表达。此类蛋白质在本发明的用于控制诱导盒表达的方法中是优选的。转录抑制蛋白与反应元件结合并阻止基因表达。

转录调节蛋白可以通过多种机制激活或失活，包括与物质的结合、与其他转录因子或共调节蛋白的相互作用(例如，同源或异源二聚化)、磷酸化和/或甲基化。可以通过激活或失活来控制转录调节蛋白。

如果转录调节蛋白是转录激活蛋白，则优选转录激活蛋白需要激活。这种激活可以通过任何合适的方式进行，但优选通过向细胞中添加外源物质来激活转录调节蛋白。可以控制外源物质向细胞的提供，从而可以控制转录调节蛋白的激活。或者，可以提供外源物质以使转录调节蛋白失活，然后停止提供以激活转录调节蛋白。

如果转录调节蛋白是转录抑制蛋白，则优选转录抑制蛋白需要失活。因此，提供一种物质来阻止转录抑制蛋白抑制转录，从而允许转录。

可以使用任何合适的转录调节蛋白，优选其可以被激活或失活。优选可以提供外源物质来控制转录调节蛋白。这种转录调节蛋白也称为诱导型转录调节蛋白。

四环素控制的转录激活是一种诱导型基因表达的方法，其中在抗生素四环素或其衍生物之一(例如，更稳定的多西环素)存在的情况下，可逆地开启或关闭转录。在该***中，转录激活蛋白是四环素反应性转录激活蛋白(rtTa)或其衍生物。rtTA蛋白能够在特定的TetO操纵基因序列处与DNA结合。这种TetO序列的几个重复序列被放置在最小启动子(例如CMV启动子)的上游，它们一起形成四环素反应元件(TRE)。该***有两种形式，取决于添加四环素或衍生物是激活(Tet-On)还是失活(Tet-Off)rtTA蛋白。

在Tet-Off***中，四环素或其衍生物与rtTA结合并使rtTA失活，使其无法与TRE序列结合，从而阻止TRE控制的基因转录。该***首次在Gossen等人，(1992)中描述了。

Tet-On***由两个组件组成：(1)组成型表达的四环素反应性转录激活蛋白(rtTa)和rtTa敏感的诱导型启动子(Tet Responsive Element，TRE)。这可与四环素或其更稳定的衍生物(包括多西环素(dox))结合，导致rtTa激活，使其与TRE序列结合并诱导TRE控制的基因表达。在本发明的方法中可以优选使用它。

因此，转录调节蛋白可以是四环素反应性转录激活蛋白(rtTa)蛋白，其可以被外源提供的抗生素四环素或其衍生物之一激活或失活。如果转录调节蛋白是rtTA，则***第二GSH位点的诱导型启动子包括四环素反应元件(TRE)。外源提供的物质是抗生素四环素或其衍生物之一。

变体和修饰的rtTa蛋白也可用于本发明的方法中，这些包括Tet-On Advanced反式激活子(也称为rtTA2S-M2)和Tet-On 3G(也称为rtTA-V16，源自rtTA2S-S2)。

四环素反应元件(TRE)通常由7个重复的19bp细菌TetO序列(由间隔序列隔开)和最小启动子组成。TRE序列的变体和修饰是可能的，因为最小启动子可以是任何合适的启动子。优选地，最小启动子在不存在rtTa结合的情况下不显示或显示最小的表达水平。***到第二GSH的诱导型启动子因此可以包含TRE。

基于四环素控制的修饰***是T-REX***(Thermo-Fisher Scientific)，其中转录调节蛋白是转录抑制蛋白TetR。该***的组件包括：(i)诱导型启动子，该启动子包含强的人巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子和两个四环素操纵子2(TetO2)位点，以及Tet抑制子(TetR)。在没有四环素的情况下，Tet抑制子形成同二聚体，其以极高的亲和力与诱导型启动子中的每个TetO2序列结合，并阻止启动子的转录。一旦添加，四环素就以高亲和力结合每个Tet抑制子同二聚体，使其无法与Tet操纵子结合。然后Tet抑制子：四环素复合物从Tet操作子中解离并允许诱导表达。在这种情况下，转录调节蛋白是TetR，诱导型启动子包含两个TetO2位点。外源提供的物质是四环素或其衍生物。

其他诱导型表达***是已知的并且可以用于本发明的方法中。其中包括AgilentTechnologies的完全控制诱导***(Complete Control Inducible)。该***基于昆虫激素蜕皮激素或其类似物百日青蜕皮酮(ponasterone A，ponA)，其可以激活哺乳动物细胞中的转录，所述哺乳动物细胞转染了黑腹果蝇蜕皮激素受体(EcR)的基因和包含蜕皮激素受体结合位点的诱导型启动子。EcR是核受体类视黄醇X受体(RXR)家族的成员。在人中，EcR与RXR形成异二聚体，与蜕皮激素反应元件(EcRE)结合。在没有PonA的情况下，转录受到异二聚体的抑制。

因此，转录调节蛋白可以是抑制蛋白，例如蜕皮激素受体或其衍生物。后者的例子包括来自Agilent technologies的VgEcR合成受体，其是EcR、糖皮质激素受体的DNA结合结构域和单纯疱疹病毒VP16的转录激活结构域的融合体。诱导型启动子包含EcRE序列或其修饰形式以及最小启动子。修饰的版本包括Agilent Technologies的E/GRE识别序列，其中对序列进行了突变。E/GRE识别序列包含用于类视黄醇X受体(RXR)和GR结合结构域的反向半位点识别元件。在所有排列中，外源提供的物质是百日青蜕皮酮A，其消除了EcR或其衍生物对诱导型启动子的抑制作用，并允许转录发生。

或者，诱导***可以基于合成的类固醇米非司酮作为外源提供的物质。在这种情况下，***杂合转录调节蛋白，其基于酵母GAL4蛋白的DNA结合结构域、人孕酮受体的截短配体结合结构域(LBD)和人NF-κB的激活结构域(AD)。该杂合转录调节蛋白可从Thermo-Fisher Scientific(Gene Switch^TM)获得。米非司酮激活杂合蛋白，并允许从包含GAL4上游激活序列(UAS)和腺病毒E1b TATA盒的诱导型启动子转录。该***在Wang等人，(1994)中描述了。

因此，转录调节蛋白可以是任何合适的调节蛋白，可以是激活蛋白或抑制蛋白。合适的转录激活蛋白是四环素反应性转录激活蛋白或基因开关杂合转录调节蛋白。合适的抑制蛋白包括rtTA、TetR或EcR的Tet-Off版本。转录调节蛋白可以根据需要进行修饰或衍生。

诱导型启动子可以包含适合与转录调节蛋白结合或相互作用的元件。转录调节蛋白与诱导型启动子的相互作用优选由外源提供的物质控制。

外源提供的物质可以是与转录调节蛋白结合或相互作用的任何合适的物质。合适的物质包括四环素(或其衍生物，例如多西环素)、百日青蜕皮酮A和米非司酮。

优选编码转录调节蛋白的基因与组成型启动子可操作地连接。或者，可以选择第一GSH，使其已经具有组成型启动子，该启动子还可以驱动转录调节蛋白基因和任何相关遗传物质的表达。组成型启动子确保持续且高水平的基因表达。常用的组成型启动子包括人β-肌动蛋白启动子(ACTB)、巨细胞病毒(CMV)、延伸因子-1α(EF1α)、磷酸甘油酸激酶(PGK)和泛素C(UbC)。CAG启动子是一种强的合成启动子，经常用于驱动高水平的基因表达，并且由以下序列构建：(C)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，(A)鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及(G)兔β-珠蛋白基因的剪接受体。

