KR20110121072A - 인체 내 암세포주에 대한 증식억제활성으로 피부암, 폐암, 자궁암 및 위암에 대해 항암효과를 갖는 조성물의 개발 - Google Patents
인체 내 암세포주에 대한 증식억제활성으로 피부암, 폐암, 자궁암 및 위암에 대해 항암효과를 갖는 조성물의 개발 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 본 발명은 홍삼추출물, 영지자실체추출물, 케르세틴, 대두추출물, 초유단백, 카테킨 성분을 함유하는 녹차추출물 및 상기의 원료들이 체내에서 이용되는데 유용하게 사용될 수 있는 원료를 혼합하여 면역을 증진시킴으로써 암세포주에 대한 증식억제 및 항암효과 활성을 가지는 항암효과조성물에 관한 것으로서 항암 및 면역강화에 탁월한 효과를 가지는 조성물에 대한 것이다.
Description
본 발명은 홍삼추출물, 영지자실체추출물, 케르세틴, 대두추출물, 초유단백, 카테킨 성분을 함유하는 녹차추출물 및 상기의 원료들이 체내에서 이용되는데 유용하게 사용될 수 있는 원료를 혼합하여 면역을 증진시킴으로써 암세포주에 대한 증식억제 및 항암효과 활성을 가지는 항암효과조성물을 제공한다.
면역기능의 저하는 외부로부터의 항원에 대한 처리기능의 저하로 인해 생체의 균형을 유지하는 항상성을 깨뜨리면서 악성종양을 비롯한 다양한 질병의 원인이 된다고 알려져 있다. 특히, 나이가 들수록 이러한 현상의 심각성은 한층 두드러지게 나타나 다가오는 고령화 사회에 많은 문제점을 제시하고 있다. 생체의 면역응답에 대한 능력은 노화(aging)되어 갈수록 저하되어 간다는 것은 잘 알려져 있다. 또한 나이가 들수록 암에 걸릴 확률도 점차로 높아지며 특히 간장 및 호흡기 계통의 암의 발생 빈도가 크게 증가하고 있다고 보고되고 있다.
암은 발견 시 이미 병이 진행되어서 수술로 완치가 불가능한 경우가 많으며, 이러한 경우 항암제 치료나 방사선 치료 등을 시도하지만 그 효과가 좋지 않고 부작용 또한 적지 않아 만족할 만한 치료법이 되지 못하고 있다. 따라서 항암제와 함께 사용되어 항암제의 부작용을 줄이거나 항암효과를 증가시켜 치료효과를 높이고 생물학적 반응을 조절할 수 있는 보조약제에 대한 연구가 필요하다.
홍삼의 가장 두드러진 효과 중 하나가 항암효과로 이것은 전 세계적으로 수많은 연구가에 의하여 현대 과학적으로 명확히 입증되어 있다. 홍삼은 암세포의 성장을 억제하고, 암세포의 자살(apoptosis)을 유도하며, 암의 발생을 예방해 주는 효과가 있다. 광범위한 역학조사 결과 인삼을 복용한 사람은 복용하지 않은 사람보다 암에 걸리는 확률이 훨씬 낮다는 것이 밝혀졌다. 특히 홍삼에만 있는 홍삼 특이성분의 약효가 강하게 작용하는 것으로 밝혀졌다.
영지버섯은 콜레스테롤 제거, 혈전방지, 간염치료, 항암, 항발암, 혈당감소, 원기회복 등과 같은 다양한 효과를 가진 것으로 밝혀져 있다. 영지의 생리활성 물질로는 고미성분, 스테로이드류, 핵산류, 글리칸류, 게르마늄, 렉틴, 항트롬빈 성분 등이 있다. 영지다당류의 강한 항암활성은 베타글루칸 단백복합체이며, 독성이 없는 새로운 항암제로서 사용가능성이 매우 높다. 베타글루칸은 암세포를 직접 공격하기보다는 비특이적 면역반응으로 대식세포, 자연살해세포, T세포 등 면역세포의 면역기능을 활성화시켜 암세포의 증식을 억제한다.
케르세틴은 식물에서 발견되는 바이오플라보노이드의 일종으로 세포들을 손상시키는 활성산소의 활동을 차단하는 효과가 있으며, 비타민C보다 항암효과가 뛰어나 암을 예방하는 물질로 각광받고 있다.
대두추출물(이소플라본)은 식물체 속에 들어있는 파이토케미컬이라는 식물성 화합물로 골다공증 예방, 심혈관계 질환 예방효과가 있으며 특히 호르몬 의존성 암인 유방암, 대장암, 전립선암, 자궁암 등을 예방하는데 탁월한 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
초유는 분만 후 수일 동안만 분비되는 젖으로 갓 태어난 동물의 새끼가 성장하는데 필요한 모든 영양분이 들어있는 물질이다. 약한 새끼가 건강을 유지할 수 있도록 강력한 면역물질인 면역글로불린, IgA, IgG, IgM, 락토페린 등을 함유하고 있으며 부작용이 전혀 없어 건강식품으로 주목을 받고 있다.
녹차추출물(카테킨)은 해독, 살균 등의 효능이 있으며, 발암성분을 갖는 불안정한 단자와 결합하여 발암물질의 활성을 무력화시킴으로써 항암효과를 갖는다. 또한 백내장 및 아토피성 피부염, DNA손상을 통해 세포가 암을 일으키는 원인이 되는 활성산소를 제거하는데 탁월할 효과가 있다.
