WO2019088656A1 - 안정화된 엑소좀의 필러 조성물 - Google Patents

안정화된 엑소좀의 필러 조성물 Download PDF

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exosome
hyaluronic acid
derived
exosomes
filler composition
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김광일
조병성
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Definitions

  • the present invention relates to a stabilized exosome filler composition, and more particularly, to a filler composition that contains exosome in a hyaluronic acid-based filler composition to increase the stability of the exosome.
  • the present invention also relates to a stabilized exosome filler composition capable of increasing the stability of exosome and adding a cosmetic effect by hyaluronic acid-based filler.
  • exosomes which have intercellular signal transduction
  • researches on its components and functions are actively under way.
  • Extracellular vesicles Cells release various membrane-type vesicles in the extracellular environment, and these release vesicles are commonly referred to as extracellular vesicles (EVs).
  • the extracellular endoplasmic reticulum is sometimes referred to as cell membrane-derived endoplasmic reticulum, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes and, in some cases, differentiated from exosomes.
  • Exosome is an endoplasmic reticulum of several tens to several hundreds of nanometers in size, composed of double lipid membranes identical to the cell membrane structure, and contains proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosomal cargo inside.
  • Exosomal cargo contains a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and differentially regulated by the environment of the secretory cells.
  • Exosome is an intercellular signaling mediator that is secreted by the cell, and various cell signals transmitted through it regulate cell behavior including activation, growth, migration, differentiation, de-differentiation, apoptosis, and necrosis of target cells It is known.
  • Exosomes contain specific genetic material and bioactivity factors depending on the nature and condition of the derived cells.
  • the proliferating stem cell-derived exosomes regulate cell behavior such as cell migration, proliferation and differentiation, and reflect the characteristics of stem cells involved in tissue regeneration (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
  • the exosome called the avatar of cells contains bioactivity factors such as growth factors similar to cells, and when the exosome is stored at room temperature, there arises a problem of stability in which the activity of growth factors and the like is lowered.
  • the exosome is stored in a simple refrigerator, the physical properties and stability of the exosome are changed in total, and the activity of the bioactive factors contained in the exosome may be lowered depending on the storage time and method.
  • Hyaluronic acid or hyaluronan is a biopolymer material in which a repeating unit composed of N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid is linearly connected, and exists at a high concentration in connective tissues and skin.
  • hyaluronic acid is found in chicken eggs, body fluids, ocular vitreous humor, joint synovial fluid, animal cushioning tissue, and placenta.
  • the hyaluronic acid or its salt has excellent biocompatibility, biodegradability and stability and is utilized as a wrinkle improving filler, an arthritis improving or treating agent, a wound healing agent, an eye surgery aid, an adhesion inhibitor, a drug delivery system and the like.
  • Fillers using hyaluronic acid or its salts are formulations that are injected into a patient to reduce the appearance of, for example, facial lines and wrinkles.
  • the hyaluronic acid-based filler has the effect of treating the soft tissue condition by replacing the endogenous matrix polymer lost in the tissue by injecting into the soft tissues such as facial wrinkles and depressions or by improving the function of the existing matrix polymer.
  • hyaluronic acid-based fillers can be applied locally to small body regions, such as the lips, nose, forehead, balls, chest, and genitals, based on volume enhancement effects, .
  • hyaluronic acid-based fillers can be injected into the joints of patients with degenerative arthritis to improve or improve symptoms.
  • the present inventors have intensively studied the new application field of exosome and medical or cosmetic technology, and found that when exosome is contained in a hyaluronic acid-based filler composition, the stability of exosome increases and hyaluronic acid- It is confirmed that the natural cosmetic effect can be added, and the present invention has been completed.
  • Another object of the present invention is to provide a stabilized exosome filler composition capable of increasing the stability of exosome and adding a cosmetic effect by hyaluronic acid-based filler.
  • the present invention provides a method for producing a hyaluronic acid, a hyaluronic acid salt or a hyaluronic acid gel, which comprises mixing at least one of hyaluronic acid, hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate)
  • hyaluronic acid salt for example, sodium hyaluronate
  • a stabilized exosome filler composition comprising exosomes which are mixed and held in at least one species.
  • exosomes refers to an endoplasmic reticulum of several tens to several hundred nanometers (preferably about 30 to 200 nm) in size, consisting of double lipid membranes identical in structure to the cell membrane The particle size of the exosome can be varied according to the cell type, the separation method and the measurement method) (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, DOI 10.1007 / s00216-015-8535-3). Exosomes contain proteins called exosomal cargo (cargo), nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.).
  • Exosomal cargo contains a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and differentially regulated by the environment of the secretory cells.
  • Exosome is an intercellular signaling mediator that is secreted by the cell, and various cell signals transmitted through it regulate cell behavior including activation, growth, migration, differentiation, de-differentiation, apoptosis, and necrosis of target cells It is known.
  • biological solution means a liquid solution of biogenic origin, in which the exosome is dispersed, suspended, precipitated, suspended or mixed, and includes, for example, a cell culture solution, a cell culture supernatant, Cell culture supernatant, whole blood, serum, cord blood, plasma, multiple fluid, brain and cerebrospinal fluid, placenta extract, and bone marrow aspirate.
  • a cell culture solution a cell culture supernatant, Cell culture supernatant, whole blood, serum, cord blood, plasma, multiple fluid, brain and cerebrospinal fluid, placenta extract, and bone marrow aspirate.
  • a “ biological solution” may be cultured or incubated under conditions that release and / or secrete exosomes, and may be frozen and thawed.
  • exosome is intended to mean an exosome that is secreted from cells of various animals, plants, bacteria, fungi, algae and the like, preferably stem cells, (E. G., Exosome-like vesicles) having a nano-sized bezacl structure and a composition similar to exosome.
  • exosome used in the present invention does not cause an adverse effect on the human body without increasing or at least reducing the cosmetic effect by the hyaluronic acid-based filler
  • various exosomes which are used in the art or can be used in the future can be used Of course. Therefore, it should be understood that the exosome isolated according to the separation method of the following embodiments should be understood as an example of exosome that can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • the stabilized exosome filler composition according to one embodiment of the present invention is prepared by mixing at least one of hyaluronic acid, hyaluronic acid salt, and hyaluronic acid gel with at least one of hyaluronic acid, hyaluronic acid salt, and hyaluronic acid gel And the like.
