CN116042422B - 一种酵母来源外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种酵母来源外泌体及其制备方法和应用，所述制备方法包括如下步骤：(1)将酵母培养至对数期时，进行仿真环境亚刺激处理，同时加入氨基酸，之后继续培养至稳定期，得到发酵液；(2)将所述发酵液进行固液分离得到细胞外泌体；将所述细胞外泌体与糖类混合，得到所述酵母来源外泌体。本发明采用仿真环境亚刺激对酵母细胞进行刺激，酵母细胞产生应激反应，分泌的高活性外泌体具备良好的抗炎症和抗氧化功效。

Description

一种酵母来源外泌体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酵母来源外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
延缓皮肤衰老是一个永恒的研究课题，近几年来我国抗衰市场容量持续高速增长。根据福布斯和Euromonitor的调查数据显示，2018年中国抗衰市场规模已达到472亿元，同比增速高达17.0％；2019年规模达到575亿元，同比增长21.8％，约占整体化妆品市场规模的12％；且从2016年起，呈现持续加速趋势，近五年复合增速达11.8％，具有非常好的前景。根据中国香精香料化妆品工业协会发布的数据，目前女性最关心、最热门的保养服务项目就是抗衰老保养，其在所有项目中的提及率高达72.2％，有90％的中国女性都采取过抗衰措施。预测到2021年，全球抗衰市场规模将达到2160亿美元。目前市场上普通延衰化妆品的活性成分主要有多肽、植物活性多酚等，延衰的产品主要面临着产品组合单一、市场定位重复、同质化现象严重等问题。
有研究者发现，酵母具有很强的应激反应能力，当它受到应激胁迫，比如紫外照射，热刺激或化学损伤等氧化胁迫时，酵母会在适应过程中，诱导进化出一套完整的感应机制，自动迅速合成许多具有自我修复性的保护性物质，以抵御这些氧化损伤所引起的伤害作用。
外泌体是由细胞释放出来的生物分子纳米结构，它们携带特定的生物分子信息，自30多年前被发现以来，因为其独特生物学特性及功能研究热度不衰，最新研究表明，干细胞的外泌体在机体抗衰老过程中发挥非常重要的作用。目前已知干细胞外泌体有抗衰与美肤功效的核心因子具有上百种，例如细胞因子FGF、EGF，细胞信号蛋白Wnt4、Wnt11，抗衰老miRNA：miRNA-124a，miRNA125b，miRNA21，miRNA-146a，miRNA-181c，miRNA-let-7b等。但同时干细胞产业化及应用存在一定的限制。酵母是一类单细胞真核模式生物，蛋白质含量为40％-60％，其蛋白质水解产物包括人体必需的八种氨基酸，研究酵母外泌体的制备方法及功效，对促进酵母在药品、食品、化妆品等领域中的应用，具有重大意义。
CN110777083A公开了一种从酵母细胞中提取获得的外泌体，所述外泌体内部含有特异肽段蛋白。提供了一种从酵母细胞中提取外泌体的方法，包括以下步骤：对酵母细胞进行培养，获得细胞培养物后进行离心，收集上清过滤后，将上清与分离液混合，再次离心，获得的沉淀物即为酵母细胞外泌体。该方法的外泌体是从酵母细胞中提取获得，它含有特异肽段蛋白，基于该特点可将其作为酵母的标志物，运用于临床，具有极大的市场前景和应用价值。
CN114009754A公开了一种发酵植物外泌体的制备方法，通过酶解、混料、灭酶提取、发酵培养、离心等工艺制备得到新型的食品原料发酵植物外泌体。与传统植物外泌体的制备方法不同，发酵植物外泌体主要通过酶解和发酵两个重要环节实现，通过酶制剂在特定温度和时间下的酶解作用，发挥最佳酶解效果，通过发酵菌粉在特定温度和时间下的发酵作用达到一定的酸度，得到发酵植物外泌体。
现有技术公开了一系列外泌体的制备方法，但是由于外泌体生物活性高而无法长期保存，因此，开发一种高生物活性、可以长期保存并且具备良好的护肤功效的外泌体是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酵母来源外泌体及其制备方法和应用，可以长期保持高生物活性，并且可以用于缓解皮肤炎症、防止氧化。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种酵母来源外泌体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将酵母培养至对数期时，进行仿真环境亚刺激处理，同时加入氨基酸，之后继续培养至稳定期，得到发酵液；
(2)将所述发酵液进行固液分离得到细胞外泌体；将所述细胞外泌体与糖类混合，得到所述酵母来源外泌体。
本发明采用仿真环境亚刺激对处于对数期的酵母进行刺激，酵母细胞产生应激反应，分泌高活性外泌体，同时加入氨基酸，可以与其他物质复合更有效发挥抗氧化作用；将发酵液进行固液分离，有效去除固体杂质，可以获取纯度更高的外泌体；将提取的外泌体与糖类混合，是由于外泌体生物活性较高，不易保存，当和糖类进行混合后，在不降低生物活性的同时可以有效提升保存时间。
优选地，所述酵母的接种量为6-10％，例如可以为7％、8％或9％等。