본 발명자는 상기에서 살펴본 물질들의 조성과 조성비에 대한 연구를 거듭한 결과, 면역강화 및 항암효과를 지닌 본 발명의 조성물을 개발하기에 이르렀다.
본 발명은 강력한 면역강화 및 항암효과를 지닌 사포닌, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rb1 등을 함유하고 있는 홍삼과, 암세포를 직접 공격하기보다는 비특이적 면역반응으로 대식세포, 자연살해세포, T세포 등 면역세포의 면역기능을 활성화시켜 암세포의 증식 억제를 위한 영지자실체추출물, 세포막을 안정시키고 면역기능을 강화하며 항산화효과를 가지는 케르세틴, 암세포의 증식을 억제하고 항산화효과를 가지는 대두추출물, 면역을 강화하고 항암치료에 수반되는 내장점막손상 완화에 효과적인 초유단백, 암세포의 증식을 억제하고 노화예방, 체지방 감소효과를 가지는 녹차추출물(카테킨)을 혼합하여 암세포의 증식억제 및 항암효과를 촉진하는 고기능성 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 본 발명의 목적은 암세포주 증식억제 활성을 갖는 홍삼추출물, 항암효과를 증대시키기 위한 영지자실체추출물, 면역증강 효과를 증대시키는 케르세틴, 암세포 증식억제효과를 갖는 대두추출물, 면역강화 효과를 갖는 초유단백, 암세포주의 증식을 억제하는 녹차추출물을 포함하는 항암 및 면역 증강용 조성물을 제공함으로써 달성된다.
여기서, 상기 암세포주 증식억제 활성을 갖는 홍삼추출물(GinsenosideRg1, GinsenosideRb1)의 유효성분 함량은 10 내지 30 중량%, 상기 암세포주의 증식을 억제하고 면역력을 증가시키는 영지자실체추출물의 유효성분 함량은 5 내지 20 중량% 인 것이 바람직하다.
그리고, 상기 세포막을 안정시키고 면역기능을 강화시키는 케르세틴의 유효성분 함량은 0.01 내지 2.0 중량%, 상기 암세포 증식 억제효과를 가진 대두추출물의 유효성분 함량은 0.01 내지 2.0 중량% 인 것이 바람직하다.
또한, 상기 면역계통을 강화하는 초유단백의 유효성분 함량은 0.01 내지 2.0 중량%, 상기 암세포의 증식을 억제하고 노화방지, 체지방감소 효과를 가진 녹차추출물의 유효성분 함량은 0.01 내지 2.0 중량% 인 것이 바람직하다. 그리고, 상기 조성물들은 캡슐제, 액제, 분말제, 과립제, 환제를 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명은 홍삼추출물, 영지자실체추출물, 케르세틴, 대두추출물, 초유단백, 카테킨을 함유한 및 상기의 원료들이 체내에서 이용되는데 유용하게 사용될 수 있는 원료를 혼합하여 면역을 증진시킴으로써 암세포주에 대한 증식억제 및 항암효과 활성을 가지는 항암효과조성물을 제공한다.
도 1은 B 16 melanoma F 10을 접종한 마우스의 조성물 배합비별 평균종양무게를 나타낸 그래프이다.
도 2는 B 16 melanoma F 10을 접종한 마우스의 조성물 배합비별 종양저해율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 16 melanoma F 10을 접종한 마우스의 조성물 배합비별 폐로 전이된 콜로니 수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 HeLa cell에 이뮤노Q-10리퀴드로 처리된 조성물 배합비별 세포증식의 억제 효과 (in vitro)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 이뮤노Q-10리퀴드로 처리된 배양시간 별 FACS 분석의 caspase 활성세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 HeLa cell에 이뮤노Q-10리퀴드로 처리된 조성물 배합비별 caspase-3의 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 7는 HeLa cell에 이뮤노Q-10리퀴드로 처리된 조성물 배합비별 XTT활성도를 나타낸 그래프이다.
도 8는 HeLa cell에 이뮤노Q-10리퀴드로 처리된 조성물 배합비별 Kinase활성도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 SNC-1세포에 처리된 조성물 배합비별 세포증식능(%)를 나타낸 그래프이다.
도 2는 B 16 melanoma F 10을 접종한 마우스의 조성물 배합비별 종양저해율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 16 melanoma F 10을 접종한 마우스의 조성물 배합비별 폐로 전이된 콜로니 수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 HeLa cell에 이뮤노Q-10리퀴드로 처리된 조성물 배합비별 세포증식의 억제 효과 (in vitro)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 이뮤노Q-10리퀴드로 처리된 배양시간 별 FACS 분석의 caspase 활성세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 HeLa cell에 이뮤노Q-10리퀴드로 처리된 조성물 배합비별 caspase-3의 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 7는 HeLa cell에 이뮤노Q-10리퀴드로 처리된 조성물 배합비별 XTT활성도를 나타낸 그래프이다.
도 8는 HeLa cell에 이뮤노Q-10리퀴드로 처리된 조성물 배합비별 Kinase활성도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 SNC-1세포에 처리된 조성물 배합비별 세포증식능(%)를 나타낸 그래프이다.
