JP7194128B2 - 固形腫瘍の診断用のバイオマーカーの絶対定量の方法および装置 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）本出願に関連するインスタントＰＣＴ国際出願は、２０１７年６月２９日に出願された米国仮出願第６２／５２６，４２５号の利益を主張し、この開示の内容が参照により本明細書に組み込まれている。さらに、２０１５年５月２６日に出願された米国出願第１４／７２１，２０５号と、２０１７年２月１５日に出願された米国出願第１５／４３３，５８６号と共に開示されている全ての内容を参照により本明細書に組み込まれている。
本発明は、免疫ブロット法を用いて臨床診断のためにバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）を組織レベルで定量的に検出する方法および装置に関する。
具体的に、本発明は、定量ドットブロット（ＱＤＢ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｏｔ ｂｌｏｔ）分析を用いて、バイオマーカーの発現レベルを検出し、参照データベースと組み合わせた場合、固形腫瘍の診断および予後を提供するための方法および装置に関する。

タンパク質分析は、現代の生物学的研究の基礎である。この技術は、抗原－抗体相互作用に基づいて様々な医学的または実験的条件下で標的抗原の発現レベルを検出する。抗原は、体内に導入された場合に免疫系による抗体の産生をトリガーする外来分子として定義される。抗体は、特異的抗原に対する特異性が高いため、臨床的、薬学的および生物医学的研究における強力なツールとなっている。

抗原は、化合物、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞（ｉｎ ｓｉｔｕ（インサイチュ）で放出されるタンパク質）、またはウイルス粒子（ｉｎ ｓｉｔｕで放出されるタンパク質）が含まれるが、これらに限定されない。抗原分子は、その全体としてまたは一部的に、ロバ、ヤギ、またはウサギなどの宿主動物に導入されて標的抗原に対する抗体を大量に生成することができる。さらに、導入された抗原または抗原の一部は、１つ以上のエピトープを有し得るので、標的抗原に対する特異的抗体を、エピトープの数に対応して１つ以上生成することができる。

典型的な免疫検出プロセスは、以下の３つの主要なステップに分けることができる。第１のステップは、サンプルアプリケーション（スポッティング）であり、ここで、調製された標的抗原含有サンプルを、まずニトロセルロース、ＰＶＤＦ膜、または、タンパク質結合能を持つマルチウェルプレート、免疫組織化学分析（ＩＨＣ）におけるガラススライド、もしくはＱＤＢプレート中の膜のような他の固相のような表面に結合（転写）させる。第２のステップは、標的抗原－抗体複合体（すなわち、免疫複合体）を形成し標識することであり、該ステップには、ブロッキング、インキュベーションおよび洗浄というサブステップを含む。ブロッキングサブステップにおいて、膜上の非特異的タンパク質結合部位は、それらを非特異的タンパク質から遮蔽するためにブロッキング緩衝液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を用いてブロックされる。ブロッキング緩衝液を加える前に、ＩＨＣのいくつかの場合には、スライドガラス上の切片をさらに処理する（脱ろうおよび抗原回復）必要がある。ブロッキング後、インキュベーションサブステップにおいて、前記膜が、標的抗原に対する抗体と共にインキュベートされて膜上に結合された抗原－抗体複合体を形成し、結合していない抗体は洗い流される。ここで使用される抗体は、予め標識された抗体として通常に市販されている。もちろん、１つの標識サブステップによりインサイチュで標識することもできる。いずれの場合においても、抗体は、レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）、例えばレポーター酵素（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｅｎｚｙｍｅ）で直接標識されるか、レポーターと結合した二次抗体を用いて間接的に標識されるものとされる。

第３のステップは、検出である。レポーター酵素から放出されるシグナルを検出し記録し、膜上に結合された免疫複合体の量や質に関連する情報を取得する。

次に、抗体を標識する異なる方法には、それぞれ対応する検出方法を必要とする。例えば、第３のステップの検出は、目視検査による発色反応、またはスキャナー、Ｘ線フィルムもしくはマイクロプレートリーダーなどを介して検出可能な化学発光シグナルであってもよい。また、抗体は蛍光で標識され、スキャナーを介して検出されてもよい。

タンパク質分析の様々な技術は、この典型的な免疫検出法の変形である。これらの技術としては、ウエスタンブロット分析技術、ドットブロット分析技術、免疫組織化学（ＩＨＣ）技術、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）技術、逆相タンパク質マイクロアレイ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ：ＲＰＰＭ）技術、ならびに新たに開発された定量ドットブロット分析（ＱＤＢ）技術およびＺｅｓｔｅｒｎ分析技術が含まれるがこれらに限定されない。

免疫組織化学的分析では、まず、組織をパラフィン包埋ブロックまたは凍結組織のいずれかとして処理され、さらに一定厚さの切片にし、得られた組織切片をスライド上に置かれる。次に、典型的な免疫プロセスにより切片を処理してスライド上に被験抗体と標的抗原とを免疫複合体に形成する。病理学者としては、予め標識された抗体を利用して顕微鏡でスライド上の標的抗原を検出することができる。パラフィン包埋ブロックからの切片に対して、抗原抗体反応を促進するために、切片をさらに処理する必要がある。これらの処理は、抗原を露出させて抗原－抗体反応を行うために、切片の脱パラフィン処理および抗原回復処理を含んでもよい。

臨床診療において、診断または予後のために、ＩＨＣはバイオマーカーの表現の変化をタンパク質レベルで検出するように広く使用されている。バイオマーカーの典型的なＩＨＣのレポートには、「＋」または「－」として記載し、またはそれらがさらに「０、１＋、２＋、３＋」とするように分類されている。例えば、乳癌診断のために一般的に使用されるバイオマーカーであるＨＥＲ２（ヒト上皮細胞成長因子受容体２）の発現レベルは、ＩＨＣにより評価され、ＨＥＲ２依存療法（Ｈｅｒ２－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ）を治療計画に含めるべきかどうかを決定する。ＩＨＣの結果は、０、１＋、２＋、および３＋という４つの群に分類される。０群と１＋群は陰性と見なされ、３＋群は陽性と見なされ、２＋群は両義（ｅｑｕｉｖｏｃａｌ）と見なされる。

より多くのＩＨＣ分析に関する情報の詳細を提供するために、臨床分野において、Ｈスコア（Ｈ指数）を含む評価システムは、染色強度と染色細胞の百分率（パーセンテージ）とをよく結合させるように開発されてきた。他の場合には、染色強度（例えば、強さまたは弱さ）と染色細胞の百分率と共に提供されている。例えば、結果は「（百分率、強度）」として報告することができる。ただし、すべてのこれらの結果は、事実上半定量的である。

ＩＨＣは、貴重な価値のある形態学的情報を提供し、且つ技術者は分析操作法を規準化するために多くの努力が投与されてきたが、その結果は依然として定性的であって、処理過程、視野および観察者間変動を含む様々な要因によって影響を受ける。この技術は、ハイスループット分析に適応させることもかなり困難である。

ＩＨＣ分析関連の不確実性は、結果的に診断中における誤りの明らかな増加につながっている。実際に、ＨＥＲ２の場合、ＩＨＣと蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）技術との間に不整合性（ｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）がほとんど３０％程度である。

ＩＨＣ分析の分類結果は、さらなるデータ分析に使用されることが困難である。例えば、それらは、陽性結果を持つ個々の患者の間に有意差がある一方、いずれも臨床診療において同じカテゴリにあると考慮されている。したがって、ＩＨＣ分析の結果では、広範なデータ分析に使用され、予想通りにより正確なより予測的な診断または予後を提供することができない。

バイオマーカーを組織レベルで定量的に検出するために、いくつかの試みがなされてきた結果は、成功を収めた。例えば、近接アッセイ（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ）に基くＨｅｒｍａｒｋアッセイでは、乳癌組織におけるＨＥＲ２の発現レベルを定量的に検出することができた。ただし、このような技術では、乳癌患者の間での相対的なＨＥＲ２の発現レベルを検出している。

一方、絶対的ＨＥＲ２レベル（ＨＥＲ２の絶対的な含有量）は、ＳＲＭ－ＭＳ技術を用いて検出することが達成された。同位体標識されたタンパク質標準品（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用して絶対的ＨＥＲ２レベルを検出し、そして７４０ａｍｏｌｅ／μｇのカットオフ値は、受診者動作特性（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ：ＲＯＣ）分析に基づいて提案された。

それにもかかわらず、これらの方法は複雑で労働集約的な方法であり、多数のサンプルのハイスループット分析に適していない。複雑なプロセスも運用コストおよび労力の大幅上昇につながっている。

一方では、最近開発されたＱＤＢ方法は、細胞および組織のいずれかから調製した複合溶解物をハイスループット形式で処理することに適切であることが実証されている。タンパク質標準品を導入すると、組み換えタンパク質の形態でも、精製タンパク質の形態でも、どちらも当該方法を便利に絶対定量法に変換させて細胞または組織レベルで特定のタンパク質の絶対含有量を測定することができる。

本発明において、発明者らはＱＤＢ分析技術が臨床診断のためにバイオマーカーの発現レベルを組織レベルで検出するために用いられるよう努めてきた。本発明の一実施形態において、臨床診断のために通常利用可能なＩＨＣアッセイを、正確、定量、客観、ハイスループット、および臨床診断または予後へのより広範囲な助けとなる面において明らかな利点を有する絶対定量アッセイに変換することができる。ＱＤＢ分析に由来の絶対データ値は、さらにデータ分析のために大規模に処理し、より正確なかつ予測的な診断および予後を提供することができる。

本発明では、バイオマーカーの発現レベルを組織レベルで定量化する方法を提供する。バイオマーカーの評価は、従来の通用方法のように分類される代わりに、定量的に検出されて行われる。