优选地，所述酵母包括啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母或假丝酵母中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述酵母为啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和假丝酵母的组合。
优选地，所述假丝酵母为柬埔寨藤黄(GARCINIA CAMBOGIA)。
优选地，所述啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和假丝酵母的接种比为1:(0.8-1.2):(0.8-1.2)，例如可以为1:0.8:0.9、1:0.9:0.9、1:0.8:1、1:1:0.9、1:1:1、1:1.1:1.2或1:1.2:1.1等。
优选地，所述培养至对数期的时间为8-15h，例如可以为9h、10h、12h、13h或14h等。
优选地，所述继续培养至稳定期的时间为30-45h，例如可以为32h、35h、38h或42h等。
优选地，步骤(1)中所述培养至对数期和继续培养至稳定期的温度各自独立地为25-30℃，例如可以为26℃、27℃、28℃或29℃等。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述仿真环境亚刺激包括氧化应激刺激、高渗透压刺激、高温刺激或低温刺激中的任意一种。
优选地，所述氧化应激刺激采用的试剂为双氧水。
优选地，所述氧化应激刺激时培养基中H2O2的含量为0.08-0.25mmol/L，例如可以为0.1mmol/L、0.13mmol/L、0.16mmol/L、0.2mmol/L、0.24mmol/L等，优选为0.2mmol/L。
优选地，所述高渗透压刺激采用的试剂为盐水溶液。
优选地，所述盐水溶液包括氯化钾水溶液和/或氯化钠水溶液。
优选地，所述高渗透压刺激时培养基中盐的浓度为0.3-0.8mmol/L，例如可以为0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L或0.7mmol/L等，优选为0.5mmol/L。
优选地，所述高温刺激的温度为37-40℃，例如可以为38℃、39℃或39.5℃等。
优选地，所述低温刺激的温度为0-15℃，例如可以为1℃、4℃、8℃或12℃等。
优选地，所述氨基酸包括半胱氨酸、甲硫氨酸或胱氨酸中的一种或至少两种的组合，优选为半胱氨酸。
优选地，所述氨基酸的添加量占培养基的质量百分比为0.1-0.25％，例如可以为0.15％、0.2％或0.24％等。
优选地，所述固液分离包括离心、一次过滤、浓缩、二次过滤的步骤。
优选地，所述离心的时间为8-12min，例如可以为9min、10min或11min等；转速为3000-6000rpm，例如可以为4000rpm、4500rpm或5000rpm等。
优选地，所述一次过滤的滤膜孔径为80-100KDa，例如可以为85KDa、90KDa或95KDa等。
优选地，所述二次过滤的滤膜孔径为20-30KDa，例如可以为23KDa、26KDa或29KDa等。
优选地，所述浓缩至体积缩小至1/6-1/4，例如可以为1/6、1/5或1/4等。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明固液分离采用离心和两次过滤进行，离心的目的是除去发酵液中的培养基杂质和细胞碎片，第一次过滤后收集上清液，有效除去小分子，第二次过滤是在浓缩之后进行，采用孔径较小的滤膜进行过滤，有效分离出溶液，留用沉淀即为细胞外泌体。
优选地，所述糖类为海藻多糖溶液。
优选地，所述海藻多糖溶液中海藻多糖的质量百分含量为1-4％，例如可以为2％、2.5％或3％等。
优选地，所述混合时海藻多糖溶液与细胞外泌体的质量比为1:(0.8-1.2)，例如可以为1:0.9、1:1或1:1.1等。
优选地，所述混合后还包括冷冻干燥的步骤。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
(1)在25-30℃条件下将酵母培养8-15h，至对数期时，进行仿真环境亚刺激处理，同时加入氨基酸，继续培养30-45h，至稳定期时，得到发酵液；
所述酵母的接种量为6-10％，所述酵母为啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和假丝酵母的组合，所述啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和假丝酵母的接种比为1:(0.8-1.2):(0.8-1.2)；
所述仿真环境亚刺激包括氧化应激刺激、高渗透压刺激、高温刺激或低温刺激中的任意一种，所述氧化应激刺激采用的试剂为双氧水，所述氧化应激刺激时培养基中H2O2的含量为0.08-0.25mmol/L；所述高渗透压刺激采用的试剂为盐水溶液，所述盐水溶液包括氯化钾水溶液和/或氯化钠水溶液，所述高渗透压刺激时培养基中盐的浓度为0.3-0.8mmol/L；所述高温刺激的温度为37-40℃；所述低温刺激的温度为0-15℃；