根据本发明的另一方面，提供了一种从源细胞生产肝细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将编码转录调节蛋白的基因靶向***源细胞的第一遗传安全港位点；和

b)靶向***一种或多种(例如，至少三种或更多种)编码选自以下转录因子的基因至源细胞的第二遗传安全港位点：AR、ARID3C、ATF5、CEBPA、CREB3L3、CUX2、EPAS1、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HLF、HNF1A、HNF4A、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、NR0B2、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、ONECUT1、ONECUT2、PPARA、PROX1、RORA、RORC、RXRA、SALL1、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16及其变体，所述基因可操作地连接诱导型启动子，其中所述诱导型启动子受转录调节蛋白调节；和；

c)培养包含***物的源细胞以获得肝细胞。

根据本发明的另一方面，提供了一种从源细胞生产肝细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将编码转录调节蛋白的基因***源细胞的第一遗传安全港位点；和

b)***一种或多种(例如，至少三种或更多种)编码选自以下转录因子的基因至源细胞的第二遗传安全港位点：AR、ARID3C、ATF5、CEBPA、CREB3L3、CUX2、EPAS1、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HLF、HNF1A、HNF4A、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、NR0B2、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、ONECUT1、ONECUT2、PPARA、PROX1、RORA、RORC、RXRA、SALL1、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16及其变体，所述基因可操作地连接诱导型启动子，其中所述诱导型启动子受转录调节蛋白调节；和；

c)培养包含***物的源细胞以获得肝细胞。

应当理解，本发明的这个方面可以与本文所述的任何转录因子组合使用。

获得肝细胞

在一个实施方案中，所述方法另外包括监测细胞群的至少一种肝细胞特征。可以在整个培养过程中监测细胞以鉴定关键谱系标志物的表达。

例如，监测可以通过定制的报告系或免疫染色，使用荧光显微镜或流式细胞术进行。这种物质包括标志物或报告分子的基因，例如诱导视觉可识别特征(包括荧光和发光蛋白)的基因。示例包括编码水母绿色荧光蛋白(GFP)的基因，其使表达它的细胞在蓝色/紫外光下发出绿色光；荧光素酶，其催化与荧光素的反应以产生光；以及来自基因dsRed的红色荧光蛋白。

该细胞还可以包含可筛选和/或可选择的报告基因表达盒，例如，包含与报道基因可操作连接的肝特异性启动子。

可选择的标记可包括抗生素或其他药物的抗性基因。药物抗性基因的示例可以包括：嘌呤霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。细胞可以在含有适当药物的培养基上培养(即，选择培养基)，并且只有那些掺入并表达抗药性基因的细胞才能存活。因此，通过使用选择培养基培养细胞，可以容易地选择包含并表达药物抗性基因的细胞。

可用作标志物的荧光蛋白基因的示例包括：绿色荧光蛋白(GFP)基因、黄色荧光蛋白(YFP)基因、红色荧光蛋白(RFP)基因或水母发光蛋白基因。可以使用荧光显微镜检测表达荧光蛋白基因的细胞，并使用细胞分选仪如流式细胞术进行选择。荧光激活细胞分选(FACS)是一种特殊类型的流式细胞术，可用于选择表达荧光蛋白的细胞。

可用作标志物的显色酶基因的示例包括但不限于：β-半乳糖苷酶基因、β-葡萄糖醛酸酶基因、碱性磷酸酶基因或分泌型碱性磷酸酶SEAP基因。可以通过应用适当的显色底物来检测表达这些显色酶基因的细胞(例如，X-gal用于β半乳糖苷酶)，因此表达标志物基因的细胞将产生可检测的颜色(例如，蓝白筛选测试中的蓝色)。

因此，该方法可以包括选择或富集由本文所述方法提供的肝细胞的步骤。在一个实施方案中，该方法包括分选肝细胞的步骤，其基于肝标志物的表达和/或非肝标志物的缺失使用荧光激活细胞分选(FACS)或免疫磁性分选方法进行。在另一个实施方案中，通过抗药性选择从在肝特异性启动子(例如，白蛋白或CYP3A4启动子)控制下表达抗生素抗性基因的基因工程化源细胞富集肝细胞。

该方法可生成表现出至少一种肝细胞特征的细胞(即，分化的细胞)。一种或多种特征可用于选择通过本发明的方法生成的肝细胞。

特征包括但不限于检测或定量表达的细胞标志物、酶活性以及形态特征和细胞间信号传导的特征。也可以评估肝细胞的生物学功能，例如，通过分析糖原储存、白蛋白和胆汁分泌、脂质合成或尿素产生。

在一个实施方案中，特征(即，肝细胞，特别是人肝细胞的特征)选自以下一种或多种：

(i)表达一种或多种肝细胞标志物，例如葡萄糖-6-磷酸酶、白蛋白、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、延胡索乙酰乙酸酶(FAH)、细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)、去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)、乙醇脱氢酶1、精氨酸酶I型、细胞色素p450 3A4(CYP3A4)、细胞色素p4502C9(CYP2C9)、UDP葡萄糖醛酸基转移酶1家族、多肽A1(UGT1A1)、肝脏特异性有机阴离子转运蛋白(LST-1)或组合；

(ii)葡萄糖-6-磷酸酶、CYP3A4、CYP2C9、白蛋白合成和分泌、胆汁产生或分泌、尿素产生或异型生物质解毒的活性；或者

(iii)肝细胞形态特征。

在一个实施方案中，根据获得的肝细胞标志物如白蛋白或CYP3A4的表达对细胞进行分选，这些标志物与肝细胞和成熟的成体肝细胞相关。

因此，在进一步的实施方案中，特征包括选自白蛋白和CYP3A4的肝细胞标志物。

肝细胞标志物可以是通过转录组分析获得的标志物。例如，单细胞RNA测序已被用于提供从供体获得的人肝细胞的详细转录谱。该信息可用于鉴定由本文所述方法产生的肝细胞。单细胞RNA测序数据提供在Aizarani等人，(2019)；MacParland等人，(2018)和Segal等人，(2019)中，其通过引用并入本文。

该方法可以包括测定通过本文所述方法获得的分化细胞并确定一组转录基因；将分化细胞的转录基因组与来自一个或多个参考肝细胞的一个或多个参考转录基因组进行比较；和鉴定分化细胞和参考肝细胞之间的匹配。

在一个实施方案中，该方法包括将分化细胞鉴定为肝细胞类型的步骤，其通过测定分化细胞的形态特征并将所述形态特征与参考组织或细胞的形态特征匹配进行。

在一个实施方案中，该方法包括将分化细胞鉴定为肝细胞类型的步骤，其通过测定分化细胞的蛋白质标志物表达并将所述蛋白质标志物表达与参考肝细胞蛋白质标志物表达匹配进行。

在一个实施方案中，该方法包括将分化细胞鉴定为肝细胞类型的步骤，其通过测定功能并将所述功能与参考肝细胞的功能匹配进行。

在一个实施方案中，通过本发明的方法获得的细胞表达肝脏定向的内胚层表型。在一个实施方案中，通过本发明的方法获得的细胞表达成肝细胞表型。在一个实施方案中，通过本发明的方法获得的细胞表达肝细胞表型。

