JP2022506561A - ヒトIL-1βに結合する抗体、その調製方法及び用途 - Google Patents
ヒトIL-1βに結合する抗体、その調製方法及び用途 Download PDFInfo
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Abstract
Description
1-1)1IL1β-hFc及びIL1RI-hisの調製
a)以下の設計趣旨に従い、ヒト由来IL1-beta(NCBI基準配列NP_000567.1)のアミノ酸配列と、TEV-hIgG1Fc(hFc:Ig gamma-1 chain C region,アクセッション番号がP01857,106-330)を繋いでIL1b-TEV-hIgG1Fcを構築し、そのうち配列番号23で表されるアミノ酸配列は、APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSSKLENLYFQGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKであり、上記配列においてENLYFQGがTEV酵素切断認識サイトであった。
a)以下の設計趣旨に従い、ヒト由来IL1-beta(NCBI基準配列NP_000567.1)のアミノ酸配列に6×Hisタグを付けてIL1b-Hisを構築し、そのうち配列番号25で表されるアミノ酸配列は、MAPVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSSHHHHHHであった。
a)標識用タンパク質の準備
上記1-2)で得られたIL-1β-Hisは、分子量が18572.14g/mol、濃度が1.068mg/ml、体積が1000μLであり、総量が1068μgであった。
上記1-1)で得られたIL1RI(1-332)-Hisは、分子量が36859g/mol、濃度が1.22mg/ml、体積が1065μLであり、総量が1.3mgであった。
a)既知のヒト由来IL1-beta(NCBI基準配列NP_000567.1)タンパク質配列に基づき、さらに、米国特許US8273350B2に記載の抗ヒトIL1-betaの抗体配列を参照してPcAb抗体を調製した。そのうち、
配列番号26で表されるPcAbの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGMNWVRQAPGKGLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCARDLRTGPFDYWGQGTLVTVSSであり、
配列番号27で表されるPcAbの重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKであり、
配列番号28で表されるPcAbの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSSLPFTFGPGTKVDIKであり、
配列番号29で表されるPcAbの軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECであった。
a)上記1-2で調製した免疫原IL1β-his(1-2)を、体積比1:1でアジュバントと混ぜ合わせて乳化させ、一回目の免疫は完全フロイントアジュバント(FCA、Sigma社製、F5881-10×10ml)を用いて抗原を乳化させた。2週間経ってから2回目の免疫を行い、抗原を不完全フロイントアジュバント(FIA、Sigma、F5881-10×10ml)で乳化させ、皮下5箇所に注射し、BALB/Cマウス(SPF級、メス、6週齢)1匹当たりに抗原量が50μgであり、各注射箇所への注射量は50μLずつであった。
2-1)ELISA法によるマウス由来抗体と抗原IL1βの結合性評価
a)1.0mg/mlのストレプトアビジン(生工バイテック社製)をCBS溶液(0.05Mの被覆炭酸塩バッファー)で濃度2μg/mlになるように希釈し、各ウェルに50μLずつ加え、4℃、一晩静置して被覆を行った。翌日、プレートをPBSTで1回洗浄した。
a)上記1-1)で調製したIL-1β-hFcを濃度4μg/mlとなるように希釈し、各ウェルに50μLずつ加え、4℃、一晩静置した後にPBSTで1回洗浄した。
a)成長状態が良好であるMRC-5細胞(中国科学院細胞バンクより入手)をパンクレアチン(Gibco社製)で消化し、細胞数を計測して96ウェルプレートに播種し、一晩静置して培養した。
マウス由来抗体の体内薬理効果に評価するに当たって、実験動物として、北京維通利華実験動物技術有限会社により購入したSPF級、メス、4~6週齢のBalb/cマウスを29匹使い、動物品質認定証番号が11400700113776であり、広東省医学実験動物センターにより購入したSPF級、メス、6~8週齢のBalb/cマウスを18匹使い、動物品質認定証番号が44007200023548であった。細胞株としては、それぞれNIH/3T3(ATCC細胞株、継代15代目)、Lenti-IL-1β-NIH/3T3(本実験室で構築し、継代11代目)であった。抗体としては、陰性対照が抗HEL抗体(Akesobio社製)であり、陽性対照がPcAbであり、候補抗体がそれぞれ9D5、18H11および19E4であった。使用試薬として、塩化ナトリウム注射液は、浙江天瑞薬品工業有限会社製のものであった。
0点:マウスの行動力正常、両側足部の動き可能
1点:マウスの走行異常、両側足部の動き可能
2点:マウスの患肢が地面に一時接触、両側足部の動き可能
3点:マウスの患肢が地面に接触不能、片側足部のみが動き可能
4-1)組換え抗体18H11(RE)、19E4(RE)及び9D5(RE)の調製
