JP7228201B2 - 生体機能を制御する新規成分 - Google Patents

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関連出願の相互参照

本国際出願は、２０１９年２月１日に日本国特許庁に出願された日本国特許出願第２０１９－１７２９６号に基づく優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２０１９－１７２９６号の全内容を本国際出願に参照により援用する。

本発明は，酵母由来のエクソソームを利用した医療用及び化粧用組成物等に関する。

プロバイオティック乳酸菌には，脂肪蓄積の抑制効果やインスリン抵抗性の改善効果といったメタボリックシンドロームの予防効果が報告されている。そのメカニズムは，経口摂取され腸管から吸収された乳酸菌由来のエクソソームが，脂肪組織や骨格筋といった腸管から遠く離れた組織に作用し，メタボリックシンドローム予防に貢献している事が考えられる。こうした効果は広く多くの人体に良いとされるバクテリアや酵母，さらには経口で摂取する多くの野菜やフルーツからも放出されている可能性が高く，その有用性に期待が高まっている。

本発明者らは，日本酒を生み出す元になる酒母は，酵母を大量に純粋培養したものであることから，エクソソームの宝庫である可能性があると考え，日本酒の製造過程の元になる酒母由来の培養液中に存在するエクソソームに初めて注目した。また、本発明者らは、日本酒同様に酵母を含有する味噌、特に１年以上熟成された味噌に含まれるエクソソームに初めて着目した。よって，本発明は，新規の食品由来のエクソソーム組成物を調製することを目的とする。別の側面において，本発明は，新規の有効成分を含有するがんの抑制剤又は組織の弾力低下の予防剤又弾力性向上剤を提供することを目的とする。

本発明者らは，その精製工程について鋭意検討の結果，独自の製法でエクソソームを抽出可能であることを見出した。本発明者らは，酒母ともろみより回収したエクソソームを用いて免疫細胞における細胞内のグランザイムの量の変化を調べたところ，増加することを見出した。サイトカインの分泌に関しては変化が見られなかった一方，線維芽細胞における老化の指標であるベータガラクトシダーゼ染色に関しては違いが見られなかった。もう一つの老化の指標として，老化線維芽細胞におけるコラゲナーゼの発現とエラスチンの発現を評価した結果，コラーゲンとエラスチンの発現量が上昇していることを確認した。これにより，本発明者らは，日本酒の酒母及びもろみ由来のエクソソームが組織の弾力低下の予防及び弾力性の向上効果を奏することを初めて見出した。

さらに、本発明者らは、味噌より回収したエクソソームを添加した老化線維芽細胞中の抗老化作用のあるI型コラーゲン及びエラスチンの遺伝子量の変化を調べたところ、増加することを見出した。また、味噌より回収したエクソソームを添加することによりＮＫ細胞の免疫活性が高まることを見出した。

よって，本発明は以下の発明に関する：
（１） 酵母から抽出されたエクソソーム。
（２） 酵母が日本酒の酒母又はもろみに含まれる酵母である、（１）に記載のエクソソーム。
（３） 日本酒の酒母又はもろみから抽出されたエクソソーム。
（４） 日本酒の酒母又はもろみを１０，０００～２０，０００×ｇで遠心することにより得られる上清を１０，０００～２１０，０００×ｇで超遠心することにより沈殿物として得られる，（２）又は（３）に記載のエクソソーム。
（５） 酵母が味噌に含まれる酵母である、（１）に記載のエクソソーム。
（６） 味噌から抽出されたエクソソーム。
（７） 味噌が１年以上熟成された味噌である、（５）又は（６）に記載のエクソソーム。
（８） 味噌が３年以上熟成された味噌である、（７）に記載のエクソソーム。
（９） （１）～（８）のいずれか１項に記載のエクソソームを含有する組成物。
（１０） （１）～（８）のいずれか１項に記載のエクソソームを４×１０⁸個／ｍｌ以上又はタンパク質量として３３ｎｇ／ｍｌ以上含有する（９）に記載の組成物。
（１１） （１）～（８）のいずれか１項に記載のエクソソームを４．７×１０¹¹個／ｍｌ以上含有する（９）に記載の組成物。
（１２） （１）～（８）のいずれか１項に記載のエクソソームを７．８×１０¹²個／ｍｌ以上含有する（９）に記載の組成物。
（１３） 前記エクソソームを有効成分として含有する、（９）～（１２）のいずれか１項に記載の組成物である，がん細胞増殖抑制用組成物。
（１４） がん細胞が，大腸がん，前立腺がん，又は乳がんである，（１３）に記載の組成物。
（１５） 前記エクソソームを有効成分として含有する、（９）～（１２）のいずれか１項に記載の組成物である，ＮＫ細胞によるグランザイム発現促進剤。
（１６） 前記エクソソームを有効成分として含有する，（９）～（１２）のいずれか１項に記載の組成物である，がんの治療用又は予防用医薬組成物。
（１７） 前記エクソソームを有効成分として含有する，（９）～（１２）のいずれか１項に記載の組成物である，コラーゲン及び／又はエラスチン産生促進剤。
（１８） 前記エクソソームを有効成分として含有する，（９）～（１２）のいずれか１項に記載の組成物である，組織の弾力性喪失予防剤又は組織の弾力性向上剤。
（１９） 組織が皮膚である，（１８）に記載の組織の弾力性喪失予防剤又は組織の弾力性向上剤。
（２０） 化粧用である，（１９）に記載の組織の弾力性喪失予防剤又は組織の弾力性向上剤。
（２１） （１）～（４）に記載のエクソソームの製造方法であって，
（ａ）日本酒の酒母又はもろみを１０，０００～２０，０００×ｇで遠心すること，
（ｂ）前記（ａ）により得られた上清を１０，０００～２１０，０００×ｇで超遠心すること，及び
（ｃ）沈殿物をエクソソーム画分として回収することを含む方法。
（２３） （５）～（８）に記載のエクソソームの製造方法であって，
（ａ）味噌を１０，０００～２０，０００×ｇで遠心すること，
（ｂ）前記（ａ）により得られた上清を１０，０００～２１０，０００×ｇで超遠心すること，及び
（ｃ）沈殿物をエクソソーム画分として回収することを含む方法。