或者，可以基于其谱系特异性细胞表面抗原的表达将某些分化的细胞从其他分化的细胞和细胞中分选出来。还有一种方法是通过评估RNA水平上的表达进行，例如，通过RT-qPCR方法或单细胞RNA测序，无需任何分选或预选步骤。这种技术在本领域中是已知的。

细胞培养

在一个实施方案中，该方法包括在允许分化成肝细胞的条件下培养细胞群足够的时间。通常，本发明的细胞在培养基中培养，所述培养基是能够维持细胞生长的富含营养的缓冲溶液。

细胞培养基可以包含适当组合的以下任何一种：盐、缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其他糖、抗生素、血清或血清替代物、以及其他组分，例如肽生长因子等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。用于本发明方法的示例性细胞培养基描述于Ang等人，(2018)中。

可以使用本发明的方法在培养后至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天获得肝细胞。在一个实施方案中，该方法包括在适当的条件下培养至少4天，例如至少6天或至少11天。在进一步的实施方案中，该方法包括在有效产生肝细胞的一段时间(例如，至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少21天、至少28天或更长，例如，5天至40天、7天至35天、14天至28天或约21天)培养细胞。在一些实施方案中，培养细胞几个小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18或21个小时)至约35天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35天)。在一个实施方案中，该方法包括培养细胞至少约5、10、15或20天以产生肝细胞。在一个实施方案中，将细胞培养4至25天，例如14至21天。

培养后，细胞群可包含两种细胞类型。例如，此类细胞群可以包含两种细胞类型，包括干细胞和肝细胞。在一个实施方案中，细胞群包含所得细胞群中多达1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5％(或任何中间范围)的肝细胞。

培养细胞可有助于诱导细胞定向至更成熟的表型，优先促进成熟细胞的存活，或具有这两种作用的组合。

根据本发明的另一方面，提供了可通过本文定义的任何一种方法获得的细胞。

根据本发明的另一方面，提供了一种细胞，其包含一个或多个外源表达盒，所述外源表达盒编码一种或多种(至少三种或更多种)转录因子，所述转录因子选自：AR、ARID3C、ATF5、CEBPA、CREB3L3、CUX2、EPAS1、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HLF、HNF1A、HNF4A、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、NR0B2、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、ONECUT1、ONECUT2、PPARA、PROX1、RORA、RORC、RXRA、SALL1、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16及其变体。应当理解，本发明的这个方面可以与本文所述的任何转录因子组合使用。

根据本发明的另一方面，提供了一种细胞，其包含一个或多个外源表达盒，所述外源表达盒编码至少三种或更多种转录因子，其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。

在一个实施方案中，细胞是肝细胞，特别是工程化的肝细胞。

如本文所述，编码三种或更多种转录因子的外源表达盒可以整合到细胞的基因组中。在进一步的实施方案中，将编码三种或更多种转录因子的外源表达盒整合到细胞基因组中的(特异性)靶位点中。或者，将编码三种或更多种转录因子的外源表达盒整合到细胞基因组中的非特异性靶位点中。

细胞组分

根据另一方面，提供了一种药物组合物，其包含通过本文所述的方法产生的肝细胞和药学上可接受的载体。

药物组合物可以包含本文所述的肝细胞与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。可用于本发明药物组合物的低温保存溶液包括例如DMSO。

出于制造、分配和使用的目的，本文所述的肝细胞可以以细胞培养物或在等渗赋形剂或培养基中的悬浮液的形式提供，任选地冷冻以促进运输或储存。

肝细胞的用途

根据本发明的任何方法产生的细胞在基础和医学研究、诊断和治疗方法中具有应用。可以使用细胞体外研究细胞发育、提供新药测试***、开发能够筛选的方法、审查治疗方案、提供诊断测试等。这些用途构成本发明的一部分。或者，可以将细胞移植到人或动物患者中用于诊断或治疗目的。细胞在治疗中的用途也包括在本发明中。

通过本发明的方法产生的肝细胞在药物筛选中特别有用。因此，在一个实施方案中，该方法还包括使肝细胞与测试物质接触以及观察由测试物质诱导的肝细胞中的变化(例如，效应)。可以使用本领域已知的方法，例如使用药理学或毒理学测定法来观察变化或效果。在一个方面，细胞可以用于评估测试物质(例如，药物，例如化合物)的方法中，包括测定测试物质对由本文所述方法提供的肝细胞的药理学或毒理学性质。该方法可以包括：a)使本文所述的肝细胞与测试物质接触；和b)测定试验物质对肝细胞的作用。

候选分子活性的评估可包括将本文所述的肝细胞与候选分子组合、确定归因于该分子的肝细胞形态、表型或代谢活性的任何变化(即，与对照(例如未处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞)进行比较)、然后将分子的作用与观察到的变化相关联。可以进行筛选，因为候选分子被设计为对肝细胞具有药理作用，或者因为该分子被设计为在其他方面具有作用，但需要确定其是否具有意外的肝的副作用。

细胞毒性首先可以通过对细胞活力、存活、形态和酶渗漏到培养基中的作用来确定。可以进行更详细的分析以确定测试物质是否影响细胞功能(例如，糖元异生、尿素生成和血浆蛋白质合成)而不会引起毒性。

或者，这些细胞可用于评估由潜在候选药物引起的基因表达模式的变化。在该实施方案中，可以将添加候选药物引起的基因表达模式的变化与对肝脏具有已知作用的对照药物引起的基因表达模式进行比较。

因此，根据另一方面，提供了一种药物筛选方法(例如，评估药物反应性)，所述方法包括使用通过本文所述的方法产生的肝细胞的步骤。根据本发明的另一方面，提供了一种药物筛选方法，所述方法包括使使用本文定义的方法产生的肝细胞或本文定义的肝细胞与药物接触，以及观察由药物诱导的肝细胞的变化。

本发明的肝细胞也可用于筛选以评估药物如何在肝脏中代谢，例如，通过产生任何药物副产物。因此，根据另一方面，提供了一种药物筛选方法，所述方法包括使使用本文定义的方法产生的肝细胞或本文定义的肝细胞与药物接触，以及观察由药物代谢中的变化。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于鉴定肝细胞中药物靶标的方法，例如，使用遗传扰动筛查结合药物成瘾。

根据本发明的另一方面，提供如本文定义的肝细胞用于治疗的用途。在一个实施方案中，治疗包括组织再生。本文提及的“组织再生”是指通过重建丢失或受损组织来恢复患病和受损器官和组织功能的治疗。

因此，本发明的肝细胞也可用于为需要这种治疗的受试者恢复一定程度的肝功能。因此，在一个实施方案中，该方法还包括将肝细胞移植到患者中。在本发明的这个方面，用于产生肝细胞的细胞可以是自体的(即，被移除、修饰的成熟细胞返回给同一个体)或来自供体(即，同种异体，包括干细胞系)。

根据另一方面，提供了一种将细胞移植到肝脏的方法，所述方法包括移植通过本文所述的方法产生的肝细胞的步骤。

在一个实施方案中，肝细胞被包封，例如被藻酸盐包封。例如，可以使用市售的藻酸盐珠和本领域已知的技术包封肝细胞。该实施方案具有避免植入肝脏或遭受免疫排斥的优点，因此肝细胞不需要在供体和患者之间进行HLA匹配。通过施用包封的肝细胞的治疗可用于患有急性(例如，来自对乙酰氨基酚过量)或慢性肝功能衰竭(例如，来自肝硬化)的患者中。