상기 본 발명의 항암 및 면역 증강용 조성물은 암세포주 증식억제 활성을 갖는 홍삼추출물, 항암효과를 증대시키기 위한 영지자실체추출물, 면역증강 효과를 증대시키는 케르세틴, 암세포 증식억제효과를 갖는 대두추출물, 면역강화 효과를 갖는 초유단백, 암세포주의 증식을 억제하는 녹차추출물을 포함한다.
여기서, 상기 암세포주 증식억제 활성을 갖는 홍삼추출물(GinsenosideRg1, GinsenosideRb1)의 유효성분 함량은 10 내지 30 중량%이고, 상기 암세포주의 증식을 억제하고 면역력을 증가시키는 영지자실체추출물의 유효성분 함량은 5 내지 20 중량% 인 것이 바람직하다.
그리고, 상기 세포막을 안정시키고 면역기능을 강화시키는 케르세틴의 유효성분 함량은 0.01 내지 2.0 중량%, 상기 암세포 증식 억제효과를 가진 대두추출물의 유효성분 함량은 0.01 내지 2.0 중량% 인 것이 바람직하다.
또한, 상기 면역계통을 강화하는 초유단백의 유효성분 함량은 0.01 내지 2.0 중량%, 상기 암세포의 증식을 억제하고 노화방지, 체지방감소 효과를 가진 녹차추출물의 유효성분 함량은 0.01 내지 2.0 중량% 인 것이 바람직하다. 그리고, 상기 조성물들은 캡슐제, 액제, 분말제, 과립제, 환제를 제형으로 제조될 수 있다.
이하, 본 발명의 암세포의 증식억제 및 항암효과를 촉진하는 고기능성 조성물을 적정비율로 혼합하여 식품, 건강기능식품, 의약품 등으로 이용가능 여부를 확인하기 위한 구체적인 구현방법의 실시예를 아래의 단계별로 설명할 것인바, 본 발명의 권리범위가 이들 실시 예에 한정되는 것이 아님은 당연하다.
홍삼추출물,
영지자실체추출물
및 면역증강제의 혼합
본 실시예에서는 주원료인 홍삼추출물과 항암효과를 갖는 영지자실체추출물, 케르세틴, 대두추출물, 면역강화 효과를 가진 초유단백, 녹차추출물의 조성물을 표 1과 같이 제조한다.
| 원 료 | 성 분(%) |
| 홍삼추출물 | 64.03 |
| 영지자실체추출물 | 25.65 |
| 케르세틴 | 2.58 |
| 대두추출물(이소플라본30%) | 2.58 |
| 초유단백 | 2.58 |
| 녹차추출물 | 2.58 |
| Total | 100.00 |
피부암 및 폐암억제에 관한 동물실험
1. 실험재료 및 실험동물과 식이의 준비
사용된 동물은 생후 5주령의 수컷 C57BL/6Cr 마우스를 분양받아 실온 21℃, 습도 60±5%, 실내조명 12시간 주기의 실험조건에서 증류수와 마우스용 고형사료를 공급한다. 일주일간 적응시킨 후 6주령에 실험을 시작하였다. 각 실험군은 다음과 같이 일반사료를 투여한 군과, 본 발명의 조성물(Anti-Tumor 이하 AT)투여군으로 나누고, 각각 혼합 비율별로 대조군(Control D), D10(AT 10%), D20(AT 20%), D30(AT 30%), D40(AT 40%), D50(AT 50%), 면역제품인 이뮤노Q-10리퀴드(이하 IQ, SH 제약)만을 투여한 대조군(Control I)과, 이뮤노Q-10리퀴드와 본 발명의 조성물을 농도별로 투여한 투여군인 I10(AT 10%), I20(AT 20%), I30(AT 30%), I40(AT 40%), I50(AT 50%)로 나누어 실험하였다. 대조군 및 투여군의 내용을 요약하면 다음 표2 와 같다.
| 구분 | 혼합용액 구분 | Food 구분 |
| 대조군 D | Distilled Water(DW) | NF(Normal Food) |
| D10 | DW | NF + AT 10% |
| D20 | DW | NF + AT 20% |
| D30 | DW | NF + AT 30% |
| D40 | DW | NF + AT 40% |
| D50 | DW | NF + AT 50% |
| 대조군 I | 이뮤노 Q-10(IQ) | NF(Normal Food) |
| I10 | IQ | NF + AT 10% |
| I20 | IQ | NF + AT 20% |
| I30 | IQ | NF + AT 30% |
| I40 | IQ | NF + AT 40% |
| I50 | IQ | NF + AT 50% |
종양세포주는 B 16 melanoma F 10을 사용하였다. 세포주는 5% CO2와 37 조건에서 배양하였다. 세포배양에 사용된 배지는 Eagle's minimum essential medium(EMEM)이었으며, fetal bovine serum(FBS)을 10% 첨가하여 사용하였다.
6주령에 B 16 melanoma F 10 세포를 꼬리정맥주사로 마우스에 주입한 후 2주간 사육하여 암을 유발시킨 후 대조군과 투여군으로 나누어 시료를 매일 경구 투여하여 실험을 진행하였으며 4주후 마우스를 경추 탈골시켜 희생시킨 후 개복하여 복강 내에 있는 종양을 모두 적출하여 종양세포의 무게를 측정하고 평균을 계산하였다.