本発明は，免疫系の活性化やアンチエイジング，さらには体内の健康を維持する貴重な成分の抽出に成功したものである。この独自の製法で得たエクソソームを含有する有効成分は，日本酒、味噌の他，他の飲料，食品，化粧品，及び医薬品などのあらゆる形態の健康維持のための製品に応用することが可能である。

獺祭の酒母ともろみを１５，０００×ｇ，４℃で１５分間遠心した結果を示す写真である。この上清をエクソソーム抽出のために使用した。 得られた酒母（Ａ）ともろみ（Ｂ）由来のエクソソーム画分について，ナノ粒子解析システムＮａｎｏＳｉｇｈｔ（解析条件：Ｃａｍｅｒａ Ｌｅｖｅｌ １４，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ７）にて粒子数の測定を行った結果を示すグラフである。酒母由来のエクソソームにおいては９５ｎｍ，もろみ由来のエクソソームにおいては１０９ｎｍに粒子径のピークが認められた。 ＨＣＴ１１６細胞に各エクソソームを０．５，１，及び２μｇ／ｍＬの濃度で添加後の，細胞増殖抑制及びアポトーシスについて評価した結果を示すグラフである。アポトーシスは，カスパーゼ活性の測定結果を示す。また， 大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６，肺がん細胞株Ａ５４９，乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１，及び前立腺がん細胞株ＰＣ－３Ｍについて増殖抑制試験の結果を表すグラフである。縦軸はコントロール（エクソソーム添加なし）の値を１とした場合の相対値を表す。 大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６，肺がん細胞株Ａ５４９，乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１，及び前立腺がん細胞株ＰＣ－３Ｍ）についてアポトーシス誘導能試験の結果を表すグラフである。縦軸はコントロール（エクソソーム添加なし）の値を１とした場合の相対値を表す。 遊走性試験の結果を表す写真である。中心の線状に白い部分が傷をつけた部分である。 図６に示す遊走性試験の結果をグラフで表す。縦軸はコントロール（ＰＢＳ）の値を１とした場合の相対値を表す。 エクソソームを添加した際の，ＮＫ細胞内のグランザイムの発現量を示す。上図は各タンパク質の発現量を示すウェスタンブロッティングの写真である。下図はウェスタンブロッティングによる発現量を定量化したグラフを示す。 ＮＫ細胞によるインターフェロンガンマ，インターロイキン１７，ＴＮＦアルファの３種類のサイトカインの分泌量に対するエクソソームの作用を評価した結果を表すグラフである。 エクソソームの老化抑制能を測定するため，ベータガラクトシダーゼ染色を行った結果を示す写真である。細胞が緑色に染色されているのは細胞が老化していることを示す。 皮下のコラーゲンとして重要なＩ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲン，及びエラスチンの発現量に対するエクソソームの作用を評価した結果を示すグラフである。各群（左から順に，Ｃｏｎｔｒｏｌ（未添加），ＥｔＯＨ，もろみ３μｌ，もろみ１０μｌ，もろみ３０μｌ，酒母３μｌ，酒母１０μｌ，酒母３０μｌ）において示された棒グラフは，左から順に，Ｉ型コラーゲンα１鎖，Ｉ型コラーゲンα２鎖，ＩＩＩ型コラーゲン，及びエラスチンの結果を表す。縦軸はコントロールの値を１とした場合の相対値を表す。 エクソソームを添加した際の，ＮＫ細胞内のグランザイムの発現量を示す（ｎ＝３）。ウェスタンブロッティングによる発現量を定量化し、平均値で表した。 Ｉ型コラーゲン及びエラスチンの発現量に対するエクソソームの作用を評価した結果を示すグラフである。各群（左から順に，非熟成，１年熟成，速醸，３年熟成）において示された棒グラフは，左側がＩ型コラーゲン、右側がエラスチンの結果を表す。縦軸はコントロールの値を１とした場合の相対値を表す。