  • the stabilized exosome filler composition of one embodiment of the present invention may further comprise a non-crosslinked hyaluronic acid gel and / or a crosslinked hyaluronic acid gel.
  • the crosslinked hyaluronic acid gel may be prepared by mixing 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE), 1,4-bis (2,3-epoxypropoxy) butane, 1,4-bisglycidyloxybutane, At least one crosslinking agent selected from the group consisting of 1,2-bis (2,3-epoxypropoxy) ethylene and 1- (2,3-epoxypropyl) -2,3-epoxycyclohexane, May be a zero cross-linked hyaluronic acid gel.
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • 1,4-bis (2,3-epoxypropoxy) butane 1,4-bisglycidyloxybutane
  • the exosome may be an exosome derived from a stem cell, an exosome derived from a plant, or an exosome derived from a yeast.
  • the stem cell-derived exosome may be exosomes derived from fat, bone marrow, umbilical cord or cord blood stem cells.
  • the plant-derived exosome may be an exosome derived from rose stem cells or an exosome derived from edelweis.
  • the exosome derived from the rosette stem cell may be one which has been separated and purified from a culture of a rosaceous embryo or a leaf-derived callus, or a culture of a rosaceous cambium or procambium-derived callus.
  • &Quot; Rosa spp. &Quot; is a generic term for dicotyledonous plants, rosewoods, rosacea, and roses, including both wild species and improved horticultural crops.
  • the exosome derived from edelvase may be one which has been separated and purified from a culture solution of plant cells obtained from leaves or stem tissues of Edelweiss, or from a culture of callus induced by scarring of cotyledon germinated from Edelweiss seeds. &Quot; Edelweiss " means a plant of the genus Leontopodium sp. , And may be Leontopodium japonicum as an example without limiting the present invention.
  • the exosome derived from yeast may be exosome derived from wine yeast or exosome derived from galactomiesces.
  • the exosome derived from the wine yeast may be one separated and purified from a wine yeast culture solution, a wine yeast fermentation product or wine.
  • Wine yeast includes both exogenous wine yeast (wild wine yeast) and cultured wine yeast (dry wine yeast).
  • wild wine yeasts include Candida, Pichia, Hanseniaspora, Zygosaccharomyces, Metschnikowiaceae ), Kloeckera (Kloeckera) and the like, and the dry wine yeast used to produce a certain quality of wine is Saccharomyces cerevisiae.
  • the exosome derived from the galactomycese may be one separated and purified from the galactomycese culture broth or the galactomycetes fermentation product.
  • "Galactomycetes” is a fungi belonging to the Dipodascaceae family and refers to galactomycetes yeasts used in the brewing or fermentation process.
  • the exosome can be obtained by performing the following steps: (a) adding trehalose to the biological solution, (b) adding the trehalose (C) separating the exosomes from the filtered biological solution using TFF (Tangential Flow Filtration), and (d) removing the buffer used for desalting and buffer exchange (diafiltration). , Adding trehalose to the solution, and performing desalting and buffer exchange (diafiltration) on the separated exosome using TFF (Tangential Flow Filtration) using the buffer solution to which the trehalose is added .
  • TFF Tangential Flow Filtration
  • exosomes having a uniform particle size distribution and high purity can be effectively obtained (FIGS. 6A to 6C) 6E).
  • trehalose in the pre-filtration step (step (b) before exocase separation by TFF) and desalting by TFF and buffer exchange step (step (d)) after separation of exosome, a high purity particle size distribution Uniform exosome can be obtained with high yield.
  • Trehalose provides the ability to efficiently isolate exosomes for impurities such as cellular debris, waste products, proteins and macromolecules.
  • the desalting and buffer exchange can be performed continuously or intermittently. Desalting and buffer exchange can be carried out using a buffer solution having a volume of at least 4 times, preferably 6 times to 10 times, more preferably 12 times the starting volume.
  • a molecular weight cutoff (MWCO) 100,000 Da (Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da or 750,000 Da TFF filter or 0.05 ⁇ ⁇ TFF filter can be used.
  • the step (c) may further include a step of concentrating the solution to a volume of 1/100 to 1/25 using TFF (Tangential Flow Filtration).
  • the biological solution may be a stem cell culture solution.
  • the type of the stem cell is not limited, but may be a mesenchymal stem cell, for example, a fat, a bone marrow, an umbilical cord or a cord blood-derived stem cell, more preferably a fat-derived stem cell.
  • the type of the adipose-derived stem cell is not limited as long as it does not cause a risk of infection by a pathogen and does not cause an immune rejection reaction, but it may be preferably a human adipose-derived stem cell.
  • the exosome used in the present invention is not limited to the exosome obtained according to the separation method described above, and it is needless to say that various exosomes which are used in the art or can be used in the future can be used. It is to be understood that the exosome isolated according to the above separation method should be understood as an example of exosome that can be used in the composition of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • the exosome is sterilized by using a sterilizing filter before mixing with at least one of hyaluronic acid, hyaluronic acid salt, and hyaluronic acid gel .
  • the stabilized exosome filler composition of one embodiment of the present invention is preferably applied in an injectable administration mode. However, it is not limited thereto and does not exclude various methods of administration known in the art.
  • the stabilized exosome filler composition of one embodiment of the present invention can be prepared with a pharmaceutical composition for wound healing, scar treatment, improvement or treatment of arthritis and the like.
  • Another embodiment of the present invention provides a cosmetic method for controlling the condition of mammalian skin except for the treatment using the stabilized exosome filler composition.
  • conditioning of the skin means improvement of the condition of the skin and / or prevention of the condition of the skin
  • improvement of the condition of the skin means visual and / Or a tactile perceptible positive change.
  • improvement of skin condition may be improvement of skin wrinkles, skin regeneration, skin moisturization, skin elasticity improvement, volume increase (for example, volume-up, skin distension, etc.).
  • Another embodiment of the present invention provides a method for wound healing, scar treatment, arthritis improvement or treatment using the stabilized exosome filler composition.
  • the stabilized exosome filler composition of the present invention has the advantage of enhancing the stability of exosome and adding the natural cosmetic effect of hyaluronic acid-based filler.
  • the stabilized exosome filler composition of the present invention can provide a long-lasting cosmetic or therapeutic effect derived from exosome as the stability of exosome increases, Can be suitably applied to the implementation of hyaluronic acid-based fillers that are convenient and less painful to the patient.