所述氨基酸包括半胱氨酸、甲硫氨酸或胱氨酸中的一种或至少两种的组合，所述氨基酸的添加量占培养基的质量百分比为0.1-0.25％；
(2)将所述发酵液进行8-12min，转速为3000-6000rpm的离心、采用孔径为80-100KDa的滤膜进行一次过滤、浓缩、采用孔径为20-30KDa的滤膜进行二次过滤得到细胞外泌体；将所述细胞外泌体与海藻多糖溶液混合后，进行冷冻干燥，得到所述酵母来源外泌体；
所述海藻多糖溶液中海藻多糖的质量百分含量为1-4％，所述混合时海藻多糖溶液与细胞外泌体的质量比为1:(0.8-1.2)。
上述各项数值范围中的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第二方面，本发明提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体通过第一方面提供的制备方法制备得到。
第三方面，本发明提供一种如第二方面提供的酵母来源外泌体在保健品、药品或化妆品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明采用仿真环境亚刺激对酵母细胞进行刺激，酵母细胞产生应激反应，分泌高活性外泌体，同时加入氨基酸，可以与其他物质复合更有效发挥抗氧化作用；将提取的外泌体与糖类混合，在不降低生物活性的同时可以有效提升保存时间；本发明制备的酵母来源外泌体具备良好的抗炎症和抗氧化功效，同时可促进I和III型胶原蛋白再生。
附图说明
图1为实施例1制备的酵母来源外泌体的电镜图；
图2为对比例1制备的酵母来源外泌体的电镜图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本文所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，还可包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
本发明所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例性地”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本文中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。
以下实施例中试剂来源如下：
啤酒酵母：广东工业大学天然药物与绿色研究所提供；
巴斯德毕赤酵母：广东工业大学天然药物与绿色研究所提供；
假丝酵母：柬埔寨藤黄(GARCINIA CAMBOGIA)，广东工业大学天然药物与绿色研究所提供；
海藻多糖：西安四叶草生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体的制备方法如下：
(1)取已活化的啤酒酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到啤酒酵母种子液；
取已活化的巴斯德毕赤酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到巴斯德毕赤酵母种子液；
取已活化的假丝酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到假丝酵母种子液；
(2)将啤酒酵母种子液、巴斯德毕赤酵母种子液和假丝酵母种子液按1:1:1接种到装有250mL新鲜培养基的1000mL三角瓶中，接种量之和为8％，28℃，170r/min，摇床培养，培养酵母细胞至对数中期；
(3)向培养基中加入双氧水，使培养基中含0.2mmol/L双氧水，同时加入0.25％的L-半胱氨酸，继续培养36h到达稳定期，得到发酵液；
(4)将发酵液进行10min，转速为5000rpm的离心，收集上清液，采用孔径为100KDa的滤膜进行过滤，收集上清液，浓缩至原体积的1/5后，采用孔径为30KDa的滤膜进行过滤，收集固体；
(5)将固体与等质量的3％海藻多糖溶液混合，冷冻干燥24h，制备得到所述酵母来源外泌体。
实施例2
本实施例提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体的制备方法如下：
(1)取已活化的啤酒酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到啤酒酵母种子液；
取已活化的巴斯德毕赤酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到巴斯德毕赤酵母种子液；
取已活化的假丝酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到假丝酵母种子液；
(2)将啤酒酵母种子液、巴斯德毕赤酵母种子液和假丝酵母种子液按1:0.9:1接种到装有250mL新鲜培养基的1000mL三角瓶中，接种量之和为7％，28℃，170r/min，摇床培养，培养酵母细胞至对数中期；