18H11、19E4、9D5の重鎖cDNA配列(重鎖可変領域の配列はそれぞれ配列番号15、配列番号31、配列番号35で表され、定常領域配列がimmunoglobulin gamma 2b heavy chain precursor[Mus musculus]140~475、アクセッション番号ACX70084.1である)および軽鎖cDNA配列(軽鎖可変領域の配列はそれぞれ配列番号16、配列番号33、配列番号37で表され、定常領域がantibody kappa light chain,partial[Mus musculus]106~213、GenBank登録番号BAB33404.1である)を、それぞれpUC57シンプルベクター(GenScript社製)に導入し、pUC57simple-18H11H/19E4H/9D5.12H及びpUC57simple-18H11L/19E4L/9D5.12Lプラスミドを得た。
上記2-1)及び2-2)のELISA法に利用し、抗原IL1βに対する組換え抗体18H11(RE)、19E4(RE)及び9D5(RE)の結合性を評価し、並びにIL1RI競合結合性抗原であるIL1βに対する上記組換え抗体の結合性を評価した。
本発明において、マウス由来抗体18H11の配列に基づいて重鎖及び軽鎖の可変領域を構造的に意味のある15個のペプチド断片に分け、さらに、PDBデータベースの抗体断片情報を利用することにより既知の構造と対比を行った。配列対比に基づき配列相同性の最も高い断片を選出し、その構造態様をシミュレーションによって検証した。そして、シミュレーションした構造断片を組合わせて可変領域の構造を再構築した。該モデルについてエネルギー最小化処理を数回行い、信頼性の高い抗体構造モデルを取得した。
6-1)ELISA法によるヒト化抗体と抗原IL1βの結合性評価
CBSで希釈したIL-1β-hisを用いて被覆を行い、4℃で一晩静置してからPBSTで1回洗浄した。1%のBSAを含むPBSでブロッキング処理を行い、37℃、30分間静置し、PBSTで3回洗浄した。下記表6に示す抗体をそれぞれ段階的に希釈して濃度勾配を形成し、37℃、30分間静置してからPBSTで3回洗浄した。二次抗体として、体積比1:5000で希釈したHRP標識ヤギ抗ヒトIgG(酵素標識二次抗体の使用液は、以下のようにして調製した。つまり、使用に先立ってHRP標識のヤギ抗ヒトIgG母液をピペットで1μL取って1%のBSAバッファー5mLに加え、均一となるように十分混ぜ合わせ、体積比1:5000の二次抗体使用液とした)を加え、37℃、30分間静置してからPBSTで4回洗浄した。各ウェルにTMBを50μL加えて着色させ、室温、暗所で5分間反応させてから終止液を加えて反応を停止させ、OD450値を測定した。
CBSで希釈したIL-1β-hFcを用いて被覆を行い、4℃で一晩静置してからPBSTで1回洗浄した。1%のBSAを含むPBSでブロッキング処理を行い、37℃、30分間静置し、PBSTで3回洗浄した。下記表8に示す抗体を段階的に希釈して濃度勾配を形成し、室温で10分間静置してからIL1RI(1-332)-hisを加え、抗体と十分混ぜ合わせて37℃、30分間静置した。PBSTで3回洗浄し、HRP標識のマウス抗His抗体(cwbio社製)を加えて37℃、30分間静置し、PBSTで4回洗浄した。各ウェルにTMBを50μL加えて着色させ、室温、暗所で5分間反応させてから終止液を加えて反応を停止させ、OD450値を測定した。
a)成長状態が良好であるMRC-5細胞(中国科学院細胞バンクより入手)をパンクレアチン(Gibco社製)で消化し、細胞数を計測した後に96ウェルプレートに播種して一晩静置した。
Fortebio社のOctet分子間相互作用解析システムを用い、EDC/sulfo-NHSでAR2Gセンサーを活性化させ、時間設定を300秒とすることにより抗体とIL1βの結合性を測定した。具体的には、抗体を10mMの酢酸ナトリウムで濃度が5μg/mLになるように希釈し(pH6.0)、センサー表面に対して固定処理を300秒間行った。そして、センサーを1Mのエタノールアミン(pH8.5)で300秒間ブロッキングし、PBSTバッファーで300秒間平衡化させた。濃度が1.56~100nM範囲の(PBSTで2倍の濃度勾配になるように希釈したもの)IL1β-hisを用い、センサーに固定した抗体と300秒間反応させた。PBSTバッファーにおいて抗原と抗体を600秒間かけて解離させ、得られたデータについて1:1モデルを利用して回帰解析を行うことにより結合定数を算出した。
評価は、以下の材料と方法を利用し、Lenti-IL-1β-NIH/3T3によって誘発されるマウス膝関節炎モデルに対するヒト化抗体18H11-H1L1、マウス由来抗体18H11の薬理効果を検証することにより行われた。
モデル組:抗HEL抗体(4.9mg/ml)を正確に0.490ml取って、生理塩水1.91mlで希釈して投与を行った。
PcAb組:KF021ZP4 PcAb(4.75mg/ml)を正確に0.505ml取って、生理塩水1.895mlで希釈して投与を行った。
18H11-H1L1組:KF021ZP4 18H11-H1L1(3.16mg/ml)を正確に0.759ml取って、生理塩水1.641mlで希釈して投与を行った。
18H11組:KF021ZP4 18H11(3.37mg/ml)を正確に0.712ml取って、生理塩水1.688mlで希釈して投与を行った。
0点:マウスの行動力正常、両側足部の動き可能
1点:マウスの走行異常、両側足部の動き可能
2点:マウスの患肢が地面に一時接触、両側足部の動き可能
3点:マウスの患肢が地面に接触不能、片側足部のみが動き可能