１．酒母及びもろみ、又は味噌由来のエクソソームの調製
酒母は，日本酒の醸造のために，蒸米・麹・水の混合物に酵母加えた培養したものである。酒母の酵母の発酵が進み，蒸米・麹・水を何回かにわけて，加えたものがもろみである。酒母ももろみも，日本酒製造の業界では通常利用されており，その製造方法も広く知られている。特に，獺祭に使用されている酒母ともろみは旭酒造株式会社（山口県岩国市周東町獺越２１６７－４）より入手可能である。酒母及びもろみからのエクソソームの抽出は，例えば，（ａ）日本酒の酒母又はもろみを遠心すること；（ｂ）前記（ａ）により得られた上清を超遠心で遠心すること；及び（ｃ）前記（ｂ）で得られた沈殿物をエクソソーム画分として回収することにより行うことができる。

味噌は大豆に米こうじと塩を混ぜて発酵させたものである。「非熟成味噌」は、熟成加工をしていない味噌を指し、「熟成味噌」は、天然の酵母や乳酸菌が自然発酵する力を利用して静置することにより熟成させた天然醸造によって造られた味噌をいう。熟成味噌は熟成期間に応じて、１年熟成味噌、３年熟成味噌などと呼ばれる。「速熟味噌」は、人工的に一定の温度下に置き加熱処理することで、麹（こうじ）の働きを活発にして強制的に発酵させ、短期間で作り上げた味噌を言い、例えば１ヶ月で熟成した速熟味噌などがある。本明細書における味噌として好ましくは、熟成味噌であり、例えば、１～３年熟成した味噌が挙げられるが、好ましくは１年以上熟成した味噌であり、より好ましくは３年以上熟成した味噌である。味噌からのエクソソームの抽出は，例えば，（ａ）味噌又は味噌を懸濁液（例えば、味噌を水で溶いたもの）を遠心すること；（ｂ）前記（ａ）により得られた上清を超遠心で遠心すること；及び（ｃ）前記（ｂ）で得られた沈殿物をエクソソーム画分として回収することにより行うことができる。

ステップ（ａ）における遠心は，１０，０００～２０，０００×ｇ，１０，０００～１５，０００×ｇ，１２，０００～１７，０００×ｇ，又は１５，０００×ｇで行うことができる。また，ステップ（ａ）の遠心は，例えば，５分以上，１０分以上，又は１５分以上行うことができる。また，ステップ（ａ）における遠心は，４℃～室温で行うことができる。ステップ（ａ）により得られた上清をエクソソームの回収に用いる。この上清は，必要に応じてフィルターろ過（例えば，０．６５μｍフィルターによるろ過）することにより，更に残渣を除くことができる。フィルター濾過は必要に応じて２段階で行うことができる。

ステップ（ｂ）における超遠心は，７０，０００～１００，０００×ｇ，１０，０００～２１０，０００×ｇ，５０，０００～２００，０００×ｇ，１００，０００～２１０，０００×ｇで行うことができる。ステップ（ｂ）の超遠心は，例えば，５０分以上，６０分以上，又は７０分以上，例えば，６０分間～４時間行うことができる。また，ステップ（ｂ）における超遠心は，４℃～室温で行うことができる。ステップ（ｂ）により得られた沈殿物をエクソソームとして回収することにより，酒母又はもろみ由来のエクソソームを得ることができる（ステップＣ）。回収したエクソソームは必要に応じて，ＰＢＳ等で洗浄することができる。洗浄は沈殿物をＰＢＳに懸濁後，１００，０００～２１０，０００×ｇで遠心して上清を除去することにより行うことができる。遠心の条件は，ステップ（ｂ）の遠心に準じて設定することができる。

得られたエクソソーム画分にエクソソームが含まれているか否かは，例えば，本願実施例の記載に準じてナノ粒子解析システムＮａｎｏＳｉｇｈｔを用いて粒子数を測定や，含有タンパク質量を測定することにより確認することができる。

あるいは，その他の方法を用いてエクソソームを主成分とする分画を取得することもでき，このような他の条件で分離濃縮した場エクソソームも本発明のエクソソームに含まれる。例えば，Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）などを用いて抽出することもできる。限外濾過，ペレッティング。

よって，一態様において，本発明は日本酒の酒母又はもろみから抽出されたエクソソームに関する。本発明のエクソソームは，好ましくは，上述の方法により得られるエクソソームである。エクソソームは，細胞から分泌される脂質二重膜に囲まれた直径３０～２００ｎｍの膜小胞体であり，通常，ｍＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ等の核酸やタンパク質等を内包している。本発明のエクソソームの平均粒子径として好ましくは、８０～２００ｎｍ、１００～１８０ｎｍ、１１０～１６０ｎｍ、又は１１８ｎｍとである。また、本発明のエクソソームのピーク径として好ましくは、７０～１４０ｎｍ、８０～１３０ｎｍ、９０～１２０ｎｍ、又は９５ｎｍとすることができる。