2. 평균 종양무게 및 종양저해율 측정
평균 종양무게는 본 발명의 조성물 투여군이 대조군에 비하여 적게 나타났으며, D20, D30, D40 검액군에서 대조군에 비하여 유의적인 차이를 보였다. 또한 물 대신 이뮤노Q-10리퀴드를 함께 섭취한 I20, I30, I40 검액군에서도 대조군에 비하여 유의적인 차이를 보였으며 D검액군에 비해 종양저해율이 높게 나타났다. 평균종양무게를 측정한 결과는 표3 과 같다.
| 구분 | 평균 종양 무게 (g) |
| 대조군D | 2.98±1.91 |
| D10 | 2.86±0.53 |
| D20 | 2.83±0.42 |
| D30 | 1.53±0.67 |
| D40 | 1.09±0.37 |
| D50 | 0.98±0.09 |
| 대조군I | 3.01±1.98 |
| I10 | 2.91±1.50 |
| I20 | 2.46±0.29 |
| I30 | 1.40±0.76 |
| I40 | 0.96±0.53 |
| I50 | 0.88±0.59 |
종양 저해율은 대조군과 조성물투여군의 종양무게를 비교한 수치로 다음의 계산식을 통해 계산하였다.
종양저해율(Inhibition rate) (%) = 100(A-B)/A
(A: 대조군의 평균 종양무게, B: 조성물 투여군의 평균 종양무게)
대조군을 제외한 D검액군과 I검액군의 평균종양무게는 조성물의 농도 20%~40%까지 농도의존적으로 크게 감소하는 유의적인 결과를 보였으며, 특히 I검액군의 평균종양무게는 이 농도구간에서 D검액군에 비해 8.5%~14% 적은 것을 알 수 있었다. 그 결과 이뮤노Q-10리퀴드의 투여와 본 발명의 조성물이 20%~40%의 농도에서 항암효과가 있는 것으로 확인되었다. 종양저해율(Inhibition rate)을 계산한 결과는 표4 와 같다.
| 구분 | 종양저해율 (Inhibition rate %) |
| D10 | 4.02 |
| D20 | 5.03 |
| D30 | 48.65 |
| D40 | 63.42 |
| D50 | 67.11 |
| I10 | 3.36 |
| I20 | 18.46 |
| I30 | 54.03 |
| I40 | 68.79 |
| I50 | 71.48 |
3. 폐에 전이된 colony수와 전이여부
대조군의 폐에 생성된 colony수와 조성물을 섭취한 실험군의 폐에 생성된 colony수를 비교한 결과 조성물의 농도 20%, 30%, 40%의 실험군의 colony수가 유의적으로 감소한 것으로 나타났으며 조성물 농도 10%의 경우 D검액군은 17%, I검액군은 20% 감소하였고, 조성물 농도 20%의 경우 D검액군은 25%, I검액군은 30% 감소하였고, 조성물 농도 30%의 경우 D검액군은 42%, I검액군은 50% 감소하였고, 조성물 농도 40%의 경우 D검액군은 58.3%, I검액군은 70% 감소하였고, 조성물 농도 50%의 경우 D검액군은 67%, I검액군은 80% 감소되었음을 알 수 있다. 이것으로부터 D검액군보다 I검액군의 colony 감소율이 더 큰 것을 알 수 있다. 조성물농도에 따른 각 대조군, 실험군의 모든 colony 수는 표5 와 같다.
| 구분 | Total colonies(갯수) |
| 대조군 D | 12 |
| D10 | 10 |
| D20 | 9 |
| D30 | 7 |
| D40 | 5 |
| D50 | 4 |
| 대조군 I | 10 |
| I10 | 8 |
| I20 | 7 |
| I30 | 5 |
| I40 | 3 |
| I50 | 2 |
이 조성물이 B 16 melanoma F 10으로 유발된 종양억제에 미치는 영향을 알아보기 위해 본 발명의 조성물을 증류수와 면역제품인 이뮤노 Q-10리퀴드를 이용해 상이한 배합비에 따라 투여한 결과 종양의 억제에 있어 유의한 결과를 얻을 수 있었으며, 폐로의 전이부분에 있어서는 이뮤노 Q-10리퀴드를 함께 섭취시킨 경우가 증류수를 섭취한 마우스에 비해 억제효과가 있음을 확인할 수 있었다.
자궁암 항암효과에 대한 세포 실험
암세포주 배양 시 조성물을 일정기간 처리할 때에 세포사적현상(apoptosis)도 유발됨을 확인하고 본 발명 조성물의 암 억제효과에 대한 실험을 하였다.
1. HeLa cell의 배양
자궁경부암 세포주인 HeLa cell은 heat-inactivated fetal bovine serum 10%를 함유하고 있는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 세포들은 3일마다 계대 배양되었고, 5% CO2 조건하의 37oC humidified incubator에서 배양되었다.
2. 검액의 제조 및 실험군 설정
대조군 D는 2% FBS와 증류수로 제조하였으며, 검액군 D는 본 발명의 조성물을 10%, 20%, 30%, 40% 그리고 50%로 제조하고, 같은 방법으로 검액군 I는 2% FBS와 이뮤노Q-10리퀴드로 제조하고, 실험군 I는 본 발명의 조성물을 10%, 20%, 30%, 40% 그리고 50%로 제조한 배양액을 실험에 사용하였다.