(3)向培养基中加入氯化钾，使培养基中含0.5mmol/L氯化钾水溶液，同时加入0.2％的半胱氨酸，继续培养40h到达稳定期，得到发酵液；
(4)将发酵液进行10min，转速为5000rpm的离心，收集上清液，采用孔径为90KDa的滤膜进行过滤，收集上清液，浓缩至原体积的1/4后，采用孔径为20KDa的滤膜进行过滤，收集固体；
(5)将固体与等质量的2％海藻多糖溶液混合，冷冻干燥30h，制备得到所述酵母来源外泌体。
实施例3
本实施例提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体的制备方法如下：
(1)取已活化的啤酒酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到啤酒酵母种子液；
取已活化的巴斯德毕赤酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到巴斯德毕赤酵母种子液；
取已活化的假丝酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到假丝酵母种子液；
(2)将啤酒酵母种子液、巴斯德毕赤酵母种子液和假丝酵母种子液按1:1:0.8接种到装有250mL新鲜培养基的1000mL三角瓶中，接种量之和为9％，28℃，170r/min，摇床培养，培养酵母细胞至对数中期；
(3)将培养基中温度升至37℃，并加入0.15％的L-半胱氨酸，继续培养35h到达稳定期，得到发酵液；
(4)将发酵液进行10min，转速为5000rpm的离心，收集上清液，采用孔径为100KDa的滤膜进行过滤，收集上清液，浓缩至原体积的1/5后，采用孔径为20KDa的滤膜进行过滤，收集固体；
(5)将固体与等质量的4％海藻多糖溶液混合，冷冻干燥30h，制备得到所述酵母来源外泌体。
实施例4
本实施例提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体的制备方法如下：
其与实施例3的区别仅在于步骤(3)，本实施例的步骤(3)为：
将培养基中温度降至10℃，并加入0.15％的L-半胱氨酸，继续培养35h到达稳定期，得到发酵液。其余原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(1)和(2)，本实施例的步骤(1)和(2)依次为：
(1)取已活化的啤酒酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到啤酒酵母种子液；
取已活化的巴斯德毕赤酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到巴斯德毕赤酵母种子液；
(2)将啤酒酵母种子液和巴斯德毕赤酵母种子液按1:1接种到装有250mL新鲜培养基的1000mL三角瓶中，接种量之和为8％，28℃，170r/min，摇床培养，培养酵母细胞至对数中期。其余原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例6
本实施例提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(1)和(2)，本实施例的步骤(1)和(2)依次为：
(1)取已活化的啤酒酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到啤酒酵母种子液；
取已活化的假丝酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到假丝酵母种子液；
(2)将啤酒酵母种子液和假丝酵母种子液按1:1接种到装有250mL新鲜培养基的1000mL三角瓶中，接种量之和为8％，28℃，170r/min，摇床培养，培养酵母细胞至对数中期。其余原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例7
本实施例提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(1)和(2)，本实施例的步骤(1)和(2)依次为：
(1)取已活化的巴斯德毕赤酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到巴斯德毕赤酵母种子液；
取已活化的假丝酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到假丝酵母种子液；
(2)将巴斯德毕赤酵母种子液和假丝酵母种子液按1:1接种到装有250mL新鲜培养基的1000mL三角瓶中，接种量之和为8％，28℃，170r/min，摇床培养，培养酵母细胞至对数中期。其余原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例8
本实施例提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(1)和(2)，本实施例的步骤(1)和(2)依次为：
