JP2009538436A - 逆相プロテインアレイ、タンパク質活性化及び発現のサイン並びに関連する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、少なくとも部分的に、Leukemia Society of America助成金番号6089及び国立衛生研究所PO1助成金番号CA−55164からの資金を使用して開発された。米国政府は本発明に一定の権利を有し得る。
表1
表2
他の例は、mIR、Hox並びにヒストンアセチル化及びメチル化レベルを含む。
試料は、採取後ただちに氷上に置き、採取の2時間以内で新鮮に処理された。白血病細胞に富む画分は、以前記載された通りFicoll−Hypaque separation(Mediatech、Hearndon、バージニア州)によって単核細胞画分を単離し、続いてmagnetic antibody−conjugated sorting(Miltenyi Biotec、Auburn、カリフォルニア州)によるCD3+/CD19+ B−細胞及びT−細胞の除去によって作製された。細胞は、ウェスタンブロット法又はRPPAアレイのための全細胞溶解液を作製するために新鮮に使用された。リン酸化エピトープの安定性を評価するために、凍結保存細胞を融解し、室温に2時間置き、且つ一定分量をRPPAのために溶解した。残りの細胞は、再凍結した。同じサイクルをもう一度繰り返した。次いで細胞を、RPPAのための通常の方法で調製した。
「幹細胞」に富む画分を単離するために、CD34+細胞をMACS(Miltenyi、Biotech Inc.、Auburn、カリフォルニア州)によって、上記の白血病細胞に富む画分から精製し、次いで抗CD34抗体、抗CD38抗体及びIgG対照(Beckton Dickinson、San Jose、カリフォルニア州)とのインキュベーション後にフロー選別によってCD34+/CD38−画分とCD34+/CD38+画分とに分離した。対照よりも強い蛍光強度を示している細胞を、陽性とみなした。選別した細胞の一定分量を純度について再分析した。選別し、且つ分離した細胞を、以下に記載の通りRPPA溶解緩衝液中に可溶化した。
ATCCから得た白血病細胞系(U937、HL60、OCI−AML3、KG−1、Mo7e、TF1)を0.5%又は10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン100mg/nL、4nMグルタミン酸(全てGibco、米国)を補充したRPMI 1640培地中で増殖させた。細胞は、回収までコンフルエントレベル以下で維持し、次いで氷冷リン酸緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄し、上記溶解緩衝液のいずれかで20〜30分間可溶化し、14000RPMで遠心分離し、沈殿物は廃棄した。細胞溶解液は、以下のRPPA節に記載の通り希釈した。
ウェスタンイムノブロット分析を、細胞4〜5×105個由来の材料及びBiorad Criterion system(Biorad、Hercules、カリフォルニア州)を使用して、対照細胞系(K562及びジャーカット細胞)及び分子量マーカーと同一のブロット上に添加した骨髄及び末梢血の試料で、以前に記載の通り実施した。多数のウェスタンブロット研究は、これらの試料がタンパク質分解を受けず(アクチンのラダー化が無いことによって評価された)且つ、リン酸化タンパク質状態が少なくとも10年間安定に残ること(網膜芽タンパク質について)を示している。