3. 세포증식 측정
36-well-plate dish에 Hela cell 1x105/㎖를 접종하여 24시간 동안 배양한 후, Hela cell의 초기농도를 1로 기준하고, 조성물을 농도별로 처리하여 24시간, 48시간, 및 72시간 배양한 후 trypphan blue로 염색하여 세포증식을 측정하여 표 6에 도시하였다.
24시간 단위로 확인하였을 때 HeLa cell의 세포증식은 D10 검액군의 경우 29% 증가, 48시간에서 28% 감소, 72시간에서 34% 감소하였으며, D20, D30, D40 검액군의 경우 시간에 따라 지속적으로 감소하였다. D50 검액군은 D40 검액군과는 큰 차이를 보이지 않았다. 그리고 I10 검액군에 24시간인 경우 9% 증가되었고, 48시간인 경우는 32%감소, 72시간에서 47% 감소하였으며, D20, D30, D40 검액군에서도 시간적으로 유의하게 감소하고 D50 검액군은 D40 검액군의 감소율과 비슷한 양상을 보이고 있음을 알 수 있다.
I검액군의 경우 D검액군에 비해 전체적으로 더 큰 감소율을 보였다. 이러한 결과로부터 조성물의 농도 20%, 30%, 40%에서의 HeLa cell의 증식억제효과가 큰 것으로 볼 때, 본 발명의 조성물의 증식 억제 효능은 이 범위 내에서 가장 활발히 일어 날 것으로 예측할 수 있다. 또한, 이뮤노Q-10리퀴드의 증식억제는 물을 공급한 실험군과 각 농도별로 비교 시 평균 약 20% 감소한 것으로 볼 때 증식억제에 더 효과가 있음을 확인하였다.
| 구분 |
배양시간 후의 HeLa cell의 개수 (1 x 105cell/㎠ ) | ||
| 24hr | 48hr | 72hr | |
| 대조군 D | 1.99±0.61 | 4.58±0.51 | 10.21±0.65 |
| D10 | 1.29±0.47 | 0.72±0.33 | 0.66±0.12 |
| D20 | 0.98±0.51 | 0.63±0.41 | 0.47±0.21 |
| D30 | 0.64±0.29 | 0.47±0.32 | 0.21±0.16 |
| D40 | 0.54±0.31 | 0.17±0.16 | 0.09±0.04 |
| D50 | 0.47±0.21 | 0.15±0.13 | 0.08±0.05 |
| 대조군 I | 2.01±0.54 | 3.91±0.77 | 9.14±0.33 |
| I10 | 1.09±0.57 | 0.68±0.46 | 0.53±0.13 |
| I20 | 0.87±0.34 | 0.54±0.31 | 0.35±0.15 |
| I30 | 0.52±0.27 | 0.36±0.13 | 0.16±0.07 |
| I40 | 0.28±0.12 | 0.13±0.02 | 0.05±0.01 |
| I50 | 0.17±0.18 | 0.08±0.11 | 0.05±0.01 |
4. 유세포 분석
농도별로 조성물을 혼합한 혼합액에 처리한 Hela cell을 trypsin으로 처리, 분리한 후 이를 원심분리하여 1㎖ PBS용액에 resuspension하였다. 여기에 intracellular caspase detection kit인 ApoStat antibody를 10㎕를 가하여 30분간 37oC 배양기에서 배양한 후 PBS로 세척하였다. 이를 0.5㎖에 녹인 후 BD FACS로 분석하여 표 7에 나타내었다.
24시간 배양 후 caspase 유전자 활성 세포의 비율은 대조군이 21.89%, 24.77%로 측정되었다. 조성물 검액군은 대조군에 비하여 모두 증가하였다.
48시간 배양 후 caspase 유전자 활성세포의 비율은 대조군이 10.00%, 11.37%로 측정되었다. 조성물 농도 10%를 제외한 20%, 30%, 40%의 조성물 농도에서는 대조군과 10% 조성물 농도에 비하여 크게 증가하였다.
72시간 배양 후 caspase 유전자 활성세포의 비율은 대조군이 7.99%, 9.78%로 측정되었다. 조성물 농도 20, 30%, 40% 검액군에서는 대조군에 비하여 증가하였다. 조성물 농도 50%는 40% 검액군과 유의한 차이가 없음을 알 수 있다. 따라서 활성세포의 비율은 조성물농도 20%, 30%, 40%에서 가장 크게 증가한 결과를 얻을 수 있었다.
| 구분 |
배양시간 후의 caspase 유전자 활성세포 비율 | ||
| 24hr | 48hr | 72hr | |
| 대조군 D | 21.89 | 10.00 | 7.99 |
| D10 | 27.71 | 6.52 | 7.87 |
| D20 | 38.26 | 10.35 | 15.29 |
| D30 | 45.37 | 12.54 | 18.24 |
| D40 | 66.55 | 14.67 | 38.86 |
| D50 | 69.87 | 15.02 | 40.07 |
| 대조군 I | 24.77 | 11.37 | 9.78 |
| I10 | 28.86 | 8.22 | 10.16 |
| I20 | 45.31 | 12.75 | 18.12 |
| I30 | 53.82 | 15.63 | 29.72 |
| I40 | 76.36 | 16.42 | 45.17 |
| I50 | 77.53 | 17.15 | 45.86 |
5. Caspase-3 활성분석
Caspase-3 활성을 분석하기 위해 caspase-3 ELISA kit를 이용하였다. 농도별로 조성물을 처리한 HeLa cell을 1,000rpm에서 4분간 원심분리한 후, 100㎕의 lysis buffer를 넣어 단백질을 추출하였다.