したがって、本発明では従来の通用の離散的結果の代わりに連続的結果を提供する。したがって、本発明では、ＩＨＣおよびＦＩＳＨの従来の通用方法よりもさらに多くの機会を提供する。

本発明の一態様によれば、サンプルの定量分析方法に関する。前記方法は、（ａ）サンプルの１つまたは複数の特徴を表す単一のマーカー（ｍａｒｋｅｒ）を提供するステップであって、前記サンプルは前記マーカーの単一ユニットの集団を含む、ステップと、（ｂ）ドットブロット分析を用いて前記マーカーを検出するステップであって、定量的結果はサンプル中の前記マーカーの単一ユニットの集団の絶対量であり、サンプル体積またはサンプル重量によって正規化される、ステップと、（ｃ）前記マーカーの定量的結果に基づいて、前記サンプルの１つ以上の特徴の客観的測定を得るステップと、を含む。

サンプルは、被験対象からの組織であってもよい。本発明の一実施形態において、組織は生検組織を指す。本発明の別の一実施形態において、組織は凍結組織を指す。また、本発明の他の一実施形態において、組織はホルマリン固定サンプルを指し、さらに本発明の別の一実施形態において、組織はホルマリン固定・パラフィン包埋サンプル（ＦＦＰＥサンプル）を指す。

被験対象は患者であってもよい。具体的には、被験対象は癌患者であってもよい。

一方、上記方法のステップ（ｂ）は、定量ドットブロット（ＱＤＢ）分析を用いて前記マーカーを検出することを含んでもよい。より具体的に、ステップ（ｂ）は、（ｂ１）結合因子を含む溶液と共にサンプルをインキュベートするステップであって、前記結合因子は、前記マーカーの単一ユニットに特異的に結合することができ、かつドットブロット分析によって定量化することができる、ステップと、（ｂ２）結合因子のＱＤＢ分析を通して前記マーカーを検出するステップとを含んでもよい。

結合因子は、免疫組織化分析を含む抗体－抗原相互作用に基づいて検出することができる。また、結合因子は、フローサイトメトリー中に検出するができる。

好ましくは、マーカーはタンパク質マーカーであり、結合因子は抗体である。さらに、抗体は、分析物特異的試薬（ａｎａｌｙｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ：ＡＳＲ）系の抗体であってもよく、また、インビトロ診断（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：ＩＶＤ）系の抗体であってもよい。

また、上記方法は、マーカーの定量的結果に基づいて患者を評価するステップ（ｄ）をさらに含む。特に、ステップ（ｄ）は、患者のための癌の診断および予後を含む。患者のための癌の診断および予後の例には、無病生存率、全生存率、ハザード比（ＨＲ）、または癌治療方案の予測を含む。

本発明で開示されている定量的に検出したバイオマーカーのレベルは、本発明と従来の通用方法との比較を容易にするために利用可能な情報の数理解析に基づいて分類でき、バイオマーカー絶対レベルの臨床的意義をよりよく探求するために役立つことができる。

本発明の一実施形態は、免疫ブロット分析に適用することができる。バイオマーカーの発現レベルは、抗体に基づく方法を用いて検出することができる。

抗体に基づく方法の線形範囲を確立することによって、バイオマーカーの絶対レベルは、タンパク質標準品（標準タンパクとも呼ばれる）を用いて同一測定中に達成することができる。

本発明の一実施形態において、ドットブロット法を用いてバイオマーカーの絶対的定量を組織レベルで達成することができる。

精製タンパク質または組換えタンパク質を使用して、画像ベースのドットブロット分析を使用してタンパク質標準曲線を確立する。画像は、画像の収集および分析によってデジタルへの変換を達成する。

得られたシグナルは、タンパク質標準曲線を確立するために使用される。

ＦＦＰＥブロック（ＦＦＰＥ塊）から抽出された総タンパク質は、ドットブロット分析に使用することができ、そして得られたシグナルは、上記参照標準曲線を使用してバイオマーカーの絶対レベルに変換することができる。

本発明の一実施形態において、定量的ドットブロット分析（ＱＤＢ分析とも呼ばれる）は、バイオマーカーの絶対レベルを組織レベルで検出するために用いることができる。

バイオマーカーのタンパク質発現レベルは、タンパク質標準品の非存在下で、ＱＤＢ法を含む免疫ブロットアッセイを通して相対的に検出することができる。分析プロセスが十分に管理されている限り（例えば、陽性対照および陰性対照を用い）、それは参考のために有益な結果を提供する。

ＱＤＢ分析において、バイオマーカーの絶対レベルは、検証済みの検出抗体を用いて検出することができる。検出抗体を検証するための方法は制限されていない。抗体は、ウエスタンブロット分析によって検証することができ、または以前の経験に基づいて検証することができる。本発明の一実施形態において、免疫組織化学用に広く受け入れられている抗体を、ＱＤＢ分析に直接使用することができる。例えば、ＡＳＲ系またはＩＶＤ系の抗体を、ＱＤＢ分析に使用することができる。これらの抗体には、ＨＥＲ２タンパク質に用いるＥＰ３および４Ｂ５クローン、ｋｉ６７に用いるＭＩＢ１、ならびにエストロゲン受容体（ＥＲ）に用いるＳＰ１が含まれるが、これらに限定されない。同様に、他の抗体に基づく検出方法（フローサイトメトリーが含まれるが、これらに限定されない）に使用される検出抗体をＱＤＢ分析に使用することができる。

検出抗体（抗体Ａ）は、既存の検出抗体（抗体Ｂ）との比較研究を通じて検証することができる。抗体Ａと抗体Ｂの両方を使用して複数のサンプルを分析しても同様の結果が得られた場合、抗体Ａは検証済みと見なすことができる。

ＱＤＢ分析用のサンプルは、凍結組織、ホルマリン固定組織、ホルマリン固定・パラフィン包埋組織のブロック（ＦＦＰＥブロック）から調製することができる。それは、サンプル中に抗原－抗体反応が達成できる限り、他の方式で保存された組織から調製することもできる。

タンパク質データベース（ＱＤＢデータベースとも呼ばれる）を構築するために、２つ以上のサンプルからのバイオマーカーの絶対レベルを関連臨床情報と組み合わせることができる。ＱＤＢデータベースの数理解析は、医療用情報を提供することができる。例えば、バイオマーカーの絶対レベルと無病生存率（ＤＦＳ）との間の可能な関連性を分析して患者に対する予測的臨床予後を提供することができる。

本発明のこれらおよび他の実施形態において、少なくとも部分的には、ＱＤＢ分析の絶対的性質が複数の情報源からの結果を互いに組み合わせて分析することが確保できる、という発見に依存する。ＱＤＢ分析からの新しい情報を継続的に追加することは、ＱＤＢデータベースを成長させることができる。ＱＤＢデータベースの分析を通して得られた情報は、患者の診断または予後を提供する。

タンパク質は、非変性形態で抽出することができ、あるいは、加熱および／または還元剤を通してさらに変性させることができる。非変性形態については、その最も広い文脈で理解されるべきである。それは、ネイティブ形態であってもよく、または抗原が還元剤（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）もしくはβ－メルカプトエタノール）にさらされていないか、または抗原を完全に変性させるのに十分な量の還元試薬にさらされていない状態を指す。

本発明の一実施形態において、実験の一貫性を確実にするために、作業対照として所定量の抗原を含めることができる。抗原含有量の絶対レベルは、毎回測定される必要があり、測定結果に抗原含有量が所定量の特定範囲内にあるときに限り、実験全体が有効であると考えることができる。

ＱＤＢ分析では、同じ溶解物に対して、同じバイオマーカーに対する２つ以上の抗体を使用して実施することができる。これらの抗体は、バイオマーカーの同じエピトープまたは異なるエピトープに対して認識することができる。これらの抗体についてそれぞれのカットオフ値（カットオフ基準値）を作成することができ、これらのカットオフ値を参照して、サンプルを陽性または陰性のいずれかとして決定することができる。すべての抗体で合意されたサンプルは、陽性または陰性として認められ、結果が一致しないものは、不明確なもの（あいまい）として割り当てられる。

本発明の一実施形態において、同じサンプルを用いて２つ以上のバイオマーカーの絶対レベルを定量化することができ、且つこれらの情報と関連臨床情報（無病生存率、全生存率、ハザード比、副反応、年齢、疾患の進行段階が含まれるがこれらに限定されない）との組み合わせを用いてパターンを見つけることができ、前記パターンは診断および予後のために使用することができる。

本発明の一実施形態において、バイオマーカーの絶対レベルは、複数の抗体を用いて検出することができ、それぞれの抗体に基づくバイオマーカーの絶対レベルと、それぞれの関連臨床情報（無病生存率、全生存率、副反応、ハザード比、年齢、疾患の進行段階が含まれるが、これらに限定されない）に結合することにより、それぞれパターンを見出すことができ、異なる抗体からの個々のパターンを用いて診断および予後のための抗体特異的情報を提供することができる。

本発明の別の態様によれば、患者からの生検サンプル中のマーカーの定量分析に基づいて患者の癌を診断するための参照データベースに関する。参照データベースは複数の参照プロファイル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｒｏｆｉｌｅ）を含み、複数の参照プロファイルのそれぞれは、（ａ）確定診断された癌患者からの生検組織サンプルを提供するステップと、（ｂ）ドットブロット分析により前記マーカーを検出するステップであって、定量的結果は、生検組織サンプル中の前記マーカーの絶対量であり、生検組織サンプルの体積または生検組織サンプルの重量によって正規化される、ステップと、（ｃ）前記定量的結果を癌患者の確定診断と関連づけることにより参照プロフィールを得るステップとによって取得される。

上記ステップ（ｂ）には、（ｂ１）前記生検組織サンプルを、前記マーカーに特異的に結合する結合因子を含む溶液と共にインキュベートするステップと、（ｂ２）前記結合因子のＱＤＢ分析を通して前記マーカーを検出するステップとを含んでもよい。