  • the present invention is capable of mixing the exosomes separated and purified by the inherent separation method into a hyaluronic acid-based filler at a low concentration, and it is easier to mix homogeneously than when a large number of exosome particles are required.
  • the present invention can prevent the problem of increasing the total volume of the hyaluronic acid-based filler composition that may occur when the exosome is mixed for cosmetic or therapeutic effects.
  • FIG. 1 is a flow chart illustrating a process for separating and purifying exosomes in a method for producing exosomes from a biological solution according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing a result of measuring a relative amount of protein contained in a solution for each step of preparing a biological solution, for example, a stem cell culture solution, according to an embodiment of the present invention .
  • the ratio of the total amount of protein in each step was expressed by the relative ratio of total protein amount to the total biological solution.
  • the experimental results show the results obtained in two different batches, respectively.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the productivity and purity of exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
  • the productivity of exosomes was calculated as "the number of particles of exosome obtained per mL of biological solution, eg, a stem cell culture (CM),” and the purity of exosome was calculated as "the number of exosomes per microgram of protein contained in the final fraction Quot; number of particles "
  • the experimental results show the results obtained in five different batches.
  • 4A to 4E show results of physical property analysis of exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
  • 4A shows particle size distribution and number of particles by TRPS (tunable resistive pulse sensing) analysis.
  • Figure 4B shows particle size distribution and number of particles by NTA (nanoparticle tracking analysis) analysis.
  • 4C shows particle images by transmission electron microscopy (TEM) according to magnification.
  • 4D shows the Western blot results of exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
  • &Quot; Figure 4E shows flow cytometric analysis results for CD63 and CD81 in marker assays for exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
  • Figures 5A-5C show the results of NTA analysis on particle size distribution showing that a uniform and high-purity exosome is obtained with trehalose addition. As the amount of trehalose added increases, a particle size distribution having a single peak can be obtained.
  • 6A to 6C show results of NTA analysis showing particle size distribution according to whether trehalose was added in the process of producing exosome according to one embodiment of the present invention.
  • 6A shows a case where trehalose is added throughout the production process
  • Fig. 6B shows a case where trehalose is added after the cell culture solution is stored in a frozen state
  • the results are shown without adding os.
  • 6D shows the results of comparing relative productivity and relative concentration of exosomes isolated by the methods of FIGS. 6A to 6C.
  • 6E shows the mean size of exosomes isolated by the methods of FIGS. 6A to 6C.
  • FIG. 7 shows the result of confirming the absence of cytotoxicity after treatment of exosome according to one embodiment of the present invention with HS68 cells of human skin fibroblasts.
  • FIG. 8 is a photograph of an exosome according to an embodiment of the present invention mixed with a hyaluronic acid filler and then photographed using NTA equipment.
  • Fig. 9 is a Western blot result showing that the stabilized exosome filler composition of the present invention is stably maintained without degradation of the surface protein of exosome, CD63, by trypsin treatment.
  • HS68 cells a human dermal fibroblast, were purchased from ATCC and cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum (purchased from ThermoFisher Scientific) and 1% antibiotic-antimycotics (purchased from ThermoFisher Scientific) The cells were subcultured in DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) medium containing 5% CO 2 at 37 ° C.
  • adipose-derived stem cells were cultured at 5% CO 2 and 37 ° C. Then, the cells were washed with a phosphate-buffered saline (purchased from ThermoFisher Scientific), replaced with serum-free, non-phenol red medium, cultured for 1 to 10 days, and the supernatant .
  • a phosphate-buffered saline purchased from ThermoFisher Scientific
  • Trehalose was added to the culture medium in an amount of 2% by weight in order to obtain an exosome having a uniform particle size distribution and high purity in the process of separating exosome.
  • the culture was filtered with a 0.22 ⁇ m filter to remove impurities such as cellular debris, waste products and large particles.
  • the filtered cultures were immediately separated to isolate exosomes.
  • the filtered culture was stored in a refrigerator (image below 10 ° C) and used for exosome isolation.
  • the filtered culture was frozen in an ultra-low temperature freezer at -60 ° C or lower, and thawed, followed by exosome isolation. Then, the exosomes were separated from the culture medium by using Tangential Flow Filtration (TFF).
  • TMF Tangential Flow Filtration
  • Example 1 a TFF (Tangential Flow Filtration) method was used for separating, concentrating, desalting and diafiltration exosomes from a culture filtrated with a 0.22 ⁇ m filter.
  • a cartridge filter also called a hollow fiber filter (purchased from GE Healthcare) or a cassette filter (purchased from Pall or Sartorius or Merck Millipore) was used.
  • the TFF filter can be selected by a variety of molecular weight cutoffs (MWCO). Exosomes were selectively isolated and concentrated by selected MWCOs, and particles, proteins, lipids, nucleic acids, low molecular weight compounds, etc. smaller than MWCO were removed.
  • MWCO molecular weight cutoffs
  • TFF filters of MWCO 100,000 Da (Dalton), 300,000 Da, or 500,000 Da were used.
  • the culture medium was concentrated to a volume of about 1/100 to 1/25 using the TFF method, and substances smaller than MWCO were removed to separate the exosomes.
  • Separated and concentrated exosomal solutions were further desalted and buffered (diafiltration) using the TFF method.
  • the desalination and buffer exchange are performed by continuous diafiltration or discontinuous diafiltration, and at least 4 times, preferably 6 times to 10 times or more, more preferably, Was performed using a buffer solution having a volume of 12 times or more.
  • 2% by weight of trehalose dissolved in PBS was added to obtain an exosome having a uniform particle size distribution and high purity.
  • 6A to 6E show the effect of obtaining an exosome having a high purity and a uniform particle size distribution with trehalose treatment at a high yield.
  • the amount of protein in the fractions of the isolated exosome, culture medium, and TFF separation process was measured using BCA colorimetry (purchased from ThermoFisher Scientific) or FluoroProfile fluorescence (purchased from Sigma).
  • BCA colorimetry purchased from ThermoFisher Scientific
  • FluoroProfile fluorescence purchased from Sigma.
  • the extent to which the exosome was isolated and concentrated by the TFF method of the present invention and the removal of proteins, lipids, nucleic acids, and low-molecular compounds was monitored by a protein determination method, and the results are shown in FIG. As a result, it was found that the protein present in the culture solution was very effectively removed by the TFF method of one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows the results of comparing the productivity and purity in five independent batches when isolating exosomes by the TFF method of one embodiment of the present invention. As a result of analyzing the results obtained from the five independent batches, it was confirmed that the exosome can be separated very stably by the TFF method of one embodiment of the present invention.