２．エクソソームを含有する組成物
別の態様において，本発明は前記エクソソームを含有する組成物に関する。本発明の組成物におけるエクソソームの含有量は，当該組成物の使用目的が達成できる濃度であれば特に限定されるものではないが，例えば，１質量％以上，２質量％以上，３質量％以上，４質量％以上，５質量％以上，１０質量％以上，２０質量％以上，３０質量％以上，４０質量％以上，又は５０質量％以上とすることができる。また、本発明の組成物が含有するエクソソームの量は、４×１０⁸個／ｍｌ以上，５×１０⁸個／ｍｌ以上，１×１０⁹個／ｍｌ以上，１×１０¹⁰個／ｍｌ以上，１×１０¹¹個／ｍｌ以上、又は１×１０¹²個／ｍｌ以上とすることができる。あるいは、本発明の組成物が含有するエクソソームの量は、エクソソームが含有するタンパク質量として３３ｎｇ／ｍｌ以上、５０ｎｇ／ｍｌ以上、１００ｎｇ／ｍｌ以上、５００ｎｇ／ｍｌ以上、１μｇ／ｍｌ以上、５μｇ／ｍｌ以上、１０μｇ／ｍｌ以上、５００μｇ／ｍｌ以上、１ｍｇ／ｍｌ以上、５ｍｇ／ｍｌ以上、１０ｍｇ／ｍｌ以上、５０ｍｇ／ｍｌ以上、１００ｍｇ／ｍｌ以上、５００ｍｇ／ｍｌ以上、１ｇ／ｍｌ以上、５ｇ／ｍｌ以とすることができる。

当該組成物におけるエクソソーム以外の成分は，使用の目的に応じて適宜選択することができ，例えば，食品，食品添加物，化粧品原料，化粧品添加物，医薬品添加物などを含有することができる。このようなエクソソーム組成物は，例えば，食品（健康食品や栄養剤を含む），化粧品，又は医薬品とすることができ，これらの原料としてその製造過程において適宜添加することにより製造することができる。よって、本発明の対象には、本発明のエクソソームを添加した食品や化粧品（エクソソームが由来する酒母、もろみ、及び／又は味噌のみが添加された食品や化粧品を除く）が含まれる。

本発明の組成物の形状は特に制限されるものではなく，利用形態に応じて適宜選択することができる。例えば，粉末状，粒状，顆粒状，錠状，棒状，板状，液状，飴状，ペースト状，クリーム状，ハードカプセルやソフトカプセルのようなカプセル状，カプレット状，タブレット状，ゲル状，ゼリー状，及びクリーム状などの形態を挙げることができる。

本発明のエクソソームはがん細胞増殖抑制作用を有することから，前記エクソソームを含有する組成物は，がん細胞増殖抑制用組成物とすることができる。本明細書において，「がん」は，上皮性悪性腫瘍，脊髄由来の造血器悪性腫瘍などが含み，具体的には，リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫など），多発性骨髄腫等の造血細胞悪性腫瘍；卵巣がん；乳がん；乳腺がん；子宮体がん，子宮頚がんなどの子宮がん；子宮内膜がん；非粘液性卵巣がんなどの卵巣がん；食道がん；胃がん；虫垂がん；大腸がん，直腸がん，結腸がんなどの大腸がん；肝細胞がんなどの肝がん；胆嚢がん；胆管がん；膵臓がん；副腎がん；消化管間質腫瘍；胸膜中皮腫などの中皮腫；喉頭がん，咽喉がん，口腔がん（口腔底がん，歯肉がん，舌がん，頬粘膜がんなど）等の頭頚部がん；上衣腫などの脳がん；唾液腺がん；副鼻腔がん（上顎洞がん，前頭洞がん，篩骨洞がん，蝶型骨洞がんなど）；甲状腺がん；肺がん；肺腺がん；骨肉腫；前立腺がん；睾丸絨毛上皮がんなどの精巣腫瘍又は睾丸がん；腎細胞がんなどの腎臓がん；膀胱がん；横紋筋肉腫などの肉腫；皮膚がん；肛門がん；あるいは，慢性骨髄性白血病および急性骨髄性白血病などの血液のがん，又はその転移がんを含む。好ましくは，がんは，大腸がん，前立腺がん，又は乳がんである。

また，本発明のエクソソームはＮＫ細胞によるグランザイム発現を促進させる作用を有することから前記エクソソームを含有する組成物は，ＮＫ細胞によるグランザイム発現促進用とすることができる。グランザイムは，ＮＫ細胞による細胞傷害活性の中心的な役割を果たすセリンプロテアーゼである。よって，本発明のＮＫ細胞によるグランザイム発現促進用組成物は，ＮＫ細胞によるがん細胞への障害能を利用したがんの治療用又は予防用医薬組成物として利用できる他，ウイルスもしくは細菌感染，または炎症性疾患の治療用組成物として利用することができる。