上記参照データベースにおいて、好ましくは、マーカーはタンパク質マーカーであり、結合因子は抗体である。参照データベースは計算メモリチップ（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｍｅｍｏｒｙ ｃｈｉｐ）に記憶されていることが好ましい。

本発明のさらに別の態様によれば、患者の癌を診断するための方法に関する。前記方法には、（ｉ）上記のような参照データベースを提供するステップと、（ｉｉ）患者から生検組織サンプルを得るステップと、（ｉｉｉ）ドットブロット法により患者からの生検組織サンプルにおいて参照データベースに使用されるマーカーを検出するステップであって、検出結果が生検組織サンプルにおける前記マーカーの絶対量である、ステップと、（ｉｖ）前記生検組織サンプルにおける前記マーカーの定量的結果を、前記参照データベースに記憶された参照プロフィールのそれぞれに比較するステップと、（ｖ）前記参照データベースから、前記生検組織サンプルにおける前記マーカーの定量的結果とのベストマッチを有する参照プロフィールを検索し、検索された参照プロフィールに関連する既知の診断結果を出力するステップとを含む。

上記の方法において、診断される癌は固形腫瘍である。

本発明のさらに別の態様によれば、患者の癌を診断するための装置に関する。前記装置には上記に説明した参照データベースを含む。

本発明のさらに別の態様によれば、患者の癌を診断するためのキットに関する。キットには上記の参照データベースを含む。あるいは、前記キットは、上記参照データベースにオンラインでアクセスするように構成されているユニットを含む。

本発明の詳細は、図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、図面および以下の説明、ならびに添付の特許請求の範囲を読めば、当業者にとって明らかとなるべきである。

ドットブロット分析を用いてＥＰ３抗体でＨＥＲ２の絶対的なレベル（絶対的含有量）を検出する図である。精製されたＨＥＲ２タンパク質を使用して用量曲線を確立し、そして収集された画像をＬｉ－Ｃｏｒ社からのＩｍａｇｅＱｕａｎｔでデジタルに変換した。タンパク質標準品で確立された用量曲線を使用して、患者サンプルから収集されたドットブロット分析画像を、これらの患者におけるＨＥＲ２絶対的レベルに変換する。 ドットブロット分析を用いてＥＰ３抗体でＨＥＲ２の絶対的なレベル（絶対的含有量）を検出する図である。精製されたＨＥＲ２タンパク質を使用して用量曲線を確立し、そして収集された画像をＬｉ－Ｃｏｒ社からのＩｍａｇｅＱｕａｎｔでデジタルに変換した。タンパク質標準品で確立された用量曲線を使用して、患者サンプルから収集されたドットブロット分析画像を、これらの患者におけるＨＥＲ２絶対的レベルに変換する。 ドットブロット分析を用いてＥＰ３抗体でＨＥＲ２の絶対的なレベル（絶対的含有量）を検出する図である。精製されたＨＥＲ２タンパク質を使用して用量曲線を確立し、そして収集された画像をＬｉ－Ｃｏｒ社からのＩｍａｇｅＱｕａｎｔでデジタルに変換した。タンパク質標準品で確立された用量曲線を使用して、患者サンプルから収集されたドットブロット分析画像を、これらの患者におけるＨＥＲ２絶対的レベルに変換する。 ドットブロット分析を用いてＥＰ３抗体でＨＥＲ２の絶対的なレベル（絶対的含有量）を検出する図である。精製されたＨＥＲ２タンパク質を使用して用量曲線を確立し、そして収集された画像をＬｉ－Ｃｏｒ社からのＩｍａｇｅＱｕａｎｔでデジタルに変換した。タンパク質標準品で確立された用量曲線を使用して、患者サンプルから収集されたドットブロット分析画像を、これらの患者におけるＨＥＲ２絶対的レベルに変換する。

ＱＤＢ分析によりＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの３つの既知のＩＨＣ分析用抗体を使用してそれらの異なる癌組織におけるそれぞれの線形範囲を確立することを示す図である。ＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの組換えタンパク質はタンパク質標準品として使用された。これらの抗体はＱＤＢ分析を用いてそれぞれの用量反応曲線が確立された。 ＱＤＢ分析によりＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの３つの既知のＩＨＣ分析用抗体を使用してそれらの異なる癌組織におけるそれぞれの線形範囲を確立することを示す図である。ＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの組換えタンパク質はタンパク質標準品として使用された。これらの抗体はＱＤＢ分析を用いてそれぞれの用量反応曲線が確立された。 ＱＤＢ分析によりＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの３つの既知のＩＨＣ分析用抗体を使用してそれらの異なる癌組織におけるそれぞれの線形範囲を確立することを示す図である。ＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの組換えタンパク質はタンパク質標準品として使用された。これらの抗体はＱＤＢ分析を用いてそれぞれの用量反応曲線が確立された。 ＱＤＢ分析によりＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの３つの既知のＩＨＣ分析用抗体を使用してそれらの異なる癌組織におけるそれぞれの線形範囲を確立することを示す図である。ＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの組換えタンパク質はタンパク質標準品として使用された。これらの抗体はＱＤＢ分析を用いてそれぞれの用量反応曲線が確立された。 ＱＤＢ分析によりＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの３つの既知のＩＨＣ分析用抗体を使用してそれらの異なる癌組織におけるそれぞれの線形範囲を確立することを示す図である。ＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの組換えタンパク質はタンパク質標準品として使用された。これらの抗体はＱＤＢ分析を用いてそれぞれの用量反応曲線が確立された。 ＱＤＢ分析によりＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの３つの既知のＩＨＣ分析用抗体を使用してそれらの異なる癌組織におけるそれぞれの線形範囲を確立することを示す図である。ＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの組換えタンパク質はタンパク質標準品として使用された。これらの抗体はＱＤＢ分析を用いてそれぞれの用量反応曲線が確立された。 ＱＤＢ分析によりＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの３つの既知のＩＨＣ分析用抗体を使用してそれらの異なる癌組織におけるそれぞれの線形範囲を確立することを示す図である。ＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの組換えタンパク質はタンパク質標準品として使用された。これらの抗体はＱＤＢ分析を用いてそれぞれの用量反応曲線が確立された。 ＱＤＢ分析によりＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの３つの既知のＩＨＣ分析用抗体を使用してそれらの異なる癌組織におけるそれぞれの線形範囲を確立することを示す図である。ＨＥＲ２、Ｋｉ６７およびＥＲの組換えタンパク質はタンパク質標準品として使用された。これらの抗体はＱＤＢ分析を用いてそれぞれの用量反応曲線が確立された。

ＱＤＢ分析で検出された、ＦＦＰＥサンプルから抽出された乳癌組織におけるＨＥＲ２、Ｋｉ６７、ＥＲの絶対レベル、および凍結胃組織におけるＨＥＲ２絶対レベルを示す図である。結果はそれぞれのＩＨＣ結果に基づいてさらにグループ化された。 ＱＤＢ分析で検出された、ＦＦＰＥサンプルから抽出された乳癌組織におけるＨＥＲ２、Ｋｉ６７、ＥＲの絶対レベル、および凍結胃組織におけるＨＥＲ２絶対レベルを示す図である。結果はそれぞれのＩＨＣ結果に基づいてさらにグループ化された。 ＱＤＢ分析で検出された、ＦＦＰＥサンプルから抽出された乳癌組織におけるＨＥＲ２、Ｋｉ６７、ＥＲの絶対レベル、および凍結胃組織におけるＨＥＲ２絶対レベルを示す図である。結果はそれぞれのＩＨＣ結果に基づいてさらにグループ化された。 ＱＤＢ分析で検出された、ＦＦＰＥサンプルから抽出された乳癌組織におけるＨＥＲ２、Ｋｉ６７、ＥＲの絶対レベル、および凍結胃組織におけるＨＥＲ２絶対レベルを示す図である。結果はそれぞれのＩＨＣ結果に基づいてさらにグループ化された。

ＱＤＢ分析で検出されたＨＥＲ２絶対レベル、および地元の病院から得られた対応のＩＨＣ結果に基づいて、連続データを分類結果に変換するためのカットオフ値を如何に確立することを示す図である。 ＱＤＢ分析で検出されたＨＥＲ２絶対レベル、および地元の病院から得られた対応のＩＨＣ結果に基づいて、連続データを分類結果に変換するためのカットオフ値を如何に確立することを示す図である。 ＱＤＢ分析で検出されたＨＥＲ２絶対レベル、および地元の病院から得られた対応のＩＨＣ結果に基づいて、連続データを分類結果に変換するためのカットオフ値を如何に確立することを示す図である。 ＱＤＢ分析で検出されたＨＥＲ２絶対レベル、および地元の病院から得られた対応のＩＨＣ結果に基づいて、連続データを分類結果に変換するためのカットオフ値を如何に確立することを示す図である。

バイオマーカーの絶対的量を用いて臨床データを如何に分析することを示す図である。この場合、ＨＥＲ２絶対レベルと乳癌患者の組織学的悪性度との間の潜在的な関連性を調べた。

本発明に係る方法を説明する前に、理解すべきであるのは、本発明は、ここで記載された特定の方法に限定されず、もちろん具体的な使用に応じて変更することができる。本明細書に記載の用語は、特定の実施形態を説明するのみを目的としており、それらの実施形態を限定する意図ではなく、本発明の保護範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるものであるとも理解すべきである。

特に断りのない限り、本明細書に記載のすべての科学技術用語は、本発明の技術分野に所属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を指す。