  • 5A to 5C show results of NTA analysis of the size distribution of exosome according to whether or not trehalose was added after the exosome was separated by the TFF method.
  • concentration of trehalose was increased to 0% by weight, 1% by weight and 2% by weight (from top to bottom of FIGS. 5A to 5C) and repeated three times.
  • particles having a size of 300 nm or more were identified, while particles having a size of 300 nm or more were reduced by increasing the amount of trehalose, and the size distribution of the exosome was uniformized .
  • FIG. 4D shows the presence of CD9, CD63, CD81 and TSG101 markers as a result of performing Western blotting on isolated exosomes according to the method of one embodiment of the present invention.
  • Anti-CD9 purchased from Abcam
  • anti-CD63 purchasedd from System Biosciences
  • anti-CD81 purchasedd from System Biosciences
  • anti-TSG101 purchasedd from Abcam
  • FIG. 4E shows the presence of CD63 and CD81 markers as a result of analysis using a flow cytometer on exosomes isolated according to the method of one embodiment of the present invention.
  • Human CD63 isolation / detection kit purchased from ThermoFisher Scientific
  • PE-mouse anti-human CD63 PE-Mouse anti markers were stained using the PE-mouse CD63 (purchased from BD) and PE-mouse anti-human CD81 (purchased from BD), and analyzed using a flow cytometer (ACEA Biosciences) Respectively.
  • the exosome used in the hyaluronic acid-based filler composition of the present invention is not limited to the exosome of the above-mentioned embodiments, and various exosomes which are used in the art or can be used in the future can be used, to be. It is to be understood that the exosomes separated according to the above embodiments are to be understood as an example of exosomes that can be used in the hyaluronic acid-based filler composition of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • exosomes were treated by concentration to the cells and the proliferation rate of the cells was confirmed.
  • HS68 cells were suspended in DMEM containing 10% FBS, and the cells were mixed with 80 ⁇ 90% confluency and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 24 hours. After 24 hours, the culture solution was removed, and the cell survival rate was evaluated by culturing the exosome prepared in Example 2 for each concentration and culturing for 24 to 72 hours.
  • WST-1 reagent purchased from Takara
  • MTT reagent purchased from Sigma
  • CellTiter-Glo reagent purchased from Promega
  • Aramar Blue reagent alamarBlue reagent purchased from ThermoFisher Scientific
  • a microplate reader purchased from Molecular Devices
  • the comparison group was based on the number of cells cultured in the normal cell culture medium not treated with exosome, and it was confirmed that no cytosoxicity by exosome was observed within the tested concentration range (FIG. 7).
  • the exosome prepared in Example 2 was mixed with at least one of hyaluronic acid, hyaluronic acid salt, and hyaluronic acid gel to prepare a stabilized exosome filler composition.
  • hyaluronic acid salt sodium hyaluronate may be used, but not limited thereto, and various hyaluronic acid salts used in the art can be used.
  • the hyaluronic acid gel may be a non-crosslinked hyaluronic acid or a crosslinked hyaluronic acid gel.
  • the crosslinked gel for example, restylene can be used.
  • a hyaluronic acid-based filler composition in which at least one of hyaluronic acid, hyaluronic acid salt, and hyaluronic acid gel was mixed was sterilized using a heat sterilization or sterilization filter.
  • a filler composition of stabilized exosomes was prepared by mixing exosomes in a hyaluronic acid-based filler composition in which at least one of sterilized hyaluronic acid, hyaluronic acid salt, or hyaluronic acid gel was mixed. At this time, the exosomes can be further sterilized using a sterilization filter before mixing with the hyaluronic acid-based filler composition.
  • the concentration of exosomes in the stabilized exosome filler composition can be adjusted to, for example, from about 1 x 10 5 particles / mL to 1 x 10 11 particles / mL (or about 0.001 to 1000 ⁇ g / mL for protein concentrations) .
  • the exosomes prepared in Example 2 were mixed with a hyaluronic acid filler at a concentration of 1 ⁇ 10 8 particles / mL, and then immediately mixed with the hyaluronic acid-based filler composition using NTA equipment (FIG. 8).
  • NTA equipment NTA equipment
  • the hyaluronic acid-based filler mixed with exosomes was stored at -20 ° C for 30 days, and then photographed using NTA equipment to confirm that the exosome was well maintained in the hyaluronic acid-based filler composition 8).
  • the last photograph on the right side of FIG. 8 confirms that there is almost no particle in the filler having no exosome mixed therein as a negative control photograph without exosome.
  • the stabilized exosome filler composition of the present invention can be suitably applied to the realization of hyaluronic acid-based filler which is easy to inject and less painful to the patient, with long-lasting cosmetic or therapeutic effect .
  • Example 6 Experiment to confirm the increase of stability of exosome by hyaluronic acid
  • the CD63 protein is a membrane protein specifically present on the surface of exosomes. It is an important marker protein used when confirming whether or not the endoplasmic reticulum secreted or released from cells is an exosome. If the CD63 protein is not detected in the endoplasmic reticulum isolated from the stem cell culture, it can be judged that the exosome is not present in the culture solution or that the exosome has lost its inherent characteristics due to the stability problem. Therefore, the stability of exosomes can be evaluated by detecting the CD63 marker protein under specific conditions. In order to confirm the stability enhancement effect of exosome by hyaluronic acid in the stabilized exosome filler composition of the present invention, the following experiment was conducted.
  • the protease, trypsin, And CD63 an exosomal surface marker protein
  • the stabilized exosome filler composition of the present invention was prepared by mixing 30 mg of hyaluronic acid at a concentration of 24 mg / mL in exosomes obtained by concentrating 8 times the exosome prepared in Example 2.
  • trypsin purchased from Sigma
  • 5 ⁇ L of trypsin was treated with the exo single sample and the sample in which the exosomes were mixed with hyaluronic acid, followed by reaction at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Protease inhibitor cocktail purchased from Sigma was then treated to inhibit the activity of trypsin.
  • Hyaluronidase obtained from Sigma, which degrades hyaluronic acid, was treated to a final concentration of 1.25 mg / mL and then incubated at 37 < 0 > C for 30 minutes Lt; / RTI > Negative controls without trypsin treatment were also electrophoresed on the exosomal samples.
