JP7256266B2 - ヒトＩＬ－１βに結合する抗体、その調製方法及び用途 - Google Patents

Description

本発明は、抗体分野に属し、より具体的にはヒトＩＬ－１βに結合する抗体、該抗体の調製方法および用途に関する。

インターロイキン１タンパク質は、インターロイキン１α（ＩＬ－１α）及びインターロイキン１β（ＩＬ－１β）を含む。ＩＬ－１βは、多機能性サイトカインであり、数種のリンパ細胞の増殖と分化を仲介し、多くの炎症反応に関与して炎症反応の進行を制御する。体内におけるＩＬ－１β分泌は、ＩＬ－１αなどのＩＬ－１ファミリー及びＩＬ－１Ｒ阻害因子（ＩＬ－１Ｒａ）によって制御される。

マクロファージなど多くの免疫細胞は、ＩＬ－１αを発現し、並びにＩＬ－１βを分泌する。ＩＬ－１β受容体はＩＬ－１Ｉ型受容体（ＩＬ－１ＲＩ）とＩＬ－１ＩＩ型受容体（ＩＬ－１ＲＩＩ）に分かれ、そのうちＩＬ－１ＲＩは、ほぼ全ての有核細胞で発現し、ＩＬ－１βと結合することによりＩＬ－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ－１ＲＡｃＰ）の凝集を誘発して複合体を形成し、シグナル通路を活性化させる。ＩＬ－１ＲＩＩは、細胞膜表面に局在すると同時に可溶性状態で細胞内に存在し、ＩＬ－１βがＩＬ－１ＲＩＩに結合することによりＩＬ－１βの活性が低下する。

ＩＬ－１βの過剰発現がクリオピリン関連周期性症候群、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群、全身型若年性特発性関節炎、高免疫グロブリンＤ症候群（ＨＩＤＳ）・メバロン酸キナーゼ欠損症（ＭＫＤ）、骨粗鬆症、骨関節炎及び他の炎症性関節炎などの免疫疾患を引き起こす主因であることが複数の研究により解明されている。例えば、多くの炎症性疾患及び自己免疫疾患にとって血清中のＩＬ－１βを含有量が症状の進行や重篤度につれて上昇し（非特許文献１）、ＩＬ－１βがＴＨ１７細胞の分化と成熟を亢進させ（非特許文献２）、かつ成熟したＴＨ１７細胞がＩＬ－１７を分泌し、乾癬などの免疫疾患を誘発することのできることが既に解明されている。こうした作用機構があるため、ＩＬ－１シグナル通路を遮断しうるＩＬ－１β阻害剤は、骨粗鬆症、炎症性関節炎及び他の免疫疾患の治療に極めて有用である。

したがって、有効な抗ＩＬ－１β抗体を開発して患者さんの服薬需要に対応することは、当分野の研究者にとって特に関心を持つ技術課題である。

Ｐａｓｃｕａｌ Ｖ，Ａｌｌａｎｔａｚ Ｆ，ｅｔａｌ．，Ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１（ＩＬ－１） ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｏｎｓｅｔ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＩＬ－１ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００５；２０１：１４７９～８６ ｄｅＪｏｎｇ Ｅ，Ｓｕｄｄａｓｏｎ Ｔ，Ｌｏｒｄ ＧＭ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｉｎｉ－ｒｅｖｉｅｗ ｓｅｒｉｅｓ ｏｎ Ｔｈ１７ ｃｅｌｌｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ １７ ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０Ｆｅｂ，１５９ｂ）：１４８～５８

上記の課題を解決するため、本発明者が抗原免疫からハイブリドーマ選別、抗体の発現と精製、生体活性の評価に至るまで鋭意検討を重ねた結果、ヒトＩＬ－１βに結合する一連の抗体を選別して取得した。さらに、本発明者がマウス由来抗体候補およびヒト化抗体候補に対して体内薬理学的研究を行った結果、マウス由来抗体１９Ｅ４、１８Ｈ１１及び９Ｄ５が何れもＩＬ－１βによって誘発されるマウス関節の病変を顕著に低減することができ、一方、ヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１が投与量１０ｍｇ／ｋｇでマウス損傷足の動きを顕著に改善し、かつマウス膝関節の腫れ面積を顕著に低減することのできることを見出した。このことから、本発明に係る斬新な構造を有するヒトＩＬ－１βに結合する抗体（以下、「ヒトＩＬ－１β結合抗体」とも称する）は、関節炎、骨粗鬆症及び他の免疫疾患を治療するための治療薬として有望である。

以上に鑑み、本発明の第１側面ではヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供し、該抗体の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２及びＨ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３で表され、その軽鎖相補性決定領域Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２及びＬ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４、配列番号５および配列番号６で表される。

本発明の一好適な実施形態において、本発明に係るヒトＩＬ－１βに結合する抗体は、マウス由来抗体１８Ｈ１１であり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８で表される。

本発明の一好適な実施形態において、本発明に係るヒトＩＬ－１βに結合する抗体は、ヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１であり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０で表される。

本発明の一好適な実施形態において、本発明に係るヒトＩＬ－１βに結合する抗体は、ヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ２Ｌ２であり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２で表される。

本発明の一好適な実施形態において、本発明に係るヒトＩＬ－１βに結合する抗体は、ヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３であり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１４で表される。

本発明の一好適な実施形態において、本発明に係る抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体及びシングルドメイン抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種である。

本発明の第２側面では、前記ヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド分子を提供する。

本発明の一好適な実施形態において、マウス由来抗体１８Ｈ１１の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１５で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１６で表される。

本発明の一好適な実施形態において、ヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１７で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１８で表される。

本発明の一好適な実施形態において、ヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ２Ｌ２の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１９で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号２０で表される。

本発明の一好適な実施形態において、ヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号２１で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号２２で表される。

本発明の第３側面では、前記ヌクレオチド分子を含んでなる発現ベクターを提供する。

本発明の第４側面では、前記発現ベクターを含んでなるホスト細胞を提供する。

本発明の第５側面では、前記ヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片を製造するための製造方法を提供し、前記製造方法は、発現条件下で上記ホスト細胞を培養することにより、前記ヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片を発現するステップａと、ステップａで発現したヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片を分離、精製するステップｂと、を含む。

本発明の第６側面では、前記ヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片を含む薬物組成物を提供し、前記薬物組成物は、上記何れか１項に記載のヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体と含んでなる。

本発明の第７側面では、前記ヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片、又は前記薬物組成物の用途を提供し、前記用途とは、関節炎、骨粗鬆症又は乾癬など、ＩＬ－１βの過剰発現に起因する免疫疾患を治療するための薬物を製造する用途であり、本発明の一好適な実施形態において、前記用途は、関節炎を治療するための薬物を製造する用途である。

本発明の第８側面では、ヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ２はＣ５３Ａ変異サイトを含み、前記抗体１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ２（ＩＭＧＴコーディング法則）はＩＳＡＹＮＧＤＴであり、そのアミノ酸配列は配列番号３８で表される。

さらに、本発明は、上記抗体とヒトＩＬ－１βとの結合エピトープを提供し、該結合エピトープとしては、配列番号２３の第１２０位トリプトファン及び第１２２位イソロイシンがプライマリサイトに該当し、第１１２位フェニルアラニン、第１２３位セリン及び第１２４位のトレオニンがセカンダリサイトに該当する。

１）本発明に係るヒトＩＬ－１βに結合する抗体は、ヒトＩＬ－１βに特異的に結合することができ、ＥＬＩＳＡ法を利用する測定からマウス由来抗体１８Ｈ１１のＥＣ_５０が陽性対照抗体と同等レベルであり、ヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１のＥＣが陽性対照抗体を上回ることが確認できた。

２）本発明に係るヒトＩＬ－１βに結合する抗体は、競合的に結合することによりＩＬ－１βとその関連受容体の結合を効果的に阻害し、そのうちマウス由来抗体１８Ｈ１１及びヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１のＥＣ_５０が陽性対照抗体と同等レベルである。

３）本発明に係るヒトＩＬ－１βに結合する抗体は、ＩＬ１βによって誘発されるＭＲＣ－５細胞のＩＬ－６分泌を効果的に抑制し、そのうちマウス由来抗体１８Ｈ１１及びヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１は、陽性対照抗体に比べてＩＬ－１βによって誘発される細胞のＩＬ－６分泌に対してより優れた抑制効果を示す。

４）本発明に係るヒトＩＬ－１βに結合する抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ動態学的解析によって示された通り、抗体に対する結合性が陽性対照抗体に匹敵する。

５）本発明に係るヒトＩＬ－１βに結合する抗体は、ＩＬ－１βによって誘発されるマウス関節炎の病変を顕著に改善し、そのうちマウス由来抗体１８Ｈ１１及びヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１は、マウス行動力評価や、関節腫れの状態・膝関節面積、体重状態などに対して陽性対照抗体に匹敵する改善効果を示す。

６）本発明によれば、１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１の重鎖をテンプレートとし、Ｈ－ＣＤＲ２にＣ５３Ａ変異を導入した変性抗体１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａは、その野生型抗体に比べてより優れた熱安定性を示す。