本発明に係る方法は、主に診断目的に有用である。したがって、本明細書中で使用される場合、用語「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、「測定する（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）／検出する（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」および「評価／評定する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」および「分析／アッセイする（ａｓｓａｙｉｎｇ）」は、交換可能に使用され、そして定量的検出と定性的検出との両方を含む。また、これらの用語は定量的検出および半定量的検出の両方を指すことができ、したがって、本明細書において用語「決定する」は、「アッセイする」、「測定する／検出する」などと同義的に使用される。定量的検出が意図される場合、「量を検出する」という分析物などの語句が使用される。定量的検出および半定量的検出のいずれかが意図される場合、分析物の「レベルを検出する」または「分析物を検出する」という語句が使用される。

適用可能な場合、常に「定量的」アッセイは、一般に、参照物（コントロール）に対するサンプルにおける分析物（検体）の量に関する情報を提供し、通常、連続的に数値で報告されるが、分析物が検出限界未満の場合、「ゼロ」値を割り当てることができる。「半定量的」アッセイは、物質の量または量の近似値をもたらし、定性的結果と定量的結果の間にあり、分析物が検出限界未満の場合、「ゼロ」値を割り当てることができる。

本明細書に記載の用語「診断」とは、乳癌または他種の癌の分子サブタイプの同定などの、分子または病理学的状態、疾患または状態の同定を指す。

本明細書に記載の用語「予後」とは、乳癌などの腫瘍性疾患の再発、転移の広がり、および薬剤耐性を含む、癌に起因する死亡または進行の可能性の予測を指す。用語「予測（的）」とは、治療的介入の結果の予測を指す。

用語「対象」、「宿主（ｈｏｓｔ）」、「患者」、および「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」とは、本明細書に互換的に使用され、診断または治療を必要とする任意の哺乳類（特にヒト）対象を指す。

バイオマーカーのタンパク質発現レベルの定量的検出は、免疫ブロット法を用いて組織レベルで達成することができる。免疫ブロット法は、その最も広い文脈で考慮されるべきである。分析プロセスが抗体に基づき固相を用いてそのプロセスに関与している限り、それは免疫ブロット分析と見なすことができる。前記固相は、膜、ＥＬＩＳＡプレート、ＱＤＢプレート（ＡＫＡ、ＱＤＢ分析に使用されるプレート）が含まれるが、これらに限定されない。

抗体の特異性を検証する方法に制限はない。抗原のエピトープが線状である場合、抗体はウエスタンブロット分析を使用して検証することができ、過去の経験に基づいて検証することもできる。例えば、多くの抗体が臨床診断および予後に使用されてきた。これらの抗体には、ＡＳＲ抗体またはＩＶＤ抗体、ならびに免疫組織化学またはフローサイトメトリー分析のための他の臨床的に許容されている抗体が含まれるが、これらに限定されない。これらの抗体のすべては、さらに検証することないままでＱＤＢ分析に使用できる。

検出抗体は、また既知の抗体を参照して検証することができる。本発明の一実施形態において、検出抗体を用いて複数のサンプルを分析し、その結果を既知の抗体（例えば、Ｒｏｃｈｅ社製のＨＥＲ２タンパク質に用いる４Ｂ５クローン）からのものと比較する。両方の抗体での一致率が特定の値を超えている場合、この抗体は検証済みの抗体と見なすことができる。

本発明の一実施形態において、バイオマーカーの発現レベルは典型的な免疫ブロット法で検出される。この方法は（１）検証された抗体と（２）タンパク質標準品を使用して確立することができる用量曲線という２つの特徴が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の一実施形態において、バイオマーカーの発現レベルは典型的な免疫ブロット法で検出される。この方法は（１）検証された抗体と（２）タンパク質標準品を使用して確立することができる用量曲線と（３）検出プロセスにおいて隣接ユニットからの干渉なしに、膜上の免疫複合体を個別に定量化することとを含む３つの特徴が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の一実施形態において、参照サンプルを実験に含めることができる。参照サンプルは、同じ免疫ブロット分析において標的サンプル（ｓａｍｐｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）と共に処理される。参照サンプルの結果を標的サンプルの結果に比べると、標的サンプルの結果が参照サンプルの結果を上回った場合、標的サンプルが陽性であり、またはその逆で陰性であると判定する。

本発明の他の実施形態において、２つ以上の参照サンプルが実験に含まれる。参照サンプルは、同じ免疫ブロット分析において標的サンプルと一緒に処理される。参照サンプルの結果は、ランク付けされた順序を定義するために使用され、そして標的サンプルの結果は、参照サンプルの結果を参照して決定される。たとえば、参照サンプル１と参照サンプル２とがそれぞれ１＋と２＋の上限を定義するために使用され、対象サンプルからの結果が参照サンプル１＋と参照サンプル２＋の結果の間にある場合、対象サンプルは２＋として割り当てられる。

本発明の一実施形態において、バイオマーカーの発現レベルは、ドットブロット法を用いて定量的に検出される。ドットブロット分析は（ａ）検証された抗体と（ｂ）抗体が１つのタイプのサンプルを分析するために使用される際に定義された線形範囲（ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ）と（ｃ）膜上の免疫複合体が画像として検出されることと（ｄ）画像のデジタルへの変換とを含む特徴が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の別の実施形態において、バイオマーカーの発現レベルはＱＤＢ法を用いて定量的に検出される。ＱＤＢ分析は（ａ）検証された抗体と（ｂ）抗体が１つのタイプのサンプルを分析するために使用される際に定義された線形範囲と（ｃ）検出プロセスにおいて隣接ユニットからの干渉なしに、膜上の免疫複合体を個別に定量化することとを含む特徴が含まれるが、これらに限定されない。

ＩＨＣの現在の一般的な形式で分類された結果は、その最も広い文脈で考慮されるべきである。これらの結果は、二値（正または負）、ランク付け（０、１＋、２＋、３＋または強、中または弱）、百分率、または上記のすべての組み合わせになることができる。Ｈスコアを含むＩＨＣに用いるいくつかのスコアリングシステムは、依然として分類された結果と見なされ、これらの結果が本質的に離散的であるからである。

本発明に開示された方法に係る結果は連続的なデータである。このデータは、本発明に係る結果の臨床的意義との比較および理解を容易にするために、一般的なＩＨＣシステムにおけるように分類された結果に変換することができる。しかしながら、この変換のプロセスは数理解析から得られるカットオフ参照値により実現され、且つこの分類の結果はカットオフ値に応じて変化している。本発明の一実施形態において、乳癌組織中の検出されたＨＥＲ２レベルは統計分析に使用することができ、カットオフ値はＩＨＣ結果に基づく受診者動作特性分析（ＲＯＣ）および乳癌組織中の絶対レベルから導き出すことができる。ＲＯＣ分析から得られたカットオフ値に関して「陽性」または「陰性」のいずれかとして割り当てることができ、ＨＥＲ２の絶対レベルがカットオフ値よりも高い場合、陽性とし、逆になると陰性である。
絶対的検出

本発明からの結果は、相対的であってもよく、またはタンパク質標準品と組み合わせて絶対的であってもよい。「相対的」および「絶対的」という用語は、検出を行うための２つの方法を意味し、それらの最も広い文脈から意味をとるべきである。相対的検出では、他の結果と比較して被検物を検出しているが、絶対的検出では、既知の量の標準単位で被検物を検出している。これらの２つの測定法の間の最も重要な違いは、おそらく、それぞれの適用範囲にある。相対的結果は、同じ実験設定条件下のみで意味があるが、絶対的結果は、異なる場所や異なる時間を含んで行われた分析結果に対しても比較可能である。

それに応じて、本発明に係る絶対的検出は、タンパク質標準品を含めることによって達成される。前記タンパク質標準品は、その最も広い文脈をとるべきである。それは、所定量の抗原、または１つ以上の所定量の１つの抗原を指す。それには、重量、百分率、体積、分子数（例えば、モル）、または上記の任意の２つ以上の組み合わせによってあらかじめ決定された量が含まれるが、それらのみには限定されていない。それは純粋な形態でも混合物の形態でもよい。それは天然形態でも、非変性形態または変性形態でもよい。本発明において、非変性形態は、天然形態と変性形態との間の任意形態と見なすことができる。
バイオマーカー

本明細書で互換的に使用される「サンプル」または「患者サンプル」または「生物学的サンプル」は、一般に、特定の分子、好ましくは以下の段落に示されている、バイオマーカーなどの生物学的サインに関連する特異的マーカー分子について試験され得るサンプルを指す。サンプルは、末梢血細胞、ＣＮＳ液、血清、血漿、口腔スワブ、尿、唾液、涙液、胸水などを含むが、これらに限定されていない。本発明で使用されるサンプルは、一般的に組織を指す。

本明細書に記載の用語「マーカー」または「バイオマーカー」とは、その最も広い文脈で定義されるべきである。本明細書で互換的に使用される「マーカー」または「バイオマーカー」は、一般に、他の表現型（例えば、病気にかかっていないか、異なる病気にかかっている）状態のと比較する場合、１つの表現型（例えば、疾患を有する）状態の被験体から採取されたサンプル中に異なった形で存在する有機生体分子（例えばポリペプチド）を指す。このように、バイオマーカーは、第２の表現型状態に対する第１の表現型状態におけるバイオマーカーの平均値または中央値が統計的に有意差を表すように計算される場合、２つの異なる表現型状態間に差によれば通常確立されるものである。

本発明において、バイオマーカーは、生物学的状態または疾患状態に関連して検出可能なタンパク質分子である。それは十分に確立された診断バイオマーカー（例えば、ＩＨＣのための診断バイオマーカー）であってもよく、または、新たに同定されたインビトロ診断用バイオマーカーであってもよい。