更に，本発明のエクソソームには，コラーゲン及び／又はエラスチン産生促進作用が確認された。よって，前記エクソソームを含有する組成物は，コラーゲン及び／又はエラスチン産生促進用とすることができる。コラーゲン及びエラスチンなどの繊維成分は，肌や血管などの組織の弾力性に重要な役割を果たすことが知られている。よって，前記コラーゲン及び／又はエラスチン産生促進用組成物は，組織の弾力性喪失を予防し又は組織の弾力性を向上させるための組成物として利用することができる。特に，組織が皮膚である場合には，前記組成物は化粧用としても利用することができる。より具体的には，老化皮膚の外観の改善用，たるみ及び/又はシワ若しくは小ジワの低減用とすることができる。当該化粧用組成物は肌に塗布するものであってもよいし，経口で体内に摂取するものであってもよい。

本発明の組成物の使用量又は投与量，及び使用方法又は投与方法は，組成物の形態や目的に応じて適宜設定することができる。例えば，食品として摂取する場合，大人が１日数回，１回につき０．０１ｍｇ～１００ｇを摂取することができる。

以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが，本発明はこれのみに限定されるものではない。また，本明細書において引用される文献は全て参照により本明細書に組み込まれる。

旭酒造株式会社の獺祭に使用されている酒母ともろみから回収したエクソソームについて，がん細胞，免疫細胞，及び老化細胞に対する影響を評価する目的で，以下の実験を行った。

（実施例１）評価用エキソソームサンプルの調製
（１）獺祭の酒母ともろみ（旭酒造株式会社）を１５，０００×ｇ，４℃で１５分間遠心後，その上澄み液を０．６５μｍフィルターでろ過した（図１）。ろ過後の上澄み液をベックマンコールター社の超遠心機及びＳＷ４１Ｔｉローターを用いて，３５，０００ｒｐｍ（１００，０００×ｇ－２１０，０００×ｇ），４℃で７０分間超遠心した。遠心後，上澄みを破棄し，洗浄のため，沈殿物をＰＢＳに懸濁後，再度同じ条件で超遠心を行った。サンプル洗浄後，チューブ底面に残ったエクソソーム画分を低吸着チューブに回収した。超遠心後の上澄み液の量は酒母が８８ｍＬ，もろみは１７６ｍＬであった。酒母及びもろみの沈殿物は，最終的に，それぞれ１７０μＬ及び３４０μＬのＰＢＳに懸濁した。

（２）非熟成味噌は、熟成加工をしていない、一般的な味噌を使用した。１年～３年熟成味噌は、人工的に加熱することなく、天然の酵母や乳酸菌が自然発酵する力を利用して１～３年自然に桶のなかで熟成を待つことにより調製した天然醸造によって造られた味噌を使用した。速熟味噌は、人工的に一定の温度下に置き加熱処理することで、麹（こうじ）の働きを活発にし強制的に発酵させ、短期間で味噌を作り上げる速醸法で１ヶ月で熟成したものを使用した。これらの味噌を１５，０００×ｇ，４℃で１５分間遠心後，その上澄み液を０．６５μｍフィルターでろ過した（図１）。ろ過後の上澄み液をベックマンコールター社の超遠心機及びＳＷ４１Ｔｉローターを用いて，３５，０００ｒｐｍ（１００，０００×ｇ－２１０，０００×ｇ），４℃で７０分間超遠心した。遠心後，上澄みを破棄し，洗浄のため，沈殿物をＰＢＳに懸濁後，再度同じ条件で超遠心を行った。サンプル洗浄後，チューブ底面に残ったエクソソーム画分を低吸着チューブに回収して使用した。

（実施例２）調製したエクソソームの粒子濃度とタンパク質濃度の測定
（１）獺祭の酒母ともろみから回収したエクソソームを，酒母由来エクソソームはＰＢＳで１００倍希釈し，もろみ由来エクソソームはＰＢＳで４０倍に希釈した。それぞれの希釈溶液をナノ粒子解析システムＮａｎｏＳｉｇｈｔ（解析条件：Ｃａｍｅｒａ Ｌｅｖｅｌ １４，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ７）にて粒子数の測定を行った。タンパク質濃度については，エクソソーム溶液２０μＬ使用してＱｕｂｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてタンパク定量を行った。

獺祭の酒母ともろみから回収したエクソソームをナノ粒子解析システムを用いた粒子数とタンパク質濃度を以下の表１に示す。また，ナノ粒子解析システムで得られた粒子の粒度分布図を図２に示す。酒母ともろみが含有するエクソソームの量は，酒母が３．８×１０⁸個／ｍｌ，もろみが０．３７×１０⁸個／ｍｌであった。また，酒母ともろみが含有するエクソソームのたんぱく質濃度は，酒母が３２．１ｎｇ／ｍｌ，もろみが１８．１ｎｇ／ｍｌであった。