ＩＬ１β－ｈＦｃの精製結果を示す図であり、そのうちＭはタンパク質の分子量マーカーであり、ライン１はカラムで精製する前のサンプルであり、ライン２はカラム素通り画分であり、ライン３～９はカラム溶出画分である。ＩＬ１β－ｈＦｃタンパク質の分子量理論値は４３．７ｋＤａであり、タンパク質ダイマーの分子量は約８７ｋＤａである。 ＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－ＨＩＳの培養上澄み液を精製した結果を示す図であり、そのうちＭはタンパク質の分子量マーカー、ライン１はカラムで精製する前のサンプルであり、ライン２はカラム素通り画分であり、ライン３～４はカラム溶出画分である。 ＩＬ１ｂ－Ｈｉｓの精製結果を示す図である、そのうちＭはタンパク質の分子量マーカーであり、ＦＴはカラム素通り画分であり、ｌｏａｄはカラムで精製する前のサンプルであり、ライン１～７はカラム溶出画分である。ＩＬ１ｂ－Ｈｉｓタンパク質の分子量理論値は１８．２ｋＤａであり、タンパク質はダイマーを形成しない。 ＰｃＡｂの精製結果を示す図であり、そのうちＭはタンパク質の分子量マーカーであり、ライン１は非還元型の抗体であり、ライン２は還元型の抗体であり、ライン３はＢＳＡ対照物である。ＰｃＡｂタンパク質の分子量理論値は１５０ｋＤａであり、抗体の重鎖分子量は約４５ｋＤａであり、軽鎖分子量は約３０ｋＤａである。 ＥＬＩＳＡでマウス由来抗体と抗原ＩＬ１βの結合性を測定するときの結果を示す図である。 抗原ＩＬ１βに対するマウス由来抗体とＩＬ１ＲＩの競合結合性をＥＬＩＳＡ法で測定するときの結果を示す図である。 Ｌ１βによって誘発されるＭＲＣ５細胞のＩＬ－６分泌に対するマウス由来抗体の阻害効果をＥＬＩＳＡ法で測定するときの結果を示す図である。 マウス行動力に対するマウス由来抗体１９Ｅ４、１８Ｈ１１及び９Ｄ５の影響を示す図である。そのうち^＊＊は正常組に比べるときの有意差Ｐ＜０．０１を示し、^＃＃はモデル組に比べるときの有意差Ｐ＜０．０１を示し、^Δは陽性薬組に比べるときの有意差Ｐ＜０．０１を示し、ｎ＝８（正常組ｎ＝７）である。 マウス膝関節の腫れに対するマウス由来抗体１９Ｅ４、１８Ｈ１１及び９Ｄ５の影響を示す図である。そのうち^＊＊は正常組に比べるときの有意差Ｐ＜０．０１を示し、^＃＃はモデル組に比べるときの有意差Ｐ＜０．０１を示し、^Δは陽性薬組に比べるときの有意差Ｐ＜０．０１を示し、^▲は１８Ｈ１１投与組に比べるときの有意差Ｐ＜０．０５を示し、ｎ＝８（正常組ｎ＝７）である。 ヒト化抗体と抗原ＩＬ１βの結合性をＥＬＩＳＡ法で測定するときの結果を示す図である。 抗原ＩＬ１βに対するヒト化抗体とＩＬ１ＲＩの競合結合性をＥＬＩＳＡ法で測定するときの結果を示す図である。 ＩＬ１βによって誘発されるＭＲＣ５細胞のＩＬ－６分泌に対するヒト化抗体の阻害効果をＥＬＩＳＡ法で測定するときの結果を示す図である。 Ｌｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３によって誘発されるマウス膝関節炎モデルの病態行動力に対するヒトＩＬ－１β結合抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１及び１８Ｈ１１の影響を示す図である。 Ｌｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３によって誘発されるマウス膝関節炎モデルの膝関節面積に対するヒトＩＬ－１β結合抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１及び１８Ｈ１１の影響を示す図である。 各変性抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動結果を示す図である。 各変性抗体及び１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１（野生型）とＩＬ１βが結合するときのＥＣ_５０を示す図である。 ＩＬ－１βによって誘発されるＭＲＣ－５細胞のＩＬ－６分泌に対する各抗体の阻害効果を示す図である。 各サンプルとＩＬ－１βの結合性を示す図である。 ＩＬ－１βによって誘発されるＭＲＣ－５細胞のＩＬ－６の分泌に対する各サンプルの阻害効果を示す図である。 抗原ＩＬ１βに対する１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３ＡとＩＬ１ＲＩの競合結合性を測定するときの結果を示す図である。 異なる投与量で抗体を投与するときのマウスＩＬ－６分泌に対する阻害効果を示す図である。 １８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの種間交叉反応性をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図である。 ファミリーメンバーＩＬ－１ａｌｐｈａ、ＩＬ－１Ｒ２及びＩＬ－１ＲＡに対する１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの選択性を示す図である。 ＩＬ－１βへの結合エピトープを確定するため、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３ＡとＩＬ－１β－Ａ１－Ｆ９９－Ｈｉｓ及びＩＬ－１β－Ａ１－Ｗ１２０－Ｈｉｓとの結合性を測定するときの結果を示す図である。 ＩＬ－１βへの結合エピトープを確定するため、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａと第１１１位～第１１５位アミノ酸残基との結合性を測定するときの結果を示す図である。 ＩＬ－１βへの結合エピトープを確定するため、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａと第１１６位～第１２０位アミノ酸残基との結合性を測定するときの結果を示す図である。 ＩＬ－１βへの結合エピトープを確定するため、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａと第１２０位～第１２４位アミノ酸残基との結合性を測定するときの結果を示す図である。

本発明において、「抗体（Ａｂ）」および「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）」とは、構造特徴が同じである約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）で構成される。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合を介して重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンにおいて同型重鎖の間のジスルフィド結合数が異なる。各重鎖および軽鎖は規則的な間隔で鎖内ジスルフィド結合を有し、各重鎖の一端に可変領域（ＶＨ）を有し、可変領域に続いて定常領域を有する。各軽鎖の一端に可変領域（ＶＬ）を有し、他端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域と重鎖の第１定常領域が対向し、かつ軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域が対向して構成される。本発明の抗体としては、マウス由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などが挙げられ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種類の抗体からなる多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体の抗原結合断片などを含む。

本発明において、「モノクローナル抗体」とは、ほぼ均一な群から得られる抗体を指し、すなわち極一部が自然変異を形成する以外、該群に含まれる単一抗体が同じであることを意味する。モノクローナル抗体は、１つの抗原サイトを高い特異性で認識して結合する。そして、通常のポリクローナル抗体製剤（通常、異なる決定基を認識する複数の抗体を含む）と異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一決定基を認識して結合する。こうした特異性に加え、モノクローナル抗体の優勢としてはハイブリドーマを培養することにより得られ、他の免疫グロブリンによって汚染されないことが挙げられる。また、「モノクローナル」とは抗体の特性を指し、すなわちほぼ均一な抗体群から得られ、何ら特別な方法で製造されるものと解釈してはいけない。

本発明において、「マウス由来抗体」とは、ラット由来抗体又はモウス由来抗体を指し、その中でもマウス由来抗体が好ましい。本発明に係るマウス由来抗体は、ヒトＩＬ－１βを抗原としてマウスを免疫し、さらにハイブリドーマ細胞を選別して得られる。本発明のマウス由来抗体としては、１９Ｅ４、１８Ｈ１１及び９Ｄ５が挙げられ、その中でも１８Ｈ１１が好ましい。

本発明において、「ヒト化抗体」とは、ヒト由来免疫グロブリン（例えば、受容体抗体）の全部又は一部ＣＤＲ領域をヒト由来抗体（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲ領域で置き換えた抗体又は抗体断片を指し、そのうちドナー抗体としては、特異性、結合性又は反応性が予期可能な動物由来（例えば、マウス、ラット又はウサギ）の抗体であってもよい。なお、受容体抗体のフレームワーク領域（以下、「ＦＲ領域」とも称する）における一部のアミノ酸残基については、動物由来抗体のアミノ酸残基又は別の抗体のアミノ酸残基に適宜置き換えることで抗体性能を更に改善し、最適化してもよい。ヒト化抗体については、例えば技術資料としてＪｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２５２５（１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３３２９（１９８８）、Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３５９６（１９９２）及びＣｌａｒｋ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ２１：３９７４０２（２０００）などを参照することができる。好ましくは、本発明に係るヒト化抗体は、マウス由来抗体１８Ｈ１１のＣＤＲ領域及びヒト由来抗体の非ＣＤＲ領域を組合わせて得られる。より好ましくは、本発明に係るヒト化抗体は、１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１、１８Ｈ１１－Ｈ２Ｌ２及び１８Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３である。最も好ましくは、本発明に係るヒト化抗体は、１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１である。

本発明において、「可変」とは、抗体可変領域の一部に配列差異があり、特定抗原に対する各抗体の結合性や特異性を決定する構成である。可変度としては、抗体可変領域全体に渡って均一に分布する訳でなく、軽鎖および重鎖の可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と称される３つのフラグメントに集中して存在する。可変領域において保存性が比較的高い部分がフレームワーク領域であり、天然重鎖および軽鎖の可変領域にそれぞれ４つのＦＲ領域を含む。れらのＦＲ領域はβ－折り畳み構造を形成し、接続リングを構成する３つのＣＤＲによって互いに連結され、或いは部分的なβ－折り畳み構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域を介して緊密に隣接し、かつ他鎖のＣＤＲと共同で抗体の抗原結合サイトを形成する［Ｋａｂａｔ等、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、第Ｉ巻第６４７～６６９頁（１９９１）］。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接に関与せず、例えば、抗体依存性細胞介在性の細胞毒性（ＡＤＣＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ）などといった他の生体作用機序を示す。

本発明において、「抗原結合断片」とは、ヒトＩＬ－１βに特異的に結合しうる抗体断片を指す。本発明の抗原結合断片としは、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などが挙げられる。Ｆａｂ断片は、抗体をパパインで消化して得られ、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体をペプシンで消化して得られる。Ｆｖ断片は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が非共有結合を介して緊密に連結されたダイマーで形成される。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をアミノ酸１５～２０個からなるペプチドリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）で連結して得られる抗体である。シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は重鎖のみで形成され、ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）又は重鎖抗体とも呼ばれ、その抗原結合領域はヒンジ領域を介してＦｃ領域に連結されたシングルドメインである。

本発明において、「結合」及び「特異的結合」とは、抗体とその抗原の反応など、２つの分子がランダムに結合する反応を指すものである。抗体は、約１０^－７Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）でその抗原に結合し、例えば、約１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ未満或いは更に低い解離定数でその抗原に結合するのが一般である。本発明において、「ＫＤ」とは特定抗体と抗原が相互作用する際の解離定数であり、抗体と抗原の結合性を反映するものである。解離定数が低いほど抗体と抗原がより堅固に結合し、抗体と抗原の結合性が高くなる。例えば、表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）を利用し、ＢＩＡＣＯＲＥ測定装置で抗体と抗原の結合性を測定することができ、或いはＥＬＩＳＡ法で抗体と抗原が結合する際の相対的結合性を測定することができる。

本発明において、「エピトープ」及び「ヒトＩＬ－１βエピトープ」とは、ヒトＩＬ－１βに存在し且つ抗体に特異的に結合する領域を指す。

本発明において、発現ベクターについては特に制限がなく、例えばｐＴＴ５、ｐＳＥＣｔａｇ系、ｐＣＧＳ３系、ｐＣＤＮＡ系ベクター等、並びに他の哺乳動物発現系に用いるベクターを使用することができ、発現ベクターに適切な転写調節配列や翻訳調節配列が連結された融合ＤＮＡ配列が含まれる。

本発明に適用可能なホスト細胞としては、上記発現ベクターを発現しうる細胞が挙げられ、例えば哺乳類動物や昆虫ホスト細胞培養系の真核細胞を利用して本発明の融合タンパク質を発現することができ、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＢＨＫ、及びこれらに由来の変性細胞などを本発明に利用可能である。また、本発明において、「細胞」と「細胞系」は同じ意味を有し、互いに置き換えることができる。

本発明において、「薬物組成物」とは、本発明のヒトＩＬ－１βに結合する抗体と薬学的に許容可能な担体とで構成される薬物製剤を指し、本発明に係る薬物組成物は、安定な治療効果を確保すると同時に本発明のヒトＩＬ－１βに結合する抗体のアミノ酸コア配列の構造完全性を維持することができ、さらに、タンパク質の多官能基を分解（例えば、凝集、脱アミノ化や酸化）から免れるようにすることができる。