本発明の一実施形態において、バイオマーカーは固形腫瘍の診断に使用される。

既知の診断用バイオマーカーには、例えば、ＡＣＴＨ、ＡＣＴＩＮ、ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ、ＡＦＰ、ＡＬＫ－１、ＡＭＹＬＯＩＤ Ａ、ＡＮＤＲＯＧＥＮ ＲＥＣＥＰＴＯＲ、ＡＮＮＥＸＩＮ、ＡＲＧＩＮＡＳＥ－１、ＢＡＰ１、Ｂ－ＡＭＹＬＯＩＤ、ＢＣＬ－１，ＢＣＬ－２、ＢＣＬ－６、ＢＥＲＥＰ４、Ｂｅｔａ－Ｃａｔｅｎｉｎ、ＢＯＢ１、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＢＲＳＴ－２、Ｃ３ｄ、Ｃ４ｄ、ＣＡＬＣＩＴＯＮＩＮ、ＣＡＬＤＥＳＭＯＮ、ＣＡＬＰＯＮＩＮ、ＣＡＬＲＥＴＩＮＩＮ、ＣＤ１４、ＣＤ１１７、ＣＤ１１７、ＢＭ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５、ＣＤ１６３、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３４、ＢＭ、ＣＤ３８、ＣＤ４、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６１、ＣＤ６８、ＣＤ７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８、ＣＤ９９、ＣＤＸ２、ＣＥＡｍ、ＣＥＡｐ、Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ、Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ ３、Ｃｌａｕｄｉｎ ４、ＣＫ ＭＩＸ、ＣＫ２０、ＣＫ３４ＢＥ１２、ＣＫ５／６、ＣＫ７、ＣＫ１９、ＣＫＡＥ１／ＡＥ３、ＣＫＣＡＭ５．２、ＣＭＶ、ｃ－Ｍｙｃ、ＣＸＣＬ１３、ＣＹＣＬＩＮ Ｄ３、Ｄ２－４０、ＤＢＡ－４４、Ｄｅｓｍｉｎ、ＤＯＧ－１、ＥＢＶ、ＬＭＰ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＧＦＲ、ＥＭＡ、ＥＭＡ－Ｐｅｒｉｎｅｕｒｉｏｍａ、ＥＲ、ＥＲＧ、Ｆａｃｔｏｒ １３ａ、Ｆａｃｔｏｒ ８、ＦＯＸＰ１、ＦＳＨ、ＧＡＬＥＣＴＩＮ－３、Ｇａｓｔｒｉｎ、ＧＡＴＡ－３、ＧＦＡＰ、ＧＨ、Ｇｌｕｃａｇｏｎ、Ｇｌｕｔ１、Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＧＰＣ、ＧＲＡＮＺＹＭＥ、Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ、ＨＢＣ、ＨＢＳ、ｈＣＧ、ＨｅｐＰａｒ １、ＨＥＲ２ｎｅｕ、ＨＧＡＬ、ＨＨＶ－８、ＨＭＢ－４５、ＨＰＬ、ＨＳＶ、ＩＤＨ１、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、Ｉｎｈｉｂｉｎ、ＩＮＩ、Ｉｎｓｕｌｉｎ、ＩＳＨ ＥＢＶ、ＩＳＨ ＫＡＰＰＡ、ＩＳＨ ＬＡＭＢＤＡ、ＫＡＰＰＡ、ＫＢＡ６２、ＫＩ６７、Ｌａｍｂｄａ、ＬＡＮＧＥＲＩＮ、ＬＡＴ、ＬＥＦ１、ＬＨ、ＬＭ０２、ＬＹＳＯＺＹＭＥ、ＭＡＰ－２、ＭＣＴ、ＭＥＬＡＮ Ａ、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＮＤＡ、ＭＯＣ－３１、ＭＰＯ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＭ１、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｎａｐｓｉｎ Ａ、ＮＢ８４、ＮＥＵ Ｎ、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、ＮＫＩ／Ｃ３、ＮＫＸ３．１、ＮＰＭ、ＮＳＥ、ＮＵＴ、２－Ｏｃｔ、Ｏｃｔ－３／４、ｐ１６、ｐ５３、ｐ５７、ｐ６３、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ、ＰＡＸ－２、ＰＡＸ－５、ＰＡＸ８、ＰＣＳＫ９、ＰＤ－１、Ｐｅｒｆｏｒｉｎ、ＰＨＨ３、ＰＨＬＤＡ１、ＰＩＮ４、ＰＬＡＰ、ＰＭＳ２、ＰＲ、ＰＲＡＰ、Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ、Ｐｒｏｘ１、ＰＳＡ、ＲＮＡ、Ｓ１００、Ｓ１００Ｐ、ＳＡＬＬ４、ＳＦ－１、ＳＭＡ、ＳＭＭＳ、Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ、ＳＯＸ－１０、ＳＯＸ１１、ＳＣＡＰ、Ｓ１Ｐ、ＳＲＥＢＰ、Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ、ＳＴＡＴ６、ＳＶ４０、ＳＹＮＡＰ、Ｔａｍｍ－Ｈｏｒｓｆａｌｌ、Ｔ－ｂｅｔ、ＴＣＬ－１、ＴＣＲ、ＴＣＲ、Ｇａｍｍａ、ＴｄＴ、ＴＨＹＲＯ、ＴＩＡ－１、ＴＯＸＯ、Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ、ＴＲＡＰ、ＴＳＨ、ＴＴＦ１、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＷＴ１、ＷＴ１（Ｃ－１９）、ＺＡＰ７０を含むが、これらに限定されていない。

この方法は、新鮮な組織中の抗原を分析するために採用することができ、またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロック中で抗原を分析するために使用することができる。抗原は、抽出プロセスに由来の抗原が抗体－抗原相互作用のプロセスを発生することができる限り、任意の方法によって組織またはＦＦＰＥから抽出することができる。ＦＦＰＥブロック中の抗原については、抗原－抗体相互作用を容易にするために、抗原回復ステップを用いて、または用いずに切片を脱パラフィンする必要がある。
参照データベース

２つ以上の標的サンプルから得られたＱＤＢ結果は、それらの適合する臨床情報と共に、数理解析用データベース（すなわち、ＱＤＢデータベース）を設立するために使用することができる。したがって、診断目的のために参照データベースを構築することができる。

用語「参照」および「対照」は、互換的に使用されてもよく、観察された値と比較され得る既知の値または一連の既知の値を指す。既知の値は、２つのパラメーター（例えばマーカーの発現レベルおよびそれに関連した表現型）の間の理解された相関関係を表す。本明細書では、既知の値は、参照データベース内の参照プロファイルを構成する。

したがって、診断目的のために多数の参照プロフィールを保存する参照データベースを作成することができ、それぞれには、治療後に既知の診断かそれとも既知の臨床転帰を有する対象（個体）から得られたサンプルのマーカー発現レベルを記録している。

一実施形態において、本発明は、参照データベース内の１つまたは複数の参照プロファイルと最もよく一致する患者プロファイルを決定する方法もさらに含む。前記方法は、（ａ）適切なプログラム式コンピュータ上で、患者からのサンプル中のマーカーの発現レベルを、参照データベース中の参照プロファイルと比較して、前記患者のプロファイルとそれぞれの前記参照プロファイルとの類似度を決定するステップと、（ｂ）適切なプログラム式コンピュータ上で、上記ステップ（ａ）で決定された類似度における最大類似度に基づいて参照データベースから、患者プロファイルに最もよく一致する参照プロファイルを検索するステップと、（ｃ）患者プロフィールに最もよく一致する参照データベース中の参照プロフィールの最大類似度または関連表現型を、ユーザインタフェース装置、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモートコンピュータシステムに出力する、または表示するステップとを含む。
絶対的量に基づく診断法

バイオマーカーの発現レベルと臨床的特徴との間の推定上の関連性は、数学的方法を用いてＱＤＢデータベースからの情報を分析して探究される。例としては、ＨＥＲ２の相対的発現レベルと患者の無病生存率との関係、およびＫｉ６７の表現レベルの胃癌患者への治療に対する有効性の予測が含まれるが、それに限定されない。この情報は、同じ分析における他の患者の予後を提供する可能である。

上記で指摘したように、臨床診療で使用される診断試験は、通常に単一分析物に頼っているため、当該分析物と他のパラメータ（いくつかの臨床的なデータを含む）との間の潜在的な内在関連を捉えることが困難である。さらに、診断検査はしばしば定量的ではなく、免疫組織化学に依存しており、多くの場合、研究場所によって結果が異なっており、一部は試薬が標準化されていないため、もう一部は解釈が主観的で容易に定量化できないためである。

タンパク質標準品がＱＤＢ分析に含まれている場合、バイオマーカーの絶対レベルを達成することができ、異なる臨床検査室にわたるベンチマークを非常に容易にする。２つ以上の標的サンプルから得られたＱＤＢ結果は、それらの適合する臨床情報と共に、数理解析用ＱＤＢデータベースを設立するために使用することができる。バイオマーカーの絶対レベルと臨床的特徴との間の推定的関連性は、数学的方法を用いて探究される。例としては、ＨＥＲ２の絶対的発現レベルと患者の無病生存率との関係が含まれるが、それに限定されない。患者のバイオマーカーの絶対レベルが検出された後、これらの情報は、将来的に患者の診断および予後を提供することができる。

複数のＱＤＢ分析の絶対結果を組み合わせて、数理解析用のデータベースのサイズを増やすことができる。バイオマーカーの絶対レベルと臨床的特徴との間の推定上の関連性は、数学的方法を用いて探究される。例としては、ＨＥＲ２の絶対的発現レベルと患者の無病生存率との関連性、またはＫｉ６７の表現レベルと胃癌患者への治療有効性の予測が含まれるが、それに限定されない。これらの情報では、既知バイオマーカー絶対レベルの患者に対して予後および診断を提供することができる。