(1)取已活化的啤酒酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到啤酒酵母种子液；
(2)将啤酒酵母种子液接种到装有250mL新鲜培养基的1000mL三角瓶中，接种量为8％，28℃，170r/min，摇床培养，培养酵母细胞至对数中期。其余原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例9
本实施例提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(1)和(2)，本实施例的步骤(1)和(2)依次为：
(1)取已活化的巴斯德毕赤酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到巴斯德毕赤酵母种子液；
(2)将巴斯德毕赤酵母种子液接种到装有250mL新鲜培养基的1000mL三角瓶中，接种量为8％，28℃，170r/min，摇床培养，培养酵母细胞至对数中期。其余原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
实施例10
本实施例提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(1)和(2)，本实施例的步骤(1)和(2)依次为：
(1)取已活化的假丝酵母平板菌种，接种到装有5mL YEPD培养基的25mL三角锥形瓶中，28℃，170r/min摇床振荡培养11h，得到假丝酵母种子液；
(2)将假丝酵母种子液接种到装有250mL新鲜培养基的1000mL三角瓶中，接种量为8％，28℃，170r/min，摇床培养，培养酵母细胞至对数中期。其余原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
对比例1
本对比例提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(3)，本对比例的步骤(3)为：
向培养基中加入占培养基质量0.25％的L-半胱氨酸，继续培养36h到达稳定期，得到发酵液。其余原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供一种酵母来源外泌体，所述酵母来源外泌体的制备方法如下：
其与实施例1的区别仅在于步骤(3)，本对比例的步骤(3)为：
向培养基中加入双氧水，使培养基中含0.2mmol/L双氧水，继续培养36h到达稳定期，得到发酵液。其余原料、用量及制备方法均与实施例1相同。
测试例1
酵母来源外泌体对双氧水损伤的NIH-3T3细胞的修复作用
将小鼠NIH-3T3细胞加入含有10％FBS胎牛血清、1％双抗(链霉素100mg/mL、青霉素100U/mL)和90％DMEM完全培养基中培养。NIH-3T3细胞培养至满后，消化离心计数，配制5万/mL细胞悬液；在96孔板中每孔接种100μL细胞悬液(按5000细胞/每孔的密度)；培养24h后，扣掉培养基，用PBS溶液轻洗1遍，加入100μL的600μmoL/mL的H2O2溶液(原浓度100mM,体积根据样品板需要量核算+2mL)；2h后，吸出双氧水，用120μL PBS溶液轻洗1遍，给药组加入100μL酵母细胞外泌体溶液，模型组，阴性对照组，空白组加入含10％的FBS的完全培养基；48h后，吸出提取物溶液，用120μL PBS轻洗1遍后，加入100μL MTT溶液(0.5mg/mL)；(原MTT配制浓度为5mg/mL，避光分装-20℃保存，体积根据样品板需要量核算+2mL)；4h后，倒去MTT溶液(不要用PBS洗)，加入150μL DMSO溶液，10min孵化，使用酶标仪，震荡20s，490nm或570nm测定OD值，计算出细胞的相对存活率，其中，酵母细胞外泌体溶液代表实施例1-10、对比例1-2制备的酵母来源外泌体分别溶于PBS，得到的1.6mg/mL、0.4mg/mL的溶液。
细胞的相对存活率％＝(OD1-OD3)/(OD2-OD3)×100％，
OD1：应激组/对照组的吸光度值；
OD2：空白对照组的吸光度值；
OD3：调零组的吸光度值。
实施例1-10、对比例1-2制备的酵母来源外泌体测试得到的NIH-3T3细胞相对存活率如表1所示。
测试例2
酵母来源外泌体对RAW264.7细胞分泌NO的抑制作用
将小鼠巨噬细胞系RAW264.7加入含有10％FBS胎牛血清、1％双抗(链霉素100mg/mL、青霉素100U/mL)和90％DMEM完全培养基中培养。RAW264.7细胞培养至满后，加入2mL完全培养基，用细胞刮刀将细胞刮打下来，吹打均匀收集至离心管，1000rpm离心3min，消化离心计数，配制2万/mL细胞悬液，在96孔板中每孔接种100μL细胞悬液(2000细胞/每孔)；培养12-20h至细胞贴壁；