本発明において、「ＩＬ－１β過剰発現に起因する疾患」とは、同一組織の正常細胞のＩＬ－１β発現レベルに比べ、異常疾患状態にある個体細胞においてＩＬ－１βの発現レベルが異常上昇することを意味する。本発明のＩＬ－１β過剰発現に起因する疾患については特に制限がなく、例えば骨粗鬆症、骨関節炎及び他の炎症性関節炎、乾癬などの免疫疾患が挙げられる。

以下、実施例や実験例を挙げて本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例や実験例に制限されない。以下において、ベクターやプラスミドの構築方法、タンパク質をコードする遺伝子をベクターやプラスミドに導入する方法、プラスミドをホスト細胞に導入する方法など、従来周知の操作については説明を省略する。これらの操作は当業者が熟知し、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓなどの出版物に詳細な説明がある。

また、本明細書において略語を使用する場合もあり、かかる略語の意味は、下記表１に示された通りである。

実施例１：抗原及び抗体候補の調製
１－１）１ＩＬ１β－ｈＦｃ及びＩＬ１ＲＩ－ｈｉｓの調製
ａ）以下の設計趣旨に従い、ヒト由来ＩＬ１－ｂｅｔａ（ＮＣＢＩ基準配列ＮＰ＿０００５６７．１）のアミノ酸配列と、ＴＥＶ－ｈＩｇＧ１Ｆｃ（ｈＦｃ：Ｉｇ ｇａｍｍａ－１ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ，アクセッション番号がＰ０１８５７，１０６－３３０）を繋いでＩＬ１ｂ－ＴＥＶ－ｈＩｇＧ１Ｆｃを構築し、そのうち配列番号２３で表されるアミノ酸配列は、ＡＰＶＲＳＬＮＣＴＬＲＤＳＱＱＫＳＬＶＭＳＧＰＹＥＬＫＡＬＨＬＱＧＱＤＭＥＱＱＶＶＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳＡＱＦＰＮＷＹＩＳＴＳＱＡＥＮＭＰＶＦＬＧＧＴＫＧＧＱＤＩＴＤＦＴＭＱＦＶＳＳＫＬＥＮＬＹＦＱＧＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫであり、上記配列においてＥＮＬＹＦＱＧがＴＥＶ酵素切断認識サイトであった。

ｂ）以下の設計趣旨に従い、ヒト由来ＩＬ１ＲＩ（１－３３２）（ＮＣＢＩ基準配列ＮＰ＿０００８６８．１）のアミノ酸配列に、６×Ｈｉｓタグを付けてＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－Ｈｉｓを構築し、そのうち配列番号２４で表されるアミノ酸配列は、ＭＫＶＬＬＲＬＩＣＦＩＡＬＬＩＳＳＬＥＡＤＫＣＫＥＲＥＥＫＩＩＬＶＳＳＡＮＥＩＤＶＲＰＣＰＬＮＰＮＥＨＫＧＴＩＴＷＹＫＤＤＳＫＴＰＶＳＴＥＱＡＳＲＩＨＱＨＫＥＫＬＷＦＶＰＡＫＶＥＤＳＧＨＹＹＣＶＶＲＮＳＳＹＣＬＲＩＫＩＳＡＫＦＶＥＮＥＰＮＬＣＹＮＡＱＡＩＦＫＱＫＬＰＶＡＧＤＧＧＬＶＣＰＹＭＥＦＦＫＮＥＮＮＥＬＰＫＬＱＷＹＫＤＣＫＰＬＬＬＤＮＩＨＦＳＧＶＫＤＲＬＩＶＭＮＶＡＥＫＨＲＧＮＹＴＣＨＡＳＹＴＹＬＧＫＱＹＰＩＴＲＶＩＥＦＩＴＬＥＥＮＫＰＴＲＰＶＩＶＳＰＡＮＥＴＭＥＶＤＬＧＳＱＩＱＬＩＣＮＶＴＧＱＬＳＤＩＡＹＷＫＷＮＧＳＶＩＤＥＤＤＰＶＬＧＥＤＹＹＳＶＥＮＰＡＮＫＲＲＳＴＬＩＴＶＬＮＩＳＥＩＥＳＲＦＹＫＨＰＦＴＣＦＡＫＮＴＨＧＩＤＡＡＹＩＱＬＩＹＰＶＴＨＨＨＨＨＨであった。

ｃ）以上のように設計した融合タンパク質ＩＬ１ｂ－ＴＥＶ－ｈＩｇＧ１Ｆｃ及びＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－Ｈｉｓについては、さらに、かかるアミノ酸配列に対してコドン最適化を行い、ＩＬ１ｂ－ＴＥＶ－ｈＩｇＧ１ＦｃのＮ末端にシグナルペプチドを付けることにより最適化し、最適化済みのＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）ベクターに導入してｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＩＬ１ｂ－ＴＥＶ－ｈＩｇＧ１Ｆｃ及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－Ｈｉｓプラスミドを構築した。

ｄ）上記２つのプラスミドを制限酵素（ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ）で消化した後、電気泳動を行ってＤＮＡ断片ＩＬ１ｂ－ＴＥＶ－ｈＩｇＧ１Ｆｃ及びＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－Ｈｉｓを回収し、それぞれ同じ制限酵素（ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ）で消化したｐｃＤＮＡ３．１ベクターと繋ぐことにより、組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＩＬ１ｂ－ＴＥＶ－ｈＩｇＧ１Ｆｃ及びｐｃＤＮＡ３．１－ＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－Ｈｉｓを構築した。

ｅ）以上で得られた２つの組換えプラスミドを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^TM２９３－ＦＣｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にそれぞれ導入して７日間培養した。培養液を４０００ｒｐｍで２０分間遠心し、０．４５μｍのミリポアフィルターを用いて減圧濾過した。そして、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム及びＮｉカラム（タンパク質精製用の液体クロマトグラフィー／ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ１０、ＧＥ社製）を用い、メーカー提供の操作マニュアルに従って精製することにより、精製したＩＬ１ｂ－ＴＥＶ－ｈＩｇＧ１Ｆｃ及びＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－Ｈｉｓ融合タンパク質を得た。

実験結果は、図１及び図２に示された通りである。図１は、ＩＬ１β－ｈＦｃ（ＩＬ１ｂ－ＴＥＶ－ｈＩｇＧ１Ｆｃ）の精製結果を示し、ＩＬ１β－ｈＦｃタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＨＰ、ＧＥ社製）で集めて精製、溶出した場合、タンパク質の一部が凝集することが確認できた。溶出画分を回収、濃縮した後、溶液交換を行って－８０℃で保存した。図２は、ＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－ＨＩＳの培養上澄み液の精製結果を示し、ＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－ＨＩＳタンパク質をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で精製、溶出し、溶出画分を回収、濃縮して－８０℃に保存した。

１－２）ＩＬ１β－ｈｉｓの調製
ａ）以下の設計趣旨に従い、ヒト由来ＩＬ１－ｂｅｔａ（ＮＣＢＩ基準配列ＮＰ＿０００５６７．１）のアミノ酸配列に６×Ｈｉｓタグを付けてＩＬ１ｂ－Ｈｉｓを構築し、そのうち配列番号２５で表されるアミノ酸配列は、ＭＡＰＶＲＳＬＮＣＴＬＲＤＳＱＱＫＳＬＶＭＳＧＰＹＥＬＫＡＬＨＬＱＧＱＤＭＥＱＱＶＶＦＳＭＳＦＶＱＧＥＥＳＮＤＫＩＰＶＡＬＧＬＫＥＫＮＬＹＬＳＣＶＬＫＤＤＫＰＴＬＱＬＥＳＶＤＰＫＮＹＰＫＫＫＭＥＫＲＦＶＦＮＫＩＥＩＮＮＫＬＥＦＥＳＡＱＦＰＮＷＹＩＳＴＳＱＡＥＮＭＰＶＦＬＧＧＴＫＧＧＱＤＩＴＤＦＴＭＱＦＶＳＳＨＨＨＨＨＨであった。

ｂ）以上のように設計した融合タンパク質については、かかるアミノ酸配列に対してコドン最適化を行い、最適化済みのＤＮＡ配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、そしてｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）ベクターに導入してｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＩＬ１ｂ－Ｈｉｓプラスミドを得た。

ｃ）上記プラスミドを制限酵素（ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ）で消化し、電気泳動を行ってＤＮＡ断片を回收し、同じ制限酵素（ＮｃｏＩ＆ＸｈｏＩ）で消化したｐＥＴ２８ａベクターと繋ぐことにより組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ－ＩＬ１ｂ－Ｈｉｓを構築した。

ｄ）以上で得られたプラスミドを受容性ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して発現株を取得し、シングルクロニーを拾って正しさを確認した後に拡大培養した。ＯＤ値が０．８～１．０に達すると、終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（Ａｍｒｅｓｃｏ社製）を加えて16℃、２０時間振とう培養した。ばい菌を遠心にて回収し、バッファーＡ[５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５ｍＭ Ｂ－ＭＥ、１０％グリセロール、ｐＨ８．０（エンドトキシン低減）]で懸濁した後、高圧処理して細胞を破壊した。１時間かけて高速遠心を行い、０．４５μｍのミリポアフィルターを用いて減圧濾過することにより上澄み液を回収した。メーカー提供の操作マニュアルに従い、ＮｉカラムＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ（タンパク質精製用の液体クロマトグラフィー／ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ１０、ＧＥ社製）を用いて精製することによりＩＬ１ｂ－Ｈｉｓ融合タンパク質を得た。

ＩＬ１ｂ－Ｈｉｓの精製結果を図３に示す。Ｎｉカラムを用いてＩＬ１ｂ－Ｈｉｓタンパク質を濃縮して精製、溶出し、溶出画分を回収、濃縮して－８０℃に保存した。ＱＣ検定からは、タンパク質凝集がないことが確認できた。

１－３）ＩＬ１β－ｈｉｓ－ｂｉｏ及びＩＬ１ＲＩ－ｈｉｓ－ｂｉｏの調製
ａ）標識用タンパク質の準備
上記１－２）で得られたＩＬ－１β－Ｈｉｓは、分子量が１８５７２．１４ｇ／ｍｏｌ、濃度が１．０６８ｍｇ／ｍｌ、体積が１０００μＬであり、総量が１０６８μｇであった。
上記１－１）で得られたＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－Ｈｉｓは、分子量が３６８５９ｇ／ｍｏｌ、濃度が１．２２ｍｇ／ｍｌ、体積が１０６５μＬであり、総量が１．３ｍｇであった。

ｂ）ビオチン粉末（分子量５５７ｇ／ｍｏｌ、Ｔｈｅｒｍｏ社製）を室温、約１５分間静置することにより平衡化した後、３ｍｇを取ってエンドトキシンを取り除いた水５４０μＬに濃度が５５６０ｎｇ／ｍｌになるように溶解し、後の使用に備えた。