  • the same amount of protein was developed by electrophoresis in 8% SDS-polyacrylamide gel, and then electroblotted on PVDF membrane. The membrane was blocked with TBS-T buffer (5% skim milk) in TBS-T buffer (0.1% Tween-20 in TBS) to block non-specific binding between anti-CD63 antibody and protein at room temperature for 1 hour.
  • the anti-CD63 antibody was firstly treated at 4 ° C overnight, washed three times with TBS-T buffer for 10 minutes, and incubated with anti-rabbit immunoglobulin G (Jackson Immuno Research Laboratories Inc.) And then washed three times with TBS-T buffer for 10 minutes.
  • CD63-specific protein expression was confirmed on the final PVDF membrane using a chemiluminescent reagent (SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Scientific).
  • the stabilized exosome filler composition (middle lane in FIG. 9) of the present invention stably maintains CD63, the surface protein of exosomes, without being decomposed by trypsin treatment.
  • the results of the tryptic treatment of the stabilized exosomal filler composition of the present invention with the CD63 protein Western blot results are almost the same as the sample without trypsin treatment in the exosomes (left lane of FIG. 9).
  • the stabilized exosome filler composition of the present invention has an effect of increasing the stability of exosome. Therefore, the stabilized exosome filler composition of the present invention can maintain the cosmetic or therapeutic effect derived from exosome for a long time as the stability of exosome increases, and the cosmetic or therapeutic effect can be maintained for a long time Can be suitably applied to the implementation of hyaluronic acid-based fillers that are convenient and less painful to the patient.

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Abstract

본 발명은 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는 엑소좀을 포함하는 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 제공한다. 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 엑소좀의 안정성이 증가됨에 따라 엑소좀으로부터 유래되는 미용적 또는 치료적 효과를 오래 지속할 수 있고, 미용적 또는 치료적 효과가 오래 지속되면서 주사가 편리하고 환자에게 고통을 덜 주는 히알루론산 기반의 필러의 구현에 적합하게 응용될 수 있다.

Description

안정화된 엑소좀의 필러 조성물
본 발명은 안정화된 엑소좀의 필러 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 히알루론산 기반의 필러 조성물에 엑소좀을 함유시켜 엑소좀의 안정성을 증가시킨 필러 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 엑소좀의 안정성을 증가시키고, 히알루론산 기반 필러에 의한 미용 효과를 부가할 수 있는 안정화된 엑소좀의 필러 조성물에 관한 것이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 엑소좀의 사용 편의성 및 효능 증대 등을 위한 다양한 의료 내지는 미용기술과의 접목은 상대적으로 주목받고 있지 못하고 있다.
즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 엑소좀을 실온에서 보관할 경우 성장인자 등의 활성이 저하되는 안정성의 문제가 발생한다. 또한, 엑소좀을 단순 냉장 보관할 경우에도 보관 시간 및 방법 등에 따라 전체적인 엑소좀의 물성 및 안정성에 변화가 생기고, 엑소좀에 포함된 생체활성 인자들의 활성도 저하될 수 있다.
한편, 얼굴이나 신체 등의 외모에 대한 관심이 증가함에 따라 피부 상태를 개선하고 외모의 부족한 부분을 보완하고자 하는 미용 수요가 늘어나고 있다. 특히, 피부 주름이나 그 밖의 피부 외관 상태를 개선하는 것을 목적으로 하는 코스메틱 시술에 대한 관심이 높아지고 있다. 예를 들어, 보톡스나 필러를 국소적으로 피부에 주사하여 주름을 개선하는 방법이 있다.
히알루론산 또는 히알루로난(hyaluronan)은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로, 결합조직 및 피부에 고농도로 존재한다. 그 밖에 히알루론산은 닭벼슬, 체액, 안구의 유리액, 관절의 활액, 동물의 완충조직, 태반 등에서 발견된다. 히알루론산 또는 그의 염은 생체적합성, 생분해성 및 안정성이 우수하여 주름 개선용 필러, 관절염 개선 또는 치료제, 상처 치료제, 안구수술보조제, 유착방지제, 약물 전달체 등으로 활용되고 있다.
히알루론산 또는 그의 염을 이용한 필러는 예를 들어, 안면 라인 및 주름의 외양을 감소시키기 위해 환자에게 주입되는 제제이다. 히알루론산 기반의 필러는 안면 주름 및 패인 곳 등의 연부 조직에 주입되어 해당 조직에서 소실된 내인성 기질 폴리머를 대체하거나, 기존의 기질 폴리머의 기능을 향상시킴으로써 연조직 병태를 치료하는 효과를 나타낸다. 또한, 히알루론산 기반의 필러는 볼륨증대 효과를 기반으로 볼륨감이 작은 신체 부위, 예를 들어 입술, 코, 이마, 볼, 가슴, 성기 등에 국소적으로 적용함으로써 해당 신체 부위에 볼륨감을 줄 수 있다. 뿐만 아니라, 히알루론산 기반의 필러는 퇴행성 관절염 환자의 관절 내에 주사되어 증상을 개선 또는 호전시킬 수 있다.
본 발명자들은 엑소좀의 새로운 응용분야 및 의료 내지는 미용기술과의 접목에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 히알루론산 기반의 필러 조성물에 엑소좀을 함유시킨 경우 엑소좀의 안정성이 증가하고 히알루론산 기반 필러 본연의 미용 효과도 부가할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 제공하는 것으로서, 보다 상세하게는 히알루론산 기반의 필러 조성물에 엑소좀을 함유시켜 엑소좀의 안정성을 증가시킨 필러 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 엑소좀의 안정성을 증가시키고, 히알루론산 기반 필러에 의한 미용 효과를 부가할 수 있는 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는 엑소좀을 포함하는 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
본 명세서에서 용어, "생물학적 용액"은 생물기원의 액체 용액으로서 엑소좀이 분산, 현탁, 침전, 부유 또는 혼합되어 있는 용액을 의미하고, 예를 들어 세포 배양액, 세포 배양 상청액, 줄기세포 배양액, 줄기세포 배양 상청액, 전혈, 혈청, 제대혈, 혈장, 복수액, 뇌 및 뇌척수액, 태반 추출액 및 골수 흡입물 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 다양한 동물, 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물 기원의 용액을 배제하는 것이 아님은 물론이다. "생물학적 용액"은 엑소좀을 방출 및/또는 분비시키는 조건 하에서 배양 또는 인큐베이션될 수 있고, 냉동 및 해동될 수도 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 다양한 동물, 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등의 세포, 바람직하게는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다.