標的対象のサンプルを使用して、複数のバイオマーカーの絶対レベルを検出することができる。これらの結果は、標的患者の臨床情報と共に、数理解析用のＱＤＢ参照データベースを設定して患者にこれらのバイオマーカーの絶対レベルが検出される場合に診断および予後を提供するために使用することができる。参照プロファイルは、それぞれが既知の診断または治療後の既知の臨床転帰を伴う患者についてのバイオマーカーの絶対レベルを保有することから得ることができる。後で、新しい患者には、そのバイオマーカーの絶対レベルを検出して参照データベースにおけるものと比較することができる。記憶された参照プロファイルの絶対レベルとの一致は、新しい患者に対する治療のための関連する診断または予後を示すことができる。

臨床的特徴は、その最も広い文脈で考慮されるべきである。前記特徴は、年齢、性別、血圧、グルコースレベル、癌の病期、危険率、無病生存期間、または患者の診断、予防、治療に関連する任意の情報が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の他の実質的な利点は、本発明の診断方法に由来する。具体的に、この方法では、臨床試験に入る前に患者をスクリーニングするためにも利用することができる。個別化治療を目的とした癌治療試験の主な障害は、患者を層別化するために利用可能なバイオマーカーがないことである。癌患者のための絶対的量に基づくスクリーニングツールの検証は、単一標準の使用および試験起動プロセスの改善によってそのような試験費用を著しく減らすことができるだろう。患者の識別およびスクリーニングのためのコストを削減して、本発明の新規なスクリーニング方法は、より広い範囲の集団および／または診療所からの患者の募集、スクリーニングおよび／または選択を容易にし、それによって不十分な患者集団に臨床試験に従事する機会を提供し、これは以前に行われた腫瘍学的試験の大部分にとって大きな制限となっている。

さらに、現在の腫瘍専門医は、通常、「標準治療」と表示されているもの、およびそのような表示を付けていないが特定の種類の癌患者に有効性を示している他の薬剤を含む、利用可能な多くの治療手段の選択肢を有する。診断後できるだけ早く、患者に最適な癌治療選択肢に割り当てられることができれば、良好な治療結果の可能性は最大化され得る。本発明の方法は、可能にする手段を提供することによってこれらの必要性を満たす。

バイオマーカーの絶対レベルは、ＱＤＢ分析を用いて検出できるか、またはそれは、ＱＤＢ分析に加えて他の方法を用いて検出できる。本発明の一実施形態において、標的サンプルの絶対レベルはＱＤＢ分析で検証される。

ＱＤＢデータベースを設立するためのバイオマーカーの絶対レベルは、ＱＤＢ分析を用いて検出することができ、またはそれはＱＤＢ分析を用いて検証することができる。ＱＤＢデータベースは、その最も広い意味で考えるべきである。ＱＤＢデータベースは、ＱＤＢ分析で検出または検証された１つのバイオマーカーの絶対レベルを有する少なくとも１つの標的サンプルを含む。

バイオマーカーの絶対レベルは、複数の抗体を用いて検出することができる。これらの抗体は、バイオマーカーの同じまたは異なるエピトープに対するものでもよい。これらの抗体により検出された前記絶対レベルは同じであってもよく、それらは互いに異なっていてもよい。前記絶対レベルは、異なる抗体を使用して互いに異なる場合、それらと使用される抗体と共に明記されるべきであり、そして診断および予後目的のために個々に処理されるべきである。

本発明の一実施形態において、サンプル中のバイオマーカーの絶対レベルを検出するために複数の検出抗体が使用される場合、これらの抗体による診断または予後が同じであれば、診断または予後は有効であるとみなされる。前記診断または予後が一致しない場合、診断または予後は「あいまい」と考えられ、それにはさらなる検証が必要である。

抗原－抗体相互作用に使用される任意の抗体は、それが標的抗原に特異的であると確認される限り、ＱＤＢ分析に使用することができる。本発明の一実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。本発明のさらに別の実施形態において、抗体はポリクローナル抗体である。

本発明の一実施形態において、免疫組織化学用の抗体は、ヒトまたは動物由来の組織または細胞を用いたＱＤＢ分析に使用することができる。

本発明の一実施形態において、フローサイトメトリー用の抗体は、ヒトまたは動物由来の組織または細胞を用いたＱＤＢ分析に使用することができる。

本発明の別の実施形態において、抗原－抗体に基づくアッセイのための抗体は、ヒトまたは動物由来の組織または細胞を用いたＱＤＢ分析に使用することができる。

本発明の一実施形態において、サンプルのＱＤＢ分析用のバイオマーカー用抗体をある波長で検出可能な蛍光色素で標識することができ、同じサンプルのＱＤＢ分析用の別のバイオマーカー用抗体を別の波長で検出可能な蛍光色素で標識することができることにより、同じサンプル中の両方のバイオマーカーを同時に分析することができる。

本発明の別の実施形態において、サンプルのＱＤＢ分析用のバイオマーカー用抗体を１つの同位体で標識することができ、同じサンプルのＱＤＢ分析用の別のバイオマーカー用抗体を別の同位体で標識することができることにより、同じサンプル中の両方のバイオマーカーを同時に分析することができる。本発明のなお別の実施形態において、サンプルのＱＤＢ分析のためのバイオマーカーに対する抗体は、１つの方法で、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）で標識することができる。同じサンプルのＱＤＢ分析のための別のバイオマーカーに対する別の抗体を蛍光染料で標識して、同じサンプル中の２つのバイオマーカーを同時に検出することができる。

本明細書に記載の「レポーター酵素」は、その最も広い文脈から意味をとるべきである。レポーター酵素は、抗体の検出を補助するために、免疫アッセイにおける抗体に対する任意の修飾であってもよい。例えば、レポーター酵素は、ヨウ化物１２５のような放射性同位体で直接標識された抗体、またはアルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼのようなレポーター酵素、または蛍光色素で直接標識されたものであってもよいが、これらに限定されない。抗体に関連されたレポーター酵素量の検出は、検出反応におけるレポーター酵素量の読み出しとしての検出可能な生成物の形成によることである。かかる生成物は、放射性、発光性、蛍光性、または可視若しくは可視範囲以外の特徴的な吸光度や反射スペクトルを有する生成物であってもよい。結合した抗原－抗体複合体を検出するために補体を使用する場合、それは上記方法のいずれかで標識するか、または特異的な抗補体抗体（ａｎｔｉ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）によって順に検出することができる。

レポーター酵素は、ヨウ化物１２５のような放射性同位体で間接的に標識された抗体、またはアルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼのようなレポーター酵素であってもよいが、これらに限定されない。抗体は、二次抗体を介して間接的に標識されてもよく、かつ二次抗体は、ヨウ化物１２５のような放射性同位体、またはアルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼのようなレポーター酵素で直接的または間接的に標識されてもよい。一実施形態において、二次抗体はビオチンで標識され、西洋ワサビペルオキシダーゼを介してストレプトアビジン分子で間接的にさらに標識される。

本明細書に記載の「抗原」および「抗体」は、その最も広い文脈から意味をとるべきである。「抗原」は、分子、細胞、ウイルス、または粒子であってもよい。用語「抗原」とは、化合物、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞（ｉｎ ｓｉｔｕで放出されるタンパク質）、またはウイルス粒子（ｉｎ ｓｉｔｕで放出されるタンパク質）、または宿主動物（ヒトを含む）によって一つ以上の抗体の産生を誘発し得る任意の分子を指す。また、抗原は任意の２つ以上の上記分子またはその一部が互いに架橋されたものを含む生成物であってもよい。抗原は純粋な形態で存在することも、混合物として存在することもできる。抗原は、修飾形態（例えば、化学物質によって修飾された形態）または未修飾形態であってもよい。

本明細書に記載の「抗体」とは、その最も広い文脈から意味をとるべきである。「抗体」は、「抗原」に結合するポリペプチドである。抗体は、従来の抗体、抗原結合部位含有従来の抗体断片、抗原結合部位含有組換え抗体、抗原に結合するタンパク質、および上記のいずれか２つ以上から架橋結合している生成物が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、純粋な形態で存在することも、混合物として存在することもできる。抗体は、修飾形態（例えば、化学物質によって修飾された形態）、または非修飾形態であってもよい。

「固形腫瘍」は、その最も広い文脈で考慮されるべきである。（充実性腫瘍）固形腫瘍とは、あらゆる組織、癌、または非癌を指し、細胞レベルでつながっており、単一細胞としては存在しない。それは、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、胃がん、腎臓がん、皮膚黒色腫、子宮頸がん、頭頸部がん、脳がん、甲状腺がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、大腸がんが含まれるが、これに限定されない。

本明細書に記載の例示的な実施形態は、現在の好ましい実施形態であり、したがって説明的な意味のみで考慮され、限定の目的ではないと理解されるべきである。各実施形態における特徴または状況についての説明は、他の実施形態における他の特徴または状況に利用可能なもののように典型的に考慮すべきである。

さらに、挙げられている実施例は、以下の実験が全ての、またはこれらのみの、実施可能な実験であることを表すことを意図するものではない。例えば、量または総計（ａｍｏｕｎｔ）、温度などの、使用された数について確実にするように努力してきたが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。
材料および方法

ヒト被験者とヒト細胞株
凍結組織およびホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片の両方を、ＩＨＣスコア（０、１＋、２＋または３＋）を含むそれらの臨床情報と共に地元の病院から取得された。そのうちの一部はＦＩＳＨの結果でした。ＭＣＦ－７およびＢＴ－４７４細胞株は、中国科学院のセルバンク（中国、上海）から取得され、これら２つの細胞株から調製した溶解物をＨＥＲ２陰性対照および陽性対照として使用した。

一般的な試薬
細胞培養に使用されるすべての一般的な試薬は、細胞培養培地および培養皿を含むＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｉｃｓ（米国マサチューセッツ州ウォルサム）から購入された。プロテアーゼ阻害剤は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州セントルイス）から購入された。他の全ての化学物質は、中国北京国薬集団化学試剤有限公司（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、中国、北京市）から購入された。組換えヒトＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２／ＣＤ３４０（６７６－１２５５）タンパク質は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．（北京、中国）から購入された。ＱＤＢプレートは、煙台、Ｙａｎｔａｉ Ｚｅｓｔｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｃｏ． Ｌｔｄ．（中国煙台市）によって製造された。