吸走96孔板上每个孔的培养基，空白对照，阴性对照组，留1列作为模型组加入含10％ FBS的1640完全培养基，给药组用10％完全培养基按药物类型和浓度配制，每组加入100μL含药的完全培养基。将24孔板放入培养箱，继续培养24h；细胞培养约24h，吸走96孔板上每个孔的培养基，空白组，阴性对照组加入含10％ FBS的1640完全培养基，模型组，给药组加入1μg/mL的LPS溶液；将24孔板放入培养箱，继续培养24h；吸取50μL上清于96板中，按NO试剂检测NO含量，测试吸光度酶标仪540nm波长测吸光值(OD)；数据处理与计算，计算不同浓度待测样品处理后细胞的OD值。做标准曲线，计算处理组的NO含量。其中，给药组代表实施例1-10、对比例1-2制备的酵母来源外泌体。
NO的含量X，按下式计算(Y为峰面积)：
Y＝(0.0074)X+(0.0778)，R2＝0.9996。
实施例1-10、对比例1-2制备的酵母来源外泌体测试得到的NO含量如表1所示。
测试例3
酵母来源外泌体对NIH-3T3细胞分泌胞外基质胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的促进作用
(1)NIH-3T3细胞培养至满后，消化离心计数，配制5万/mL细胞悬液，在96孔板中每孔接种100μL细胞悬液(5000细胞/每孔)；培养12-20h至细胞贴壁；
(2)析出培养基，并用PBS洗板1次，在药物组中分别加入100μL用完全培养基稀释的实施例1-10、对比例1-2制备的酵母来源外泌体溶液，浓度为1.6mg/mL、0.4mg/mL，模型组、空白组加入含10％的FBS的完全培养基，于培养箱中培养24h或48h；
(3)将96孔板中的培养液吸入0.5mL的EP管中，在12000r/min，4℃条件下离心10min(注意提前打开离心机预冷)，收集上清；
(4)应用双抗体夹心法测定标本中鼠I型、III型胶原蛋白水平。用纯化的鼠I型、III型胶原蛋白捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入鼠I型、III型胶原蛋白，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的鼠I型、III型胶原蛋白呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算样品中鼠I型、III型胶原蛋白含量。测试结果如表1所示。
测试例4
电镜实验
透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)是一种使用较为广泛的纳米显微成像技术，常被用于EVs的表征，可以从外泌体的形态和大小两个方面对外泌体进行鉴定分析。鉴定原理：将经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度等相关，因此可形成明暗不同的影像，影像在放大、聚焦后在成像器件(如荧光屏、胶片、以及感光耦合组件)上显示出来。在使用TEM对EVs进行成像过程中，常需使用重金属盐，如四氧化锇和乙酸铀等试剂对EVs进行负染，以突出EVs的脂质膜结构，本测试例通过乙酸铀进行染色扫描电镜观察TEM，示例性地，实施例1制备的酵母来源外泌体的电镜观察情况如图1所示，对比例1制备的酵母来源外泌体的电镜观察情况如图2所示；如图所示，可以明显看到实施例1、对比例1制备得到的外泌体的大小在100nm左右，具有双层囊膜结构，形态和大小复合外泌体的结构特征。
表1
实施例1-4制备的酵母来源外泌体能够对双氧水氧化损伤的NIH-3T3细胞具备修复作用，表现出良好的抗氧化生物活性，三种酵母菌协同作用增进外泌体的生物活性，当使用两种酵母菌或者单一酵母菌时，双氧水氧化损伤的NIH-3T3细胞的存活率则会大幅降低；当酵母菌对数中期未进行仿真环境亚刺激时，双氧水氧化损伤的NIH-3T3细胞的存活率则会显著降低；当酵母菌对数中期未加入氨基酸时，双氧水氧化损伤的NIH-3T3细胞的存活率则显著降低。
实施例1-4制备的酵母来源外泌体能够抑制LPS诱导的巨噬细胞对NO的产生，具有良好的抗炎症生物活性，三种酵母菌协同作用增进外泌体的生物活性，当使用两种酵母菌或者单一酵母菌时，对于巨噬细胞产生NO的抑制作用显著减弱；当酵母菌对数中期未进行仿真环境亚刺激时，对于巨噬细胞产生NO的抑制作用显著减弱；当酵母菌对数中期未加入氨基酸时，对于巨噬细胞产生NO的抑制作用显著减弱。
实施例1-4制备的酵母来源外泌体能够显著促进细胞外基质胶原蛋白I和胶原蛋白III的生成，三种酵母菌协同作用增进外泌体的生物活性，当使用两种酵母菌或者单一酵母菌时，对于促进细胞外基质胶原蛋白I和胶原蛋白III的生成显著减弱；当酵母菌对数中期未进行仿真环境亚刺激时，对于促进细胞外基质胶原蛋白I和胶原蛋白III的生成显著减弱；当酵母菌对数中期未加入氨基酸时，对于促进细胞外基质胶原蛋白I和胶原蛋白III的生成显著减弱。
因此，本发明提供的酵母来源外泌体具备良好的抗氧化和抗炎症功效，可以应用于缓解炎症反应、延缓皮肤衰老相关的药品、保健品或化妆品等领域中。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (14)