タンパク質生化学における制限要因の1つは、抗体(AB)の有効性及び品質である。各候補抗体は、RPPAによる使用のために承認される前に、ストリンジェントな検証手順の対象となった。ABは、細胞系及び患者試料に対してWBにおいて主要な単一のバンドを有し、いかなる非特異的バンドも有さない必要がある。それは、ABが、切断、突然変異又は欠失によるサイズ変異体を含む既知の細胞特性を認識する場合には容認される。リン酸化されたエピトープに対する抗体は、タンパク質のリン酸化された又はリン酸化されていない形態を生じる、刺激された(例えば増殖因子)又は阻害された(特異的阻害剤)試料に対する特異性を示す必要があった。別法として、遺伝子的に改変された細胞(例えばトランスフェクトされた又はsiRNA阻害された)及び細胞系は、ABを検証するために使用できた。最後に、上記基準に合格した抗体について、RPPAによる結果は、WBによって認められるそれと同等である必要があった。
定量の目的でタンパク質細胞溶解液をアレイの調製の直前に98ウェルプレートで追加の溶解緩衝液で系列希釈(6又は8系列希釈:完全強度、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)した。希釈は、マルチチャネルピペットで手作業で行った。希釈試料を、384ウェルプレートに移し、10分間、95℃で加熱した。これらのプレートから溶解液材料をautomated robotic GeneTac arrayer(Genomic Solutions、Inc.、North Bellerica、Ann Arbor、ミシガン州)で、ニトロセルロースで覆ったガラススライド(FAST Slides、Schleicher & Schuell BioScience、Inc.米国、Keene、ニューハンプシャー州)上にプリントした。24枚までの同一のスライドを一度にプリントできる。採用されたRPPAトランスファー法は、アレイピンの接触1回当たりタンパク質溶解液約1nL(完全強度タンパク質溶解液からの細胞10個当量に相当)がニトロセルロースガラススライドに移される非接触法である。ガラススライド上にスポットされるタンパク質濃度は、試料セットの中の元のタンパク質濃度に応じて、ピンの接触回数をドットスポット1つ当たり5から10回(8倍系列希釈後の細胞100から0.8個当量に相当する)に変化させることによって調整できる。1152個までの個々のドットを、スライド1枚にプリントできる。アレイスライド上の各スポットは、具体的な試料の溶解液の一定の希釈物を表している。6倍系列希釈ステップを使用する場合、試料192個程度を単一のスライド上にスポットできる。一度プリントするとスライドは、−80℃で安定であり、少なくとも6〜12ヵ月間染色可能である。希釈したタンパク質をプリントするプレート(384ウェルプレート)は、−80℃で少なくとも12〜18ヵ月間保存可能であり、同じ元の試料からの新たなアレイスライドの複数回の反復プリントプロセスに使用できる。
スライドのプリント後、スライドのブロッキング、ブロッティング及び抗体のインキュベーションについてイムノブロッティングのために使用するのと同じストリンジェントな条件を適用する。最初にマイクロアレイスライドを、一次抗体の添加の前に内在性ペルオキシダーゼ、アビジン、及びビオチンタンパク質活性についてブロックした。DAKO(Copenhagen、デンマーク)シグナル増幅システムをAB結合強度の検出及び増幅のために使用した。この市販で入手可能な触媒系キットは、3,3’−ジアミノベンジジンテトラクロライド(DAB)を使用し、一次抗体によって検出されるシグナルを増幅するために基質のレポーター沈着を触媒した。ビオチン化された二次抗体(抗マウス又は抗ウサギ)を、シグナル増幅のための開始点として使用する。二次抗体に付着したストレプトアビジン−ビオチン複合体及びこの複合体上のビオチン−チラミド沈着は、反応を増幅するために使用される。チラミド結合西洋ワサビペルオキシダーゼは、DABを切断し、優れた信号雑音比を有する安定な茶色の沈澱物を生じる。本技術は、フェムトモル感度範囲まで高感度且つ再現可能である。