（２）それぞれの味噌から回収したエクソソーム１gを生理的食塩水で溶解後、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（解析条件：Ｃａｍｅｒａ Ｌｅｖｅｌ １４，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ７）にて粒子数の測定を行った。

測定の結果、非熟成味噌の粒子数は１．２×１０¹⁰個／ｍｌ、１年熟成味噌は４．７×１０¹¹個／ｍｌ、３年熟成味噌は７．８×１０¹²個／ｍｌ、速熟味噌は２．５×１０¹⁰個／ｍｌであった。

（実施例３）ＨＣＴ１１６細胞における増殖試験及び細胞死試験
ＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸腺癌由来癌細胞）を９６ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに２，０００細胞ずつ播種して，翌日，実施例１で調製したエクソソームを０．５，１，及び２μｇ／ｍＬの濃度で添加した。その３日後に細胞増殖試験を行い，細胞増殖の評価を行った。

アポトーシスによる細胞死は，ｃａｓｐａｓｅ活性を測定することにより評価した。細胞増殖試験が終わった（３）の細胞から培地を除去し，Ｍ－ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１００μｌ加えて細胞を溶解して細胞溶解液を得た。５０μｌの細胞溶解液と５０μｌのＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ社）の溶液を混合して，発光によりｃａｓｐａｓｅ活性を測定した。

図３に示すとおり，もろみ，並びに酒母由来のエクソソームを０．５，１，２μｇ／ｍＬの濃度で大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６に加えたところ，コントロール（ＰＢＳ）と比較して，もろみでは０．５μｇ／ｍＬ以上で，酒母では１μｇ／ｍＬ以上で増殖抑制活性が見られた。しかしアポトーシスに関して，コントロールと比較して優位な差は見られなかったことから，大腸がん細胞株における酒母，もろみ由来のエクソソームの効果は細胞増殖抑制活性であると考えられた。

（実施例４）多様な癌細胞種における増殖試験及び細胞死試験
結腸癌以外の癌細胞においても同様の効果があるか確かめるため，エクソソーム濃度を２μｇ／ｍＬとした以外は実施例３と同様の方法でより多くのがん細胞種（大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６，肺がん細胞株Ａ５４９，乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１，及び前立腺がん細胞株ＰＣ－３Ｍ）について増殖抑制試験及びアポトーシス誘導能試験を行った。

図４に示すとおり，実施例２と同様に大腸がん細胞株において，増殖抑制効果が再現された。また，大腸がんと同等の効果が，前立腺がん細胞株及び乳がん細胞株においても認められ，肺がんにおいても比較的弱いながらも増殖抑制効果が認められた。

アポトーシス測定の結果を図５に示す。ＰＢＳと比較した相対量で評価した結果，全ての細胞株で顕著なアポトーシス誘導は見られなかった。そのため，図４で見られた細胞増殖抑制効果についても，細胞死誘導によるものではなく，細胞増殖を抑制することによることが再確認された。

（実施例５）がん細胞における遊走性試験
ＨＣＴ１１６細胞を２４ｗｅｌｌプレートに播種し，翌日，プレート内に傷を付け，一部空間を作った。傷をつけた日をＤａｙ０として，Ｄａｙ０，Ｄａｙ１，Ｄａｙ２に細胞を撮影し，傷を付けた部分が細胞の遊走により，どれだけ狭まったのかを評価した。

遊走性試験の結果を図６（写真）及び図７（グラフ）に示す。遊走能に関しては，もろみと酒母で阻害する傾向は見られたが，顕著な抑制効果は見られなかった。

酒母ともろみからそれぞれエクソソーム画分を単離することに成功した。がん細胞における，増殖抑制能及び細胞死誘導能を評価した結果，前立腺がん，大腸がん，及び乳がん細胞株において，増殖抑制作用が，肺がん細胞株において弱い増殖抑制作用が認められた。これらの細胞株への細胞死を誘導していないことが確認されたことから，酒母ともろみ由来のエクソソームは，がん細胞を死に至らしめずに，細胞の増殖だけを抑制する効果を持つことがわかった。また癌細胞の遊走能に関しては，阻害する傾向は見られたものの，顕著な変化は認められなかった。以上より，酒母ともろみ由来のエクソソームはがん細胞の増殖を抑制する効果が認められたが，この効果は抗がん剤のように細胞死を誘導するほどの強い効果ではなく，穏やかにがん細胞の増殖を止める効果であると考察された。

（実施例６）免疫細胞におけるグランザイムの発現解析
（１）長期間培養可能なＮＫ細胞であるＮＫ－９２ＭＩ細胞を２４ｗｅｌｌプレートに２５，００００細胞ずつ播種し，実施例１で調製したエクソソームを３，１０，又は３０μ／Ｌ（味噌エクソソームの場合、細胞あたりおよそ１００個、すなわち１ウエルあたり２ｘ１０⁷個の粒子）となるように添加した。その２日後に細胞を回収し，タンパク質抽出を行い，ウェスタンブロッティング法によりタンパク質の発現量を測定した。