그러나 본 발명에서 사용되는 엑소좀은 히알루론산 기반 필러에 의한 미용 효과를 증가시키거나 적어도 감소시키지 않으면서 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 발명의 일 구체예의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은, 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는 엑소좀을 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은, 가교되지 않은 히알루론산 겔 및/또는 가교된 히알루론산 겔을 더 포함할 수 있다. 상기 가교된 히알루론산 겔은 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르 (BDDE), 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄, 1,4-비스글리시딜옥시부탄, 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌 및 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시사이클로헥산 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 가교결합제로 가교결합된 히알루론산 겔일 수 있다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 상기 엑소좀은 줄기세포 유래의 엑소좀, 식물 유래의 엑소좀, 또는 효모 유래의 엑소좀일 수 있다.
예를 들어, 상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 줄기세포 유래의 엑소좀일 수 있다.
또한, 예를 들어, 상기 식물 유래의 엑소좀은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀 또는 에델바이스 유래의 엑소좀일 수 있다.
상기 장미 줄기세포 유래의 엑소좀은 장미의 배(胚) 또는 잎 유래 캘러스의 배양액, 또는 장미의 형성층 또는 전형성층 유래 캘러스의 배양액으로부터 분리 정제된 것일 수 있다. "장미(Rosa spp.)"는 쌍떡잎 식물군, 장미목, 장미과 및 장미속에 속하는 식물을 총칭하며, 야생종과 개량을 가한 원예종을 모두 포함한다.
상기 에델바이스 유래의 엑소좀은 에델바이스의 잎 또는 줄기 조직으로부터 얻은 식물세포의 배양액, 또는 에델바이스 종자로부터 발아된 떡잎에 상처를 내어 유도시킨 캘러스의 배양액으로부터 분리 정제된 것일 수 있다. "에델바이스"는 레온토포디움 속 (Leontopodium sp.) 식물을 의미하며, 본 발명을 한정하지 않는 예시로서 레온토포디움 자포니쿰(Leontopodium japonicum)일 수 있다.
또한, 예를 들어, 상기 효모 유래의 엑소좀은 와인 효모 유래의 엑소좀 또는 갈락토마이세스 유래의 엑소좀일 수 있다.
상기 와인 효모 유래의 엑소좀은 와인 효모 배양액, 와인 효모 발효물 또는 포도주로부터 분리 정제된 것일 수 있다. "와인 효모"는 외기성 와인 효모(야생 와인 효모)와 배양된 와인 효모(드라이 와인 효모)를 모두 포함한다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 야생 와인 효모로는 칸디다(Candida), 피키아(Pichia), 한세니아스포라(Hanseniaspora), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 메트쉬니코비아케에(Metschnikowiaceae), 클로에케라(Kloeckera) 등이 있고, 일정한 품질의 포도주를 만들기 위해 사용되는 드라이 와인 효모로는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)가 있다.
상기 갈락토마이세스 유래의 엑소좀은 갈락토마이세스 배양액 또는 갈락토마이세스 발효물로부터 분리 정제된 것일 수 있다. "갈락토마이세스"는 디포다스카세에(Dipodascaceae) 과(科)에 속하는 균류(fungi)로서, 양조 또는 발효 과정에 사용되는 갈락토마이세스 속(屬) 효모들을 지칭한다.
본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 상기 엑소좀은 하기의 단계들을 수행하여 수득될 수 있다: (a) 생물학적 용액에 트레할로오스를 첨가하는 단계, (b) 상기 트레할로오스가 첨가된 생물학적 용액을 여과하는 단계, (c) 상기 여과된 생물학적 용액으로부터, TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀을 분리하는 단계, 및 (d) 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하고, 상기 트레할로오스가 첨가된 완충용액을 이용한 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여, 상기 분리된 엑소좀에 대한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계.
한편, 상기 (d) 단계에서 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하면, 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 효과적으로 수득할 수 있다(도 6A 내지 도 6E 참조). TFF에 의한 엑소좀 분리 전의 사전 여과 과정((b) 단계)과 엑소좀 분리 후 TFF에 의한 탈염 및 버퍼교환 과정((d) 단계)에서 트레할로우스를 사용하는 것에 의해 고순도의 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있다. 한편, 트레할로오스는 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 엑소좀을 효율적으로 분별할 수 있는 기능을 부여한다.
상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행할 수 있다. 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행할 수 있다. 또한, TFF를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 ㎛ TFF 필터를 사용할 수 있다. 상기 (c) 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함할 수 있다.
본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 상기 생물학적 용액은 줄기세포 배양액일 수 있다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용되는 엑소좀은 전술한 바와 같은 분리방법에 따라 수득된 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 발명의 일 구체예의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하기 전에 멸균 필터를 사용하여 제균하는 과정을 더 포함하여 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 바람직하게는 주사 투여 방식으로 적용된다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다.
본 발명의 일 구체예의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료 등을 위한 약학 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부의 상태 조절이란 피부의 상태를 개선시키고/시키거나 피부의 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부의 상태 개선이란 피부 조직의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부의 상태 개선이란 피부주름 개선, 피부재생, 피부보습, 피부탄력 개선, 볼륨감 증대 등(예를 들어, 볼륨업(volume-up), 피부팽만 등)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 상기 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 이용한, 상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 엑소좀의 안정성을 증가시킬 수 있고 히알루론산 기반 필러 본연의 미용 효과를 부가할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 엑소좀의 안정성이 증가됨에 따라 엑소좀으로부터 유래되는 미용적 또는 치료적 효과를 오래 지속할 수 있고, 미용적 또는 치료적 효과가 오래 지속되면서 주사가 편리하고 환자에게 고통을 덜 주는 히알루론산 기반의 필러의 구현에 적합하게 응용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 고유 분리방법에 의해 분리 정제된 엑소좀을 저농도로 히알루론산 기반의 필러에 혼합 제조가 가능하고 엑소좀 입자수를 많이 필요로 하는 경우 보다 균질한 혼합이 용이하다. 이로써, 본 발명은 미용이나 치료적 효과를 위해 엑소좀을 혼합하는 경우 발생할 수 있는 히알루론산 기반의 필러 조성물의 전체 볼륨이 증가하는 문제를 방지할 수 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 생물학적 용액으로부터 엑소좀을 제조하는 방법에 있어서 엑소좀을 분리 및 정제하는 과정을 설명하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 생물학적 용액, 예를 들어 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 생물학적 용액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀의 생산성은 "생물학적 용액, 예를 들어 줄기세포 배양액(CM) 단위 mL 당 얻어진 엑소좀의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4A 내지 도 4E는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 4A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 4D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 4E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5A 내지 도 5C는 트레할로오스 첨가에 따라 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀이 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 트레할로오스의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6A 내지 도 6C는 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀의 제조과정에서 트레할로오스 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "도 6A"는 제조 과정 전과정에서 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6B"는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6C"는 트레할로오스를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "도 6D"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "도 6E"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 8은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 히알루론산 필러에 섞은 후 NTA 장비를 이용하여 촬영한 사진이다.