추출된 단백질은 2~4㎎/㎖의 농도로 50㎕가 되게 하여 96-well flat plate에 분주하고 50㎕의 2X running buffer와 1% DTT solution을 가했다. 5㎕의 caspase-3 colorlimetric substrate를 넣은 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 405nm파장에서 흡광도를 측정하였다.
24시간 배양 후 HeLa cell의 caspase-3 활성도는 대조군에서 0.0827, 0.0871로 측정되었다. 조성물을 혼합한 혼합액 검액군은 20%이상의 배합비에서 대조군에 비하여 증가하였다.
48시간 배양 후 HeLa cell의 caspase-3 활성도는 대조군에서 0.0911, 0.0931로 측정되었다. 조성물을 혼합한 혼합액 검액군은 20%이상의 배합비에서 대조군에 비하여 증가하였다.
72시간 배양후 HeLa cell의 caspase-3 활성도는 대조군에서 0.1099, 0.1145로 측정되었다. 조성물을 혼합한 혼합액 검액군은 모든 배합비에서 대조군에 비하여 증가하였다. caspase-3 활성도는 40% 배합비에서 가장 큰 증가를 보였다.
| 구분 |
배양시간후의 HeLa cell caspase-3의 활성도 | ||
| 24hr | 48hr | 72hr | |
| 대조군 D | 0.0827 | 0.0911 | 0.1099 |
| D10 | 0.0671 | 0.0752 | 0.1123 |
| D20 | 0.0875 | 0.0917 | 0.1213 |
| D30 | 0.0903 | 0.0962 | 0.1277 |
| D40 | 0.0988 | 0.1115 | 0.1464 |
| D50 | 0.1008 | 0.1176 | 0.1504 |
| 대조군 I | 0.0871 | 0.0931 | 0.1145 |
| I10 | 0.0591 | 0.0736 | 0.1161 |
| I20 | 0.0901 | 0.0943 | 0.1238 |
| I30 | 0.0876 | 0.1006 | 0.1326 |
| I40 | 0.1014 | 0.1121 | 0.1571 |
| I50 | 0.1073 | 0.1215 | 0.1622 |
6. 세포활성 측정
96-well plate Hela cell 5 x 103개를 접종하고 24시간 동안 배양한 후 농도별로 조성물을 혼합한 혼합액을 처리하여 24시간, 48시간 및 72시간 동안 배양하였다. 이후 2,3-Bis (2-methoxy4-nitro-5sulfophenyl)-2H tetrazolium-carboxanilide inner salt(이하 XTT)와 phenazine methosulfate(이하 PMS)를 배양액의 20%가 되게 하여 4시간 동안 HeLa cell에 처리하였다. 세포활성은 XTT와 PMS처리 후 450nm 파장의 XTT tetrazolium ring 분해 산물인 formazan crystal의 optical density로 측정하여 표7과 도4 에 나타내었다.
세포활성도를 XTT assay로 확인한 결과, 24시간 배양 후 대조군의 HeLa cell의 세포활성도는 0.51 ±0.12, 0.41 ±0.10로 측정되었다. 조성물을 혼합한 혼합액 검액군은 20%이상의 배합비에서 대조군에 비해 유의한 감소를 나타내었다.
48시간 배양 후 대조군의 HeLa cell의 세포활성도는 0.77 ±0.08, 0.72 ±0.04로 측정되었다. 조성물을 혼합한 혼합액 검액군은 20%이상의 배합비에서 대조군에 비하여 유의한 감소를 나타내었다.
72시간 배양 후 대조군의 HeLa cell의 세포활성도는 0.74 ±0.09, 0.64 ±0.03로 측정되었다. 조성물을 혼합한 혼합액 검액군은 20%이상의 배합비에서 대조군에 비하여 유의한 감소를 나타내었다.
| 구분 |
배양시간 후의 HeLa cell XTT 활성도 | ||
| 24hr | 48hr | 72hr | |
| 대조군 D | 0.51±0.12 | 0.77±0.08 | 0.74±0.09 |
| D10 | 0.54±0.14 | 0.58±0.11 | 0.67±0.08 |
| D20 | 0.38±0.08 | 0.32±0.07 | 0.33±0.08 |
| D30 | 0.27±0.11 | 0.18±0.06 | 0.22±0.06 |
| D40 | 0.16±0.05 | 0.11±0.03 | 0.12±0.04 |
| D50 | 0.14±0.04 | 0.11±0.02 | 0.11±0.01 |
| 대조군 I | 0.41±0.10 | 0.72±0.04 | 0.64±0.03 |
| I10 | 0.52±0.12 | 0.62±0.12 | 0.72±0.19 |
| I20 | 0.34±0.09 | 0.24±0.06 | 0.27±0.06 |
| I30 | 0.12±0.02 | 0.11±0.02 | 0.22±0.11 |
| I40 | 0.10±0.02 | 0.08±0.02 | 0.11±0.01 |
| I50 | 0.09±0.02 | 0.08±0.02 | 0.10±0.01 |
7. Map kinase 활성 측정
농도별로 조성물을 처리한 HeLa cell을 trypsin/EDTA로 분리하였다. 이를 PBS로 세척하고 Trizol 1㎖를 처리하여 세포를 분쇄한 후, chloroform 200㎕를 첨가하여 ice에서 10분간 배양하였다. 이를 13,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액만 취한 후 2-propanol 500㎕를 첨가하고 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 RNA를 응축하였다.