18H11-H1L1の重鎖をテンプレートとし、プライマーを設計してPCR変異導入法を利用することにより、重鎖の相補性決定領域H-CDR2に位置する第53位システイン(C)残基をそれぞれアラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、アスパラギン(N)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、ヒスチジン(H)、リシン(K)、アルギニン(R)、アスパラギン酸(D)、グリシン(G)、セリン(S)、トレオニン(T)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、プロリン(P)残基に変えた。PCR反応が終わると、反応系に制限酵素DpnI(New England BioLabs社製、カタログ番号R0176L)を0.5μL加え、37℃、30分間消化してから氷上に5分間静置した。得られた遺伝子をばい菌に導入し、翌日にばい菌コロニーを拾って配列測定を行い、正確な変異クローンを選出してそれぞれ18H11-H1L1の軽鎖と共に293-F細胞に導入した。培養を始めてから7日後に培養液を回収して高速遠心し、ミリポアフィルターで減圧濾過した。そして、メーカー提供のマニュアルに従ってProtein Aカラムで精製することにより変性抗体を得た。図15に各変性抗体のSDS-PAGE電気泳動結果を示し、そのうちWTは18H11-H1L1であった。
各変性抗体と抗原IL1βの結合性は、上記6-1)と同様にして評価した。各変性抗体及び18H11-H1L1(WT)とIL1βの結合EC50は、それぞれ図16及び表 に示される通りである。
実施例9の実験結果に基づいてIL-1βと強い結合を示す抗体を選出し、上記6-3)と同様にして、IL-1βによって誘発されるMRC-5細胞のIL-6分泌に対するこれら抗体の阻害活性を測定した。測定結果を図17に示す。測定結果から、他の変性抗体に比べ、18H11-Hu-C53I(すなわち、C53I)及び18H11-Hu-C53A(すなわち、C53A)は、IL-1βによって誘発されるMRC-5細胞のIL-6分泌に対して比較的高い阻害活性を示し、IC50がそれぞれ2.416nM及び2.323nMであることが確認できた。
18H11-Hu-C53I、18H11-Hu-C53A及び18H11-H1L1を40℃の水浴に28日間置き、異なる時点でサンプルを採集し、最後のサンプリングが終わると、上記6-1)及び6-3)と同様にしてそれぞれ各サンプルのIL-1βへの結合性、及びIL-1βによって誘発されるMRC-5細胞のIL-6分泌に対する阻害活性を測定した。
上記6-2)と同様にして、変性抗体18H11-Hu-C53AとIL1RI競合結合性抗原IL1βの結合性を評価した。
Biacore法を利用し、18H11-H1L1、18H11-Hu-C53A及びPCAbとIL1βとの結合動態パラメータを測定した。具体的には、捕捉法を利用してProtein Aチップ(GE社製、バッチ番号10261132)で0.5μg/mL の抗体を捕捉し、接触時間(contact time)を75秒、流速(flow rate)を10μL/分間、再接触時間(regeneration contact timeを30秒とした。また、抗原を解析物とし、接触時間(contact time)を180秒、解離時間(dissociation time)を900秒、流速(flow rate)を30μL/分間、再接触時間(regeneration contact time)を30秒とした。測定で得られた各動態パラメータを、下記表10に示す。
Balb/cマウス(メス、週齢5~7週、体重15~20g)の適応性を高めるため飼育を1週間行い、体重に基づき7つの組に分け、各組は8匹ずつであった。腹腔内経由で18H11-Hu-C53A抗体を投与し、投与量をそれぞれ2.5mg/kg、0.5mg/kg、0.1mg/kgとし、対照組にはPBS又は同じサブタイプのIgG対照物を投与した。24時間経過した後、マウスに組換えヒトIL-1β-Hisを5μg皮下注射し、IL-1βを注射してから4時間立った時点でマウスに対して採血を行った。4℃で血清を分離し、ELISA法でマウス血清中におけるIL-6発現レベルを測定することにより、異なる投与量で抗体を投与したときのマウスIL-6分泌に対する阻害効果を検討した。
18H11-Hu-C53Aの種間交叉反応性については、ELISA法を利用して測定した。具体的には、サル及びラットのIL-1βタンパク質であるMacaca-IL-1β(NCBI基準配列NP_001270498.1)及びRat-IL-1β(NCBI基準配列NP_113700.2)を用い、それぞれ1ウェル当たりに0.2μgの量で96ウェルELISAプレートを被覆し、上記6-1)と同様にしてこれら動物種のIL-1βに対する18H11-Hu-C53Aの交叉反応性を測定した。このとき、Macaca-IL-1β、Rat-IL-1βの調製は、上記1-1)と同様にして行われた。
ヒトIL-1alpha、IL-1R2及びIL-1RA(Sino Biological社製であり、製品識別番号がそれぞれ10128-HNCH-20、10111-H08H-50及び10123-HNAE-100である)を用い、1ウェル当たりに0.2μgの量で96ウェルELISAプレートを被覆し、上記6-1)と同様にしてこれらタンパク質に対する18H11-Hu-C53Aの選択性を測定した。