1.一种酵母来源外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）将酵母培养至对数期时，进行仿真环境亚刺激处理，同时加入氨基酸，之后继续培养至稳定期，得到发酵液；
（2）将所述发酵液进行固液分离得到细胞外泌体；将所述细胞外泌体与糖类混合，得到所述酵母来源外泌体；
其中，所述酵母为啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和假丝酵母的组合，所述啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和假丝酵母的接种比为1:(0.8-1.2):(0.8-1.2)；
所述仿真环境亚刺激包括氧化应激刺激、高渗透压刺激、高温刺激或低温刺激中的任意一种，所述氧化应激刺激采用的试剂为双氧水；所述高渗透压刺激采用的试剂为盐水溶液，所述盐水溶液包括氯化钾水溶液；所述高温刺激的温度为37-40℃；所述低温刺激的温度为0-15℃；所述氨基酸包括半胱氨酸；
所述固液分离包括将所述发酵液进行8-12 min、转速为3000-6000 rpm的离心、采用孔径为80-100 KDa的滤膜进行一次过滤、浓缩、采用孔径为20-30 KDa的滤膜进行二次过滤得到细胞外泌体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酵母的接种量为6-10%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述培养至对数期的时间为8-15 h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述继续培养至稳定期的时间为30-45 h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述培养至对数期和继续培养至稳定期的温度各自独立地为25-30℃。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氧化应激刺激时培养基中H2O2的含量为0.08-0.25 mmol/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述高渗透压刺激时培养基中盐的浓度为0.3-0.8mmol/L。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸的添加量占培养基的质量百分比为0.1-0.25%。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述糖类为海藻多糖溶液。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述海藻多糖溶液中海藻多糖的质量百分含量为1-4%。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述混合时海藻多糖溶液与细胞外泌体的质量比为1:(0.8-1.2)。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述混合后还包括冷冻干燥的步骤。
13.根据权利要求1项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）在25-30℃条件下将酵母培养8-15 h，至对数期时，进行仿真环境亚刺激处理，同时加入氨基酸，继续培养30-45 h，至稳定期时，得到发酵液；
所述酵母的接种量为6-10%，所述酵母为啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和假丝酵母的组合，所述啤酒酵母、巴斯德毕赤酵母和假丝酵母的接种比为1:(0.8-1.2):( 0.8-1.2)；
所述仿真环境亚刺激包括氧化应激刺激、高渗透压刺激、高温刺激或低温刺激中的任意一种，所述氧化应激刺激采用的试剂为双氧水，所述氧化应激刺激时培养基中H2O2的含量为0.08-0.25 mmol/L；所述高渗透压刺激采用的试剂为盐水溶液，所述盐水溶液包括氯化钾水溶液水溶液，所述高渗透压刺激时培养基中盐的浓度为0.3-0.8mmol/L；所述高温刺激的温度为37-40℃；所述低温刺激的温度为0-15℃；
所述氨基酸包括半胱氨酸，所述氨基酸的添加量占培养基的质量百分比为0.1-0.25%；
（2）将所述发酵液进行8-12 min、转速为3000-6000 rpm的离心、采用孔径为80-100KDa的滤膜进行一次过滤、浓缩、采用孔径为20-30 KDa的滤膜进行二次过滤得到细胞外泌体；将所述细胞外泌体与海藻多糖溶液混合后，进行冷冻干燥，得到所述酵母来源外泌体；
所述海藻多糖溶液中海藻多糖的质量百分含量为1-4%，所述混合时海藻多糖溶液与细胞外泌体的质量比为1:(0.8-1.2)。
14.一种酵母来源外泌体，其特征在于，所述酵母来源外泌体通过权利要求1-13任一项所述的制备方法制备得到。
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