LSBにおける細胞溶解液を、1nL当たり細胞10個当量の細胞濃度にブロモフェノールブルーを含むWB溶解緩衝液を使用して調製する(「青色」溶解液と称する)。試料は、凍結前に使い捨てバイアルに50μlずつ分注する。調製され、保存され且つ使用可能なWB青色溶解液がRPPAによって分析可能であるかどうかを評価するために、我々は、これらを同じ患者から同日に1nL当たり細胞7又は10個のいずれかの濃度で調製された凍結保存標本を使用して新たに調製した細胞溶解液(「透明溶解液」)と比較した。「青色」及び「透明」溶解液の両方は、データ評価(図1)のために分析可能であった希釈曲線の直線部分において強いシグナルを生じた(図2)。「透明」及び「青色」溶解液の間の患者内の可変性は、極少であった。図1のスライドは、Stat3及びp−Stat3(Tyr705)について染色した患者試料由来のリン酸化タンパク質染色の例を示している。5名の異なる患者から同日に採取した末梢血(PB)及び骨髄(BM)試料を異なる行に、第一列は新たに調製した「透明」溶解液で、及び第二列は既存の「青色」溶解液で、プリントした。最上列と比較して、第二列におけるより強いシグナルは、透明溶解液に対して青色溶解液の元の試料中のnL当たりの細胞数がより多いためである。結論として、WB溶解緩衝液中のブロモフェノールブルーは、図1に例示する通りシグナル検出及び分析に影響せず、LSBにおける既存のタンパク質溶解液をRPPAのために使用できることを示唆している。
リン酸化エピトープの安定性を評価するために、我々は、タンパク質を生成するために使用する細胞の操作がリン酸化タンパク質の検出に影響するかどうかを試験した。患者から同じ日に採取し、凍結保存した血液及び骨髄由来の細胞のバイアルを融解し、一部を全細胞溶解液を作製するために移し、残りの細胞を再凍結した。これを2回繰り返し、その後第二の溶解液を調製した。これらの凍結融解標本を、新鮮に調製した溶解液と共にスライド上にプリントし、且つ8種の全体及びリン酸化タンパク質:ERK1/2、p−MAPK42/44、Stat3、p−Stat3(Thr705)、Akt、p−Akt(Ser473)、p38、p−p38(Thr180/Tyr182)で探索した。新鮮に調製した青色溶解液と、1回目又は3回目の融解からの凍結保存由来試料(PB又はBMのいずれか)から調製された試料との間にリン酸化エピトープ発現強度における統計的有意差はなかった。(図5及び図6)。WB又はフローサイトメトリーを使用する我々の発見と一致して、(リン酸化)−タンパク質と同程度のレベルの発現がPB及びBM試料(患者5を除く)において観察され、白血病細胞に富むPB及びBM試料を、どちらか一方のみが入手可能である場合には同じ分析において使用できることを示している。上記観察は、同時に回収されたPB及びBM試料を有するAML試料23個の第三の試料セットにおいてさらに確認された。これらの標本の発現プロファイルは、教師なし階層的クラスター分析において同じ患者由来のPBとBMの間において統計的有意差を示さなかった(23試料及び37抗体についてp=0.67)。
RPPAの再現性及び可変性を評価するために、溶解調製物間の変動さらにはプレート及び実験準備並びにアレイ実施の間の変動を試験した(サンプル間及びサンプル内並びにアレイ内及びアレイ間の変動)。
試料中のタンパク質の絶対濃度を正確に決定するために、今回我々は、タンパク質濃度が不明である試料との比較のために、既知の濃度の精製タンパク質又は組換えペプチドに対する標準シグナル強度−濃度曲線を作製する。これらのペプチド標準−基準曲線を使用して、各試料/溶解液の未知のタンパク質濃度を算出できる。最初に、各スライド上にプリントされた対照細胞溶解液(例えば、U937、HL60、ジャーカット)のタンパク質濃度を、「スライド」のシグナル強度についての基準点として役立てるために決定する。次いで各スライドは、対照細胞溶解液のタンパク質発現強度について標準化できる。それから、絶対タンパク質濃度をペプチド標準曲線を読み取って決定できる。一例を図7に示す。精製した活性化Aktタンパク質及びp−Akt473ペプチドをRPPAによって配置した。シグナル強度(Y軸)対タンパク質濃度(タンパク質(pg)logスケール)をプロットした。精製した活性化AKT及びリン酸化AKTペプチドとシグナル強度との間には直線関係があった。RPPAアッセイは、活性化AKTタンパク質をピコグラムレベルまで、リン酸化AKTペプチドをフェムトグラムレベルまで検出し、細胞数又はタンパク質濃度の最少差異を検出する能力についての我々の観察を補完する。