在另一方面，还可以提供治疗患有肝功能障碍或处于肝功能障碍风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文提供的肝细胞或含肝细胞的细胞群。

根据另一方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括使用通过本文所述的方法产生的肝细胞的步骤。所述疾病可以是包括急性或慢性肝功能障碍的疾病。适合用本文所述的肝细胞治疗的疾病包括与急性或慢性肝功能障碍有关的疾病，例如自身免疫性肝脏疾病(例如自身免疫性慢性肝炎或原发性胆汁性肝硬化)、肝硬化、急性药物诱导的肝损伤(例如，对乙酰氨基酚过量)、暴发性肝功能衰竭、肝胆癌、遗传性肝功能不全(如威尔逊病、吉尔伯特综合征或α1-抗胰蛋白酶缺乏症)、病毒性肝炎和任何其他导致肝功能受损的病症。

肝细胞可以在任何能够充分进入循环的部位施用，通常在腹腔内施用。对于某些代谢和解毒功能，肝细胞进入胆道是有利的。因此，肝细胞可以在肝脏附近施用(例如，在治疗慢性肝脏疾病时)或在脾脏附近施用(例如，在治疗暴发性肝功能衰竭时)。在一种方法中，通过肝动脉或通过门静脉将肝细胞施用到肝循环中。如上文所述，肝细胞可以被包封，例如被藻酸盐包封。

根据本发明的另一方面，提供了一种生物人工肝脏，其包含本文定义的肝细胞。生物人工肝脏的发展已在本领域广泛描述，例如参见Selden等人，(2017)ScientificReports 7:14518和例如，美国专利号US5837234、US6582955、US7824912和US9402944。生物人工肝脏可以用于暂时替代肝脏的功能，允许患者的肝脏进行修复和再生。其还可用于模拟肝脏特异性功能、分析基因改变对组织功能的作用、并提供高度分化的可用作筛选药物或治疗模型的组织。生物人工肝脏依赖于使用肝细胞进行解毒和肝脏合成因子的分泌。生物人工肝脏可以包含肝细胞，其悬浮在板透析器中、微囊化于合适的基质中或附着于包被有细胞外基质的微载体珠上。或者，可以将肝细胞置于填充床、多板平板床、微通道筛网或围绕中空纤维毛细血管的固体支持物上。生物人工肝脏可以是装置的一部分，所述装置具有入口和出口，受试者血液通过该入口和出口，任选地具有用于向细胞提供营养物的附加端口。

分化试剂盒

根据另一方面，提供了一种用于将细胞分化为肝细胞的试剂盒，其包含：

(i)源细胞和激活或增加一种或多种(例如，至少三种或更多种)转录因子的表达或量的试剂；和/或

(ii)一个或多个表达盒，其编码一种或多种(例如，至少三种或更多种)转录因子；

其中所述一种或多种(例如，至少三种或更多种)转录因子选自：AR、ARID3C、ATF5、CEBPA、CREB3L3、CUX2、EPAS1、FOXA1、FOXA2、FOXA3、GATA4、HHEX、HLF、HNF1A、HNF4A、HNF4G、KLF15、KLF9、MLXIPL、NCOA2、NR0B2、NR1H4、NR1I2、NR1I3、NR5A2、ONECUT1、ONECUT2、PPARA、PROX1、RORA、RORC、RXRA、SALL1、SMAD1、SREBF1、STAT3、TSHZ2、XBP1、ZBTB16及其变体。

根据另一方面，提供了一种用于将细胞分化为肝细胞的试剂盒，其包含：

(i)源细胞和激活或增加至少三种或更多种转录因子的表达或量的试剂；或

(ii)一个或多个表达盒，其编码至少三种或更多种转录因子，

其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。

在一个实施方案中，表达盒包含诱导型表达构建体，所述构建体包含编码一种或多种转录因子的序列。

如本文所述，本文所述转录因子的组合在本发明中特别有用。如果需要转录因子的组合，这些可以在相同或不同的表达盒上编码。因此，在一个实施方案中，试剂盒包含编码两种或更多种转录因子，例如三种、四种、五种、六种、七种或八种转录因子的表达盒(优选诱导型表达盒)。优选地，所述试剂盒包含编码三种或更多种，更优选四种或更多种转录因子的表达盒。

根据另一方面，提供了本文定义的试剂盒用于将细胞分化成肝细胞的用途。

所述试剂盒可以包含用于执行该方法的一种或多种物品和/或试剂。例如，用于本文所述方法的一种或多种转录因子基因、其衍生物、变体或片段可以以分离的形式提供，并且可以是试剂盒的一部分，例如，在合适的容器中，例如在小瓶中，其中内容物被从外部环境中保护。

在一个实施方案中，所述试剂盒另外包含至少一种源细胞，例如多能干细胞(例如诱导型多能干细胞)或非多能、非肝细胞。

在一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于培养细胞的培养基和用于根据本文定义的方法制备增强的潜能细胞或重新编程的多能细胞的说明书。

应当理解，本文描述的所有实施方案都可以应用于本发明的所有方面。

本发明的其他特征和优点将从本文提供的描述中显而易见。然而，应该理解的是，说明和具体实施例虽然指示了本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式给出，因为各种变化和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。现在将使用以下非限制性实施例描述本发明：

实施例

概要

进行了一种筛选方法来鉴定参与将诱导型多能干细胞(iPSC)重新编程为肝细胞的转录因子(TF)。

通过转导慢病毒载体(LV)池将表1中列出的TF引入iPSC，每个慢病毒载体(LV)携带单个TF，以将多个独特的TF编码序列以随机方式稳定整合到基因组中并使其过表达(图1)。调整感染复数(MOI)以在大多数起始iPSC群中产生每个细胞平均整合1-6个不同的TF。在相同条件下平行培养转导的iPSC和未转导的对照。起始iPSC分别携带针对白蛋白和CYP3A4的红色和绿色荧光蛋白报告基因RFP和GFP，白蛋白和CYP3A4在各自的内源基因位点被敲除。白蛋白(ALB)是肝脏分泌的主要血浆蛋白。它在胎儿和成体肝细胞以及肝胆双潜能祖细胞中表达。CYP3A4是氧化酶CYP450家族的成员，参与异型生物质***，其表达仅限于成熟的成体肝细胞(Aizarani等人，2019；MacParland等人，2018；Segal等人，2019)。因此，可以单独使用ALB:RFP追踪不同发育阶段和类型的LV转导后的肝细胞。相反，ALB:RFP和CYP3A4:GFP的共表达标志着潜在的成熟肝细胞。每天使用荧光显微镜对LV转导后的细胞进行成像，以监测两种荧光报告基因的表达。在第11天，分选RFP+/GFP+细胞并进行单细胞RNA测序。分析单细胞转录组以鉴定在每个细胞中过表达的外源重新编程TF。还将单细胞转录组与原代肝细胞的转录组进行比较，以确定在单细胞水平上转录组的相似程度。这种一般策略描述于图1。

结果

ALB+/CYP3A4+细胞可在39或34个编程TF池过表达后的11天内生成

转导携带所有39个TF(表1)或选择用于初步筛选的34个TF(表2)的慢病毒载体池后，在第7天在细胞亚群中表达ALB:RFP(图2和3，小图a-c)。相比之下，仅在第10天在较小部分的ALB:RFP+细胞中检测到CYP3A4:GFP表达(图2和3，小图d-f，箭头)，与CYP3A4的体内表达谱一致。重要的是，在相同条件下培养的未转导细胞中均未检测到RFP和GFP表达，表明单独的培养基不足以诱导肝标志物(图2和3，小图g-i)。这些结果表明，iPSC的肝重新编程需要39或34个候选中TF的组合。