（２）酒母エクソソームの結果
図８に示すとおり，酒母エクソソームを添加することにより，ＮＫ細胞内のグランザイムの発現量の増加が見られた。図８の上図はタンパク質の発現量を評価するウェスタンブロッティングの写真で，下図はその発現量を定量化したものである。以上のことから，酒母エクソソームはＮＫ細胞内のグランザイムの発現を上げることで殺細胞効果に貢献すると考えられる。もろみエクソソームに関しては，グランザイムの発現量に大きな変化は見られなかった。

（３）味噌エクソソームの結果
図１２に示すとおり，１年及び３年熟成味噌のエクソソームを添加することにより，ＮＫ細胞内のグランザイムの発現量の増加が見られた。よって，１年以上熟成した味噌のエクソソームはＮＫ細胞内のグランザイムの発現を上げることで殺細胞効果に貢献すると考えられる。

（実施例７）免疫細胞におけるサイトカインの分泌測定
ＮＫ細胞のサイトカイン分泌として主要なインターフェロンガンマ，インターロイキン１７，ＴＮＦアルファの３種類のサイトカインの分泌量を評価した。ＮＫ－９２ＭＩ細胞を２４ｗｅｌｌプレートに２５，００００細胞ずつ播種し，３，１０，又は３０μ／Ｌとなるようにエクソソームを添加した。その２日後に培養上清を回収し，３００ｇで３分間遠心して上清を回収した。上清中のインターフェロンガンマ，インターロイキン１７，ＴＮＦアルファの測定はＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。

結果を図９に示す。いずれのサイトカインにおいても大きな分泌量の上昇は見られなかったが，酒母エクソソームにおいてインターフェロンガンマの分泌量が減少していた。

（実施例８）老化細胞におけるベータガラクトシダーゼ染色
老化細胞の評価方法としてベータガラクトシダーゼ染色を行った。ベータガラクトシダーゼ染色は高感度であることが知られているＳＰｉＤＥＲ－βＧａｌ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いた。具体的には，３，１０，又は３０μ／Ｌとなるようにエクソソームを加えた線維芽細胞（Ｐ８）を６０ｍｍディッシュに２×１０⁵細胞／ディッシュとなるように播種し，二回継代し，細胞を老化させた。細胞を継代するごとに３，１０，又は３０μ／Ｌとなるようにエクソソームを加えた。その後，老化させた線維芽細胞（Ｐ１０）を３５ｍｍガラスベースディッシュに播種した。翌日，培地を吸引除去し，ＨＢＳＳ ２ｍｌで１回洗浄した。培養開始から７２時間後に４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液２ｍｌを添加し，室温で３分間固定化した。４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液２ｍｌを吸引除去し，ＨＢＳＳ ２ｍｌで２回洗浄を行った。ＳＰｉＤＥＲ－βＧａｌ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２ｍｌ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を加え，３７℃で３０分間静置した。その後，ＨＢＳＳ ２ｍｌで２回洗浄を行い，共焦点レーザー顕微鏡で観察した。

結果を図１０に示す。コントロール及びエクソソーム添加細胞のいずれの細胞においても細胞が緑色に染色されたことから，もろみ及び酒母由来のエクソソームは細胞の老化を止めることができなかったことが示された。

（実施例９）老化細胞におけるコラゲナーゼ，エラスチンの発現量の測定
（１）老化線維芽細胞で活性が減少しているコラーゲンとエラスチンの発現量のエクソソーム添加による変化を評価した。老化させた線維芽細胞（Ｐ１０）を２４ｗｅｌｌプレートに１００，０００細胞播種し，翌日３，１０，又は３０μ／Ｌ（味噌エクソソームの場合、細胞あたりおよそ１００個、すなわち１ウエルあたり２ｘ１０⁷個の粒子）となるようにエクソソームを添加し，その２日後にＱｉａｇｅｎ ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ
ｋｉｔを用いてＲＮＡ抽出を行った。抽出されたＲＮＡをサンプルとして，Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。定量的ＰＣＲのためにＴａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の）を使用した。コラゲナーゼとエラスチンの検出用のプライマー／プローブとして，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＴａｑｍａｎ法を用いて評価した。Ｉ型コラーゲンアルファ１鎖，Ｉ型コラーゲンアルファ２鎖，ＩＩＩ型コラーゲン，エラスチンのプライマー／プローブを使用した。

（２）酒母・もろみエクソソームの結果
皮下のコラーゲンとして重要なＩ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲン，そしてエラスチンの発現量の評価を行った。その結果を図１１に示す。酒母エクソソームを加えることでＩ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンそしてエラスチンの発現量が全て上昇することがわかった。一方，もろみエクソソームを添加した場合，これらの物質の発現量に変化は見られなかった。