ｃ）下記式に従って、タンパク質標識に必要なビオチン量（μＬ）を算出した。

ｄ）濃度が５５６０ｎｇ／ｍｌのビオチン溶液をそれぞれ２種類の標識用タンパク質の溶液に適宜加え、氷上で１時間静置した。

ｅ）ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ社製）を用い、タンパク質精製装置ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＵＰＣ１００（ＧＥ社製）によってタンパク質溶液をＰＢＳに変え、同時に遊離ビオチンを除いた。タンパク質を分注し、液体窒素で急速凍結してから－８０℃で保存した。

１－４）陽性対照抗体ＰｃＡｂの調製
ａ）既知のヒト由来ＩＬ１－ｂｅｔａ（ＮＣＢＩ基準配列ＮＰ＿０００５６７．１）タンパク質配列に基づき、さらに、米国特許ＵＳ８２７３３５０Ｂ２に記載の抗ヒトＩＬ１－ｂｅｔａの抗体配列を参照してＰｃＡｂ抗体を調製した。そのうち、
配列番号２６で表されるＰｃＡｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＶＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＩＩＷＹＤＧＤＮＱＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＧＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＲＴＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳであり、
配列番号２７で表されるＰｃＡｂの重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫであり、
配列番号２８で表されるＰｃＡｂの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＥＩＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＧＳＳＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＬＩＫＹＡＳＱＳＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＡＹＹＣＨＱＳＳＳＬＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫであり、
配列番号２９で表されるＰｃＡｂの軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣであった。

ｂ）上記の抗体配列については、かかるアミノ酸配列に対してコドン最適化を行い、最適化済みのＤＮＡ配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、そしてｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社提供）ベクターに導入してｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＰＣＡＢＨプラスミド、およびｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＰＣＡＢＬプラスミドを得た。

ｃ）ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＰＣＡＢＨプラスミド、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－ＰＣＡＢＬプラスミドを制限酵素（ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ）で消化し、電気泳動を行って遺伝子断片ＰＣＡＢＨ、ＰＣＡＢＬを回収し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターと繋いで組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＰＣＡＢＨ、及びｐｃＤＮＡ３．１－ＰＣＡＢＬを得た。

ｄ）以上で得られた組換えプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＰＣＡＢＨ、ｐｃＤＮＡ３．１－ＰＣＡＢＬをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ ２９３－Ｆ細胞に導入し、７日後に培養液を取って高速遠心を行い、ミリポアフィルターで減圧濾過した。メーカー提供の操作マニュアルに従い、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（タンパク質精製用の液体クロマトグラフィー／ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ１０、ＧＥ社製）で精製することにより抗体ＰＣＡＢを得た。

図４に、ＰｃＡｂの精製結果を示す。ＰｃＡｂタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで濃縮、精製し、溶出画分を回収、濃縮して－８０℃に保存した。

１－５）マウス由来抗体の調製
ａ）上記１－２で調製した免疫原ＩＬ１β－ｈｉｓ（１－２）を、体積比１：１でアジュバントと混ぜ合わせて乳化させ、一回目の免疫は完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ、Ｓｉｇｍａ社製、Ｆ５８８１－１０×１０ｍｌ）を用いて抗原を乳化させた。２週間経ってから２回目の免疫を行い、抗原を不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ、Ｓｉｇｍａ、Ｆ５８８１－１０×１０ｍｌ）で乳化させ、皮下５箇所に注射し、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ＳＰＦ級、メス、６週齢）1匹当たりに抗原量が５０μｇであり、各注射箇所への注射量は５０μＬずつであった。

ｂ）２回目の免疫が終わってから１０日後、マウス尻尾から少量の血液サンプルを採って血清抗体価を測定し、間接ＥＬＩＳＡ法で血清抗体価が１：８１０００又はそれ以上になったことを確認した上でマウスに対して追加免疫を行った。

ｃ）追加免疫済のマウスを解剖して脾臓を摘出し、セルストレーナーにおいて単細胞懸濁液に研磨した後、骨髄腫細胞ＳＰ２／０－１４Ａｇと５：１の割合で混ぜ合わせた。遠心を行い、細胞の凝集塊を分散させた後に３７℃の水浴においてＰＥＧ／ＤＭＳＯ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）をゆっくり滴下することにより細胞を融合させた。１５００ｒｐｍで遠心し、１×ＨＡＴ（５０×、Ｓｉｇｍａ社製）、１５％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）、１×マイシリンを含むＩＭＤＭ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）で再懸濁し、９６ウェル細胞プレートに播種して培養した。

ｄ）間接ＥＬＩＳＡ法で９６ウェル細胞プレートに対して選別を行い、選別で得られた陽性クローンについては間接ＥＬＩＳＡ法、３段階の希釈勾配を形成して２回目の選別を行い、３回目の選別は、競合ＥＬＩＳＡ法および原液を用いて行うことにより陽性クローンを選出した。

ｅ）上記細胞融合、選別で得られた目的陽性クローンについて、限界希釈法でサブクローニングを２回行い、サブクローニングを１回実施する度に間接ＥＬＩＳＡ法で選別し、サブクローニングを２回行うことにより安定細胞株を得た。

ｆ）以上で得られた安定細胞株を、低ＩｇＧウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地で培養し、そして培地から上澄み液を回収、精製してモノクローナル抗体を得た。

実施例２：マウス由来抗体の評価
２－１）ＥＬＩＳＡ法によるマウス由来抗体と抗原ＩＬ１βの結合性評価
ａ）１．０ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン（生工バイテック社製）をＣＢＳ溶液（０．０５Ｍの被覆炭酸塩バッファー）で濃度２μｇ／ｍｌになるように希釈し、各ウェルに５０μＬずつ加え、４℃、一晩静置して被覆を行った。翌日、プレートをＰＢＳＴで１回洗浄した。

ｂ）各ウェルに、上記１－３）で調製した０．２μｇ／ｍｌのＩＬ－１β－ｈｉｓ－ｂｉｏを５０μＬずつ加え、３７℃、３０分間静置してからＰＢＳＴで３回洗浄した。

ｃ）各ウェルに、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（ＢＳＡ乾燥粉末１ｇをＰＢＳに加えて溶かし、溶液量を１００ｍｌに調整したもの）を３００μＬ加えてブロッキング処理を行い、３７℃、３０分間静置してからＰＢＳＴで３回洗浄した。

ｄ）上記１－４）で調製した対照抗体ＰｃＡｂ、および上記１－５）で調製し且つ下記表２に示されるマウス由来抗体を濃度１μｇ／ｍｌになるように希釈し、さらに、３段階希釈することで７段階の濃度勾配を形成し、希釈液をブランク対照物とした。各ウェルに５０μＬずつ加えて３７℃、３０分間静置し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。

ｅ）二次抗体としてＨＲＰ標識のヤギ抗マウスＩｇＧ（酵素標識二次抗体用液を用い、ピペットでヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰ二次抗体母液１μＬを取って１％のＢＳＡバッファー５ｍｌに加え、十分に振り混ぜる。つまり、二次抗体を１：５０００の倍率で希釈し、使用時に適時調製したものである）およびＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（酵素標識二次抗体用液を用い、ピペットでヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＨＲＰ二次抗体母液１μＬを取って、１％のＢＳＡを含むバッファー５ｍｌに加え、十分に振り混ぜる。つまり、二次抗体を１：５０００の倍率で希釈し、使用時に適時調製したものである）を各ウェルに５０μＬずつ加えて３７℃、３０分間静置し、ＰＢＳＴで４回洗浄した。

ｆ）各ウェルにＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ社製）を５０μＬ加えて着色させ、室温、暗所にて５分間反応させた後に終止液を加えて反応を中止させ、波長４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。

下記表３及び図５に実験結果を示す。実験結果から、ＫＦ０２１ＺＰ４ ９Ｄ５、ＫＦ０２１ＺＰ４ １８Ｂ１、ＫＦ０２１ＺＰ４ １８Ｅ１、ＫＦ０２１ＺＰ４ １８Ｈ１１及びＫＦ０２１ＺＰ４１９Ｅ４が何れもＩＬ－１β－ｈｉｓ－ｂｉｏに結合しうることが実証された。

２－２）ＥＬＩＳＡ法によるマウス由来抗体とＩＬ１ＲＩ競合結合性抗原ＩＬ１βの結合性評価
ａ）上記１－１）で調製したＩＬ－１β－ｈＦｃを濃度４μｇ／ｍｌとなるように希釈し、各ウェルに５０μＬずつ加え、４℃、一晩静置した後にＰＢＳＴで１回洗浄した。

ｂ）各ウェルに１％のＢＳＡを含むＰＢＳを３００μＬずつ加え、３７℃、３０分間静置してブロッキング処理を行い、ブロッキング処理後にＰＢＳＴで３回洗浄した。

ｃ）上記２－１）で調製した抗体を２μｇ／ｍｌに希釈し（使用時の終濃度は１μｇ／ｍｌである）、さらに、３段階希釈して７段階の濃度勾配を形成し、希釈液をブランク対照物とした。各ウェルに５０μＬずつ加えて室温、１０分間静置した後、さらに、各ウェルに上記１－１）で調製した濃度が０．０８μｇ／ｍｌのＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－ｈｉｓ（使用時の終濃度は０．０４μｇ／ｍｌである）を５０μＬずつ加え、抗体と十分混ぜ合わせて３７℃、３０分間静置し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。

ｄ）二次抗体としてＨＲＰ標識のマウス抗Ｈｉｓを１：８０００の倍率で希釈し、各ウェルに５０μＬずつ加えて３７℃、３０分間静置し、ＰＢＳＴで４回洗浄した。

ｅ）各ウェルにＴＭＢを５０μＬ加えて着色させ、室温、暗所にて５分間反応させて終止液を加えて反応を中止させ、波長４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。

下記表４及び図６に実験結果を示す。実験結果からＫＦ０２１ＺＰ４ ９Ｄ５、ＫＦ０２１ＺＰ４ １８Ｂ１、ＫＦ０２１ＺＰ４ １８Ｅ１、ＫＦ０２１ＺＰ４ １８Ｈ１１及びＫＦ０２１ＺＰ４ １９Ｅ４が何れも効率よくＩＬ－１β－ｈＦｃとＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－ｈｉｓの結合を阻害しうることが実証された。

２－３）ＩＬ１βによって誘発される細胞のＩＬ６分泌に対するマウス由来抗体の阻害効果
ａ）成長状態が良好であるＭＲＣ－５細胞（中国科学院細胞バンクより入手）をパンクレアチン（Ｇｉｂｃｏ社製）で消化し、細胞数を計測して９６ウェルプレートに播種し、一晩静置して培養した。

