JP5130465B2 - 肝細胞癌マーカー及び肝細胞癌の検査方法 - Google Patents
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Description
1.生体から生体検体を分離し、当該生体検体中のEB1(End-binding protein 1)を癌予後予測マーカーとして検出又は定量することを特徴とする肝細胞癌の検査方法。
2.生体検体が、肝細胞癌を含む生体検体である前項1に記載の検査方法。
3.EB1の検出又は定量を、免疫学的手法により行う前項1又は2に記載の検査方法。
4.免疫学的手法が、免疫組織染色である前項3に記載の検査方法。
5.生体検体中のEB1を検出又は定量するための抗EB1抗体を含む前項1〜4のいずれか1に記載の検査方法に用いる検査用試薬。
6.生体検体中のEB1を検出又は定量するための抗EB1抗体と、EB1と抗EB1抗体の反応を検出しうる標識を含む前項1〜4のいずれか1に記載の検査方法に用いる検査用試薬キット。
正常肝、背景肝、高分化型肝細胞癌、中分化型肝細胞癌、低分化型肝細胞癌を3例ずつ、計15症例の生体検体について、EB1に対する特異抗体(抗EB1抗体)を用いてウェスタンブロット法によりEB1の発現を調べた。各生体検体は手術検体から取得したものであり、国立がんセンターの倫理委員会の審査及び承認を得たものである。
ウェスタンブロット法を行う前に、各生体検体について以下の前処理を行った。
各症例の手術検体から肝細胞を含む組織を回収し、液体窒素で凍らせた。凍らせた組織をマルチビーズショッカーTM(安井機器、大阪)にて破砕して粉末状にした。粉末状にした組織にタンパク質抽出用緩衝液(6M ウレア、2M チオウレア、3% CHAPS、1% TritonX-100)を加えてタンパク質を抽出した。
上記抽出したタンパク質20μgをSDS−PAGEにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。1次抗体は、ウサギ抗EB1抗体(Santa Cruz Biotechnology社)を用いた。2次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体 (GE Healthcare Biosciences社)を用いた。1次抗体は200倍希釈し、2次抗体は1000倍希釈した。検出にはECLキット(GE Healthcare Biosciences社)を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーLAS-3000TM (富士フィルム社)及び ImageQuantTM software (GE Healthcare社)により解析した。
ウェスタンブロット法による解析の結果、蛍光二次元電気泳動法と同様に、正常肝、背景肝、高分化型肝細胞癌では低発現であったが、中分化肝細胞癌、低分化型肝細胞癌では高発現の傾向にあった(図3)。
EB1の予後予測能を検証する目的で、抗EB1抗体を用いた免疫組織染色を肝細胞癌145症例の検体について行った。
パラフィン包埋組織切片試料について、CSA染色 (catalyzed signal amplification (CSA) system(DAKO社)の使用説明書の指示に従い、免疫組織染色を行った。通常の方法に従い脱パラフィン処理した切片試料を、10mMクエン酸塩緩衝液(pH 6.0)中で10分間121℃オートクレーブ滅菌した。切片試料を、500倍希釈のウサギ抗EB1ポリクローナル抗体(Santa Cruz社)、HRP標識抗ウサギ抗体(DAKO社)、増幅試薬及び抗蛍光HRP(DAKO社)を用いて標識した。免疫組織染色のために更にDAB染色 (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)(DAKO社)を行った。
免疫組織染色を行った145症例のうち、EB1陽性症例は40例、陰性症例は105例であった。EB1陽性症例は中分化肝細胞癌、低分化型肝細胞癌に多い傾向にあった(表1)。予後との関連を検討した結果、術後5年生存率はEB1陽性症例では22.6%であったのに対し、EB1陰性症例では60.9%であり、陽性症例は陰性症例よりも有意に予後不良であった(p<0.0001)(図5A)。また術後5年無再発生存率に関してもEB1陽性症例は7.8%であったのに対し、EB1陰性症例は29.9%であり、陽性症例は陰性症例よりも有意に再発が多く認められた(p<0.0001)(図5B)。
本発明において、EB1を肝細胞癌予後予測マーカーとして選別するに至った経緯として、二次元電気泳動及び質量分析を行い、肝細胞癌の予後に影響を及ぼすタンパク質を選別した。その内容について、以下に具体的に示す。