도 9는 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물의 경우 엑소좀의 표면 단백질인 CD63이 트립신 처리에도 분해되지 않고 안정적으로 유지되고 있는 것을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다. 트레할로오스 처리에 따라 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있는 효과를 확인한 결과는 도 6A 내지 도 6E에 도시하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀, 배양액, 및 TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(ThermoFisher Scientific에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다. 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀이 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법에 의하여 모니터링하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 그 결과 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거됨을 알 수 있었다.
본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀을 분리하는 경우 생산성과 순도를 독립적인 다섯 배치에서 비교한 결과를 도 3에 도시하였다. 독립적인 다섯 배치로부터 얻어진 결과를 분석한 결과, 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 안정적으로 엑소좀을 분리할 수 있음을 확인하였다.
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 4A 내지 도 4C에 도시하였다.
TFF 방법으로 엑소좀을 분리한 후, 트레할로오스의 첨가 여부에 따른 엑소좀의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 5A 내지 도 5C에 도시하였다. 트레할로오스 농도를 0 중량%, 1 중량% 및 2 중량%로 증가시켰고(도 5A 내지 도 5C의 위에서부터 아래), 3회 반복하여 실험하였다. 트레할로오스가 존재하지 않은 경우 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 트레할로오스의 첨가량을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.
TFF 방법으로 엑소좀을 분리하는 과정에 트레할로오스의 첨가에 따른 효과를 추가로 조사하였다. 도 6A 내지 도 6C에서 보는 바와 같이 엑소좀의 제조과정 전과정에 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀을 얻을 수 있었다(도 6A). 반면 트레할로오스를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용하되, 탈염과 버퍼교환 과정에서만 트레할로오스를 첨가하여 TFF 과정을 진행한 경우나, 트레할로오스를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀을 얻었다(도 6B 및 도 6C).
분리된 엑소좀의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀을 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀의 농도도 5배 이상 높았다(도 6D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀의 평균 크기도 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 6E).
도 4D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.
도 4E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
한편, 본 발명의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사용되는 엑소좀은 전술한 바와 같은 실시예들의 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기 실시예들에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 7).
실시예 5: 안정화된 엑소좀의 필러 조성물의 준비
실시예 2에서 준비된 엑소좀을 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하여 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 제조하였다. 히알루론산 염을 사용하는 경우에는 히알루론산 나트륨을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에서 사용되는 다양한 히알루론산 염이 사용될 수 있다. 또한, 히알루론산 겔은 가교되지 않은 히알루론산 또는 가교된 히알루론산 겔을 사용할 수 있는데, 가교된 겔로서는, 예를 들어 레스틸렌을 사용할 수 있다.
히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 혼합된 히알루론산 기반의 필러 조성물을 가열 멸균 또는 멸균 필터를 이용하여 제균하였다. 멸균된 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 혼합된 히알루론산 기반의 필러 조성물에 엑소좀을 혼합하여 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 제조하였다. 이때, 엑소좀을 히알루론산 기반의 필러 조성물에 혼합하기 전 멸균 필터를 이용하여 추가로 멸균할 수 있다. 안정화된 엑소좀의 필러 조성물 내의 엑소좀의 농도는 예를 들어 대략 1×105 입자/mL 내지 1×1011 입자/mL (또는 단백질 농도로는 대략 0.001 내지 1000 μg/mL)로 조정될 수 있다.
실시예 2에서 준비된 엑소좀을 1×108 입자/mL 농도로 히알루론산 필러에 섞은 후 즉시 NTA 장비를 이용하여 엑소좀이 히알루론산 기반의 필러 조성물 내에 잘 혼합되었는지를 확인하였다(도 8). 또한, 엑소좀이 혼합된 히알루론산 기반의 필러를 영하 20℃에 30일 간 보관한 후 다시 NTA 장비를 이용하여 촬영하여 엑소좀이 히알루론산 기반의 필러 조성물 내에 양호하게 유지되고 있는지를 확인하였다(도 8). 그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 엑소좀이 히알루론산 기반의 필러 조성물 내에 잘 혼합되어 있고 냉동 보관 후에도 혼합 상태가 양호하게 유지되고 있음을 촬영 이미지로부터 확인할 수 있었다. 한편, 도 8의 오른쪽 마지막 사진은 엑소좀이 없는 음성대조군 사진으로서, 엑소좀이 혼합되어 있지 않은 필러에는 거의 입자가 존재하지 않은 것을 확인시켜 주고 있다.
상기와 같은 결과들로부터 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 미용적 또는 치료적 효과가 오래 지속되면서 주사가 편리하고 환자에게 고통을 덜 주는 히알루론산 기반의 필러의 구현에 적합하게 응용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6: 히알루론산에 의한 엑소좀의 안정성 증가 확인 실험
CD63 단백질은 엑소좀의 표면에 특이적으로 존재하는 막단백질로서 세포로부터 분비 또는 방출된 소포체가 엑소좀인지 여부를 확인할 때 사용되는 중요한 마커 단백질이다. 줄기세포 배양액으로부터 분리된 소포체에서 CD63 단백질이 검출되지 않으면 해당 배양액에 엑소좀이 존재하지 않거나 엑소좀이 안정성 문제 때문에 고유 특성을 잃은 것으로 판단할 수 있다. 따라서, 특정 조건에서 CD63 마커 단백질의 검출여부에 의해 엑소좀의 안정성을 평가할 수 있다. 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물에서 히알루론산에 의한 엑소좀의 안정성 증대 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
실시예 2에서 준비된 엑소좀을 8배 농축한 엑소좀 샘플과, 이러한 엑소좀에 히알루론산을 혼합한 샘플(본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물에 해당)에 대해, 단백질 분해 효소인 트립신을 처리하고 엑소좀 표면 마커 단백질인 CD63을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 8배 농축한 엑소좀에 24 mg/mL 농도의 히알루론산 30 mg을 혼합하여 준비하였다. 상기 엑소좀 단독 샘플과, 상기 엑소좀에 히알루론산을 혼합한 샘플에 대해 5 μL의 트립신(Sigma에서 구입)을 처리하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 프로테아제 저해제 칵테일(Protease inhibitor cocktail)(Sigma에서 구입)을 처리하여 트립신의 활성을 억제하였다.