白血病細胞におけるタンパク質発現の分析のほとんどは、希少な幹細胞集団よりも、骨髄又は血液中の白血病細胞のバルク集団を利用する。未解決の疑問は、幹細胞中のタンパク質発現は、白血病細胞のバルク集団のそれと同様であるか又は異なっているかである。実際には10〜20000個のLSC又はHSCだけが、試料から単離できることから(細胞1×107個の0.001%=幹細胞10000個)、伝統的方法(WB、フロー)は、幹細胞におけるタンパク質発現を分析できていない。対照的に、RPPA分析のためのスライド1枚は、8倍希釈系列について細胞約200個のタンパク質当量物を必要とするだけであり、RPPAを、少量細胞集団の分析に理想的に適するものにし、且つ幹細胞10〜20000個は、一試料から50から200枚のスライドのプリント(50から200の異なるABに相当)を可能にする十分な溶解液を提供するであろう。この数は、各スライドに蛍光色素プローブCy3及びCy5を使用して2倍にできた。実験的に我々は、単離されたCD34+/CD38−幹細胞、CD34+/CD38+細胞、CD34+細胞及びバルク白血病細胞集団からタンパク質溶解液を作製した。図8は、RPPAによってアッセイし、且つ様々なABで探索した陽性及び陰性(CD34/38)HSC系列のいくつかの例を示す。結果は、HSCは正常SCと比較して異なるタンパク質サイン有することを示している(データ未記載)。
RPPAと従来技術との相関関係をヒト白血病細胞系U937及びNB4において評価した。細胞を、様々な用量のシタラビン単独又はイダルビシンとの組合せでインキュベートした。細胞を様々な時点で溶解し、分析し、且つRPPA及びWBによって探索した。RPPAでの発現レベルは、ウェスタンブロット法によって決定した発現レベルと高度に相関した。WBとRPPAの結果の間には、相関係数がAkt、p−Akt(473)、Erk、p−Erk(42/44)、Bcl−2についてはR2=0.89〜0.98の間である優れた相関関係があった(データ未記載)。
アレイ間比較。アレイ分析における1つの課題は、アレイ間の可変性及び染色の比較可能性である(アレイ間)。スライド間を増大させる1つの手法は、各スライド上で未刺激、刺激された及び阻害された細胞溶解液(例えばMDA−468±EGF、U937、HL60、ジャーカット±FAS又は細胞溶解液の混合物)からなる陽性対照を実施することである。これらは、「スライド」のシグナル強度に対する基準点として役立つ。個々の試料は、平均スライド強度との比較で、及び異なる抗体で染色したスライド上の特定の試料の強度との関係において比較できる。したがって、異なるアレイ由来の試料及び抗体の相互比較を比較できる。
タンパク質の添加量はシグナル強度に影響する。プリント、AB結合/検出及び染色の可変性を補正するために、我々は、タンパク質添加量補正法の開発を目指した。この必要性は、異なる試料セット(細胞系、一次試料、幹細胞)の教師なし階層的クラスター分析が、その対応するセットに応じて試料を配置するという観察によって支持される。試料は、個々のタンパク質発現強度についてのその実際の値よりもそのタンパク質添加量に応じてクラスター化する。