ｂ）試験需要に合わせて陰性対照組（ＭＲＣ－５細胞＋ＩＬ－１β＋ｍＩｇＧ又はＭＲＣ－５細胞＋ＩＬ－１β＋ｈＩｇＧ）、陽性対照組（ＭＲＣ－５細胞＋ＩＬ－１β＋ＰｃＡｂ）、試験組（ＭＲＣ－５細胞＋ＩＬ－１β＋濃度が異なる抗体）を設け、細胞を３７℃のインキュベータに入れて２４時間培養した。そのうち、ＩＬ－１βはＳｉｎｏ社製であり、濃度が５８８ｎＭであり、陽性抗体ＰｃＡｂは上記１－４）で調製したものであり、濃度が３．４ｍｇ／ｍＬであり、抗体９Ｄ５は上記１－５）で調製したものであり、濃度が２．１７ｍｇ／ｍＬであり、抗体１８Ｅ１は上記１－５）で調製したものであり、濃度が１．８ｍｇ／ｍＬであり、抗体１８Ｂ１は上記１－５）で調製したものであり、濃度が１．５６ｍｇ／ｍＬであり、抗体１８Ｈ１１は上記１－５）で調製したものであり、濃度が０．４ｍｇ／ｍＬであり、抗体１９Ｅ４は上記１－５）で調製したものであり、濃度が０．１４ｍｇ／ｍＬであった。

ｃ）２４時間後に培養上澄み液を回収してＩＬ－６活性を測定し、具体的には、ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｅｗｅバイオテック社製）を用い、キットに添付の操作マニュアルに従って定量分析を行った。

ＩＬ－６活性の測定結果を図７に示す。実験結果から、ＩＬ－１βがＭＲＣ－５細胞のＩＬ－６分泌を亢進させ、抗体９Ｄ５、１８Ｅ１、１８Ｂ１、１８Ｈ１１及び１９Ｅ４がＩＬ－１βに対して阻害効果を示すため、ＩＬ－１βによって誘発されるＭＲＣ－５細胞のＩＬ－６分泌を阻害しうることを確認でき、そのうち９Ｄ５、１８Ｈ１１および１９Ｅ４がＩＬ－１βによって誘発されるＩＬ－６分泌に対してより優れた阻害効果を示した。

以上の結果に基づき、より優れた活性を示す３つのマウス由来抗体９Ｄ５、１８Ｈ１１及び１９Ｅ４に対して更に体内薬理効果を評価することにした。

実施例３：マウス由来抗体の体内薬理効果
マウス由来抗体の体内薬理効果に評価するに当たって、実験動物として、北京維通利華実験動物技術有限会社により購入したＳＰＦ級、メス、４～６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを２９匹使い、動物品質認定証番号が１１４００７００１１３７７６であり、広東省医学実験動物センターにより購入したＳＰＦ級、メス、６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを１８匹使い、動物品質認定証番号が４４００７２０００２３５４８であった。細胞株としては、それぞれＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ細胞株、継代１５代目）、Ｌｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３（本実験室で構築し、継代１１代目）であった。抗体としては、陰性対照が抗ＨＥＬ抗体（Ａｋｅｓｏｂｉｏ社製）であり、陽性対照がＰｃＡｂであり、候補抗体がそれぞれ９Ｄ５、１８Ｈ１１および１９Ｅ４であった。使用試薬として、塩化ナトリウム注射液は、浙江天瑞薬品工業有限会社製のものであった。

評価は、以下の手順に従って行った。実験用抗体として、モデル組用の濃度２ｍｇ／ｍｌの抗ＨＥＬ２抗体は、濃度４．８８ｍｇ／ｍｌの原液から０．９８４ｍｌ（４．８ｍｇ）取って塩化ナトリウム注射液１．４１６ｍｌに加え、溶液総量が２．４ｍｌになるようにした。陽性投与組用の濃度２ｍｇ／ｍｌのＰｃＡｂ抗体は、濃度７．６５ｍｇ／ｍｌの原液から０．６２７ｍｌ（４．８ｍｇ）を取って塩化ナトリウム注射液１．７７３ｍｌに加え、溶液総量が２．４ｍｌになるようにした。９Ｄ５投与組用の濃度２ｍｇ／ｍｌの９Ｄ５抗体は、濃度５．７０ｍｇ／ｍｌの原液から０．８４２ｍｌ（４．８ｍｇ）を取って塩化ナトリウム注射液１．５５８ｍｌに加え、溶液総量が２．４ｍｌになるようにした。１８Ｈ１１投与組用の濃度２ｍｇ／ｍｌの１８Ｈ１１抗体、濃度３．３１ｍｇ／ｍｌの原液から１．４５０ｍｌ（４．８ｍｇ）を取って塩化ナトリウム注射液０．９５０ｍｌに加え、溶液総量が２．４ｍｌになるようにした。１９Ｅ４投与組用の濃度２ｍｇ／ｍｌの１９Ｅ４抗体は、濃度６．２６ｍｇ／ｍｌの原液から０．７６７ｍｌ（４．８ｍｇ）を取って塩化ナトリウム注射液１．６３３ｍｌに加え、溶液総量が２．４ｍｌになるようにした。

マウス４７匹を体重に基づきランダムで５つの組に分け、そのうち正常組（ｎ＝７）に塩化ナトリウム注射液を１０ｍｌ／ｋｇの用量で投与し、モデル組（ｎ＝８）に抗ＨＥＬ抗体を２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、陽性投与組（ｎ＝８）にＰｃＡｂを２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、１９Ｅ４投与組（ｎ＝８）に１９Ｅ４を２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、１８Ｈ１１投与組（ｎ＝８）に１８Ｈ１１を２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、９Ｄ５投与組（ｎ＝８）に９Ｄ５を２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。そして、マウスへの投与は、尾静脈内注射にて行った。

Ｂａｌｂ／ｃマウスは、腹腔内に抱水クロラールを注射して麻酔させた後、左膝関節部位にそれぞれの細胞懸濁液を注射し、そのうち正常組は、マウス1匹当たりにＮＩＨ／３Ｔ３細胞を５万個接種し、モデル組、陽性投与組、１９Ｅ４投与組、１８Ｈ１１投与組及び９Ｄ５投与組は、マウス1匹当たりにＬｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３細胞をそれぞれ５万個接種した。

接種後の第３日目、第５日目にマウス体重を測定し、接種後の５日目に下記基準に従ってマウス行動力評価を行った。そして、マウスを安楽死処分し、解剖を行ってからノギスで膝関節滑膜の長さと幅を測定した。
０点：マウスの行動力正常、両側足部の動き可能
１点：マウスの走行異常、両側足部の動き可能
２点：マウスの患肢が地面に一時接触、両側足部の動き可能
３点：マウスの患肢が地面に接触不能、片側足部のみが動き可能

図８は、マウス行動力に対する抗体１９Ｅ４、１８Ｈ１１及び９Ｄ５の影響を示す。正常組に比べ、モデル組のマウスは明らかに行為異常を示した（Ｐ＜０．０１）。投与後、モデル組に比べ、陽性薬組ではマウスの行為異常を顕著に低減し（Ｐ＜０．０１）、候補抗体１９Ｅ４、１８Ｈ１１および９Ｄ５投与組もマウスの行為異常を顕著に低減することができた（Ｐ＜０．０１）。一方、マウス行為異常に対する抑制効果からして、１９Ｅ４は陽性投与組に比べて明らか劣り（Ｐ＜０．０５）、１８Ｈ１１及び９Ｄ５は陽性投与組と同等の効果を示し（Ｐ＞０．０５）、１８Ｈ１１及び９Ｄ５のマウス行為異常に対する抑制効果も同等であった（Ｐ＞０．０５）。

図９は、マウス膝関節の腫れに対する抗体１９Ｅ４、１８Ｈ１１及び９Ｄ５の影響を示す。正常組に比べてモデル組のマウス膝関節の腫れ面積が明らかに大きくなり（Ｐ＜０．０１）、陽性薬を投与した後にはマウス膝関節の腫れ面積が顕著に低下した（Ｐ＜０．０１）。候補抗体１９Ｅ４、１８Ｈ１１及び９Ｄ５もマウス膝関節の腫れ面積を顕著に低減することができるが（Ｐ＜０．０１）、１９Ｅ４は、陽性投与組に比べてマウス膝関節の腫れ面積に対する抑制効果が劣り（Ｐ＜０．０１）、１８Ｈ１１は、陽性投与組と同等の抑制効果を示し（Ｐ＞０．０５）、９Ｄ５も陽性投与組に比べてマウス膝関節の腫れ面積に対する抑制効果が劣ることが確認できた（Ｐ＜０．０５）。また、マウス膝関節の腫れに対する抑制効果からして、１８Ｈ１１は９Ｄ５を上回った（Ｐ＜０．０５）。

マウス体重に対する抗体１９Ｅ４、１８Ｈ１１及び９Ｄ５の影響を下記表５に纏めて示す。表５に示すように、正常組に比べ、モデル組のマウス体重が顕著に低下するが（Ｐ＜０．０１）、陽性投与組はマウス体重への影響をほぼ示さず（Ｐ＜０．０１）、１９Ｅ４は、モデル組に比べてマウス体重への影響がやや弱く、１８Ｈ１１及び９Ｄ５は、陽性投与組と同じくマウス体重に対してほぼ影響を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。また、１８Ｈ１１及び９Ｄ５は、マウス体重に対して同等の影響を示した（Ｐ＞０．０５）。

表５において、正常組に比べるときの^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊Ｐ＜０．０５であり、モデル組に比べるときの^＃＃Ｐ＜０．０１、^＃Ｐ＜０．０５であり、陽性投与組に比べるときの^ΔΔＰ＜０．０１であり、ｎ＝８であり、正常組はｎ＝７であった。

以上の結果から、候補抗体１９Ｅ４、１８Ｈ１１及び９Ｄ５は、何れもＩＬ－１βによって誘発されるマウスの関節炎病変を顕著に低減し、そのうち、候補抗体１８Ｈ１１及び９Ｄ５は、陽性対照抗体ＰｃＡｂと同様の抑制効果を示した。マウス行動力評価と膝関節の腫れの実験データを合わせて考察すると、本発明の条件下で１８Ｈ１１が９Ｄ５を上回る効果を示すことが確認できた。

配列測定の結果、候補抗体１８Ｈ１１、１９Ｅ４及び９Ｄ５の配列情報は、以下の通りであった。つまり、１８Ｈ１１は、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、ヌクレオチド配列が配列番号１５で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８で表され、ヌクレオチド配列が配列番号１６で表される。１９Ｅ４は、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３０で表され、ヌクレオチド配列が配列番号３１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３２で表され、ヌクレオチド配列が配列番号３３で表される。９Ｄ５は、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３４で表され、ヌクレオチド配列が配列番号３５で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３６で表され、ヌクレオチド配列が配列番号３７で表される。