表2.用于生成肝细胞的转录因子，包括登录号(2020年3月11日访问)

第11天ALB+/CYP3A4+细胞的转录与原代肝细胞相似

在LV转导34个TF(表2)的池后第11天，将培养物分离并进行流式细胞术(图4A)。ALB:RFP+和ALB:RFP+/CYP3A4:GFP+细胞分别占群的5.7％和0.08％(图4A)。对ALB:RFP+/CYP3A4:GFP+细胞进行分选并进行单细胞RNA测序。为了评估分选细胞与人肝脏中肝细胞的关系，将第11天的单细胞RNA-seq数据集与来自MacParland等人，2018的已发表的人肝脏细胞单细胞RNA-seq数据集进行比较。除肝细胞外，人的肝脏还包含非肝细胞类型，如胆管细胞、Kuppfer细胞、星状细胞、内皮细胞和免疫细胞，这些都包括在MacParland等人，2018年的数据集中。我们使用均匀流形逼近和投影(UMAP)根据在分选的第11天细胞表达的所有基因和MacParland数据集的差异基因表达对细胞进行分组(图4B)。我们发现第11天RFP+/GFP+细胞的亚组与从人肝脏分离的肝细胞聚类在一起，表明第11天重新编程的细胞获得了与其体内对应部分相似的转录组。这一结果巩固了34个TF的肝重新编程能力。尽管表达白蛋白和CYP3A4报告基因，但第11天细胞的一小部分没有与肝细胞聚类，这表明它们在全局基因表达方面没有完全编程。

重新编程群中成体和胎儿肝细胞样细胞的鉴定

类似的分析如图4所示，其使用更大的参照细胞数据集再次运行，以确定在肝细胞重新编程期间出现的群的细胞类型身份。我们首先构建了一个参照单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集小组，包括来自Bit Bio以及来自人成体肝脏(MacParland等人，2018)和胎儿肝脏(Popescu等人，2019)的公共可获得数据的核心iPSC系(图5A)。

然后，在用34个TF(来自表2)或17个TF(表3中的那些以及PROX1)的慢病毒(LV)池转导iPSC后，我们在重新编程的不同时间点取样一些重新编程的群。我们根据ALB-RFP和CYP3A4-GFP报告基因的表达对重新编程的细胞进行分选，包括双阳性、单阳性和双阴性群(图5C)。使用参照文库，我们训练了一个分类器，以根据它们的转录组(全基因组基因表达)对不同的细胞类型进行聚类。然后我们使用UMAP，一种非线性降维技术(Becht等人，2019)，对不同的细胞类型进行可视化。UMAP图显示了参照细胞内四种不同细胞类型之间的明显区别(图6A):(1)iPSC、(2)成体肝细胞、(3)胎儿肝细胞、(4)和非肝细胞细胞类型。非肝细胞簇包括在肝脏中发现的其他细胞类型，例如血细胞、免疫细胞、内皮细胞、胆管细胞、Kupffer细胞和星状细胞。为了测试分类器是否可以正确识别新数据集中的细胞类型，我们使用了一个对照scRNA-seq数据集，该数据集是我们使用从商业来源获得的冷冻保存的成体肝细胞生成的(图5B)。这些与参照成体肝细胞聚类在一起(图6B)，确认分类器可以正确鉴定细胞类型。然后，我们将分类器用于重新编程的群。将重新编程的细胞投射到参照细胞上，显示出预期的异质性，在细胞类型图中具有多样化的分布(图6C)。我们观察到与参照成体肝细胞聚类的重新编程细胞亚群(图6C和D)。被鉴定为成体肝细胞的重新编程细胞的百分比随着重新编程持续时间的增加而增加，并且与ALB和CYP3A4报告基因的表达呈正相关(图6E)。在从34个TF筛选获得的细胞中，第11天(D11)ALB+/CYP3A+细胞与成体肝细胞聚类的细胞百分比最高。该百分比在从17个TF筛选获得的第10天(D11)的ALB+/CYP3A4+群中进一步增加，这与我们的生物信息学分析预测的该组TF的重新编程能力增加一致。相比之下，第2天(D2)的细胞和来自第7天(D7)和第11天(D11)的细胞的报告阴性群对成体或胎儿肝细胞群的贡献最低，并且这些细胞中的大多数与iPSC匹配。

一个编程的TF亚组富集在第11天的RFP+/GFP+细胞中

从测序读数中选择性地鉴定出在每个细胞中表达的转导的外源TF(eTF)序列。55％的第11天的RFP+/GFP+细胞表达等于或少于每个细胞6个独特的TF(图7)。绘制了单个细胞中每个TF的表达水平。该分析表明，16个TF的组(表3)富集在第11天的RFP+/GFP+细胞级分中，这些细胞与体内肝细胞高度相似。

表3.用于生成肝细胞的转录因子，包括登录号(2020年3月11日访问)

通过过表达14个TF的池生成表达成熟肝细胞标志物的肝细胞

基于第11天的RFP+/GFP+细胞中的高表达频率，从表3中列出的16个TF中选择了14个TF。这14个TF(表4)作为池被转导至iPSC。在LV转导后第13天，我们使用针对CYP3A4的抗体进行免疫荧光染色。来自CYP3A4：GFP报告基因的GFP信号与内源性CYP3A4蛋白共定位，证实了报告基因的功能(图8A)。我们还对细胞进行了其他成熟肝细胞标志物的染色，包括CYP2C9(氧化酶的CYP450家族的另一成员)和UGT1A1(一种参与药物、类固醇激素和胆红素***的UDP-葡萄糖醛酸基转移酶)。我们发现一个细胞亚群除了CYP3A4:GFP和ALB:RFP之外，还共同表达CYP2C9和UGT1A1(图8B)，表明这14个TF可以生成肝细胞，这些肝细胞合成参与药物代谢和***的关键肝细胞酶。

表4.用于生成肝细胞的转录因子，包括登录号(2020年3月11日访问)

重新编程细胞与参照原代肝细胞之间肝细胞特异性基因表达的比较

我们使用PanglaoDB数据库(https://panglaodb.se/)和已发表的文献(Segal等人，2019)选择一组基因，其表达对成体和/或胎儿肝细胞和多能干细胞是独特的，并且在参照细胞中稳健表达(总结在图5)。该组由与成体肝细胞(28个基因)、胎儿肝细胞(8个基因)和在成体和胎儿肝细胞中都表达的基因(41个基因)和iPSC(6个基因)特异性相关的标志物基因组成。我们绘制了参照细胞和重新编程细胞的单个细胞中每个基因的表达水平(图9A-D)，并根据它们与不同细胞类型簇的关联对其进行分组，如图6C和D。值得注意的是，参照肝细胞和冷冻保存的对照肝细胞在细胞类型特异性基因组中的许多基因表达方面都表现出显著的异质性。这可能反映了人肝脏中由于不同肝脏区域中存在具有不同功能的不同肝细胞亚型导致的肝细胞的异质性(Kietzmann，2017)。或者，观察到的异质性可能是由于转录本检测中的变异性造成的，这被称为退出(drop-out)(Haque等人，2017年)。我们探寻重新编程细胞在多大程度上概括了参照细胞类型的基因表达谱。一般来说，我们观察到在参照细胞和重新编程细胞中鉴定的匹配细胞类型簇之间高水平一致(图9A-D)。在参照成体肝细胞或用作内部对照的冷冻保存的肝细胞中稳健表达的基因在重新编程细胞的成体肝细胞簇中以相似的水平表达。