本データセットは、遺伝子発現アレイの分析に対して使用されたものと同一のプログラム及びアルゴリズムを使用して分析する。データは、差次的タンパク質発現に基づくクラスターの存在について、統計的ソフトウェアを使用するモネセティック(二値変数)クラスター化法によって分析される。連続性補正カイ2乗検定を統計的分析のために使用する。様々なクラスター化法(階層的クラスター分析、K−平均、独立成分分析、相互情報量及びジーンシェービングを含む)を、試料を統計的に類似の群に分類するために使用する。これらの群の頑健性及び統計的有意性は、データのブートストラップリサンプリングによって評価される。追加的に、この分類のドライバーは、pathway analysis software(Ingenuity Syst.、Mountain View、カリフォルニア州)を使用して、活性化される経路を分析することによって決定できる。患者試料は、患者の特徴(細胞遺伝学的、年齢性別、FAB型、血液病前歴、芽球百分率を含む)及び転帰データ(治療への反応、治療の型、寛解期間など)を含むLeukemia Sample Bank Databaseに関連している。これらのデータは、フィッシャーの直接確率計算法、分散分析及び再発までの期間についてのコックス比例ハザードモデルを含む標準的統計的方法を使用してRPPAクラスターと相関させ得る。この様に、我々は、RPPAによって作製された患者試料のクラスターが臨床的有意性を有するか、及び細胞遺伝学、化学療法型などの特定のエンドポイントと関連するかどうかを決定できる。差異を決定するための適切な能力は、患者試料約80個の「トレーニングセット」及び独立した「試験及び検証セット」としての少なくとも患者試料120個を必要とする。分析される患者試料320個が高い情報内容を提供する任意の研究における転写プロファイリングによって分析されるいかなるものより多いことを強調することは、重要である。MDACC Leukemia Sample bankは、十分な数を超える液体窒素保存患者試料及び迅速な処理に利用できる使用準備済みのウェスタンブロット溶解液を保有している(我々は、トレーニングセット試料80〜100個及び試験セット試料240個を既に同定している)。
本開示の特定の実施形態による方法を、急性骨髄性白血病(AML)及び骨髄異形成(MDS)患者試料の多量のセットを、それらのサイトカイン及びケモカインの発現について試験するために既存の技術と共に使用し、発現のパターンを決定し、臨床成績と相関付けた。タンパク質発現及び活性化は、骨髄異形成(MDS)及び急性骨髄性白血病(AML)において白血病細胞の病態生理を決定し、内在性の変化(例えば突然変異、メチル化)及び、ストローマ相互作用、サイトカイン(CTKN)及びケモカイン由来の外因性シグナルに依存する。
RPPA 上記に記載の通りフォーマットしたRPPAスライドを、52種のタンパク質及びリン酸化タンパク質で患者試料550個を分析するために使用した。患者由来試料は、白血病細胞に富むCD3/CD19を除いた血液又は骨髄からの1マイクロリットル当たり細胞約1×104個の細胞濃度で作製した全血細胞溶解液であった。これらの試料を、繰返しでプリントし、1つの群は、「A」と表記したスポットに、他方は、その両側に逆向きで割り当て、上下逆の「B」で表した。標準化のために、11個の細胞系の混合物からなる陽性対照及びタンパク質可溶化緩衝液からなる陰性対照を使用した。発現管理のために、ベースライン及び、文字「C」によって模式的に示される増殖因子又はサイトカイン刺激バージョン並びに文字「N」で示される18個の正常末梢血試料を含む18個の細胞系を使用した。シグナル強度の定量を可能にするために、測定することが予想される多くのタンパク質にわたる138種の精製ペプチド(患者試料を囲む紫色のバンドで示す)を含めた。プリントの模式図を例示する図を図9に例示する。
表3:血液及び骨髄から調製された白血病細胞に富む試料におけるタンパク質発現レベル
表4:細胞遺伝学ではタンパク質サイン群中で不均一に分布する
表5:タンパク質サイン群及び細胞遺伝学による反応率
表6:タンパク質サイン群及び細胞遺伝学についての再発率
AML患者73名を本開示の特定の実施形態による方法を使用して評価した。タンパク質22種及びリン酸化タンパク質15種を測定した。異なるタンパク質発現サインが存在し、予後の徴候であった。異なる反応率及び異なる再発率が、存在した。各サイン群についての反応率、原発性不応性又は抵抗性率及び再発率を表7に示す。CR及び抵抗性率が群ごとに異なる一方で、総再発率は群7を除いて全ての群において同様であった。