実施例４：組換え抗体の調製及び結合性評価
４－１）組換え抗体１８Ｈ１１（ＲＥ）、１９Ｅ４（ＲＥ）及び９Ｄ５（ＲＥ）の調製
１８Ｈ１１、１９Ｅ４、９Ｄ５の重鎖ｃＤＮＡ配列（重鎖可変領域の配列はそれぞれ配列番号１５、配列番号３１、配列番号３５で表され、定常領域配列がｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇａｍｍａ ２ｂ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］１４０～４７５、アクセッション番号ＡＣＸ７００８４．１である）および軽鎖ｃＤＮＡ配列（軽鎖可変領域の配列はそれぞれ配列番号１６、配列番号３３、配列番号３７で表され、定常領域がａｎｔｉｂｏｄｙ ｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ，ｐａｒｔｉａｌ［Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］１０６～２１３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＢ３３４０４．１である）を、それぞれｐＵＣ５７シンプルベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）に導入し、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１８Ｈ１１Ｈ／１９Ｅ４Ｈ／９Ｄ５．１２Ｈ及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１８Ｈ１１Ｌ／１９Ｅ４Ｌ／９Ｄ５．１２Ｌプラスミドを得た。

ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１８Ｈ１１Ｈ／１９Ｅ４Ｈ／９Ｄ５．１２Ｈ及びｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ－１８Ｈ１１Ｌ／１９Ｅ４Ｌ／９Ｄ５．１２Ｌプラスミドを制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ）で消化し、電気泳動で回収した重鎖及び軽鎖をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターに導入し、得られた２つの組換えプラスミドを同時に２９３Ｆ細胞に導入した。細胞培養を行い、７日後に培養液を高速遠心し、ミリポアフィルターで減圧濾過した後、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラムに注入して溶出バッファーでタンパク質を溶出した。回収した目的サンプルについては、ＨｉＴｒａｐ脱塩キットで溶液をＰＢＳに変えた。

４－２）組換え抗体の結合性評価
上記２－１）及び２－２）のＥＬＩＳＡ法に利用し、抗原ＩＬ１βに対する組換え抗体１８Ｈ１１（ＲＥ）、１９Ｅ４（ＲＥ）及び９Ｄ５（ＲＥ）の結合性を評価し、並びにＩＬ１ＲＩ競合結合性抗原であるＩＬ１βに対する上記組換え抗体の結合性を評価した。

測定結果から、組換え抗体１８Ｈ１１（Ｒｅ）、１９Ｅ４（Ｒｅ）および９Ｄ５（Ｒｅ）は何れもＩＬ１βに結合し、かつマウス由来抗体１８Ｈ１１、１９Ｅ４及び９Ｄ５や、陽性対照抗体ＰＣＡｂに匹敵する結合活性を示すことが確認できた。また、組換え抗体１８Ｈ１１（Ｒｅ）、１９Ｅ４（Ｒｅ）及び９Ｄ５（Ｒｅ）は何れもＩＬ１βとＩＬ１ＲＩの結合を効果的に阻害し、１８Ｈ１１（Ｒｅ）とＩＬ１ＲＩ競合結合性抗原であるＩＬ１βとの結合性は、マウス由来抗体１８Ｈ１１や陽性対照抗体ＰＣＡｂの場合と同等のレベルであった。

実施例５：ヒト化抗体の構築
本発明において、マウス由来抗体１８Ｈ１１の配列に基づいて重鎖及び軽鎖の可変領域を構造的に意味のある１５個のペプチド断片に分け、さらに、ＰＤＢデータベースの抗体断片情報を利用することにより既知の構造と対比を行った。配列対比に基づき配列相同性の最も高い断片を選出し、その構造態様をシミュレーションによって検証した。そして、シミュレーションした構造断片を組合わせて可変領域の構造を再構築した。該モデルについてエネルギー最小化処理を数回行い、信頼性の高い抗体構造モデルを取得した。

構造モデルを構築すると同時に、マウス由来ＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列を、データベースにおけるヒト由来配列と対比することにより相同性の最も高い配列を選出した。以上で得られた３次元の立体構造モデルにおいて差異性を示す各アミノ酸について慎重な検討を重ね、構造完全性やＣＤＲ領域に対する可能な影響を評価した。このとき、かかる配列を可能な限り完全にヒト化する観点から、ヒト由来配列における共通アミノ酸についても評価対象として検証を行った。最終配列を確定するに先立って、抗体結合性を影響しない前提で可能な糖鎖修飾サイトを予測してこれらの修飾サイトを取り除いた。このように得られたヒト由来化の遺伝子をそれぞれ１８Ｈ１１Ｈ１、１８Ｈ１１Ｈ２、１８Ｈ１１Ｌ１及び１８Ｈ１１Ｌ２（抗体の定常領域配列はＮＣＢＩのデータベースから得られ、重鎖の定常領域はＩｇ ｇａｍｍａ－１ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎに由来し、アクセッション番号がＰ０１８５７であり、軽鎖の定常領域はＩｇ ｋａｐｐａ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎに由来し、アクセッション番号がＰ０１８３４である）と命名した。

ヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号９で表され、ヌクレオチド配列は配列番号１７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０で表され、ヌクレオチド配列は配列番号１８で表される。

ヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ２Ｌ２の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１１で表され、ヌクレオチド配列は配列番号１９で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１２で表され、ヌクレオチド配列は配列番号２０で表される。

また、ヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１３で表され、ヌクレオチド配列は配列番号２１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１４で表され、ヌクレオチド配列は配列番号２２で表される。そのうち、重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は、ＨＣＤＲ１がＧＹＬＦＴＧＹＹ（配列番号１）であり、ＨＣＤＲ２がＩＳＣＹＮＧＤＴ（配列番号２）であり、ＨＣＤＲ３がＳＲＳＤＹＹＧＴＳＤＹ（配列番号３）であり、軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は、ＬＣＤＲ１がＳＳＶＳＹ（配列番号４）であり、ＬＣＤＲ２がＴＴＳ（配列番号５）であり、ＬＣＤＲ３がＱＱＲＩＩＹＰＰＴ（配列番号６）であった。

実施例６：ヒト化抗体の評価
６－１）ＥＬＩＳＡ法によるヒト化抗体と抗原ＩＬ１βの結合性評価
ＣＢＳで希釈したＩＬ－１β－ｈｉｓを用いて被覆を行い、４℃で一晩静置してからＰＢＳＴで１回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキング処理を行い、３７℃、３０分間静置し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。下記表６に示す抗体をそれぞれ段階的に希釈して濃度勾配を形成し、３７℃、３０分間静置してからＰＢＳＴで３回洗浄した。二次抗体として、体積比１：５０００で希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（酵素標識二次抗体の使用液は、以下のようにして調製した。つまり、使用に先立ってＨＲＰ標識のヤギ抗ヒトＩｇＧ母液をピペットで１μＬ取って１％のＢＳＡバッファー５ｍＬに加え、均一となるように十分混ぜ合わせ、体積比１：５０００の二次抗体使用液とした）を加え、３７℃、３０分間静置してからＰＢＳＴで４回洗浄した。各ウェルにＴＭＢを５０μＬ加えて着色させ、室温、暗所で５分間反応させてから終止液を加えて反応を停止させ、ＯＤ_４５０値を測定した。

ＥＬＩＳＡ測定の結果を下記表７及び図１０に示す。測定結果から、１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１、１８Ｈ１１－Ｈ２Ｌ２及び１８Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３が何れもＩＬ－１β－ｈｉｓに結合可能であることが確認できた。

６－２）ＥＬＩＳＡ法によるヒト化抗体とＩＬ１ＲＩ競合結合性抗原ＩＬ１βの結合性評価
ＣＢＳで希釈したＩＬ－１β－ｈＦｃを用いて被覆を行い、４℃で一晩静置してからＰＢＳＴで１回洗浄した。１％のＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキング処理を行い、３７℃、３０分間静置し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。下記表８に示す抗体を段階的に希釈して濃度勾配を形成し、室温で１０分間静置してからＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－ｈｉｓを加え、抗体と十分混ぜ合わせて３７℃、３０分間静置した。ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ標識のマウス抗Ｈｉｓ抗体（ｃｗｂｉｏ社製）を加えて３７℃、３０分間静置し、ＰＢＳＴで４回洗浄した。各ウェルにＴＭＢを５０μＬ加えて着色させ、室温、暗所で５分間反応させてから終止液を加えて反応を停止させ、ＯＤ_４５０値を測定した。

ＥＬＩＳＡ測定の結果を下記表８及び図１１に示す。測定結果から、１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１、１８Ｈ１１－Ｈ２Ｌ２及び１８Ｈ１１－Ｈ３Ｌ３がＩＬ－１β－ｈＦｃとＩＬ１ＲＩ（１－３３２）－ｈｉｓの結合を効果的に阻害することのできることが確認できた。

６－３）ＩＬ１βによって誘発される細胞のＩＬ６分泌に対するヒト化抗体の阻害効果
ａ）成長状態が良好であるＭＲＣ－５細胞（中国科学院細胞バンクより入手）をパンクレアチン（Ｇｉｂｃｏ社製）で消化し、細胞数を計測した後に９６ウェルプレートに播種して一晩静置した。

ｂ）ＩＬ－１β、ＰｃＡｂ及び測定用抗体をそれぞれ３７℃、２０分間静置し、細胞溶液に加えて２４時間反応させた。そのうち、ＩＬ－１βは、Ｓｉｎｏ社製であり、濃度が５８８ｎＭであり、陽性抗体ＰｃＡｂは、濃度が３．４ｍｇ／ｍＬであり、対照抗体ｈＩｇＧは、濃度が４．８８ｍｇ／ｍＬであり、測定用抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１は、濃度が５ｍｇ／ｍＬであり、測定用抗体１８Ｈ１１－Ｈ２Ｌ２は、濃度が１．５ｍｇ／ｍｌであった。

ｃ）２４時間後に細胞上澄み液を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｄａｋｅｗｅ社製）を用い、キットに添付の操作マニュアルに従ってＩＬ－６を定量的に測定した。

ＩＬ－６の測定結果を図１２に示す。測定結果から、ＩＬ－１βがＭＲＣ－５細胞のＩＬ－６分泌を亢進させ、一方、抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１及び１８Ｈ１１－Ｈ２Ｌ２は、ＩＬ－１β阻害活性があることから、ＩＬ－１βによって誘発されるＭＲＣ－５細胞のＩＬ－６分泌を阻害することができ、抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１の場合、ＩＬ１βによって誘発される細胞のＩＬ６分泌に対して陽性対照抗体を上回る阻害効果を示し、抗体１８Ｈ１１－Ｈ２Ｌ２の場合、陽性対照抗体と同等の阻害効果を示すことが確認できた。