응축된 RNA를 70% 에탄올로 세척 후 건조시켜 20㎕의 DEPC-DW에 녹였다. 추출한 RNA 1㎍를 이용하여 SUPSCRIPTcDNA synthesis kit로 cDNA를 합성하였다. cDNA template 1㎕, internal marker인 GAPDH의 forward와 reverse primer 각각 10pmol 및 Taq polymerase 1 unit을 가한 후 93℃ 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 1분으로 PCR을 30cycle수행하였다. 세포성장인자인 MAP kinase도 동일한 방법으로 PCR을 수행하였으며 anealing온도만 58℃로 하였다.
각 PCR product를 1% agarose gel에 100V로 30분간 전기영동한 후 UV transiluminator로 증폭된 DNA를 확인하였다. MAP kinase cDNA 분석을 위한 sequence는 GAPDH 5' primer (5'-accaca gtcca- tgcc atcac-3')와 GAPDH 3' primer (5'-tccaccaccct-gttgctgta-3')를 사용하여 PCR 정량을 실시하여 표 10에 나타내었다.
24시간 배양 후 HeLa cell의 MAP kinase 활성도를 조사한 결과 대조군은 75354, 73695 CNT/mm2로 측정되었고, 조성물을 혼합한 혼합액 검액군의 MAP kinase 활성도는 모두 대조군에 비해 낮게 측정되었다.
48시간 배양 후 HeLa cell의 MAP kinase 활성도를 조사한 결과 대조군은 74386, 72361 CNT/mm2로 측정되었고, 조성물을 혼합한 혼합액 검액군의 MAP kinase 활성도는 모두 대조군에 비해 낮게 측정되었다.
72시간 배양 후 HeLa cell의 MAP kinase 활성도를 조사한 결과 대조군은 73918, 71254 CNT/mm2로 측정되었고 조성물을 혼합한 혼합액 검액군의 MAP kinase 활성도는 모두 대조군에 비해 낮게 측정되었다. 배합비가 높아감에 따라 활성도도 감소하였으나 40% 와 50% 사이에서는 유의한 차이가 없음을 알 수 있었다.
| 구분 |
배양시간후의 HeLa cell의 MAP kinase활성도 (density CNT) |
||
| 24hr | 48hr | 72hr | |
| 대조군 D | 75354 | 74386 | 73918 |
| D10 | 40086 | 37194 | 36907 |
| D20 | 34315 | 33755 | 32911 |
| D30 | 33589 | 32575 | 31785 |
| D40 | 32158 | 31756 | 30865 |
| D50 | 31425 | 30924 | 30245 |
| 대조군 I | 73695 | 72361 | 71254 |
| I10 | 35621 | 27963 | 30065 |
| I20 | 32481 | 31627 | 29878 |
| I30 | 29612 | 28669 | 27663 |
| I40 | 29336 | 28996 | 26331 |
| I50 | 29125 | 28451 | 26175 |
이 조성물이 자궁경부암 세포인 HeLa cell의 apoptosis를 유발하는 기전에 대해서 endoplasmic reticulum stress-pathway와 mito chod ria- dependent pathway가 중요한 역할을 할 것으로 사료되며, 조성물의 농도별, 시간별 처리가 HeLa cell의 apoptosis에 미치는 영향에 대한 알아보기 위해 본 발명의 조성물의 상이한 농도에 따라 HeLa cell에 처리한 후 세포증식, 유세포 분석, caspase-3의 활성, 세포활성 및 MAP kinase 발현을 관찰하여 유의한 결과를 얻을 수 있었다.
조성물 검액이 자궁경부암 HeLa cell의 세포증식에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군과 비교하여 24시간, 48시간 및 72시간 배양 시 조성물 혼합액을 처리한 검액군에서 세포수가 농도의존적으로 유의하게 감소하였으며, 시간별로 저하된 세포성장율을 통해 세포증식이 억제된 것을 확인할 수 있었다.
자궁경부암의 발암과정은 자궁경부상피세포의 수명이 연장되어 전체 세포수가 증가하면 종양으로 발전하게 되는데, 이 과정에 apoptosis의 감소가 밀접하게 관련 있다고 생각되고 있다.
인체종양세포
SNU
-1(위암)에 대한 증식억제효과
1. SNU-1세포의 배양
RPMI 1640에 FBS를 10% 첨가한 배지를 사용하여 배양하였으며, 25cm2의 조직배양용 flask에서 37 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 세포의 수집은 0.25% trypsin/1mM EDTA 용액을 이용하여 단세포로 만들었고, 세포수는 0.4% trypanblue 용액으로 염색한 후 Hempcytometer를 사용하여 계수하였다.