ベンタナ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）ウサギモノクローナル一次抗体および抗ヒトエストロゲン受容体（クローンＳｐ１）は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ社から購入された。ウサギ抗ＨＥＲ２抗体（クローンＥＰ３）およびマウス抗ヒトＫｉ６７（クローンＭＩＢ１）はＺＳＧＢ－ＢＩＯ社（中国北京）から購入された。ＨＲＰ標識ロバ抗ウサギＩｇＧ二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂ（Ｐｉｋｅ Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）から購入された。

細胞および組織溶解物の調製
凍結組織については、約１５０ｍｇの組織を組織生検から切り出し、そしてプロテアーゼ抑制剤（２μｇ／ｍＬのロイペプチン、２μｇ／ｍＬのアプロチニン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、２ｍＭのＰＭＳＦ、２ｍＭのＮａＦ）を加えた３００μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｎａ_２Ｐ_２Ｏ_７、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１０％グリセロール）中にハンドヘルド組織ホモジナイザーを用いて３０秒処理した後、１２０００×ｇで５分間遠心分離した。免疫ブロット分析のために上清を集めた。総タンパク質濃度は、製造元の取扱説明に従って、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて検出された。ＭＣＦ－７およびＢＴ－４７４細胞から溶解物を調製するために、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）中で細胞を５０回上下にピペッティングすることによって溶解させた。遠心分離後に上清を回収し、総タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキットによって検出した。

ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックについては、２つの１５μｍ切片を収集し、脱パラフィンし、そしてプロテアーゼ抑制剤（２μｇ／ｍＬのロイペプチン、２μｇ／ｍＬのアプロチニン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、２ｍＭのＰＭＳＦ、２ｍＭのＮａＦ）を加えた３００μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｎａ_２Ｐ_２Ｏ_７、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１０％グリセロール）中に処理した後、１２０００×ｇで５分間遠心分離した。免疫ブロット分析のために上清を集めた。総タンパク質濃度は、製造元の取扱説明に従って、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて検出された。ＭＣＦ－７およびＢＴ－４７４細胞から溶解物を調製するために、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液中で細胞を５０回上下にピペッティングすることによって溶解させた。遠心分離後に上清を回収し、総タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて検出された。

ドットブロット分析
図に示すように精製ＨＥＲ２タンパク質を段階希釈し、ＦＦＰＥ切片から抽出した全タンパク質と共に膜上にスポットした。これらのサンプルは、Ｌｉ－ＣｏｒのＣ－Ｄｉｇｉｔ Ｗｅｓｔｅｒｎブロットスキャナーを使用して画像が取り込まれるまで、典型的なドットブロット法で処理された。Ｌｉ－Ｃｏｒ社に由来のＩｍａｇｅＱｕａｎｔｉプログラムを使用して画像をデジタルに変換し、そしてタンパク質標準曲線を確立して、患者サンプルからの画像収集をバイオマーカーの絶対レベルに変換した。

ＱＤＢ分析
特異的抗体（ＨＥＲ２についてはＥＰ３または４Ｂ５クローン、Ｋｉ６７についてはＭＩＢ１、エストロゲン受容体（ＥＲ）についてはＳＰ１）の線形範囲は、これらのバイオマーカーについてそれぞれ陽性と試験された患者からの全溶解物を使用することによって決定した。溶解物は、乳癌または胃癌組織３～４個から調製された等量の組織溶解物を最初に混合することによって調製された。混合した溶解物を０～２μｇまで段階希釈してＱＤＢ分析の線形範囲を決めた。市販されているか、または社内で自己発現および精製されたタンパク質標準品も０～５００ｐｇまで段階希釈してＱＤＢ分析の線形範囲を決定するために使用された。

サンプルを２μＬ／ｕｎｉｔでＱＤＢプレート上に三重にするように加え、従来の技術文献に記載の通りに処理した。一次抗体を１００μＬ／ウェルで加えて４℃で一晩インキュベーションし、そしてロバ抗ウサギまたはロバ抗マウス二次抗体をＱＤＢプレートと共に室温で４時間インキュベートした。ＱＤＢプレートをＴＢＳＴで２回簡単にすすぎ、さらに１０分間ずつ５回洗浄した後、白色９６ウェルプレート（製造元の取扱説明によって調製されたＥＣＬ溶液を１００μｌ／ウェルで予め満たされたこと）に３分間挿入した。Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｉ ２００ ｐｒｏ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダーを使用して「カバー付きプレート」のオプションにより、プレートの個々のウェルからの化学発光シグナルを定量した。

線形回帰式はそれぞれ段階希釈蛋白質標準品を用いて確立した。この式を用いて各乳癌組織サンプル中の総ＨＥＲ２レベルを計算し、そして結果をＢＣＡタンパク質アッセイキットにより検出された総タンパク質量により補正した。実験の一貫性を確実にするために、ＢＴ４７４およびＭＣＦ７から調製した２種の細胞溶解物を、陽性対照および陰性対照として使用した。２種の細胞溶解物を小さい分ずつ分けた。それらの絶対バイオマーカーレベルをまずＱＤＢ分析で検出して記録された後、通常サンプルとして全てのＱＤＢ実験に含まれて使用する。ブランク値２倍未満の化学発光読み取り値を有するサンプルは検出不可能と見なされ、データ分析のために０と入力された。最終結果は、組換えＨＥＲ２タンパク質の純度の百分率によってさらに校正された。

統計的解析
統計的有意性についての一般的な検定には、とりわけ、ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、クラスカル－ウォリスＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ、ウィルコクソンＷｉｌｃｏｘｏｎ、マン－ホイットニーＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ、およびオッズ比が含まれる。バイオマーカーは、単独でまたは組み合わせて、被験体が標的表現型の状態に属するという相対的確率の尺度を提供する。それ自体、バイオマーカーは、例えば疾患、薬物の治療有効性などのためのマーカーとしての用途を見出すことができる。したがってバイオマーカーは、診断などを容易にするアッセイにおける分析物である。

全てのデータは平均値±標準偏差（ＳＤ）として示された。各群の間の差は、対になっていない両側スチューデントｔ検定を用いてマイクロソフトエクセルを用いて計算した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意と見なした。図の説明文に示されるように、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用いて受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した。

実施例１は、ドットブロット分析を用いてＦＦＰＥサンプル中のＨＥＲ２の絶対レベルを如何に検出する方法を示す。

図１Ａでは、組換えＨＥＲ２タンパク質を段階希釈し、ＦＦＰＥブロックから抽出した４人の患者サンプルと共に膜上にスポットした。

膜上にスポットされたタンパク質標準品および患者サンプルを、ドットブロット分析において抗ＨＥＲ２タンパク質のＥＰ３クローンで処理し、そして図１Ａおよび図１Ｂに示すように、Ｌｉ－Ｃｏｒ社製のＣ－Ｄｉｇｉｔ Ｗｅｓｔｅｒｎブロットスキャナーを使用して画像を収集した。

図１Ｃに示すように、図１Ａの画像をＬｉ－Ｃｏｒ社に由来のソフトウェアＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いてデジタルに変換し、これらのデジタルを用いてタンパク質標準曲線を確立した。

同じコンピューターソフトウェアを使用して４人の患者サンプルからの画像もデジタルに変換し、そしてこれらのデジタルは、図１Ｃで確立されたタンパク質標準曲線に基づいてＨＥＲ２絶対レベルに変換された。

図面の図２Ａ～２Ｈは、特異的抗体を用いてＱＤＢ分析の線形範囲をどのように決めるかを示している。図２Ａは、ＨＥＲ２－ＥＰ３抗体を用いた凍結乳癌組織に対するＱＤＢ分析の線形範囲を示す。図２Ｂは、ＨＥＲ２－ＥＰ３抗体を用いたＦＦＰＥ切片に対するＱＤＢ分析の線形範囲を示す。図２Ｃは、組換えＨＥＲ２タンパク質に対するＱＤＢ分析の線形範囲を示す。図２Ｄは、ＭＩＢ１抗体を用いた凍結胃癌組織に対するＱＤＢ分析の線形範囲を示す。図２Ｅは、Ｋｉ６７に対するＭＩＢ１抗体を用いたＦＦＰＥ切片に対するＱＤＢ分析の線形範囲を示し、図２Ｆは、ＭＩＢ１抗体を用いたＫｉ６７タンパク質の組換え断片（フラグメント）に対するＱＤＢ分析の線形範囲を示す。図２Ｇは、ＳＰ１抗体を用いたエストロゲン受容体（ＥＲ）タンパク質の組換え断片に対するＱＤＢ分析の線形範囲を示す。図２Ｈは、ＥＲに対するＳＰ１抗体を用いたＦＦＰＥ切片対するＱＤＢ分析の線形範囲を示す。

図３Ａ～３Ｄは、それぞれＨＥＲ２－４Ｂ５、ＭＩＢ１およびＳＰ２抗体を用いた乳癌組織におけるＨＥＲ２（Ａ）、Ｋｉ６７（Ｂ）およびＥＲ（Ｃ）の絶対レベルを示す。図３Ｄにおいて、凍結胃癌組織におけるＨＥＲ２の絶対レベルは、ＨＥＲ２－ＥＰ３抗体を用いて検出された。結果は３回の独立した実験でのそれぞれの三重繰り返しの結果の平均値であり、それらのＩＨＣスコアに基づいてグループ化された。