立体構造に基づきIL-1β(配列番号23において第1位~第153位)を2つのペプチド断片に分け、それぞれ発現、精製してIL-1β-A1-F99-His(第1位のアラニン残基~第99位のフェニルアラニン残基で構成され、C末端に6×Hisタグが付いたもの)及びIL-1β-A1-W120-His(第1位のアラニン残基~第120位のトリプトファン残基で構成され、C末端に6×Hisタグが付いたもの)を得た。被覆用溶液でIL-1β-A1-F99-His、IL-1β-A1-W120-His及びIL-1β-WT-His(すなわち、IL-1β-his)をそれぞれ0.5μg/mLとなるように希釈し、得られた希釈液を用いてELISAプレート被覆した。そして、上記6-1)と同様にして18H11-Hu-C53Aに対する各断片の結合性を測定した。
Claims (16)
- a)重鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列が配列番号1で表されるH-CDR1、アミノ酸配列が配列番号2で表されるH-CDR2、アミノ酸配列が配列番号3で表されるH-CDR3、および
b)軽鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列が配列番号4で表されるL-CDR1、アミノ酸配列が配列番号5で表されるL-CDR2、アミノ酸配列が配列番号6で表されるL-CDR3
を含むことを特徴とする、ヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体は、マウス由来抗体又はヒト化抗体である、請求項1に記載のヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体は、マウス由来抗体であり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号7で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号8で表される、請求項2に記載のヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体は、ヒト化抗体であり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号9、配列番号11及び配列番号13のうち何れか1つで表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号10、配列番号12及び配列番号14のうち何れか1つで表される、請求項2に記載のヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片。
- 前記の抗原結合断片は、Fab断片、F(ab’)2断片、Fv断片、一本鎖抗体及びシングルドメイン抗体からなる群より選ばれる任意の1つである、請求項1に記載のヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖相補性決定領域H-CDR2は、C53A変異サイトを含み、かつH-CDR2のアミノ酸配列が配列番号38で表される、請求項1~5の何れか1項に記載のヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1~6の何れか1項に記載のヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド分子。
- 重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が配列番号15、配列番号17、配列番号19及び配列番号21のうち何れか1つで表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列が配列番号16、配列番号18、配列番号20及び配列番号22のうち何れか1つで表される、請求項7に記載のヌクレオチド分子。
- 請求項7~8の何れか1項に記載のヌクレオチド分子を含んでなることを特徴とする、発現ベクター。
- 請求項9に記載の発現ベクターを含んでなることを特徴とする、ホスト細胞。
- 請求項1~6の何れか1項に記載のヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片を製造する方法であって、
発現条件下で請求項10に記載のホスト細胞を培養することにより、ヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片を発現するステップaと、
ステップaで発現したヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片を分離、精製するステップbと
を含むことを特徴とする、製造方法。 - 請求項1~6の何れか1項に記載のヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなることを特徴とする、薬物組成物。
- 請求項1-6の何れか1項に記載のヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片又は請求項12に記載の薬物組成物の、IL-1β過剰発現によって誘発される免疫疾患を治療するための薬物の製造における使用。
- 前記IL-1β過剰発現によって誘発される免疫疾患は、関節炎、骨粗鬆症又は乾癬である、請求項13に記載の使用。
- ヒトIL-1βに結合するときの主な結合エピトープは、配列番号23の第120位トリプトファン及び第122位イソロイシンであることを特徴とする、ヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片。
- 前記結合エピトープは、更に、配列番号23の第112位フェニルアラニン、第123位セリン及び第124位トレオニンを含む、請求項15に記載のヒトIL-1βに結合する抗体又はその抗原結合断片。
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