肝脏中的肝细胞可以执行多种功能，包括药物和毒素的代谢、调节葡萄糖和脂质的合成、分解、储存和释放、合成和储存氨基酸和维生素。我们比较了参照细胞和重新编程细胞中特定肝细胞功能的基因表达(图10)。来自成体肝细胞簇的重新编程细胞在表达水平和异质性方面表现出与参照和对照肝细胞相似的基因表达谱。

为了以无偏见和定量的方式评估来自重新编程群的成体肝细胞样细胞与参照肝细胞的相似性，我们使用Pearson相关分析在基于全基因组基因表达的层次聚类后对不同类别的细胞进行评分。这些结果被绘制在热图上，以显示不同簇之间彼此的相关程度(图11)。支持分类结果，在参照和对照冷冻保存的肝细胞之间观察到近乎完美的相关性。基于相关性矩阵，被归类为成体肝细胞的重新编程细胞与两个成体细胞群聚类在一起，表明其转录组与成体肝细胞密切相关。

总而言之，scRNA-seq分析表明，重新编程的培养物包含在单细胞全基因组基因表达谱方面与原代成体肝细胞身份相匹配的细胞，该细胞表现出几个关键基因表达标识，包括与肝细胞特异性代谢途径相关的那些标识。在少数基因中观察到的不相似的表达可能反映了从肝脏分离和体外生成的不同肝细胞亚型的取样。或者，它可能表明缺乏最佳旁分泌信号传导或可进一步开发的体外培养条件。通过在为培养原代肝细胞而开发的优化条件下培养重新编程细胞，可以改善基因表达谱(Swift等人，2010；Xiang等人，2019)。

鉴定肝细胞重新编程所需的TF组合

与成体肝细胞对应的重新编程细胞每个细胞表达不同数量的独特外源重新编程TF(eTF)，范围从1到16(图12A)。单个TF在重新编程的群中表现出差异表达(图12B和C)。基于这一点和来自细胞重新编程文献的数据，我们测试了4种转录因子是否足以将细胞重新编程为肝细胞样细胞。为了鉴定可能导致重新编程的特定的4种TF组合，我们探寻了在与每个参照细胞类型对应的细胞中检测到34或17个TF组中能够产生的所有可能的4种TF组合中的哪些独特的4种TF组合。我们根据在每个细胞类型簇中表达TF组合的细胞百分比对每个TF组合进行排序，并选择在给定簇中的20％或更多的细胞中表达的组合。在34个TF和17个TF筛选中与成体肝细胞聚类的重新编程细胞中观察到的组合具有可比性，总结在表5(图12D)。以类似的方式对包含3个TF的TF组合进行分析，这些组合总结在表6(图12E)。我们推测表5和6中显示的特定TF组合单独、或与其他TF(例如，如本文所示)一起，可以将iPSC重新编程为肝细胞。

通过使用组合CREB3L3-FOXA1-NR1I2-HHEX证实重新编程来验证TF组合的鉴定方法

为了测试我们上述方法是否可以正确鉴定可以将细胞重新编程为肝细胞样细胞的TF组合，我们测试了已鉴定的前4种TF组合之一：CREB3L3-FOXA1-NR1I2-HHEX，其中包括最富集的4种在来自重新编程细胞的成体肝细胞簇中发现的TF。

第8天，在用携带这4种TF的慢病毒颗粒池(4TF-LV)转导后，出现了表达ALB-RFP报告基因的细胞(图13A)，表明该细胞获得了肝细胞身份。到第14天，ALB+菌落长大，其中一个亚组也表达CYP3A4-GFP报告基因，表明这些细胞进展为成体肝细胞样状态(图13A)。重要的是，未经处理的iPSC不诱导任何肝的报告基因。在4TF-LV培养物中也可检测到一些报告基因阴性细胞，但这可能是因为并非所有4种TF都使用独立携带单个因子的慢病毒颗粒池引入到整个培养物中的每个单细胞中。我们还观察到ALB+细胞簇中CYP3A4报告基因的一些异质表达，这可能是由于以下一种或多种原因而发生的：(1)集落中如在成体肝脏中一样存在CYP3A4-肝细胞样细胞，(2)由于缺乏基因组整合，一些ALB+细胞可能缺少一种或多种CYP3A4+表达所需的eTF，或(3)在培养期间沉默慢病毒转基因。

我们使用特异性抗体测试了与肝细胞功能相关的特定蛋白质的表达，包括CYP3A4、CYP1A2、CYP2D6和CYP2C9(I期药物代谢)、UGT1A1(II期代谢)、ASGR1(血清稳态)和PCK2(葡萄糖稳态)(图13B)。所有蛋白质均在4TF-LV培养物中表达，并显示出与ALB和CYP3A4表达的高度重叠，表明CREB3L3-FOXA1-NR1I2-HHEX组合可以驱动细胞进入肝细胞样状态，同时表达多种蛋白质，其参与在成体肝脏的肝细胞中运作的功能上非依赖的途径。

为了评估通过重新编程获得的肝细胞样细胞是否可以发挥成体肝细胞的功能，我们对细胞进行了CYP3A4依赖性药物代谢测定法，称为CYP3A4-GLO测定法(Promega)。为此，用发光底物处理细胞，该底物通过CYP3A4转化为荧光素产物，并测量了作为读数的发光(图13C)。Huh7和HepG2肝癌细胞被用作阳性对照，因为建立了这些细胞的用于研究药物代谢、并通常用于测试细胞色素P450的活性的体外模型(Bulutoglu等人，2020)。用来自3个独立iPSC系(4TF-LV)的CREB3L3-FOXA1-NR1I2-HHEX重新编程的细胞表现出比对照Huh7和HepG2细胞高出多个数量级的功能水平。这些结果表明，重新编程的细胞已经建立了一种功能性药物代谢途径，该途径参与底物/药物的摄取、通过细胞色素P450活性进行的氧化以及将副产物输出到细胞外。

FOXA1、HHEX和NR1I2的互补活性用于使用CREB3L3-FOXA1-NR1I2-HHEX进行重新编程

我们旨在确定我们的TF组合鉴定的方法是否可以鉴定特定的TF组合，以用于成功的重新编程。为此，我们测试了当从组合CREB3L3-FOXA1-NR1I2-HHEX中除去单个TF时，是否仍然发生重新编程(图14)。我们发现除去FOXA1在重新编程的第8天消除了iPSC向ALB+肝细胞的进展，在重新编程的第14天ALB+/CYP3A4+细胞，证明FOXA1用于细胞获得早期肝脏身份时的重新编程的初始阶段，这反映在ALB表达。排除HHEX后，第8天未检测到ALB+细胞，然而，到第14天出现ALB+和ALB+/CYP3A4+集落，尽管与4TF组合相比数量减少。有趣的是，排除NR1I2并不影响iPSC向ALB+细胞的进展，然而，在第14天消除了ALB+/CYP3A4+细胞的形成。然而，撤回CREB3L3并没有导致基于ALB和CYP3A4报告基因表达的重新编程发生任何明显的变化。总体而言，这些结果表明，FOXA1、HHEX和NR1I2在重新编程期间各自执行独特的功能，并且各自用于在CREB3L3-FOXA1-NR1I2-HHEX组合进行重新编程的情况下。此外，FOXA1-NR1I2-HHEX足以使重新编程进展为ALB+/CYP3A4+状态，而不需要CREB3L3。然而，应该注意的是，由于我们的读数仅限于ALB和CYP3A4报告基因的表达，我们目前不能排除CREB3L3排除对重新编程细胞其他特征的影响，例如功能途径活性的影响，因为CREB3L3被证明参与成体肝脏中的几个代谢过程(Khan&Margulies，2019)。