６－４）ヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１の結合性評価
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ社のＯｃｔｅｔ分子間相互作用解析システムを用い、ＥＤＣ／ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳでＡＲ２Ｇセンサーを活性化させ、時間設定を３００秒とすることにより抗体とＩＬ１βの結合性を測定した。具体的には、抗体を１０ｍＭの酢酸ナトリウムで濃度が５μｇ／ｍＬになるように希釈し（ｐＨ６．０）、センサー表面に対して固定処理を３００秒間行った。そして、センサーを１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）で３００秒間ブロッキングし、ＰＢＳＴバッファーで３００秒間平衡化させた。濃度が１．５６～１００ｎＭ範囲の（ＰＢＳＴで２倍の濃度勾配になるように希釈したもの）ＩＬ１β－ｈｉｓを用い、センサーに固定した抗体と３００秒間反応させた。ＰＢＳＴバッファーにおいて抗原と抗体を６００秒間かけて解離させ、得られたデータについて１：１モデルを利用して回帰解析を行うことにより結合定数を算出した。

測定結果を下記表９に示す。測定結果から、陽性対照抗体に比べてヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１がより高い結合性を示すことが確認できた。

実施例７：ヒト化抗体の薬理効果
評価は、以下の材料と方法を利用し、Ｌｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３によって誘発されるマウス膝関節炎モデルに対するヒト化抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１、マウス由来抗体１８Ｈ１１の薬理効果を検証することにより行われた。

実験動物は、広東省医学実験動物センターより入手したＳＰＦ級、５～７週齢、メス、体重１５～２０ｇのＢａｌｂ／ｃマウス４０匹を用い、動物品質認定証番号が４４００７２０００３２４９０であった。細胞株は、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ細胞株、継代２４代目）及びＬｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３（Ａｋｅｓｏｂｉｏ社製、継代２１代目）を用いた。実験で使われる抗体としては、抗ＨＥＬ抗体（Ａｋｅｓｏｂｉｏ社製）を陰性対照物とし、ＰｃＡｂを陽性対照物とし、１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１及び１８Ｈ１１をそれぞれ候補抗体とした。塩化ナトリウム注射液は、広東利泰製薬会社製であった。

以下の手順に従って細胞培養を行った。つまり、液体窒素からＮＩＨ／３Ｔ３（Ｐ１９）、Ｌｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３（Ｐ１６）細胞株を取り出し、３７℃の水浴において迅速に融解し、細胞懸濁液を１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製）及び１％のペニシリン・ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に加えて３７℃、５％のＣＯ_２インキュベータで培養した。そして、通常の方法でＮＩＨ／３Ｔ３及びＬｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３を継代培養し、継代を１回実施する度にＬｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３細胞にブラストサイジンＳ塩酸塩（Ｇｉｂｃｏ社製）を加えて選別を行った。

Ｌｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の培養上澄み液に含まれるＩＬ－１β量は、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１β Ｐｒｅｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｄａｋｅｗｅバイオテック社製）に添付の操作マニュアルに従って測定した。

４０匹のＢａｌｂ／ｃマウスを秤量し、正常組、異種対照組、ＰｃＡｂ組、１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１組、１８Ｈ１１組とランダムで５つの組に分け、各組は８匹ずつであった。各組については、投与量を１０ｍｇ／ｋｇ、投与体積を１０ｍｌ／ｋｇ、投与濃度を１ｍｇ／ｍｌとし、尾静脈内注射にてそれぞれ投与を行い、投与頻度は、接種前に１回であった。具体的には、細胞接種に先立ってマウスの体重に基づき尾静脈内経由で以下に示す通り、モデル組に抗ＨＥＬ抗体、ＰｃＡｂ組にＰｃＡｂ、１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１組に１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１、１８Ｈ１１組に１８Ｈ１１、正常組に同量の生理塩水をそれぞれ投与した。
モデル組：抗ＨＥＬ抗体（４．９ｍｇ／ｍｌ）を正確に０．４９０ｍｌ取って、生理塩水１．９１ｍｌで希釈して投与を行った。
ＰｃＡｂ組：ＫＦ０２１ＺＰ４ ＰｃＡｂ（４．７５ｍｇ／ｍｌ）を正確に０．５０５ｍｌ取って、生理塩水１．８９５ｍｌで希釈して投与を行った。
１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１組：ＫＦ０２１ＺＰ４ １８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１（３．１６ｍｇ／ｍｌ）を正確に０．７５９ｍｌ取って、生理塩水１．６４１ｍｌで希釈して投与を行った。
１８Ｈ１１組：ＫＦ０２１ＺＰ４ １８Ｈ１１（３．３７ｍｇ／ｍｌ）を正確に０．７１２ｍｌ取って、生理塩水１．６８８ｍｌで希釈して投与を行った。

ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｌｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３細胞が必要とされる接種数に達した後（細胞密度が培養皿面積の８０％）、細胞を回収し、安全キャビネット内において古い培地を吸い取り、ＰＢＳで１回洗い流してから０．０５％のトリプシン・ＥＤＴＡ（１ｘ、Ｇｉｂｃｏ社製）を適宜加えて室温、１分間かけて消化処理を行い、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ完全培地を加えて消化処理を停止させた。細胞懸濁液を１２００ｒｐｍ、４分間遠心し、上澄み液を取り除いた。細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で再懸濁させ、細胞数を計測してから細胞濃度が２００万個／ｍｌとなるようにし、氷上に置いて次に備えた。

動物モデル構築（細胞接種）は、以下の通りに行われた。マウスを麻酔した後、正常組に対してはマウスの右膝関節腔内にＮＩＨ／３Ｔ３細胞を１匹ごとに５万個細胞、２５μｌ接種し、他の組に対してはマウスの右膝関節腔内にＬｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を１匹ごとに５万個細胞、２５μｌ接種した。接種後に膝関節の傷口を縫い合わせ、さらに、傷口の感染を防止するため縫合箇所に２０倍希釈したペニシリンを塗った。

細胞を接種してから５日目に、各組のマウスに対して下記基準に従って行動力評価を行った。点数付けが終わると、各組のマウスを安楽死処分し、ノギスで膝関節滑膜の長さ（ｍｍ）と幅（ｍｍ）を測定し、膝関節の面積（ｍｍ^２）を算出した。
０点：マウスの行動力正常、両側足部の動き可能
１点：マウスの走行異常、両側足部の動き可能
２点：マウスの患肢が地面に一時接触、両側足部の動き可能
３点：マウスの患肢が地面に接触不能、片側足部のみが動き可能

実験データについては以下で表し、ＧｒａｐｈＰａｄソフトで処理してから1元配置分散解析を実施することにより組別対比を行い、このとき、Ｐ＜０．０５の場合を有意差があるとし、Ｐ＜０．０１の場合を顕著な有意差があるとした。

１）図１３に、マウス行動力に対する抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１、１８Ｈ１１の影響を示す。正常組に比べてモデル組のマウスは、病理的な行為異常が明らかに多発した（Ｐ＜０．０１）。一方、陽性投与組（ＰｃＡｂ組）、１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１組及び１８Ｈ１１組は何れもマウス患肢の異常行動・行為を効果的に抑制することができ（Ｐ＜０．０１）、そのうち１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１、１８Ｈ１１は陽性対照抗体であるＰｃＡｂと同等の抑制効果を示した。

２）図１４に、マウスの膝関節面積に対する抗体１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１、１８Ｈ１１の影響を示す。正常組に比べてモデル組のマウスは、膝関節面積が顕著に増加し（Ｐ＜０．０１）、膝関節の腫れが見られた。一方、陽性投与組（ＰｃＡｂ組）、１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１組及び１８Ｈ１１組は、何れもマウス膝関節の腫れ面積を効果的に抑制することがで（Ｐ＜０．０１）、そのうち１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１、１８Ｈ１１は陽性対照抗体であるＰｃＡｂと同等の抑制効果を示した。

以上の実験結果から、Ｌｅｎｔｉ－ＩＬ－１β－ＮＩＨ／３Ｔ３を用いて構築した動物膝関節炎モデルにおいて、３つの抗体ＰｃＡｂ、１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１、１８Ｈ１１は、投与量１０ｍｇ／ｋｇの条件下で何れもマウス患肢の行動・行為を顕著に改善し、同時にマウス膝関節の腫れ面積を顕著に低減することができ、そのうち１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１及び１８Ｈ１１抗体は、陽性対照抗体であるＰｃＡｂと同等の改善効果を示した。

実施例８：変性抗体の調製
１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１の重鎖をテンプレートとし、プライマーを設計してＰＣＲ変異導入法を利用することにより、重鎖の相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ２に位置する第５３位システイン（Ｃ）残基をそれぞれアラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、プロリン（Ｐ）残基に変えた。ＰＣＲ反応が終わると、反応系に制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製、カタログ番号Ｒ０１７６Ｌ）を０．５μＬ加え、３７℃、３０分間消化してから氷上に５分間静置した。得られた遺伝子をばい菌に導入し、翌日にばい菌コロニーを拾って配列測定を行い、正確な変異クローンを選出してそれぞれ１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１の軽鎖と共に２９３－Ｆ細胞に導入した。培養を始めてから７日後に培養液を回収して高速遠心し、ミリポアフィルターで減圧濾過した。そして、メーカー提供のマニュアルに従ってＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで精製することにより変性抗体を得た。図１５に各変性抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動結果を示し、そのうちＷＴは１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１であった。

実施例９：ＥＬＩＳＡ法による変性抗体の結合性評価
各変性抗体と抗原ＩＬ１βの結合性は、上記６－１）と同様にして評価した。各変性抗体及び１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１（ＷＴ）とＩＬ１βの結合ＥＣ_５０は、それぞれ図１６及び表 に示される通りである。

実施例１０：ＩＬ－１βによって誘発される細胞のＩＬ－６分泌に対する変性抗体の阻害効果
実施例９の実験結果に基づいてＩＬ－１βと強い結合を示す抗体を選出し、上記６－３）と同様にして、ＩＬ－１βによって誘発されるＭＲＣ－５細胞のＩＬ－６分泌に対するこれら抗体の阻害活性を測定した。測定結果を図１７に示す。測定結果から、他の変性抗体に比べ、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ｉ（すなわち、Ｃ５３Ｉ）及び１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａ（すなわち、Ｃ５３Ａ）は、ＩＬ－１βによって誘発されるＭＲＣ－５細胞のＩＬ－６分泌に対して比較的高い阻害活性を示し、ＩＣ_５０がそれぞれ２．４１６ｎＭ及び２．３２３ｎＭであることが確認できた。

実施例１１：変性抗体の熱安定性
１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ｉ、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａ及び１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１を４０℃の水浴に２８日間置き、異なる時点でサンプルを採集し、最後のサンプリングが終わると、上記６－１）及び６－３）と同様にしてそれぞれ各サンプルのＩＬ－１βへの結合性、及びＩＬ－１βによって誘発されるＭＲＣ－５細胞のＩＬ－６分泌に対する阻害活性を測定した。

測定結果を図１８に示し、各サンプルのＥＣ_５０は、図の表に示される通りであった。測定結果から、サンプルを４０℃の水浴に置いてから０日目～２８日目において、ＩＬ－１βに対する１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１の結合性が約２．６倍低下し、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの場合は約１．４倍低下し、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ｉの場合は約２．７倍低下することが確認できた。