レーザーマイクロダイセクション(mmi CellCutTM、NIPPN TechnoCluster社)を用いて細胞を回収し、タンパク質抽出用緩衝液(6M ウレア、2M チオウレア、3% CHAPS、1% TritonX-100)を加えてタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質を蛍光色素(サチュレーションダイCy5TM、GE Healthcare Biosciences社)で標識した。標識は以下のように行った。(1)終濃度30mMとなるようにpH8.0のトリス緩衝液を加え、次に(2)1nmolのTECP(トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンヒドロクロライド,Sigma社)を加え、(3)37℃で60分間処理した。次に、(4)Cy5蛍光色素を4nmol加えて、37℃で30分間処理した。今回の実験に用いたタンパク質試料から等量ずつタンパク質試料を集めて混合し、内部コントロール試料とした。内部コントロール試料を蛍光色素(サチュレーションダイCy3TM、GE Healthcare Biosciences社)で上記と同様に標識した。Cy5で標識した個別のサンプルとCy3で標識した内部コントロール試料を混合し、ウレア可溶化液で最終容量420μlとした。その際、終濃度が65mMとなるようにジチオスレイトール(DDT)を、2%となるようにとアンフォラインTM(GE Healthcare Biosciences社)を加えた。Cy5で標識した個別試料とCy3で標識した内部コントロール試料を混合したサンプルを一枚の二次元電気泳動ゲルで泳動した。
まず、一次元目の泳動はイモビラインゲル(24cm、pI4−7、GE Healthcare Biosciences社)と、Multiphor IITM(GE Healthcare Biosciences社)を使用した。泳動するタンパク質試料でイモビラインゲルを室温にて一晩膨潤させた。泳動は40000Vhで行った。二次元目の泳動は9−15%のポリアクリルアミドのグラジエントゲルと、二次元泳動装置を使用した。泳動は泳動装置一台につき18Wで10時間、15℃で行った。
泳動終了後は、タンパク質を検出する目的で、ガラス板に挟んだままの状態のゲルをレーザースキャナー(Typhoon TrioTM、GE Healthcare Biosciences社)に載せてスキャンした。
読み込んだ画像を画像解析ソフトDeCyderTM(GE Healthcare Bio-sciences社)で解析した。
a.ゲル内消化法
全自動スポット回収装置ProHunterTM(AsOne社)を用いて、ゲルから96穴プレートにスポットを回収した。ゲルをメタノールで十分洗浄し、タンパク質分解酵素(トリプシン)で37℃にて一晩処理した。この処理によってタンパク質はペプチド化される。得られたペプチドは、60%アセトニトリルにてゲルを洗浄することで回収した。
b.質量分析
ペプチドの質量を測定するためにLTQTM(サーモエレクトロン社)を使用した。タンパク質同定のためのデータベース検索にはMasCotTMを使用した。
上記方法により二次元電気泳動を行った結果、約5000個のタンパク質スポットが得られた(図6)。これにより得られた、約5000個のタンパク質スポットから、各群間の比較において、(1)Wilcoxon検定 p<0.01、(2)平均値の値が3倍以上の差、(3)p値の低い順番に上位20番目まで、という基準でタンパク質スポット120個を選別した。質量分析装置を用いたタンパク質同定の結果、EB1に由来するタンパク質スポットが、120個のスポット中に含まれていた。このEB1に由来するタンパク質スポットの濃度は、正常肝、背景肝、高分化型肝細胞癌では低かったが、中分化型肝細胞癌、低分化型肝細胞癌では高い傾向にあった(図1、2)。そこで、EB1に着目し、EB1が肝細胞癌の予後予測マーカーとなりうるかについて検討した。これにより、上記実施例2の結果が得られ、予後予測マーカーとして希望しうることが確認できた。
Claims (6)
- 分離された生体検体中のEB1(End-binding protein 1)を癌予後予測マーカーとして検出又は定量することを特徴とする肝細胞癌の検査方法。
- 生体検体が、肝細胞癌を含む生体検体である請求項1に記載の検査方法。
- EB1の検出又は定量を、免疫学的手法により行う請求項1又は2に記載の検査方法。
- 免疫学的手法が、免疫組織染色である請求項3に記載の検査方法。
- 生体検体中のEB1を検出又は定量するための抗EB1抗体を含む請求項1〜4のいずれか1に記載の肝細胞癌の検査方法に用いる癌予後予測検査用試薬。
- 生体検体中のEB1を検出又は定量するための抗EB1抗体と、EB1と抗EB1抗体の反応を検出しうる標識を含む請求項1〜4のいずれか1に記載の肝細胞癌の検査方法に用いる癌予後予測検査用試薬キット。
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