SDS-PAGE 겔에 상기 샘플들의 로딩을 용이하게 하기 위하여, 히알루론산을 분해하는 히알루로니다아제 (hyaluronidase)(Sigma에서 구입)를 최종 농도로 1.25 mg/mL의 농도로 처리하고 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 엑소좀 샘플에 트립신을 처리하지 않은 음성대조군도 전기영동하였다. 먼저, 동량의 단백질을 8% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여 전개시킨 후 PVDF 막에 전기적으로 블로팅하였다. 항-CD63 항체와 단백질 간의 비특이적 결합을 차단하기 위해 상기 막을 5% 스킴 밀크(skim milk)가 포함된 TBS-T 완충용액 (TBS 내의 0.1% Tween-20)에 넣어 1시간 동안 상온에서 블로킹하였다. 이후 항-CD63 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 1차 처리하고 TBS-T 완충용액으로 10분간 3회 세척한 후, HRP가 연결된 항-토끼 면역글로불린 G(Jackson Immuno Research　Laboratories Inc.)를 상온에서 1시간 동안 2차 처리하고 다시 TBS-T 완충용액으로 10분간 3회 세척하였다. 최종 PVDF 막에 화학발광시약(SuperSignal West Femto Maximum sensitivity Substrate, Thermo Scientific)을 이용하여 CD63 특이적인 단백질 발현을 확인하였다.
상기와 같은 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 엑소좀과 히알루론산을 혼합한 샘플(본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물)은 트립신에 의한 CD63 엑소좀 표면 단백질 분해를 억제하고 엑소좀의 안정성을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다(도 9의 가운데 레인 참조). 반면에, 엑소좀 단독 샘플의 경우 트립신 처리에 의해 CD63 엑소좀 표면 단백질이 관찰되지 않아 CD63 단백질의 분해 및 엑소좀의 변성 내지는 파괴가 있었음을 알 수 있다(도 9의 오른쪽 레인).
도 9에 도시된 바와 같이 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물(도 9의 가운데 레인)은 엑소좀의 표면 단백질인 CD63이 트립신 처리에도 분해되지 않고 안정적으로 유지되고 있는 것을 알 수 있다. 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물에 대한 트립신 처리 후 CD63 단백질 웨스턴 블랏 결과는 엑소좀에 트립신이 처리되지 않은 샘플(도 9의 왼쪽 레인)과 거의 동일하다.
이러한 결과를 종합하면, 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 엑소좀의 안정성을 증가시키는 효과가 있다고 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 엑소좀의 안정성이 증가됨에 따라 엑소좀으로부터 유래되는 미용적 또는 치료적 효과를 오래 지속할 수 있고, 미용적 또는 치료적 효과가 오래 지속되면서 주사가 편리하고 환자에게 고통을 덜 주는 히알루론산 기반의 필러의 구현에 적합하게 응용될 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (22)

  1. 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과,
    상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는 엑소좀을 포함하는, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    가교되지 않은 히알루론산 겔, 또는 가교된 히알루론산 겔 중 적어도 1종을 더 포함하는, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 가교된 히알루론산 겔은 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르 (BDDE), 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄, 1,4-비스글리시딜옥시부탄, 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌 및 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시사이클로헥산 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 가교결합제로 가교결합된 히알루론산 겔인, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 줄기세포 유래의 엑소좀, 식물 유래의 엑소좀, 또는 효모 유래의 엑소좀인, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 줄기세포 유래의 엑소좀인, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 식물 유래의 엑소좀은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀 또는 에델바이스 유래의 엑소좀인, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 장미 줄기세포 유래의 엑소좀은 장미의 배(胚) 또는 잎 유래 캘러스의 배양액, 또는 장미의 형성층 또는 전형성층 유래 캘러스의 배양액으로부터 분리 정제된 것인, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 에델바이스 유래의 엑소좀은 에델바이스의 잎 또는 줄기 조직으로부터 얻은 식물세포의 배양액, 또는 에델바이스 종자로부터 발아된 떡잎에 상처를 내어 유도시킨 캘러스의 배양액으로부터 분리 정제된 것인, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  9. 제4항에 있어서,
    상기 효모 유래의 엑소좀은 와인 효모 유래의 엑소좀 또는 갈락토마이세스 유래의 엑소좀인, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 와인 효모 유래의 엑소좀은 와인 효모 배양액, 와인 효모 발효물 또는 포도주로부터 분리 정제된 것인, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 갈락토마이세스 유래의 엑소좀은 갈락토마이세스 배양액 또는 갈락토마이세스 발효물로부터 분리 정제된 것인, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하기 전에 멸균 필터를 사용하여 제균하는 것을 특징으로 하는, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 하기의 단계들을 수행하여 수득되는, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물:
    (a) 생물학적 용액에 트레할로오스를 첨가하는 단계, (b) 상기 트레할로오스가 첨가된 생물학적 용액을 여과하는 단계, (c) 상기 여과된 생물학적 용액으로부터, TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀을 분리하는 단계, 및 (d) 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하고, 상기 트레할로오스가 첨가된 완충용액을 이용한 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여, 상기 분리된 엑소좀에 대한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행하는 것을 특징으로 하는, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    TFF(Tangential Flow Filtration)를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da, 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm TFF 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함하는, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 생물학적 용액은 줄기세포 배양액인, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 줄기세포는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포인, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료를 위한 약학 조성물로 제조되는, 안정화된 엑소좀의 필러 조성물.
  21. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 안정화된 엑소좀의 필러 조성물 을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법.
  22. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 안정화된 엑소좀의 필러 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료 방법.
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