2. Clonogenic assay를 위한 최적접종세포수 결정
Clonogenic assay는 정상세포와 종양세포의 특성 차이점을 이용한 것으로, 정상세포와는 달리 종양세포의 무절제한 분열증식 특성을 이용하여 일정농도의 soft agar내에서 colony를 형성하는 점을 이용한 방법이다. 직경 35mm 조직배양용 petri-dish에 0.5% agar를 함유하는 하층배지를 1㎖ 주입하여 하층평판을 조제한 다음 CO2 incubator에 보존한 후 위에 0.3% agar를 함유하는 일정농도의 종양세포와 시료현탁액을 1㎖씩 주입시켜 중층평판을 만든 후 37 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 10~14일 배양후 50㎛이상의 크기를 나타내는 colony를 현미경으로 계수하여 종양의 억제정도를 판정하였다.
3. Clonogenic assay를 위한 최적 접종 세포수의 결정
Clonogenic assay의 경우 접종 세포수 당 colony 형성률은 접종 세포수에 비례하여 colony가 형성되나 한계이상 접종될 경우 세포수에 반비례하여 colony수가 감소하게 된다. 따라서 colony의 비례증식구간 안에서 접종 세포수를 결정하여야 한다. 평판 최적의 접종수를 조사한 결과 3,000cell/㎖를 최적의 접종세포수로 결정하였다.
4. 종양세포(SNC-1)에 대한 조성물의 세포생존율 측정
종양세포를 상기의 최적접종수로 접종한 petri-dish에 조성물을 함께 혼합하여 10일 배양 후 형성된 colony의 수를 계수하여 종양세포(SNC-1)에 대한 조성물의 세포생존율을 측정한 결과는 다음 표 11과 같다. D10, I10 검액군은 낮은 증식억제효과를 나타내었으며, D20, I20 검액군부터 농도의존적인 증식억제효과를 나타내었다. D40, I40 검액군 이상의 농도에서는 유의적인 결과를 나타내지 않았다.
| 구분 | SNC-1 세포생존율 (%) |
| 대조군 D | 100 ± 3.25 |
| D10 | 95 ± 3.56 |
| D20 | 78 ± 2.36 |
| D30 | 50 ± 1.25 |
| D40 | 31 ± 2.56 |
| D50 | 30 ± 1.25 |
| 대조군 I | 100 ± 2.56 |
| I10 | 94 ± 2.89 |
| I20 | 75 ± 2.56 |
| I30 | 47 ± 2.65 |
| I40 | 27 ± 3.15 |
| I50 | 27 ± 1.25 |
상기에서 살펴본 실험예들을 통하여, 본 발명의 조성물이 암세포주에 대한 증식억제 및 항암효과 활성을 가지는 것을 알 수 있다.
본 발명은 상술한 특정의 실시 예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.
Claims (8)
- 암세포주 증식억제 활성을 갖는 홍삼추출물, 항암효과를 증대시키기 위한 영지자실체추출물, 면역증강 효과를 증대시키는 케르세틴, 암세포 증식억제효과를 갖는 대두추출물, 면역강화 효과를 갖는 초유단백, 암세포주의 증식을 억제하는 녹차추출물을 포함하는 항암 및 면역 증강용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 홍삼추출물의 유효성분 함량이 10 내지 30 중량% 인 것을 특징으로 하는 항암 및 면역증강용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 영지자실체추출물의 유효성분 함량이 5 내지 20 중량% 인 것을 특징으로 하는 항암 및 면역증강용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 케르세틴의 유효성분 함량이 0.01 내지 2.0 중량% 인 것을 특징으로 하는 항암 및 면역증강용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 대두추출물의 유효성분 함량이 0.01 내지 2.0 중량% 인 것을 특징으로 하는 항암 및 면역증강용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 초유단백의 유효성분 함량이 0.01 내지 2.0 중량% 인 것을 특징으로 하는 항암 및 면역증강용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 녹차추출물의 유효성분 함량이 0.01 내지 2.0 중량% 인 것을 특징으로 하는 항암 및 면역증강용 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 캡슐제, 액제, 분말제, 과립제, 환제를 제형으로 하는 것을 특징으로 하는 항암 및 면역증강용 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100040500A KR20110121072A (ko) | 2010-04-30 | 2010-04-30 | 인체 내 암세포주에 대한 증식억제활성으로 피부암, 폐암, 자궁암 및 위암에 대해 항암효과를 갖는 조성물의 개발 |
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|---|---|---|---|
| KR1020100040500A KR20110121072A (ko) | 2010-04-30 | 2010-04-30 | 인체 내 암세포주에 대한 증식억제활성으로 피부암, 폐암, 자궁암 및 위암에 대해 항암효과를 갖는 조성물의 개발 |
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|---|---|
| KR20110121072A true KR20110121072A (ko) | 2011-11-07 |
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|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102688312A (zh) * | 2012-05-28 | 2012-09-26 | 上海皓澎医药科技有限公司 | 一种具有抗癌作用的中草药剂及制备方法 |
| CN102885301A (zh) * | 2012-09-19 | 2013-01-23 | 北京同仁堂健康药业股份有限公司 | 一种增强免疫力的组合物及其制备方法 |
| CN104398911A (zh) * | 2014-11-21 | 2015-03-11 | 李坤 | 一种治疗崩漏的药物口服液 |
-
2010
- 2010-04-30 KR KR1020100040500A patent/KR20110121072A/ko not_active Application Discontinuation
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