在重新编程为肝细胞样细胞中FOXA3可替代FOXA1

FOXA1是FOX转录因子的FOXA亚家族(也称为HNF3亚家族)的成员。FOXA亚家族包括结构相关的蛋白质FOXA1、FOXA2和FOXA3(Golson和Kaestner，2016)。所有3种蛋白质都在肝脏发育过程中表达，并且它们的表达在成年期保持在肝脏中。对小鼠的几项研究表明，这3种FOXA因子可以相互补偿，包括在胚胎发育和成年期的肝脏中((Iwafuchi-Doi等人，2016；Kaestner等人，1999；Lee等人，2005；Shen等人，2001))。FOXA3在与成体肝细胞聚类的重新编程细胞中高度富集(图12B和C)，并且在高频TF组合中很容易检测到(表5和6)。我们探寻FOXA3与CREB3L3、NR1I2和HHEX组合时是否可以将iPSC重新编程为ALB+/CYP3A4+肝细胞样细胞。为此，我们通过过表达CREB3L3-FOXA1-NR1I2-HHEX或CREB3L3-FOXA3-NR1I2-HHEX并行重新编程iPSC(图15)。两种培养产生相似数量的ALB+/CYP3A4+细胞，证明FOXA3在重新编程为肝细胞样细胞期间可与FOXA1互换，这与在与成体肝细胞聚类的重新编程细胞中检测到的TF组合中FOXA3的观察一致(表5和6)。

在重新编程为肝细胞样细胞中NR1I3可替代NR1I2

NR1I2和NR1I3是功能和结构上相关的核受体家族TF(Banerjee等人，2015)。我们探寻当NR1I3与CREB3L3、FOXA1和HHEX组合时是否可以实现重新编程(图16)。在用CREB3L3-FOXA1-NR1I2-HHEX或CREB3L3-FOXA1-NR1I3-HHEX并行进行重新编程的培养物中，在第13天可检测到相似水平的ALB+/CYP3A4+细胞，表明在肝细胞重新编程的情况下NR1I2和NR1I3之间可能存在潜在的功能相似性。

方法

生成编码重新编程TF的慢病毒载体和转导

将单个TF编码序列克隆到慢病毒载体(LV)中。通过标准方法生成并滴定慢病毒载体。

产生携带白蛋白和CYP3A4报告基因的iPSC系

使用标准基因编辑方法生成报告细胞系。简而言之，构建了两种基因敲入同源定向修复(HDR)供体质粒，分别用于白蛋白和CYP3A4，其在天然基因P2A肽的终止密码子之前***，然后是红色或绿色荧光蛋白编码序列(分别用于白蛋白或CYP3A4)。使用HDR将这些供体质粒引入iPSC系中相应的基因基因座位点。分离克隆的iPSC系并通过基因分型PCR显示包含所需的敲入基因。

细胞培养和慢病毒载体的转导

诱导型多能干细胞(iPSC)系在包被有玻连蛋白(Life Technologies)的标准组织培养板上的Essential 8(E8)培养基(ThermoFisher Scientific)中常规培养。每3-6天使用0.5mM EDTA/Tris(Life Technologies)将团块中的细胞传代一次。转导前一天(第-1天)，用PBS洗涤iPSC一次，并通过用TrypLE(Life Technologies)处理解离成单细胞。对细胞进行计数，并在补充有10uM ROCK抑制剂Y-27632的E8(Supp)中以12500个细胞/cm2的密度铺板。第二天(第0天)，由39个TF的全部或其亚组组成的慢病毒载体(LV)池重新悬浮在Ang及其同事(Ang等人，2018)使用的培养基中，所述培养基经过修改，并补充了10ug/ml硫酸鱼精蛋白(PS)。用包含LV的培养基交换E8培养基。第二天(D1)，用新鲜培养基更换培养基，每隔一天更新一次。

荧光显微镜和免疫荧光染色

为了检测白蛋白-2A-RFP和CYP3A4-2A-GFP，使用Revolve4(Echo Labs)对细胞进行成像。对于免疫荧光染色，使用以下抗体：CYP2C9(Abcam，ab4236)、CYP3A4(Santa CruzBiotechnology，sc53850)、UGT1A1(R&D Systems)。

细胞分选和单细胞RNA测序(SC RNA-seq)

对于FACS，在LV转导后第11天将培养物分离成单个细胞并重新悬浮在培养基中。根据10x Genomics推荐的标准方案处理分选的细胞群。

参考文献

Aizarani et al.(2019).A human liver cell atlas reveals heterogeneityand epithelial progenitors.Nature 572(7768)：199-204

Ang et al.(2018).A Roadmap for Human Liver Differentiation fromPluripotent Stem Cells.Cell Reports 22(8)：2190-2205

Banerjee et al.(2015).Targeting xenobiotic receptors PXR and CAR inhuman diseases.In Drug Discovery Today(Vol.20，Issue 5，pp.618-628).ElsevierLtd.

Becht et al.(2019).Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP.Nature Biotechnology，37(1)，38-47.

Bulutoglu et al.(2020).A comparison of hepato-cellular in vitroplatforms to study CYP3A4 induction.PLOS ONE，15(2)，e0229106.

Cerbini et al.(2015)PLOS One，10(1)：e0116032

Golson and Kaestner，(2016)Fox transcription factors：From developmentto disease.Development(Cambridge)，143(24)，4558-4570

Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(12)：5547-51#

Haque et al.(2017).A practical guide to single-cell RNA-sequencingfor biomedical research and clinical applications.In Genome Medicine(Vol.9，Issue 1).BioMed Central Ltd.

Iwafuchi-Doi et al.(2016).The Pioneer Transcription Factor FoxAMaintains an Accessible Nucleosome Configuration at Enhancers for Tissue-Specific Gene Activation.Molecular Cell，62(1)，79-91.

lansante et al.(2018).Human hepatocyte transplantation for liverdisease：current status and future perspectives.Pediatric Research 2018 83(1-2)：232-240

Kaestner et al.(1999).Inactivation of the winged helix transcriptionfactor HNF3αaffects glucose homeostasis and islet glucagon gene expression invivo.Genes and Development，13(4)，495-504.

Khan&Margulies(2019).The role of mammalian Creb3-like transcriptionfactors in response to nutrients.In Frontiers in Genetics(Vol.10，Issue JUN，p.591).Frontiers Media S.A.

Kietzmann，T.(2017).Metabolic zonation of the liver：The oxygengradient revisited.In Redox Biology(Vol.11，pp.622-630).Elsevier B.V.