図４Ａ～４Ｄは、受診者動作特性（ＲＯＣ）分析を使用してＱＤＢ結果を分類結果に如何に変換する方法を示す。ＱＤＢ分析からの結果は、それらのＩＨＣ結果に基づいて陰性群と陽性群に分けられ、これらの２つの群のデータは、最適化の特異性と感度とのカットオフ値を計算するために使用された。図４Ａおよび図４Ｂは、それぞれＨＥＲ２－ＥＰ３およびＨＥＲ２－４Ｂ５抗体に基づくＱＤＢ分析結果のＲＯＣ曲線を示した。図４Ｃと図４Ｄは、ＲＯＣ分析から提案されたカットオフ値に基づいてＱＤＢ結果を陰性群と陽性群に分ける方法を示す。

図５では、２６３個のＦＦＰＥサンプルからのＨＥＲ２絶対レベルを検出し、地方病院によりＮｏｔｔｉｎｇｈａｍ組織学的スコアに基づいて提供された組織学的悪性度（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｇｒａｄｅ）に基づいて群としてプロットした。級別Ｉ群（グループ）に３４のサンプル、級別ＩＩ群に１２５のサンプル、級別ＩＩＩ群に１０４のサンプルがあった。３つの等級の平均は０．０８、０．７３、および３．１５ｎｍｏｌｅ／ｇであった。ＨＥＲ２レベルは、級別Ｉ群および級別ＩＩ群からのものよりも級別ＩＩＩ群の患者で有意に高く、そしてＨＥＲ２絶対的レベルは級別Ｉ群の患者よりも級別ＩＩ群の患者の間で有意に高かった。この結果は、ＩＨＣ分析とＦＩＳＨ分析の両方を用いた現在の一般的な分類システムでは達成できない。

本明細書に引用された全ての刊行物および特許は、あたかも各個別の刊行物または特許が具体的かつ個別に参考として援用されるように示され、参照により本明細書に援用されている。いかなる刊行物の引用も出願日前のその開示のためであり、そして本発明が先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供された出版日は実際の出版日とは異なる可能性があり、それは独立して確認する必要があるかもしれない。参照により本明細書に組み込まれる文書に記載されている用語の定義が、本明細書に明示的に定義されている用語の定義と矛盾する限りにおいて、本明細書に記載の定義が優先する。

次の声明では、特に開示される発明のいずれかに向けられている特定の実施形態またはそれらの組み合わせが新規で自明ではない点を示していると考えられている。特徴、機能、要素および／または特性の他の組み合わせまたはサブコンビネーションで具体的に表現される発明は、本願特許請求の範囲の補正または本願や関連出願における新しい請求項介して請求することができる。そのような補正されたまたは新しい請求項は、それらが異なる発明に関するものであるかまたは同じ発明に関するものであるかにかかわらず、元の請求項と範囲が異なるか、広いか、狭いか、または等しいかにかかわらず、同様に本発明の主題の範囲内に含まれるとみなされる。

Claims (18)

1. サンプルの定量分析方法であって、
   （ａ）サンプルの１つまたは複数の特徴を表す単一のマーカーを提供するステップであって、前記サンプルはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルであり、前記マーカーのエピトープの単一ユニットの集団を含む、ステップと、
   （ｂ）定量ドットブロット（ＱＤＢ）分析を用いて前記マーカーを検出するステップであって、定量的結果はサンプル中の前記マーカーのエピトープの単一ユニットの集団の絶対量であり、前記ＦＦＰＥ組織サンプル中の総タンパク質重量によって補正される、ステップと、
   （ｃ）前記マーカーの絶対定量的結果に基づいて、前記サンプルの１つ以上の特徴の測定を得るステップと、を含む
   サンプルの定量分析方法。
2. 前記ステップ（ｂ）には、
   （ｂ１）結合因子を含む溶液と共にサンプルをインキュベートするステップであって、前記結合因子は、前記マーカーのエピトープの単一ユニットに特異的に結合することができ、且つ、前記結合因子は、前記定量ドットブロット（ＱＤＢ）分析によって定量化することができる、ステップと、
   （ｂ２）前記結合因子のＱＤＢ分析により前記マーカーを検出するステップと、を含む、請求項１に記載の定量分析方法。
3. 前記マーカーはタンパク質マーカーであり、そして前記結合因子は抗体である、請求項２に記載の定量分析方法。
4. 前記抗体は分析物特異的試薬（ａｎａｌｙｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ：ＡＳＲ）抗体もしくはインビトロ診断（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：ＩＶＤ）抗体であり、または免疫組織化学でアッセイすることができる、請求項３に記載の定量分析方法。
5. 前記サンプルは被検対象からの生検組織である、請求項１に記載の定量分析方法。
6. 被検対象は癌患者である、請求項５に記載の定量分析方法。
7. 前記マーカーの絶対定量的結果は、該マーカーの絶対的定量結果に基づいて患者を評価するために使用される定量結果である、請求項６に記載の定量分析方法。
8. 患者を評価することは、患者に対して癌の診断および予後を含む、請求項７に記載の定量分析方法。
9. 前記癌の診断および予後は、無病生存率、全生存率、ハザード比、および治療案の予測を含む、請求項８に記載の定量分析方法。
10. 患者を評価することは、市販のキットによって行われる、請求項９に記載の定量分析方法。
11. 患者からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプル中のマーカーの抗体による絶対定量分析に基づき、患者の癌を診断するための参照データベースの提供方法であって、
    複数の参照プロフィールの提供を含み、前記複数の参照プロフィールのそれぞれは、
    （ａ）定量ドットブロット（ＱＤＢ）分析により前記マーカーを検出するステップであって、定量的結果は、確定診断された癌患者から提供された既存のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプル中の前記マーカーの絶対量であり、前記ＦＦＰＥ組織サンプル中の総タンパク質重量によって補正される、ステップと、
    （ｂ）前記定量的結果を癌患者の確定診断と関連づけることにより参照プロフィールを得るステップとによって得られる、
    参照データベースの提供方法。
12. 前記ステップ（ｂ）には、
    （ｂ１）前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルを、前記マーカーに特異的に結合する結合因子を含む溶液と共にインキュベートするステップと、
    （ｂ２）前記結合因子のＱＤＢ分析により前記マーカーを検出するステップとを含む、請求項１１に記載の参照データベースの提供方法。
13. 前記マーカーはタンパク質マーカーであり、そして前記結合因子は抗体である、請求項１２に記載の参照データベースの提供方法。
14. 患者からの生検組織サンプル中のマーカーの定量分析に基づき、患者の癌を診断するための参照データベースの構築方法であって、
    前記参照データベースは、複数の参照プロフィールを含み、前記複数の参照プロフィールのそれぞれは、
    （ａ）定量ドットブロット（ＱＤＢ）分析により前記マーカーを検出するステップであって、定量的結果は、確定診断された癌患者から提供された既存のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプル中の前記マーカーの絶対量であり、前記ＦＦＰＥ組織サンプル中の総タンパク質重量によって補正される、ステップと、
    （ｂ）前記定量的結果を癌患者の確定診断と関連づけることにより参照プロフィールを得るステップとによって得られる、参照データベースの構築方法。
15. 患者の癌を診断するための診断結果を取得する方法であって、
    請求項１１に記載の提供方法により参照データベースを提供するステップと、
    ＱＤＢ分析法により患者から得た既存のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおいて前記参照データベースに使用されるマーカーの含有量を検出するステップであって、検出結果が前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおける前記マーカーの絶対量である、ステップと、
    前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおける前記マーカーの定量的結果を、前記参照データベースに記憶された参照プロフィールのそれぞれに比較するステップと、
    前記参照データベースから、前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおける前記マーカーの定量的結果とのベストマッチを有する参照プロフィールを検索し、検索された参照プロフィールに関連する既知の診断結果を出力するステップとを含む、方法。
16. 請求項１１に記載の提供方法により提供される参照データベースを記憶したコンピュータ可読記憶媒体を含み、
    前記コンピュータ可読記憶媒体により前記参照データベースを利用して、
    ＱＤＢ分析法により患者のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおいて前記参照データベースに使用されるマーカーの含有量を検出するステップであって、検出結果が前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおける前記マーカーの絶対量である、ステップと、
    前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおける前記マーカーの定量的結果を、前記参照データベースに記憶された参照プロフィールのそれぞれに比較するステップと、
    前記参照データベースから、前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおける前記マーカーの定量的結果とのベストマッチを有する参照プロフィールを検索し、検索された参照プロフィールに関連する既知の診断結果を出力するステップとの操作を実行する、患者の癌を診断するための装置。
17. インターネットを介して請求項１１に記載の提供方法により提供される参照データベースにアクセスするように構成されているユニットを含み、
    前記参照データベースを利用して、
    ＱＤＢ分析法により患者のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおいて前記参照データベースに使用されるマーカーの含有量を検出するステップであって、検出結果が前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおける前記マーカーの絶対量である、ステップと、
    前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおける前記マーカーの定量的結果を、前記参照データベースに記憶された参照プロフィールのそれぞれに比較するステップと、
    前記参照データベースから、前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおける前記マーカーの定量的結果とのベストマッチを有する参照プロフィールを検索し、検索された参照プロフィールに関連する既知の診断結果を出力するステップとの操作を実行する、患者の癌を診断するための装置。
18. 患者からの生検組織サンプル中のマーカーの定量分析に基づき、患者の癌を診断するための参照データベースの使用であって、
    ＱＤＢ分析法により患者のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおいて前記参照データベースに使用されるマーカーの含有量を検出し、検出結果が前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおける前記マーカーの絶対量であり、
    前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおける前記マーカーの定量的結果を、前記参照データベースに記憶された参照プロフィールのそれぞれに比較し、
    前記参照データベースから、前記ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検組織サンプルにおける前記マーカーの定量的結果とのベストマッチを有する参照プロフィールを検索し、検索された参照プロフィールに関連する既知の診断結果を出力する、参照データベースの使用。
    

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