また、図１９に示すように、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ｉ、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａ及び１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１（すなわち、１８Ｈ１１－Ｈｕ－ＷＴ）を４０℃の水浴に置いてから０日目～２８日目において、ＩＬ－１βによって誘発されるＭＲＣ－５細胞のＩＬ－６分泌に対する１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１の阻害活性が約２．９倍低下し、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ｉの場合は約６．２倍低下し、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの場合は約１．５倍低下し、各サンプルのＩＣ_５０、図の表に示される通りであった。このことから、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの相対的熱安定性が１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１及び１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ｉの場合を上回ることが確認できた。

実施例１２：１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａ与ＩＬ１ＲＩ競合結合性抗原ＩＬ１βの結合性検測
上記６－２）と同様にして、変性抗体１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３ＡとＩＬ１ＲＩ競合結合性抗原ＩＬ１βの結合性を評価した。

測定結果を図２０に示す。図２０に示すように、ＩＬ１βとＩＬ１ＲＩの結合に対する１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａ及びＰＣＡｂのＩＣ_５０がそれぞれ０．０２８ｎＭ、０．０２８ｎＭ及び０．０３０ｎＭであり、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３ＡもＩＬ１βとＩＬ１ＲＩの結合を効果的に阻害し、その活性が１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１及び陽性対照抗体であるＰＣＡｂと同等のレベルであることが確認できた。

実施例１３：Ｂｉａｃｏｒｅ法による１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの結合性評価
Ｂｉａｃｏｒｅ法を利用し、１８Ｈ１１－Ｈ１Ｌ１、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａ及びＰＣＡｂとＩＬ１βとの結合動態パラメータを測定した。具体的には、捕捉法を利用してＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップ（ＧＥ社製、バッチ番号１０２６１１３２）で０．５μｇ／ｍＬ の抗体を捕捉し、接触時間（ｃｏｎｔａｃｔ ｔｉｍｅ）を７５秒、流速（ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）を１０μＬ／分間、再接触時間（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｃｔ ｔｉｍｅを３０秒とした。また、抗原を解析物とし、接触時間（ｃｏｎｔａｃｔ ｔｉｍｅ）を１８０秒、解離時間（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を９００秒、流速（ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）を３０μＬ／分間、再接触時間（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｃｔ ｔｉｍｅ）を３０秒とした。測定で得られた各動態パラメータを、下記表１０に示す。

実施例１４：１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの体内薬理効果
Ｂａｌｂ／ｃマウス（メス、週齢５～７週、体重１５～２０ｇ）の適応性を高めるため飼育を１週間行い、体重に基づき７つの組に分け、各組は８匹ずつであった。腹腔内経由で１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａ抗体を投与し、投与量をそれぞれ２．５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇとし、対照組にはＰＢＳ又は同じサブタイプのＩｇＧ対照物を投与した。２４時間経過した後、マウスに組換えヒトＩＬ－１β－Ｈｉｓを５μｇ皮下注射し、ＩＬ－１βを注射してから４時間立った時点でマウスに対して採血を行った。４℃で血清を分離し、ＥＬＩＳＡ法でマウス血清中におけるＩＬ－６発現レベルを測定することにより、異なる投与量で抗体を投与したときのマウスＩＬ－６分泌に対する阻害効果を検討した。

測定結果を図２１に示す。図２１に示すように、ＰＢＳ投与組（陰性対照組）の阻害率実測値を０とした場合、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａは、投与量２．５ｍｇ／ｋｇでマウスＩＬ－６分泌に対する阻害率が９１．０６％であり、投与量０．５ｍｇ／ｋｇでマウスＩＬ－６分泌に対する阻害率が７３．１１％であり、投与量０．１ｍｇ／ｋｇでマウスＩＬ－６分泌に対する阻害率が２９．４６％であることが確認てきた。

実施例１５：１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの種間交叉反応性
１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの種間交叉反応性については、ＥＬＩＳＡ法を利用して測定した。具体的には、サル及びラットのＩＬ－１βタンパク質であるＭａｃａｃａ－ＩＬ－１β（ＮＣＢＩ基準配列ＮＰ＿００１２７０４９８．１）及びＲａｔ－ＩＬ－１β（ＮＣＢＩ基準配列ＮＰ＿１１３７００．２）を用い、それぞれ１ウェル当たりに０．２μｇの量で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを被覆し、上記６－１）と同様にしてこれら動物種のＩＬ－１βに対する１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの交叉反応性を測定した。このとき、Ｍａｃａｃａ－ＩＬ－１β、Ｒａｔ－ＩＬ－１βの調製は、上記１－１）と同様にして行われた。

測定結果を図２２に示す。図２２に示すように、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３ＡはサルのＩＬ－１βタンパク質に効果的に結合することができ、そのＥＣ_５０が０．０２５ｎＭであり、ラットのＩＬ－１βタンパク質に対しては結合性が示さなかった。

実施例１６：ＩＬ－１ａｌｐｈａ、ＩＬ－１Ｒ２及びＩＬ－１ＲＡファミリーメンバーに対する１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの選択性
ヒトＩＬ－１ａｌｐｈａ、ＩＬ－１Ｒ２及びＩＬ－１ＲＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、製品識別番号がそれぞれ１０１２８－ＨＮＣＨ－２０、１０１１１－Ｈ０８Ｈ－５０及び１０１２３－ＨＮＡＥ－１００である）を用い、１ウェル当たりに０．２μｇの量で９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを被覆し、上記６－１）と同様にしてこれらタンパク質に対する１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの選択性を測定した。

測定結果を図２３に示す。図２３に示すように、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａは、ＩＬ－１Ｒ２やＩＬ－１ＲＡに対して反応性を示さないが、ＩＬ－１α（ＩＬ－１ａｌｐｈａ）に対して反応性を示し、そのＥＣ_５０が０．６５２ｎＭであり、ＩＬ－１β（ＩＬ－１ｂｅｔａ）に対しても反応性を示し、そのＥＣ_５０が０．０２６ｎＭであった。これらの結果から、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３ＡがヒトＩＬ－１βを特異的に認識しうることが確認できた。

実施例１７：ＩＬ－１βにおける１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの結合エピトープ
立体構造に基づきＩＬ－１β（配列番号２３において第１位～第１５３位）を２つのペプチド断片に分け、それぞれ発現、精製してＩＬ－１β－Ａ１－Ｆ９９－Ｈｉｓ（第１位のアラニン残基～第９９位のフェニルアラニン残基で構成され、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグが付いたもの）及びＩＬ－１β－Ａ１－Ｗ１２０－Ｈｉｓ（第１位のアラニン残基～第１２０位のトリプトファン残基で構成され、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグが付いたもの）を得た。被覆用溶液でＩＬ－１β－Ａ１－Ｆ９９－Ｈｉｓ、ＩＬ－１β－Ａ１－Ｗ１２０－Ｈｉｓ及びＩＬ－１β－ＷＴ－Ｈｉｓ（すなわち、ＩＬ－１β－ｈｉｓ）をそれぞれ０．５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、得られた希釈液を用いてＥＬＩＳＡプレート被覆した。そして、上記６－１）と同様にして１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａに対する各断片の結合性を測定した。

測定結果を図２４に示す。図２４に示すように、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａは、ＩＬ－１β－Ａ１－Ｆ９９－Ｈｉｓに結合できず、ＩＬ－１β－Ａ１－Ｗ１２０－Ｈｉｓには結合するが、ＩＬ－１β－ＷＴ－Ｈｉｓの場合に比べて弱い結合性を示した。この識見に基づき、プライマーを設計してＩＬ－１βの第９９位フェニルアラニン残基～第１２０位トリプトファン残基や、第１２０位以降のアミノ酸残基をアラニン残基に逐一変え、上記と同様に発現精製して１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３Ａの結合エピトープを確定した。

実験結果をそれぞれ図２５、図２６及び図２７に示す。これらの実験結果から、１８Ｈ１１－Ｈｕ－Ｃ５３ＡとＩＬ－１βの結合に対して影響が最も大きいアミノ酸残基として、つまり、主な結合エピトープは第１２０位のトリプトファン残基及び第１２２位のイソロイシン残基であり、それに続いて第１１２位のフェニルアラニン残基、第１２３位のセリン残基及び第１２４位のトレオニン残基も結合性に寄与することが確認できた。

Claims (12)

1. ａ）重鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列が配列番号１で表されるＨ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号２で表されるＨ－ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号３で表されるＨ－ＣＤＲ３、および
   ｂ）軽鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列が配列番号４で表されるＬ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号５で表されるＬ－ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号６で表されるＬ－ＣＤＲ３
   を含む抗体であって、
   前記抗体は、マウス由来抗体であり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８で表される
   ことを特徴とする、ヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片。
2. ａ）重鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列が配列番号１で表されるＨ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号２で表されるＨ－ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号３で表されるＨ－ＣＤＲ３、および
   ｂ）軽鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列が配列番号４で表されるＬ－ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号５で表されるＬ－ＣＤＲ２、アミノ酸配列が配列番号６で表されるＬ－ＣＤＲ３
   を含む抗体であって、
   前記抗体は、ヒト化抗体であり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０で表される
   ことを特徴とする、ヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片。
3. 前記の抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、及び一本鎖抗体からなる群より選ばれる任意の１つである、請求項１又は２に記載のヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片。
4. 前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖相補性決定領域Ｈ－ＣＤＲ２は、Ｃ５３Ａ変異サイトを含み、かつＨ－ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号２に代えて配列番号３８で表される、請求項２に記載のヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片。
5. 請求項１又は２に記載のヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド分子。
6. 重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が配列番号１５で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が配列番号１６で表される、又は、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が配列番号１７で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が配列番号１８で表される、請求項５に記載のヌクレオチド分子。
7. 請求項５又は６に記載のヌクレオチド分子を含んでなることを特徴とする、発現ベクター。
8. 請求項７に記載の発現ベクターを含んでなることを特徴とする、ホスト細胞。
9. 請求項１又は２に記載のヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片を製造する方法であって、
   発現条件下で請求項８に記載のホスト細胞を培養することにより、ヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片を発現するステップａと、
   ステップａで発現したヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片を分離、精製するステップｂと
   を含むことを特徴とする、製造方法。
10. 請求項１～４の何れか１項に記載のヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなることを特徴とする、薬物組成物。
11. 請求項１～４の何れか１項に記載のヒトＩＬ－１βに結合する抗体又はその抗原結合断片又は請求項１０に記載の薬物組成物の、ＩＬ－１β過剰発現によって誘発される免疫疾患を治療するための薬物の製造における使用。
12. 前記ＩＬ－１β過剰発現によって誘発される免疫疾患は、関節炎、骨粗鬆症又は乾癬である、請求項１１に記載の使用。

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