（３）味噌エクソソームの結果
Ｉ型コラーゲンとエラスチンの発現量の評価を行った。その結果を図１３に示す。味噌エクソソームを加えることでＩ型コラーゲンとエラスチンの発現量が全て上昇することがわかった。特に、３年熟成エクソソームを添加した場合，これらの物質の発現量が顕著に高くなった。

以上、酒母ともろみ及び味噌からエクソソーム画分を単離し，免疫細胞と老化細胞における機能を評価した。免疫細胞に関してはがん細胞の殺細胞効果を持つＮＫ細胞に注目した。その結果，酒母エクソソームの添加により，殺細胞効果を持つことが知られているグランザイムの細胞内にける量が増加したことがわかった。この結果は，ＮＫ細胞が，がん細胞を攻撃する際により効果的に多くのがん細胞を殺すことを示唆している。一方，他の免疫細胞を呼び込むサイトカインの分泌に関しては大きな変化は見られなかった。酒母エクソソームにおけるインターフェロンガンマの分泌量が減っているが，これはグランザイムの発現量と逆相関していることからも，ＮＫ細胞が殺細胞活性を高めている段階であると考えることができる。

一方，線維芽細胞における老化の評価に関しては，酒母エクソソーム，もろみエクソソームともに線維芽細胞の老化を食い止めることができなかった。一方，酒母エクソソームの添加により老化した線維芽細胞におけるコラーゲンの産生とエラスチンの産生が高まったことから，皮膚の老化により減少するコラーゲンとエラスチンの産生を高める働きがあることが示唆された。

以上により，酵母（酒母、もろみ、味噌）由来のエクソソームはＮＫ細胞の殺細胞効果をグランザイムの発現量を増やすことにより高めることがわかった。また老化細胞に関しては，コラーゲンとエラスチンの発現量を高めることから，皮膚における弾力性低下の防止及び弾力性の向上に貢献できると考察される。

Claims (18)

1. 日本酒の酒母又はもろみに含まれる酵母から抽出されたエクソソームを含有するがん細胞増殖抑制用組成物。
2. タンパク質量として５００ｎｇ／ｍｌ以上の前記エクソソームを含有する，請求項１に記載の組成物。
3. タンパク質量として１μｇ／ｍｌ以上の前記エクソソームを含有する，請求項１に記載の組成物。
4. １年以上熟成された味噌に含まれる酵母から抽出されたエクソソームを含有する，がん細胞増殖抑制用組成物。
5. ３年以上熟成された味噌に含まれる酵母から抽出されたエクソソームを含有する，請求項４に記載の組成物。
6. 味噌に含まれる酵母から抽出されたエクソソームを４．７×１０ ^１１ 個／ｍｌ以上含有する請求項４又は請求項５に記載の組成物。
7. 味噌に含まれる酵母から抽出されたエクソソームを７．８×１０ ^１２ 個／ｍｌ以上含有する請求項４又は請求項５に記載の組成物。
8. がんが，大腸がん，前立腺がん，又は乳がんである，請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 日本酒の酒母又はもろみに含まれる酵母から抽出されたエクソソームを含有する，ＮＫ細胞によるグランザイム発現促進剤。
10. １年以上熟成された味噌に含まれる酵母から抽出されたエクソソームを含有する，ＮＫ細胞によるグランザイム発現促進剤。
11. ３年以上熟成された味噌に含まれる酵母から抽出されたエクソソームを含有する，請求項１０に記載のグランザイム発現促進剤。
12. ＮＫ細胞１個あたりおよそ１００個の前記エクソソームを接触させるように含有する，請求項９～請求項１１のいずれか１項に記載のグランザイム発現促進剤。
13. 日本酒の酒母又はもろみに含まれる酵母から抽出されたエクソソームを含有する，繊維芽細胞によるコラーゲン及び／又はエラスチン産生促進剤。
14. ３年以上熟成された味噌に含まれる酵母から抽出されたエクソソームを含有する，コラーゲン及び／又はエラスチン産生促進剤。
15. 繊維芽細胞１個あたりおよそ１００個の前記エクソソームを接触させるように含有する，請求項１３又は請求項１４に記載のコラーゲン及び／又はエラスチン産生促進剤。
16. 繊維芽細胞が老化した繊維芽細胞である，請求項１３～請求項１５のいずれか一項に記載のコラーゲン及び／又はエラスチン産生促進剤。
17. 化粧用である，請求項１３～請求項１６のいずれか１項に記載のコラーゲン及び／又はエラスチン産生促進剤。
18. エクソソームが以下の製造方法で製造されたことを特徴とする，請求項１～請求項１７のいずれか１項に記載のがん細胞増殖抑制用組成物，ＮＫ細胞によるグランザイム発現促進剤，又はコラーゲン及び／又はエラスチン産生促進剤：
    （ａ）日本酒の酒母若しくはもろみ又は味噌を１０，０００～２０，０００×ｇで遠心すること，
    （ｂ）前記（ａ）により得られた上清を１０，０００～２１０，０００×ｇで超遠心すること，及び
    （ｃ）沈殿物をエクソソーム画分として回収することを含む方法。

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