Lee et al.(2005).Foxa2 is required for the differentiation ofpancreatic α-cells.Developmental Biology，278(2)，484-495.MacParland et al.(2018).Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinctintrahepatic macrophage populations.Nature Communications 9(1)：4383

Nishikawa et al.(2015).Resetting the transcription factor networkreverses terminal chronic hepatic failure.Journal of Clinical Investigation125(4)：1533-44

Papapetrou et al.(2011)Nature Biotechnology，29(1)：73-8

Popescu et al.(2019).Decoding human fetal liverhaematopoiesis.Nature，574(7778)，365-371.Qian et al.(2012).In vivoreprogramming of murine cardiac fibroblasts into inducedcardiomyocytes.Nature.485(7400)：593-8

Segal et al.(2019).Single cell analysis of human fetal liver capturesthe transcriptional profile of hepatobiliary hybrid progenitors.NatureCommunications 10(1)：3350

Selden et al.(2017)Scientific Reports 7：14518

Shen et al.(2001).Foxa3(Hepatocyte Nuclear Factor 3Y)is Required forthe Regulation of Hepatic GLUT2 Expression and the Maintenance of GlucoseHomeostasis during a Prolonged Fast.Journal of Biological Chemistry，276(46)，42812-42817.

Swift et al.(2010).Sandwich-cultured hepatocytes：An in vitro model toevaluate hepatobiliary transporter-based drug interactions andhepatotoxicity.In Drug Metabolism Reviews(Vol.42，Issue 3，pp.446-471).InformaHealthcare.

Wang et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8180-8184

Williams DP.(2018).Application of hepatocyte-like cells to enhancehepatic safety risk assessment in drug discovery.Philosoρhical TransactionsThe Royal Society B Biological Sciences 373(1750)

Xiang et al.(2019).Long-term functional maintenance of primary humanhepatocytes in vitro.Science，364(6438)，399-402.

Claims (32)

1.一种产生肝细胞的方法，所述方法包括增加非肝细胞群中的至少三种或更多种转录因子的表达，其中三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体，和培养该细胞群以获得肝细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述三种或更多种转录因子选自：(1)FOXA1、FOXA2或FOXA3，(2)NR1I2或NR1I3，和(3)以下中的一种或多种:HHEX、CREB3L3、GATA4、KLF9、ATF5、MLXIPL、ARID3C、CUX2、HNF4A、HNF4G、NR0B2、ONECUT1、ONECUT2、RXRA、SALL1、SREBF1及其变体。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述三种或更多种转录因子选自：(1)FOXA1、FOXA2或FOXA3；(2)NR1I2或NR1I3；和(3)以下中的一种或多种:HHEX、CREB3L3、GATA4、KLF9、ATF5、MLXIPL、HNF4A、HNF4G、ONECUT1、RXRA、SREBF1；及其变体。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述三种或更多种转录因子选自：(1)FOXA1、FOXA2或FOXA3；(2)NR1I2或NR1I3；和(3)以下中的一种或多种:HHEX、CREB3L3、GATA4、KLF9、ATF5、MLXIPL、HNF4A、RXRA、SREBF1；及其变体。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述三种转录因子包括FOXA1、CREB3L3、NR1I2或其变体。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述三种转录因子包括FOXA1、HHEX、NR1I2或其变体。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述方法包括增加FOXA1、CREB3L3、NR1I2、HHEX或其变体的表达。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述方法包括增加至少四种或更多种转录因子，特别是五种、六种或七种或更多种转录因子的表达。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述方法包括增加三种至七种转录因子的表达。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述非肝细胞群包括源细胞。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述非肝细胞群包括多能干细胞，特别是诱导型多能干细胞。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述方法包括通过多能干细胞或诱导型多能干细胞的细胞重新编程来产生肝细胞。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述肝细胞为人肝细胞。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，所述方法还包括监测所述细胞群的至少一种肝细胞的特征。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述特征选自以下一种或多种：

(i)表达一种或多种肝细胞标志物，例如葡萄糖-6-磷酸酶、白蛋白、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、延胡索乙酰乙酸酶(FAH)、细胞角蛋白8(CK8)、细胞角蛋白18(CK18)、去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)、乙醇脱氢酶1、精氨酸酶I型、细胞色素p450 3A4(CYP3A4)、细胞色素p4502C9(CYP2C9)、UDP葡萄糖醛酸基转移酶1家族、多肽A1(UGT1A1)、肝脏特异性有机阴离子转运蛋白(LST-1)或组合；

(ii)葡萄糖-6-磷酸酶、CYP3A4、CYP2C9、白蛋白合成和分泌、胆汁产生或分泌、尿素产生或异型生物质解毒的活性；或者

(iii)肝细胞形态特征。

16.如权利要求14或15所述的方法，其中，所述特征包括选自白蛋白和CYP3A4的肝细胞标志物。

17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，通过使所述细胞群与所述转录因子或激活或增加所述转录因子的表达或量的一种或多种试剂接触来增加所述转录因子的表达。

18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，所述转录因子的表达是受控的转录。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中使用包括以下的方法将编码一种或多种转录因子的序列引入细胞群：

-将转录调节蛋白的编码序列靶向***细胞的第一遗传安全港位点；和

-将诱导盒靶向***细胞的第二遗传安全港位点，其中所述诱导盒包含与诱导型启动子可操作连接的所述转录因子序列，并且所述启动子受转录调节蛋白调节。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其包括在合适的条件下培养至少4天。

21.一种从源细胞生产肝细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将编码转录调节蛋白的基因靶向***源细胞的第一遗传安全港位点；和

b)靶向***至少三种或更多种转录因子至源细胞的第二遗传安全港位点，其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16及其变体，所述基因可操作地连接诱导型启动子，其中所述诱导型启动子受转录调节蛋白调节；和；

c)培养包含***物的源细胞以获得肝细胞。

22.至少三种或更多种转录因子生成肝细胞的用途，其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。

23.一种可通过权利要求1至21中定义的任一方法获得的细胞。

24.一种细胞，其包含一个或多个外源表达盒，所述外源表达盒编码至少三种或更多种转录因子，其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。

25.如权利要求23或24所述的细胞，其中，所述细胞是工程化的肝细胞。

26.如权利要求23至25中任一项所述的细胞，其中，所述三种或更多种转录因子整合到所述细胞的基因组中。

27.如权利要求26所述的细胞，其中，所述三种或更多种转录因子整合到所述细胞的靶位点中。

28.如权利要求23至27中任一项所定义的细胞，用于治疗。

29.一种用于将细胞分化为肝细胞的试剂盒，其包含：

(i)源细胞和激活或增加至少三种或更多种转录因子的表达或量的试剂；和/或

(ii)一个或多个表达盒，其编码至少三种或更多种转录因子，

其中所述三种或更多种转录因子选自：FOXA1或FOXA3；NR1I2或NR1I3；HHEX；CREB3L3；GATA4；KLF9；ATF5；MLXIPL；FOXA2；AR；ARID3C；CEBPA；CUX2；EPAS1；HLF；HNF1A；HNF4A；HNF4G；KLF15；NCOA2；NR0B2；NR1H4；NR5A2；ONECUT1；ONECUT2；PPARA；PROX1；RORA；RORC；RXRA；SALL1；SMAD1；SREBF1；STAT3；TSHZ2；XBP1；ZBTB16；及其变体。

30.如权利要求29所述的试剂盒用于将细胞分化成肝细胞的用途。

31.一种药物筛选方法，所述方法包括使采用权利要求1至21中任一项所定义的方法产生的肝细胞或如权利要求23至28中任一项所定义的肝细胞与药物接触、和观察药物诱导的肝细胞的变化或药物代谢的变化。

32.一种用于治疗患有肝脏疾病或功能障碍、或处于肝脏疾病或功能障碍风险的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的使用如权利要求1至21中任一项所定义的方法产生的肝细胞，或如权利要求23至28中任一项所定义的肝细胞。

Images