表7:群ごとのCr、抵抗率及び再発率
表8:細胞遺伝学ではタンパク質サイン群中に不均一に分布した
Claims (13)
- プロテインアレイで複数の試料をアッセイするステップと、アッセイした試料をパターンに基づいてクラスター化するステップと、ヒートマップを作成するステップとを含むプロセスによって形成されるタンパク質活性化及び発現のサイン。
- プロテインアレイが逆相プロテインマイクロアレイである、請求項1に記載の方法。
- タンパク質発現及び活性化のサインを用意するための方法であって、患者からタンパク質試料を得るステップと、測定されるタンパク質に対応する1つ又は複数のタンパク質発現レベル及びリン酸化レベルを得るステップと、1つ又は複数の発現レベル又はリン酸化レベルのパターンに基づいて試料をクラスター化するステップと、クラスター化及び測定されるタンパク質を使用してヒートマップを作成するステップとを含む上記方法。
- 1つ又は複数のタンパク質発現レベル及びリン酸化レベルを得るステップが逆相プロテインマイクロアレイを使用して試料をアッセイするステップを含む、請求項3に記載の方法。
- 癌患者由来の細胞試料におけるタンパク質発現レベル若しくはリン酸化レベル又はその両方を少なくとも1つの基準タンパク質発現及び活性化のサインと比較するステップを含む、試料を分析するための方法であって、患者のタンパク質発現レベル若しくはリン酸化レベル又はその両方と、少なくとも1つの基準タンパク質発現及び活性化のサインとの間の相違点又は類似点が患者における癌の予後の指標となる上記方法。
- タンパク質がシグナル伝達経路(STP)タンパク質、アポトーシス制御タンパク質、細胞周期制御タンパク質、サイトカイン及びケモカインから選択される、請求項5に記載の方法。
- 患者の細胞試料中の1つ又は複数のタンパク質のタンパク質発現レベル若しくはリン酸化レベル又はその両方を表すデータを含む第一記憶媒体;少なくとも1つの基準タンパク質発現及び活性化のサインを表すデータを含む第二記憶媒体;タンパク質発現レベル若しくはリン酸化レベル又はその両方を少なくとも1つの基準タンパク質発現及び活性化サインと比較できるプログラム;並びにプログラムを実行できる処理装置を含むシステム。
- 複数の試料又は試料セット、陽性対照及び陰性対照を含むマイクロアレイであって、試料又は試料セットがスライド上に配列されており、各試料又は試料セットが陽性対照若しくは陰性対照又はその両方を伴っている上記マイクロアレイ。
- マイクロアレイからのシグナルを標準化するための方法であって、複数のシグナルから三次元トポグラフ図を作成するステップと、三次元トポグラフ図中に見出される不規則性を補正するステップとを含み、ここで、複数のシグナルが1つ又は複数の陰性対照及び陽性対照由来である上記方法。
- 癌の予後及び癌の治療を評価するための方法であって、新たに診断された患者及び疾患の異なる段階にある他の患者由来の癌細胞試料を提供するステップと、試料をプロテインアレイでアッセイするステップと、癌の予後を評価するために細胞試料全般にわたるアッセイの結果を比較するステップと、新たに診断された患者のために個別化された治療法を考案するステップとを含む上記方法。
- 癌細胞が固形腫瘍、転移性癌又は非転移性癌、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄異形成、骨髄腫及びリンパ腫由来である、請求項10に記載の方法。
- 表現型効果に関して生物学的試料を分類する方法であって、細胞試料のタンパク質発現及び活性化プロファイルを決定するステップであって、タンパク質発現及び活性化プロファイルが表現型効果に相関しているステップと、表現型効果に関して試料を分類するステップとを含む上記方法。
- 表現型効果が疾患の予後と相関する、請求項12に記載の方法。
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